JP2002528087A - 改良ａａｖベクター産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、遺伝子治療に使用する、遺伝子工学的ウイルスベクター、特にアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。本発明は、アデノウイルス等のヘルパーウイルスを実質的に含まず、関連するヘルパーウイルスを産出しないでＡＡＶの産出が可能なＡＡＶヘルパー機能を提供する少なくとも１つの遺伝子産物をコードする核酸が付与された、高力価の組替えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）パッキング細胞を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、遺伝子治療用の遺伝子操作ウイルスベクターの分野、より詳細には
、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。

【０００２】 アデノ関連ウイルスは、非病原性ヒトパルボウイルスである（Ｂｅｒｎｓ、１
９９０ａ、Ｂｅｒｎｓ、１９９０ｂに概説）。このウイルスは、約４．６ｋｂの
一本鎖ＤＮＡとして複製される。プラス鎖およびマイナス鎖がパッケージングさ
れ、感染性を有する。ＡＡＶの効率的な複製には、細胞のヘルパーウイルスとの
同時感染が必要である。ＡＡＶを補助すると同定されているウイルスは、アデノ
ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
および仮性狂犬病ウイルスである（Ｂｅｒｎｓ、１９９６）。ヘルパーウイルス
の非存在下では、ＡＡＶの実質的な複製は認められない。したがって、ＡＡＶは
また、ディペンドウイルスとして分類される。ヘルパーウイルスが存在しない場
合、ＡＡＶゲノムを宿主ゲノムに組込むことができる。野生型ウイルスは、第１
９番染色体長腕の組込み部位（ｑ１３．３−ｑ ｔｅｒ）に強い選好性（７０％
）を有する（Ｋｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｓａｍｕｌｓｋｉ、１９９
３、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９９１）。組込み後、ウイルス遺伝子
の発現は、検出不可能である。組込まれたプロウイルスは、導入細胞の***時に
宿主細胞ゲノムの正常な部分として複製されて、娘細胞となる。ウイルスの生活
環のこの段階は、潜伏段階として公知である。この潜伏段階は安定であるが、ヘ
ルパーウイルスによる導入遺伝子の感染の妨げとなり得る。ヘルパーウイルスの
感染後、ＡＡＶは、宿主ゲノムから切り出され、複製を開始する。この溶菌サイ
クルの初期段階の間、ｒｅｐ遺伝子が発現する。約１２〜１６時間後、キャプシ
ドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３が検出可能な量で産生され、複製さ
れたウイルスＤＮＡがビリオン中にパッケージングされる。ＡＡＶゲノムおよび
その遺伝子の略図を図１に示す。ビリオンは、細胞の核に蓄積し、ＡＡＶおよび
ヘルパーウイルスの蓄積の結果として細胞溶解した場合に放出される（Ｂｅｒｎ
ｓ、１９９０ａ、Ｂｅｒｎｓ、１９９０ｂ）。したがって、これまでのところ霊
長類の６つの血清型が特徴づけられれている（Ｂｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．、１９
９４、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．、１９９８）。ＡＡＶゲノムは、２つの
遺伝子ｒｅｐおよびｃａｐを含む（図１）。３つのプロモーター（Ｐ５、Ｐ１９
、およびＰ４０）は、４つのＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅ
ｐ５２、およびＲｅｐ４０）および３つのキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ
２、およびＶＰ３）をコードするｍＲＮＡの合成を駆動する。ＡＡＶゲノムは、
逆方向末端反復（ＩＴＲ）と呼ばれる１４５ｂｐの配列（ウイルスの組込み、複
製、およびキャプシド形成に必要な全てのシス作用配列を含むと考えられている
）の両端に隣接している（Ｌｕｓｂｙ ｅｔ ａｌ．、１９８０、Ｓａｍｕｌｓ
ｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。

