CN116143855B - 一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用,本发明的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物,由于双键结构的存在使分子构象更加稳定,不容易被核酸酶识别并水解,并且该类帽类似物也表现出较好的体外转录产量以及加帽效率数据;同时,含有双键的mRNA帽类似物与真核起始因子(elF4E)有更好的结合能力,表现出更好的mRNA翻译效果。
Description
技术领域
本发明涉及化学及生物工程技术领域,具体涉及一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用。
背景技术
真核mRNA在其5'-末端带有“帽”结构,众所周知,此“帽”结构在翻译中起重要作用。天然存在的帽结构由7-甲基鸟苷组成,该鸟苷通过三磷酸桥连接到第一个转录核苷酸的5'-末端,从而导致7G(5')ppp(5')N,其中N是任何核苷酸。mRNA帽在基因表达中起重要作用。帽结构可以保护mRNA免受外切核酸酶的降解,使RNA可以从细胞核转运到细胞质,并参与翻译起始复合物的组装。帽类似物已用作体外T7或SP6 RNA聚合酶转录的引物,以获得在其5'末端具有帽结构的RNA。
通过体外转录合成mRNA已经成为引入外源基因并进行表达蛋白的重要工具,并广泛应用于疾病的治疗和预防中,体外转录合成mRNA使得工作人员能够制备在各种生物学应用中表现适当的RNA分子。此类应用包括多肽的研究应用和商业生产,例如,在无细胞翻译体系中产生在特定位点包含“非天然”氨基酸的多肽,或在培养的细胞中产生就其活性或稳定性而言需要翻译后修饰的多肽。在后者体系中,合成进行显著更长的时间,并因此产生更多的蛋白质。
基于结构特点,现有技术中,mRNA的5’末端帽子结构与真核起始因子(elF4E)结合能力的高低决定了该mRNA在细胞内的翻译表达效果。现有的帽类似物结构一般是天然的帽子结构,其mRNA的翻译效果不稳定,对于不同的序列或者不同的表达宿主结果差异较大。
发明内容
本申请提供了一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用,该mRNA帽类似物结构中的使用乙烯基膦酸模拟正常的膦酸功能,由于结构的改进,乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物具有空间构象的优势,和真核起始因子(elF4E)具有更好的结合能力,最终可以提高mRNA在细胞内的翻译水平。
一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物,其包含以下结构:
其中,R1、R2、R3和R4独立的为氢、羟基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的O-烷基、取代或未取代的S-烷基、取代或未取代的NH-烷基、取代或未取代的N-二烃基、取代或未取代的O-芳香基、取代或未取代的S-芳香基、取代或未取代的NH-芳香基、取代或未取代的O-芳烷基、取代或未取代的S-芳烷基、取代或未取代的NH-芳烷基;
B1、B2独立的为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基;
Ra、Rb、Rc独立的为以下结构:
Y为O、OCH2、OCH、CH2、CH、C2H3或C3H5;Z为OH、SH、BH3、芳基、烷基、O-烷基或O-芳基;X为O、CH2或NH;W为H、OH、烷基、O-烷基、N-烷基、S-烷基、卤素;/>表示是双键或者单键,并与五元糖环连接;
且Ra、Rb、Rc结构中至少有一个结构中Y为OCH或CH。
上述R1、R2、R3和R4独立的为氢、羟基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的O-烷基、取代或未取代的S-烷基、取代或未取代的NH-烷基。
上述取代或未取代的O-烷基中碳原子个数为0-5;
优选的,上述取代或未取代的O-烷基中碳原子个数为1、2或3。
上述B1、B2独立的为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶。
上述Ra、Rb、Rc独立的为以下结构:
其中Y为CH、C2H3或C3H5;Z为OH或烷基;X为O或CH2;W为H、OH或烷基;
Ra、Rb、Rc结构中至少有一个结构中Y为CH。
上述R1、R2、R4均为羟基,R3为甲氧基;B1为腺嘌呤、B2为鸟嘌呤;
Ra、Rb、Rc中有一个或两个为以下结构
具体结构如下所示:
优选的,上述Ra、Rb、Rc中只有一个为以下结构