【０００３】 増殖性感染の間、最初にＰ５プロモーターが活性化され、Ｒｅｐ ７８および
Ｒｅｐ６８の産生を指向する。これらのタンパク質は、ウイルス遺伝子のＡＶＶ
複製およびトランス調節に必須である。Ｐ１９プロモーターからＲＥｐ５２およ
びＲｅｐ４０が発現し、これはＡＡＶゲノムのパッケージングに関与すると考え
られる（Ｃｈｅｊａｎｏｖｓｋｙ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ、１９８９、Ｓｍｉｔ
ｈ ａｎｄ Ｋｏｔｉｎ、１９９８）。キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、
およびＶＰ３がＡＡＶ Ｐ４０プロ−ターの２．６ｋｂ転写物から産生され、こ
れは、同一のスプライスドナーおよび２つの異なるスプライスアクセプター部位
の使用によって２つの２．３ｋｂ ｍＲＮＡにスプライシングされる。スプライ
スアクセプター部位は、ＶＰ１転写開始シグナルの両端に位置する。ＶＰ１は、
ＶＰ１翻訳開始コドンの前に直接スプライスアクセプターを使用するメッセンジ
ャーから翻訳される。ＶＰ２およびＶＰ３は、ＶＰ１ ＡＴＧのアクセプター３
‘にスプライシングされるメッセンジャーｍＲＮＡから翻訳される。タンパク質
ＶＰ２およびＶＰ３は、ＡＣＧ翻訳開始（Ｖｐ２）または下流ＡＴＧ（ＶＰ３）
の使用によってこのメッセンジャーから翻訳される。３つ全てのコード領域がイ
ンフレームであるので、キャプシドタンパク質は、同一のアミノ酸配列を有する
巨大なドメインを共有する。ＶＰ３は、ＶＰ１およびＶＰ２中に完全に含まれて
いるが、後者の２つはさらなるアミノ末端配列を含む。同様に、ＶＰ１は、完全
なＶＰ２タンパク質を含むが、さらなるＮ末端配列を含む。３つ全てのキャプシ
ドタンパク質は、同一の位置で終結する（Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９
９４）。ＡＡＶキャプシドは、直径２０ｎｍ〜４０ｎｍであり（Ｂｅｒｎｓ ａ
ｎｄ Ｂｏｈｅｎｓｋｙ、１９８７、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．、１
９８３）、約５％ＶＰ１、５％ＶＰ２、および９０％ＶＰ３を含む。この比は、
代替的にスプライシングされたメッセンジャーの相対存在量およびＶＰ２のＡＣ
Ｇ開始コドンでの翻訳開始効率の減少を反映すると考えられる。

【０００４】 アデノ関連ウィルスベクターを、野生型ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺
伝子の目的の配列との置換によって作製することができる。組換えウイルスの作
製のために、ヒト細胞に感染させた関連ヘルパーウイルスは、異なる手段でｒｅ
ｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を供給する必要がある。これは、ＡＡＶのｒｅｐ遺
伝子およびｃａｐ遺伝子を含むがＡＡＶのＩＴＲを欠く、ＡＡＶパッケージング
機能を付与するいわゆるパッケージングプラスミドのトランスフェクションによ
って日常的に行われる。組換えＡＡＶを、典型的には、ヘルパーウイルス感染細
胞への組換えＡＡＶを含むプラスミドとパッケージングプラスミドとの同時トラ
ンスフェクションによって作製する。組換えウイルスは、典型的には、細胞トラ
ンスフェクションの４８〜７２時間後にこの培養物から回収する。この方法で作
製された組換えＡＡＶは、高力価で、野生型ＡＡＶを本質的に含まずに作製する
ことができる（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ
ａｌ．、１９８９）。細胞はまた、ヘルパーウイルス（通常、アデノウイルス
）と共に関連的に感染されるので、このヘルパーウイルスも産生される（Ｃｌａ
ｒｋ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｈｅ
ｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｍｏｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．、１９９８
、Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９７ａ）。ＡＶＶ複製およびパッケージン
グはまた、無細胞系を用いて試験管内で行うことができる（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．、１９９２、Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｎｉ ｅｔ ａｌ．、１
９９４、Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９８、Ｗａｒｄ ｅｔ ａ
ｌ．、１９９８）。

【０００５】 ｒＡＡＶ調製物中のヘルパーウイルスの存在は望ましくない。関連ヘルパーウ
イルスは潜在的な病原体であり、臨床的用途には、たとえ微量の組換えＡＶＶ調
製物のヘルパーウイルス汚染でも受け入れられない。いくつかの方法を使用して
組換えＡＡＶ調製物からヘルパーウイルスを取り除く。アデノウイルスの場合、
これらには、密度と温度感受性の相違が含まれる。ＡＡＶ粒子は、１．４１〜１
．４５ｇ／ｃｍ^３の密度であるのに対してアデノウイルスは２〜５ｇ／ｃｍ^３で
あり、最も一般的に使用されるヘルパーウイルスは、１．３３ｇ／ｃｍ^３の密度
である。密度勾配遠心沈殿法によって、この相違を利用して２つのウイルスを分
離する（Ｃｌａｒｋ ｅｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．
、１９９７）。温度感受性の相違を使用して汚染したアデノウイルスを取り除く
こともできる。アデノ関連ウィルス粒子は、アデノウイルス粒子よりも熱処理に
対して耐性を示す。日常的に、組換えＡＡＶ調製物を、５６℃で１時間インキュ
ベートする。組換えＡＡＶは、この処理に耐性を示すが、アデノウイルス（ヘル
パーウイルス）は耐性を示さない（Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｍ
ｏｎａｈａｎ ｅｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９
９７ａ）。これらの方法はほとんどのヘルパーウイルスの除去に十分であるにも
かかわらず、組換えＡＡＶの臨床への応用には理想的ではない。１つの理由とし
て、臨床への応用は大量の組換えＡＡＶの産生を必要とする。これは、大量のヘ
ルパーウイルスも産生されるので、その後ｒＡＡＶ調製物を完全に取り除かなけ
ればならないことを意味する。さらに、ヘルパーウイルスの非存在を確証するの
は困難である。

【０００６】 本発明は、哺乳動物細胞中に目的の遺伝子を移入し且つ発現するように設計さ
れた遺伝子操作ウイルスベクターの作製、産生、および精製に関する。本発明は
、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスを本質的に含まない、高力価の組換え
アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）ベクターの産生法を提供する。 いくつかのウイルスにより、ＡＡＶのヘルパー機能を得ることができる。アデノ
ウイルスのヘルパー機能は、絶えず最も良好に特徴づけられている。アデノウイ
ルスでは、完全な許容性のあるＡＡＶ感染を必要とする４つの領域が同定されて
いる。これらは、Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、およびＶＡ領域である。Ｅ１で
は、ＥｌａおよびＥ１ｂ領域由来の遺伝子が重要である。これらの遺伝子の役割
が発見され、特徴づけられた研究が概説されている（Ｃａｒｔｅｒ、１９９０）
。ＨＳＶはまた、ＡＡＶのヘルパーウイルスとして機能することができる。これ
までのところ、同定されたヘルパーウイルス機能を有するＨＳＶ遺伝子は、ＩＣ
Ｐ８およびＩＰＣ４遺伝子（ウイルスＤＮＡポリメラーゼおよびおそらくウイル
スヘリカーゼ）を含む（Ｂｅｒｎｓ、１９９６）。本発明は、関連するヘルパー
ウイルスを産生しないで組換えＡＡＶを作製可能なＡＡＶヘルパー機能を提供す
る遺伝子産物をコードする核酸が付与されたアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）パッ
ケージング細胞を提供する。

【０００７】 より詳細には、本発明は、複製可能アデノウイルスを含まない高力価の組換え
ＡＡＶ株の大量産生に特に適切な方法、細胞株、組換えアデノウイルスベクター
、および組換えＤＮＡ分子を提供する。通常の細胞では、ＡＡＶの複製およびパ
ッケージングは、検出不可能である。しかし、ヘルパーウイルス機能の非存在下
で低レベルの複製およびパッケージングを誘導することができる。小規模でＡＡ
Ｖの増殖性複製を誘導するためのいくつかの方法が発表されている。これらには
、細胞***抑制薬での細胞の処置またはＵＶ照射（Ｙａｃｏｂｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．、１９８９）が含まれる（これらに限定されない）が、複製可能ヘルパーウ
イルスを含まない高力価の組換えＡＡＶ株の大量産生には適切でない。本発明は
、組換えＡＡＶ産生中のヘルパーウイルス産生を完全に回避するための構造的に
より良好な溶液を提供する。ヘルパーウイルス産生の防止により、骨の折れる精
製ならびにその後の調製物の確認および試験が必要なくなる。本発明は、ＡＡＶ
複製に必要なヘルパーウイルスの排除によりＡＡＶ産生中のヘルパーウイルスの
産生を排除する方法を提供する。