一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物的制备方法,包括以下步骤:(1)m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐的合成;(2)磷酸酯键连接的二核苷酸的制备;(3)乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物合成。
具体的包括以下步骤:(1)m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐的合成:对鸟苷或其类似物依次进行二磷酸化、N7的甲基化、二磷酸的咪唑化反应等合成m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐;(2)磷酸酯键连接的二核苷酸的制备:通过2’OMe-A或其修饰亚磷酰胺单体与保护的鸟苷或其修饰类似物,在四氮唑的作用下偶联形成第一个磷酸酯键,通过酸作用,脱除保护基,然后引入第二个磷酸,最终水解得到磷酸酯键连接的二核苷酸;(3)乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物合成:m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐和磷酸酯键连接的二核苷酸反应制备乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物。
具体步骤包括:
(1)m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐的合成:
1)称取鸟苷或其类似物,溶解在磷酸三甲酯中,反应液冷却至0℃,缓慢滴加三氯氧磷(1.8eq.),冰浴下搅拌4小时后,加水淬灭反应,反相色谱纯化得中间体a。2)将中间体a,三苯基膦(1.0eq.),2,2’二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时,反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出,滤饼用丙酮充分洗涤得中间体b。3)取中间体b溶解DMF中,加入磷酸三丁胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)后室温搅拌5小时。反应结束后离子色谱纯化得到中间体c。3)将中间体c溶解在20倍体积的纯化水中,反应液冷却至4℃,缓慢滴加硫酸二甲酯,过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5,HPLC监测反应,反应结束后离子色谱纯化得到中间体d。5);将中间体d,三苯基膦(1.0eq.),2,2’二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时,反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出,滤饼用丙酮充分洗涤得到m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐。
(2)磷酸酯键连接的二核苷酸的制备:
称取2’OMe-rA或其修饰亚磷酰胺单体于单口瓶中,用二氯甲烷溶解,再加入的2’,3’乙酰基鸟苷或其类似物,降温至25±2℃,氮气鼓吹下加入四氮唑,升温至25±2℃反应。监测反应结束后,将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中,监测反应结束后旋干,浓缩后的油膏溶解在二氯甲烷中,加入1.1eq.的三氟乙酸,监测反应结束后,旋干,石油醚/二氯甲烷按一定比例打浆,过滤得中间体e;将e溶解在乙腈中,加入1.2eq.的膦试剂、1.2eq.的四氮唑充分搅拌反应,监测反应结束后,再加入1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中,监测反应结束后旋干,在旋瓶中加入3L甲醇和3L浓氨水,室温反应4小时,监测反应,反应结束后旋干,加入20L超纯水,进入反向离子渗透设备,洗涤浓缩,冻干得磷酸酯键连接的二核苷酸。
(3)乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物合成:
将步骤(1)得到的m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐溶解在含有MnCl2的DMF溶液中,并添加到步骤(2)得到的磷酸酯键连接的二核苷酸的DMF溶液中,在室温下搅拌反应,24小时后,用0.25M EDTA溶液终止反应;将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。收集HPLC纯度>97%的洗脱产物,浓缩完以上分离液,再装载到强阴离子树脂,使用0-1.0M的醋酸钠洗脱液线性梯度洗脱,收集HPLC纯度>98.5%的洗脱产物,合并高纯度洗脱液,通过纳滤设备去除残留的醋酸钠溶液并浓缩得目标产物含乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物。