【０００８】 近年、組換えＡＡＶ産生の改良法は、多くの注目を集めている。標準的な方法
よりも組換えＡＡＶの収率を改良するための、ＡＡＶ遺伝子であるｒｅｐおよび
ｃａｐの種々の発現法が見出されている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９７
、Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｖ
ｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．、１９９７）。さらに、ヘルパーウイルス機能は研
究中であり、組換えＡＶＶ調製物の質および収率を共に改良する方法が見出され
ている（Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａ
ｌ．、１９９６、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．、１９９８ｂ）。本発明の１つの態様
では、アデノウイルスＥ２Ａ遺伝子およびさらに必要とされるヘルパー機能を発
現し、さらに必要とされるヘルパー機能は、ＲＣＡの形成を誘導するパッケージ
ング細胞に既に存在するＥ２Ａヘルパー機能と重複する配列を保有しないパッケ
ージング細胞を供する。好ましくは、Ｅ−２Ａ遺伝子は、アデノウイルスｔｓ１
２５に由来する。本発明の別の実施形態では、アデノウイルスＥ１領域およびさ
らに必要なヘルパー機能を発現し、さらに必要なヘルパー機能は、ＲＣＡ形成を
誘導するパッケージング細胞に既に存在するＥ１ヘルパー機能と重複する配列を
保有しない、パッケージング細胞を提供する。本発明の１つの特定の態様では、
パッケージング細胞はＰＥＲ細胞株を含む。ＰＥＲ細胞株は、ヒトアデノウイル
ス５ Ｅ１領域を含む完全に特徴づけられたプラスミド（ＷＯ ９７／００３２
６）で不死化された正常なヒト胚網膜芽細胞（ＨＥＲ）から作製することができ
る。ＰＥＲ細胞は、ＰＥＲ細胞に存在するＥ１領域と重複する配列を保有しない
新規のＥ１欠失アデノウイルスベクター（ＷＯ ９７／００３２６）と組み合わ
せたＲＣＡの形成の防止に特に有用である。本発明の１つの態様では、ＰＥＲ細
胞に、ＲＣＡの形成を誘導するＰＥＲ細胞中に既に存在するＥ１配列と重複する
配列を含まないＥ１欠損アデノウイルスの挿入によってさらに必要なヘルパーウ
イルス機能を供給する。本発明の別の態様では、ＰＥＲ細胞に、ヘルパーウイル
ス機能をコードする遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ（このプラスミドがＲＣＡの
形成を誘導するＰＥＲ細胞中に既に存在するＥ１配列と重複する配列を含まない
）でのトランスフェクションによってさらに必要なヘルパーウイルス機能を供給
する。このようなＰＥＲ細胞の例として、Ｐｅｒ．Ｃ６は、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏ
ｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＡＭＲ
）で寄託番号９６０２２９４０ＥＣＡＣＣで寄託されている。ｒＡＡＶ産生用に
最も一般的に使用される細胞株は、ＨｅＬａおよび２９３である。これらの細胞
株は広く一般に使用されているにもかかわらず、いくつかの欠点が存在する。Ｈ
ｅＬａ細胞は、ヒト癌由来であるので、そのＤＮＡ中に１つまたは複数の癌遺伝
子を保有する。いくつかの染色体ＤＮＡはこれらの細胞に対して産生されたウイ
ルスベクターと同時にパッケージングされるので、患者の標的細胞中に存在する
ことになると考えられる。ＨｅＬａ細胞と比較して、２９３細胞はヒトの癌に由
来しないという利点がある。しかし、２９３細胞は、いくつかのアデノウイルス
配列で安定にトランスフェクトされ、結果として、Ｅ１遺伝子を発現する（Ｇｒ
ａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、１９７７ａ）。このＥ１遺伝子発現は、組換えＡＡＶ
の産生に十分である（Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｓｎｙｄｅｒ
ｅｔ ａｌ．、１９９７ｂ、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．、１９９８）。しかし、２
９３細胞株には欠点がある。Ｅ１領域を細胞のＤＮＡに安定に組込むだけではな
い。アデノウイルスゲノムの左半分から、細胞株は、左側のＩＴＲ、パッケージ
ングシグナル、Ｅ１遺伝子、およびタンパク質ＩＸをコードする遺伝子を含む少
なくともアデノウイルス５配列１−４３４４を保有することが公知である（Ｌｏ
ｕｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９９７）。単にＥ１配列のみの存在ではないので、両
端に最も一般的に使用されるＥ１欠失アデノウイルスベクターまたは欠失変異体
（ｄ１３１２（Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９７ｂ）など）と重複する有
意な領域を残している。重複領域は、最も一般的に使用されるＥ１欠失アデノウ
イルスベクターと２９３中のアデノウイルス５配列との間での相同組換えに十分
である。このような相同組換えにより、複製可能アデノウイルス（ＲＣＡ）（Ｈ
ｅｈｉｒ ｅｔ ａｌ．、１９９６）の望ましくない産生を誘導し得る。特に大
量調製では、Ｅ１欠失アデノウイルスベクター株におけるＲＣＡの存在は問題で
ある（Ｉｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９６、Ｌｏｃｈｍｕｌｌｅｒ ｅｅｔ
ａｌ．、１９９４）。（Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．、１９９６）およびＷＯ
９６／４０２４０に記載の発明は、組換えＡＡＶの産生のためのアデノウイル
スヘルパー機能を得るための、アデノウイルスｄ１３０９由来のＸｂａＩ消化Ｄ
ＮＡから単離した３５，０００ｂｐ ＤＮＡでの２９３細胞のトランスフェクシ
ョンを含む。この技術は、このＸｂａＩフラグメントが、複製可能アデノウイル
スの偶発的な産生が可能である、２９３中のアデノウイルス配列と有意に重複す
るので理想的ではない。別の欠点は、ｄ１３０９はＥ３領域にＤＮＡが挿入され
ていることである。この技術の巧妙な調整により、アデノウイルス遺伝子を欠く
一方で、組換えＡＡＶ産生のためのヘルパーウイルス機能を保持するアデノウイ
ルスヘルパープラスミドが産生されている（ＷＯ９７／１７４５８、Ｆｅｒｒａ
ｒｉ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｘｉａｏ ｅ
ｔ ａｌ．、１９９８ａ）。ＲＣＡを回避するためのこれらのアデノウイルス後
期遺伝子欠失ヘルパープラスミドの使用は、一般に、２９３細胞に限定される。
上記のように、この細胞株は、いくつかの欠点を有し、２９３細胞株のさらなる
１つの欠点は、Ｅ１領域のみを発現するので、組換えＡＡＶの有効な大量産生に
ヘルパー機能がさらに必要であり、この機能は個別に供給する必要があることで
ある。さらに、２９３細胞の培養は、困難であると考えられる。

【０００９】 本発明の別の実施形態では、例えば、アデノウイルスｔｓ１２５由来のアデノ
ウイルス領域Ｅ１およびＥ２ａを発現する安定なパッケージング細胞を提供する
。本発明のこの好ましい実施形態では、Ｅ２ａの機能的発現を、組換えＡＡＶの
収率を最適にするように調節することができる。さらに必要なヘルパー機能は、
Ｅ１、Ｅ２ａ欠失アデノウイルスの形態またはヘルパーウイルス機能をコードす
る遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの形態で得られるが、ヘルパーアデノウイルス
ベクターまたはプラスミドＤＮＡは、ＲＣＡの形成を誘導する本発明のパッケー
ジング細胞に既に存在するヘルパーウイルス機能と重複する配列を含まない。こ
の好ましい実施形態では、本方法によりＲＣＡの形成を誘導するパッケージング
細胞中に既に存在するＥ１領域と重複する配列を移入しない場合、Ｅ２ａヘルパ
ー機能を、パッケージング細胞に付加的に供給することができる。

【００１０】 本発明の好ましい実施形態では、アデノウイルス後期遺伝子発現を、後期遺伝
子の転写物での介在またはさらに必要なヘルパー機能をコードするＤＮＡ由来の
１つまたは複数のコード遺伝子の除去のいずれかによって本質的に抑制する。

【００１１】 本発明の別の態様では、本発明の細胞を、産生用に多数増殖させて、組換えＡ
ＡＶを回収および精製する。組換えＡＡＶの産生用に、細胞に、組換えＡＡＶ
ＤＮＡ、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含む遺伝子、ならびにヘル
パーウイルス機能を含むＤＮＡを供給する。本発明の好ましい実施形態では、Ａ
ＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を、それらが全く同一の分子に存在する
ようにプラスミドＤＮＡに物理的に結合させて、さらに必要なヘルパー機能を得
る。この細胞に、組換えＡＡＶ産生の開始直前に、組換えＡＡＶの産生に必要な
ＤＮＡを供給することができ、この場合、各産生用に細胞はある方法によってＤ
ＮＡを供給される必要がある。この方法は、多数の細胞へのＤＮＡのトランスフ
ェクションまたは感染に適切な任意の方法であり得る。本発明の特に好ましい実
施形態では、組換えＡＡＶ産生に必要なＤＮＡを、ポリ（２−（ジメチルアミノ
）エチル−１０−４−アミノブチル）ホスファゼンまたは他のポリ（オルガノ）
ホスファゼンを用いてＰＥＲ細胞にトランスフェクトする。あるいは、組換えＡ
ＡＶ産生に必要なＤＮＡの一部を、ＰＥＲ細胞染色体ＤＮＡに安定に組込むこと
ができる。