一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物的应用,该乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物用于T7 RNA聚合酶体系下的的mRNA加帽。T7RNA聚合酶是一种依赖DNA的RNA聚合酶,其对噬菌体T7启动子序列有高特异性。该酶从T7启动子***到转录载体下游的DNA上合成大量RNA。T7RNA聚合酶催化的IVT(体外转录)反应体系是目前最成熟的mRNA制备体系。
通常20ul的IVT反应体系中含有50U的T7RNA聚合酶,同时搭配1ul的帽类似物(100mM)可以获得最佳的转录产量以及加帽效率。
本发明提供了一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用,该乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物适用于以DNA序列为模板利用体外共转录方法生产的mRNA,该DNA序列可以来源或改造自病毒、动物、植物等物种,同时其生产的mRNA具有更低的免疫原性、更高的蛋白翻译效率、更好的稳定性。
本发明相比现有技术具有以下优点:
1、与现有帽结构类似物Cleancap相比,本发明的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物,由于双键结构的存在使分子构象更加稳定,不容易被核酸酶识别并水解,并且该类帽类似物也表现出较好的体外转录产量以及加帽效率数据;同时,含有双键的mRNA帽类似物与真核起始因子(elF4E)有更好的结合能力,表现出更好的mRNA翻译效果。
2、本发明设计的乙烯基膦酸修饰帽子结构,含有乙烯基基团,可以有效地固定5’末端帽子的空间结构,并且提高mRNA的5’末端帽子结构与真核起始因子(elF4E)结合能力,进而可以提高mRNA的翻译效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
术语解释:本发明中“eq.”为当量。
各实施例中所使用的原料名称及来源参见下表1:
表1
实施例1:以中间体A和B为原料的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物的合成方法
将中间体A(2mol)溶解在含有MnCl2(20mol)的DMF溶液中,随后将中间体B(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应。24小时后,用10L的0.25M EDTA溶液终止反应。将混合物装载到DEAE Sephadex柱(30×500cm)上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物,反应路线流程,如方程式(1)所示:
其中,化合物A通过以下步骤得到:1)称取5g鸟苷,溶解在70.0ml的磷酸三甲酯中,反应液冷却至0℃,缓慢滴加三氯氧磷(1.8eq.),冰浴下搅拌4小时后,加水淬灭反应,反相色谱纯化得中间体A1。2)将中间体A1,三苯基膦(1.0eq.),2,2’二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时,反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出,滤饼用丙酮充分洗涤得中间体A2。3)取10g中间体A2溶解DMF中,加入磷酸三丁胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)后室温搅拌5小时。反应结束后离子色谱纯化得到中间体A3。3)将中间体A3溶解在20倍体积的纯化水中,反应液冷却至4℃,缓慢滴加硫酸二甲酯,过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5,HPLC监测反应,反应结束后离子色谱纯化得到中间体A4。5);将中间体A4,三苯基膦(1.0eq.),2,2’二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时,反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出,滤饼用丙酮充分洗涤得中间体A。
化合物A反应路线流程,如方程式(2)所示:
其中,化合物B通过以下步骤得到:1)取10g鸟苷溶解在150mL吡啶中,将三甲基氯硅烷(5.0eq.)加入到反应液中,随后室温搅拌2小时。降温至0℃,将异丁酰氯(1.5eq.)滴加到反应液中,随后室温反应3小时。冰浴下依次将20mL氨水,500mL水滴加到反应液中,二氯甲烷洗涤水相后水相用热水重结晶得到中间体B1。
2)取10g中间体B1溶解在150mL吡啶中,降温至0℃,将4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(1.2eq.)的吡啶溶液(50mL)滴加到反应液中。室温搅拌4小时,TLC监测反应至完全。冰浴下用5%的NaHCO3水溶液淬灭反应。乙酸乙酯萃取后用正己烷结晶得到中间体B2。
3)取10g中间体B2溶解在100mL的DMF溶液中,TBDMSCl(3.1eq.)加入到反应液中后室温搅拌过夜。加入饱和碳酸钠水溶液后用乙酸乙酯萃取,结晶得到中间体B3。
4)取8g中间体B3溶解在80mL 80%的乙酸溶液中,室温搅拌5小时后加入400mL的乙酸乙酯,随后用饱和碳酸钠调节pH至中性。分离有机相浓缩后柱层析得到中间体B4。
5)取5g中间体B4溶解在50mL DMF中,DMSO(6.0eq.)和EDCI(3.0eq.)加入到反应液后再将吡啶(1.0eq.)和三氟乙酸(1.0eq.)滴加到反应液中。室温反应5小时后用乙酸乙酯稀释反应液,有机相分别用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤后浓缩,柱层析得到中间体B5。
6)将四乙基亚甲基二磷酸脂(1.5eq.)冰浴下滴加到NaH(60%,1.0eq.)的THF(80mL)悬浊液中,随后0℃搅拌0.5小时。将中间体B5(3g)的THF溶液(40mL)缓慢滴加到反应液中。室温搅拌过夜。冰浴下将饱和氯化铵水溶液滴加到反应液中淬灭反应,乙酸乙酯萃取后浓缩,柱层析得到中间体B6。
7)取2g中间体B6溶解在40mL乙腈中,将三乙基溴硅烷(10.0eq.)加入到反应液中,随后加热到75℃过夜后浓缩,粗品用反相制备得到中间体B7。
8)取1g中间体B7和DMT-2'OMe-A(Bz)(1.2eq.)溶解在DMF中,将DCC(2.5eq.)加到反应液中室温过夜。反应液浓缩后柱层析得到中间体B8。
9)取1g中间体B8溶解在80%的醋酸水溶液中,室温搅拌过夜,反应完全,浓缩后纯化得到中间体B9。
10)取0.6g中间体B9溶解在二氯甲烷中(12mL),分别将四氮唑(1.1eq.)和双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺(1.1eq.)加入到反应液中,室温反应5小时,反应完全后浓缩得到中间体B10的粗品。
11)将中间体B10的粗品溶解在20mL的氨水中,加热至50℃过夜,反应结束后浓缩,反相色谱纯化得到中间体B。
化合物B反应路线流程,如方程式(3)所示:
实施例2:以中间体C和D为原料的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物的合成方法
以中间体C和D为原料,参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例2的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物。反应路线流程,如方程式(4)所示:
其中,化合物C通过以下步骤得到:1)取5g中间体B7溶解在H2O/TFA(1:1,50mL)中,室温搅拌1小时,反应完全。反相色谱纯化得到中间体C1。
2)取3g中间体C1与三苯基膦(1.5eq.),2,2’二硫二吡啶(1.5eq.),三乙胺(2.5eq.),咪唑(8.0eq.)溶解在20.0mL的DMF中,室温搅拌10小时,反应完全。反应液加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出,滤饼用丙酮充分洗涤得到中间体C2。
3)称取2g中间体C2溶解DMF中,加入磷酸三乙胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)后,室温搅拌8小时后,反应完全。反相色谱纯化得到中间体C3。
4)取2g中间体C3溶解在40mL纯化水中,反应液冷却至4℃,缓慢滴加硫酸二甲酯,过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5,HPLC监测反应,反应结束后离子色谱纯化得到中间体C4。
5)参考中间体C2的合成方法得到中间体C。
化合物C反应路线流程,如方程式(5)所示:
其中,化合物D通过以下步骤得到:称取5kg的2’OMe-rA亚磷酰胺单体于单口瓶中,用50L的二氯甲烷溶解,再加入2.73kg的2’,3’乙酰基鸟苷,降温至25±2℃,氮气鼓吹下加入880g四氮唑,升温至25±2℃反应。监测反应结束后,将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中,监测反应结束后旋干,浓缩后的油膏溶解在4L二氯甲烷中,加入1.1eq.的三氟乙酸,监测反应结束后,旋干,石油醚/二氯甲烷按一定比例打浆,过滤得中间体D1;将D1溶解在4L乙腈中,加入1.2eq.的膦试剂、1.2eq.的四氮唑充分搅拌反应,监测反应结束后,再加入1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中,监测反应结束后旋干,在旋瓶中加入3L甲醇和3L浓氨水,室温反应4小时,监测反应,反应结束后旋干,加入20L超纯水,进入反向离子渗透设备,洗涤浓缩,冻干得中间体D,反应路线流程,如方程式(6)所示:
实施例3:以中间体A和E为原料的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物的合成方法
以中间体A和E为原料,参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例3的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物。反应路线流程,如方程式(7)所示:
其中,化合物E通过以下步骤得到:1)取5g中间体D1溶解在50mL DMF中,DMSO(6.0eq.)和EDCI(3.0eq.)加入到反应液后再将吡啶(1.0eq.)和三氟乙酸(1.0eq.)滴加到反应液中。室温反应5小时后用乙酸乙酯稀释反应液,有机相分别用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤后浓缩,柱层析得到中间体E1。
2)将四乙基亚甲基二磷酸脂(1.5eq.)冰浴下滴加到NaH(60%,1.0eq.)的THF(80mL)悬浊液中,随后0℃搅拌0.5小时。将中间体E1(3g)的THF溶液(40mL)缓慢滴加到反应液中。室温搅拌过夜。冰浴下将饱和氯化铵水溶液滴加到反应液中淬灭反应,乙酸乙酯萃取后浓缩,柱层析得到中间体E2。
3)取1g中间体E2溶解在20mL乙腈中,将三乙基溴硅烷(10.0eq.)加入到反应液中,随后加热到75℃过夜后浓缩,粗品用反相制备得到中间体E3。
4)取0.3g中间体E3溶解在6mL氨水中,加热至50℃反应过夜。反应结束后浓缩,反相色谱纯化得到中间体E。反应路线流程,如方程式(8)所示:
实施例4:以中间体B和C为原料的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物的合成方法
以中间体B和C为原料,参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例4的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物。反应路线流程,如方程式(9)所示:
实施例5:以中间体C和E为原料的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物的合成方法
以中间体C和E为原料,参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例5的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物。反应路线流程,如方程式(10)所示:
实施例6:以中间体A和F为原料的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物的合成方法
以中间体A和F为原料,参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例6的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物。反应路线流程,如方程式(11)所示:
/>
其中,化合物F通过以下步骤得到:1)取5g中间体B9溶解在50mL DMF中,DMSO(6.0eq.)和EDCI(3.0eq.)加入到反应液后再将吡啶(1.0eq.)和三氟乙酸(1.0eq.)滴加到反应液中。室温反应5小时后用乙酸乙酯稀释反应液,有机相分别用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤后浓缩,柱层析得到中间体E1。
2)将四乙基亚甲基二磷酸脂(1.5eq.)冰浴下滴加到NaH(60%,2.0eq.)的THF(80mL)悬浊液中,随后0℃搅拌0.5小时。将中间体E1(3g)的THF溶液(40mL)缓慢滴加到反应液中。室温搅拌过夜。冰浴下用冰水淬灭反应,室温搅拌2小时后浓缩。粗品用反相色谱纯化得到中间体F2。