【００１２】 本発明の別の態様では、本発明の細胞である組換えＡＡＶを、完全に規定され
た無血清培地を用いた懸濁培養で成長させた本発明のパッケージング細胞を用い
て産生させる。

【００１３】 本発明の１つの実施形態では、ヘルパー機能は複製可能ヘルパーウイルスの形
成を誘導する重複を含まない、ＡＡＶ複製サイクルに必要な全てのヘルパー機能
を含むパッケージング細胞の産生法を提供する。本発明の好ましい実施形態では
、パッケージング細胞を、さらに必要なヘルパー機能との重複を含まないアデノ
ウイルスＥ１領域で安定に形質転換する。本発明の特に好ましい実施形態では、
パッケージング細胞はＥ１領域およびＥ２ａ領域で安定に形質転換されている。
本発明のこの特に好ましい実施形態では、Ｅ２ａ機能は、シグナルにしたがって
自由にオンとオフに切り替えることができる。本発明の好ましい実施形態では、
Ｅ２ａ遺伝子は、アデノウイルス変異株Ｈ５ｔｓ１２５由来であるので、シグナ
ルは、温度で切り替わる。本発明の別の特に好ましい実施形態では、パッケージ
ング細胞を、アデノウイルス５Ｅ１領域、Ｅ２ａ遺伝子、およびアデノウイルス
５ＶＡ領域（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．、１９８９）またはアデノウイル
ス５Ｅ４ｏｒｆ６遺伝子またはその両方で安定に形質転換する。この特に好まし
い実施形態では、アデノウイルス５ＶＡ領域および／またはアデノウイルス５Ｅ
４ｏｒｆ６遺伝子の転写活性を調節する。これは、転写活性をシグナルにしたが
って自由にオンまたはオフに切り替えることができることを意味する。

【００１４】 本明細書中で使用される、用語「さらに必要なヘルパー機能」はまた、コード
遺伝子が組換えＡＡＶ産生細胞のＤＮＡに安定に組込まれないか、さらなる発現
が所望される、組換えＡＡＶの有効な（大量）産生を可能にするヘルパーウイル
ス機能をいう。このようなさらに必要なヘルパー機能を、哺乳動物細胞への外来
遺伝物質の導入が可能な任意のウイルスまたは非ウイルス法（ポリ（オルガノ）
ホスファゼン、ポリエチレンイミン、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレー
ション、組換え、脂質またはリポソーム媒介遺伝子導入が含まれるが、これらに
限定されない）によって得ることができる。

【００１５】 本発明の１つの実施形態では、さらなるＡＡＶパッケージング機能のみを必要
とするパッケージング細胞および組換えＡＡＶ産生用の組換えＡＡＶベクターを
提供する。このパッケージング細胞は、安定に組込まれたアデノウイルスＤＮＡ
由来の必要なアデノウイルスヘルパー機能を含み且つ提供する。本発明の１つの
態様では、ヘルパー機能は、安定に組込まれたＥ１領域によって得られる。本発
明の別の態様では、ヘルパー機能は、安定に組込まれたＥ１領域および安定に組
込まれたＥ２ａ遺伝子によって得られる。本発明のこの特定の実施形態では、Ｅ
２ａ機能を、シグナルにしたがって自由にオンまたはオフに切り替えることがで
きる。本発明の好ましい実施形態では、Ｅ２ａ遺伝子は、アデノウイルス変異株
Ｈ５ｔｓ１２５由来であるので、シグナルは、温度で切り替わる。本発明の別の
特に好ましい実施形態では、パッケージング細胞を、アデノウイルス５Ｅ１領域
、Ｅ２ａ遺伝子、およびアデノウイルス５ＶＡ領域（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ
ａｌ．、１９８９）またはアデノウイルス５Ｅ４ｏｒｆ６遺伝子またはその両方
で安定に形質転換する。この特に好ましい実施形態では、アデノウイルス５ＶＡ
領域および／またはアデノウイルス５Ｅ４ｏｒｆ６遺伝子の転写活性を調節する
が、これは、転写活性をシグナルにしたがって自由にオンまたはオフに切り替え
ることができることを意味する。

【００１６】 本発明は、本発明の細胞を含む細胞培養を提供する。ヒト遺伝子治療用の組換
えベクターの大量産生には、産生細胞株用の容易で拡大可能な培養法が必要であ
り、培地中にいかなるヒトまたは動物の成分も含まない懸濁培養（すなわち、無
血清培地）または他の大量培養（バイオリアクター培養など）が好ましい。多数
の哺乳動物細胞に増殖させるために、いくつかの系が考案されている。これらに
は、回転ボトル培養、細胞キューブ、およびバイオリアクターが含まれるが、こ
れらに限定されない。これらの各系は、利点および欠点を有する。細胞が懸濁液
中で増殖するバイオリアクターは、規格化およびより大きな規模への増加が最も
容易である。しかし、欠点の１つは、懸濁液中の細胞は容易にトランスフェクト
されないことである。多種の異なる細胞の最適な増殖を支持するための多くの異
なる細胞培養を開発する。これらの培地のほとんどは、ダルベッコ改変イーグル
培地（ＤＭＥＭ）の変形に基づき、ウシ血清を補充している。本発明者らは、規
定の無血清培地を用いて本発明の細胞を懸濁培地に適応させた。無血清培地は、
外来因子の質および存在で変化し得る天然の血清源に依存しないので、完全に明
確であるという利点を有する。これらの無血清培地は、血清中での細胞増殖用の
必須成分の代わりの添加物を含む。

【００１７】 本発明はまた、本発明の細胞または細胞培養の使用を含む組換えアデノ関連ウ
ィルスの産生法および遺伝子治療におけるこれらのアデノ関連ウィルスベクター
の使用を提供する。

【００１８】 本発明は、ＡＡＶ−２に基づいて記載されているが、他のＡＡＶ血清型（１お
よび３〜５）または未だ発見されていない血清型もまた同一の目的に適用するこ
とができることが明白である。他の種で共通のディペンドウイルスもまた、同一
の目的に使用することができ、例えば、イヌアデノ関連ウィルスをヒトの細胞に
感染させることができる。さらに、ヒトＡＡＶは、種特異的アデノウイルスが存
在する限り多くの哺乳動物細胞中で複製し、それぞれの種特異的アデノウイルス
を用いて、本発明の細胞および方法によって他の種由来のディペンドウイルスを
産生することができる。非霊長類ディペンドウイルスの非限定的な例は、トリ、
イヌ、ウシのアデノ関連ウィルスである（Ｂｅｒｎｓ、１９９６）。例えば、遺
伝子産物の機能が類似の場合、アデノウイルス１〜４、６〜５１、または他のヒ
トもしくは動物のアデノウイルスを同一の目的で操作することができることも当
業者に明白である。類似のＡＡＶヘルパー機能が得られるが、異なるウイルス（
ＨＳＶ、ＣＭＶ、および仮性狂犬病ウイルスなどであるが、これらに限定されな
い）由来であるか、他の天然供給源由来であるか、合成形態で産生される遺伝子
産物を、同一の目的で使用することができる。

【００１９】 本発明を、本明細書の実験の部および図面でさらに説明するが、これらは本発
明を限定しない。

【００２０】 （実験の部）材料と方法。ＤＮＡ構築物。パッケージングプラスミドｐＩＭ４
５（７．３ｋｂ）は、ＡＡＶ−２ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含み（Ｍ
ｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．、１９９１）、これはＳ．Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ博
士から贈与されたものであった。ｐＡＣＶ−βｇａｌ（８．３ｋｂ）は、ＡＡＶ
−ＩＴＲの間にＣＭＶ−ＬａｃＺ発現カセットを含むプラスミドであり、これは
、Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ博士から贈与されたものであった。プラス
ミドｐＩＧ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂは、ヒトＰＧＫプロモーターの転写調節下でＡｄ５
ＥｌａおよびＥ１ｂ遺伝子（Ａｄ５のヌクレオチド４５９〜３５１０）を含み、
これはＷＯ／９７／００３２６に記載されている。プラスミドｐＥ２ａは、以下
に記載の別名プラスミドｐｃＤＮＡ３ｗｔＥ２Ａである。プラスミドｐＥ４ｏｒ
ｆ６を、ｐＣＭＶ／ｎｅｏのＢａｍＨＩ部位へのＡｄ５ Ｅ４ｏｒｆ６タンパク
質をコードする９２９ｂｐフラグメントの挿入によって作製した（Ｈｉｎｄｓ
ｅｔ ａｌ．、１９９０）。