3)取1g中间体F2溶解在20mLDMF中,将三乙基溴硅烷(10.0eq.)加入到反应液中,随后加热到75℃过夜后浓缩,粗品用反相制备得到中间体F3。
4)取0.3g中间体F3溶解在H2O/TFA(1:1,30mL)中,室温搅拌1小时,反应完全。反相色谱纯化得到中间体F。反应路线流程,如方程式(12)所示:
实施例7:以中间体C和F为原料的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物的合成方法
以中间体C和F为原料,参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例7的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物。反应路线流程,如方程式(13)所示:
对比例1:m7GpppA2’OMepG
m7GpppA2’OMepG的合成方法参考上述实施例的合成方法(所使用的原料参考各实施例中的制备方法),反应路线流程,如方程式(14)所示:
/>
各实施例所得到的帽类似物以及对比例所得到的帽类似物结构如下表2所示,
表2
/>
测试例1:mRNA体外转录产量及加帽效率的测定
利用乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物的体外合成:先用NotI线性化质粒,4℃酶切过夜;DNA模板抽提;体外转录合成mRNA,分别使用实施例1-7的乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物及对比例1的帽类似物作为帽结构。
反应体系如表3:
表3
体系 | 用量 |
T7 RNA聚合酶 | 50U |
10X buffer | 2μl |
100mM ATP | 1μl |
100mM GTP | 1μl |
100mM CTP | 1μl |
100mM N1-Me-pUTP | 1μl |
100mM帽类似物 | 1μl |
无机焦磷酸酶 | 0.05U |
核酸酶抑制剂 | 20U |
无菌无酶水 | 补足至20μl |
模板 | 1μg |
备注:在实验过程中,首先计算好体系所需物料体积,然后进行加样。首先在体系中加入无菌无酶水,随后依次加入10X buffer、NTPs、帽类似物,混匀后轻轻离心,随后加入核酸酶抑制剂、无机焦磷酸酶、T7 RNA聚合酶、线性化DNA模板,充分混匀后轻轻离心,于37℃下孵育。2小时后加入DNase I 1U,37℃继续孵育30分钟以去除DNA模板,然后进行RNA纯化,通常使用磁珠纯化方法。纯化的mRNA用无菌无酶水进行溶解,随后利用Nanodrop One进行定量检测。
液相色谱质谱法(LC-MS)被用来检测不同起始帽类似物的mRNA的IVT加帽率;首先需要设计一段与转录产物mRNA起始碱基匹配的具有标记的DNA探针,通常的标记为biotin标记,将链霉亲和素标记的磁珠清洗后与合成的DNA探针、mRNA及10×RNase H reactionbuffer室温室温孵育30分钟,边孵育边缓慢混匀,随后加入20ul RNase H(5U/ul)孵育37度3h,每半个小时混匀一次。孵育结束后对磁珠进行清洗,清洗完成后的磁珠加入100μL加热到80℃的75%甲醇,混合物在加热板上加热到80℃,保持3分钟,然后放置磁力架上吸取上清,使用蒸发离心机在室温下干燥45分钟至10μl。然后将样品重新悬浮在50μl的100μMEDTA/1% MeOH中,即可用于LC-MS分析,确定转录反应中RNA的加帽情况。由于加帽与非加帽的碱基在分子量上有明显区别,利用分子质量差别即可判定不同帽类似物起始的mRNA转录的加帽率。具体结果见表4。
表4
编号 | 产量(μg) | 加帽率(%) |
实施例1 | 117ug | 96.4% |
实施例2 | 125ug | 96.3% |
实施例3 | 122ug | 95.3% |
实施例4 | 106ug | 94.5% |
实施例5 | 102ug | 90.2% |
实施例6 | 96ug | 87.3% |
实施例7 | 85ug | 82.6% |
对比例1 | 120ug | 95.6% |
由实验结果可知,实施例1-7均能够通过IVT转录出相应的目标mRNA。其中实施例1、2、3与对比例1的产量相当,同时实施例1、2、3的加帽效率优于对比例1或与对比例1的加帽效率相当。实施例4、5、6、7的体外转录产量以及加帽效率明显低于对比例1。这可能是和帽类似物结构相关,实施例4、5、6、7的刚性结构影响了帽类似物与模板起始转录位点的结合,最终也影响了体外转录产量以及加帽效率。
测试例2:真核起始因子(elF4E)结合能力测试
测试方法:首先用运行缓冲液(50mM磷酸盐,100mM氯化钠,and 0.01%vol/volTween 20,pH 6.0or 7.4)稀释样本,此实验样本有实施例1-7以及对比例1帽类似物样本。进样时间为2min,进样流速20ul/min,解离时间为2.5min。残留样本用再生缓冲液(10mMHEPES,150mM NaCl,and 0.01%vol/vol吐温20,pH 7.4))洗脱下来,时间为30sec,流速设为30ul/min。最后通过Biacore T100评价软件(version2.0.2)分析生成传感图并计算结合常数。
表5
由上表5的实验数据可知,实施例1、2、3、4、5、6与elF4E蛋白的结合常数优于对比例1,其中,实施例1、2、3与elF4E蛋白的结合常数显著优于对比例1,说明实施例1、2、3与elF4E蛋白的结合能力最强。同时我们也发现实施例7与elF4E蛋白的结合常数相比于对比例1最低,说明实施例7与elF4E蛋白的结合能力最弱。因此,当帽类似物结构中含有乙烯基结构,可能对提高帽类似物与elF4E蛋白的结合能力有一定的提高,但是实施例7的含有三个乙烯基结构的刚性结构影响了帽类似物与elF4E蛋白的结合,最终也影响了体外转录产量以及加帽效率。
测试例3:mRNA翻译效率
测试方法:采用eGFP编码序列为DNA模板,利用实施例1-7及对比例1的帽类似物为起始进行体外转录。随后将获得的不同的mRNA产物进行293T细胞的转染。293T细胞以(0.5-1)×105个细胞进行铺板(24孔板)。转染时细胞密度一般60-80%为佳,每孔转染2μg mRNA,转染试剂选用Lipofectamine MessengerMAX Transfection Reagent(Invitrogen)并参考其使用方法进行操作。转染后的细胞放置在37℃,CO2孵育箱中,转染4-6小时后,更换为新鲜的完全培养基。在37℃的CO2培养箱箱中孵育24小时以后,荧光显微镜观察其中GFP的荧光强度,并且更具荧光强度计算实施例1-7相对于对比例1的荧光强度比例。
表6
编号 | 细胞荧光相对强度(相对于对比例1) |
实施例1 | 3.16 |
实施例2 | 2.44 |
实施例3 | 2.31 |
实施例4 | 1.41 |
实施例5 | 1.36 |
实施例6 | 1.12 |
实施例7 | 0.54 |
对比例1 | 1 |
由上表6的实验数据可知,实施例1、2、3、4、5、6的帽类似物转录的mRNA在细胞内翻译效果相比于对比例1好,其中,实施例1、2、3的翻译效果显著优于对比例1,说明实施例1、2、3的帽类似物转录的mRNA在细胞内翻译效果最强。同时我们也发现实施例7的翻译效果相比于对比例1最低。因此,当帽类似物结构中含有乙烯基结构,可能对提高帽类似物mRNA在细胞内翻译效果有促进作用,但是实施例7的含有三个乙烯基结构的刚性结构影响了帽类似物与elF4E蛋白的结合,最终也影响了mRNA在细胞内翻译效果。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物,其特征在于,其包含以下结构:
,
其中,R1、R2、R3和R4独立的为氢、羟基、烷基、O-烷基;
所述B1、B2独立的为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶;
Ra、Rb、Rc中有一个或两个为以下结构;双键与五元糖环连接;
其余Ra、Rb、Rc为以下结构:,Y为O、OCH2、CH2;Z为OH;X为O;W为H、OH、烷基、O-烷基;/>表示是单键,并与五元糖环连接;
所述烷基、O-烷基中碳原子个数为1、2或3。
2.根据权利要求1所述的一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物,其特征在于,所述Ra、Rb、Rc中只有一个为以下结构。
3.根据权利要求1所述的一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物,其特征在于:所述R1、R2、R4均为羟基,R3为甲氧基;B1为腺嘌呤、B2为鸟嘌呤。
4.根据权利要求1-3的任一项所述的一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物,其特征在于:具体结构如下所示:
,,
,,
,。
5.权利要求1-4的任一项所述的一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物的应用,其特征在于:该乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物用于体外T7 RNA聚合酶体系下的mRNA加帽。
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