【００２１】 ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ寄託ｐ９７０８２１２２）。Ｉ
ＴＲ配列の平滑末端クローニングを容易にするために、野生型ヒトアデノウイル
ス５型（Ａｄ５）ＤＮＡを、過剰なｄＮＴＰの存在下でクレノウ酵素で処理した
。クレノウ酵素の不活化およびフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール
沈殿の後、ＤＮＡを、ＢａｍＨＩで消化した。このＤＮＡ調製物を、さらに精製
せずに以下のように調製したｐＢＲ３２２由来のベクターＤＮＡを用いたライゲ
ーション反応に使用した：ｐＢＲ３２２ ＤＮＡを、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨ
Ｉで消化し、ＴＳＡＰ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での処理に
よって脱リン酸し、ＬＭＰアガロースゲル（ＳｅａＰｌａｑｕｅ ＧＴＧ）で精
製した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ．）への形
質転換およびアンピシリン耐性コロニーの分析後、Ａｄ５中のＢａｍＨＩ部位か
ら右側のＩＴＲにわたるインサート用に、予想される消化パターンを示す１つの
クローンを選択した。右側のＩＴＲでのクローニング境界（ｃｌｏｎｉｎｇ ｂ
ｏｒｄｅｒ）の配列分析により、ＩＴＲのほとんどの３‘Ｇ残渣は失われている
ことが明らかになり、ＩＴＲの残部は妥当であることが見出された。

【００２２】 ｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍ（ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ９７０８２１１７）。
野生型アデノ５型ＤＮＡを、ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、２０．６ｋｂ
フラグメントを、ゲルから電気的溶出によって単離した。ｐＢＲ３２２を、同一
の酵素で消化し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎによってアガロースゲルから精製した。両
フラグメントをライゲートし、コンピテントＤＨ５αに形質転換した。得られた
クローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍを、制限酵素消化によって分析し、９１
９〜２１５６６ｂｐのアデノウイルス配列有するインサートを含むことが認めら
れた。

【００２３】 ｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−Ｂａｍ（ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ９７０８２１１４
）。クローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍを、ＥｃｏＲＩ（ｐＢＲ３２２中）
で線状化し、ＡｆｌＩＩで部分消化した。ＡｆｌＩＩの６５℃で２０分の熱変性
後、フラグメントの末端をクレノウ酵素で満たした。次いで、ＤＮＡを、Ｐａｃ
Ｉ部位を含む平滑末端二本鎖オリゴリンカー（５‘−ＡＡＴＴＧＴＣＴＴＡＡＴ
ＴＡＡＣＣＧＣＴＴＡＡ−３’）にライゲートした。このリンカーを、以下の２
つのオリゴヌクレオチド：５‘−ＡＡＴＴＧＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＣ−３
’および５‘−ＡＡＴＴＧＣＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣ−３’のアニーリング
およびクレノウ酵素での平滑末端化によって作製した。ライゲートしたＤＮＡを
沈殿させて緩衝液を交換し、これを過剰なＰａｃＩ酵素で消化して、オリゴのコ
ンカテマーを取り除く。３５３４から２１５６６６ｂｐまでの配列およびベクタ
ー配列を含む２２０１６ｂｐの部分フラグメントを、ＬＭＰアガロース（Ｓｅａ
Ｐｌａｑｕｅ）で単離し、再ライゲートして、コンピテントＤＨ５αに形質転換
した。ＰａｃＩ部位を含み、巨大なアデノフラグメントを保持することが見出さ
れた１つのクローンを選択し、５‘末端を配列決定して、ＡｆｌＩＩ部位中のＰ
ａｃＩリンカーの正確な挿入を評価した。

【００２４】 ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｐａｃ＃２（ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ９７０８
２１２０）およびｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ＃８（ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ
９７０８２１２１）。クローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ中のＡｄ５のＩ
ＴＲ付近のＰａｃＩ部位の挿入を可能にするために、ｐＢＲ３２２バックボーン
中のＣｌａＩ部位とＩＴＲ配列の開始部位との間の約１９０ヌクレオチドを取り
除いた。これを、以下のように行った。ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲをＣｌ
ａＩで消化して、種々の時間（２、５、１０、および１５分間）ヌクレアーゼＢ
ａｌ３ｌで処理した。ヌクレオチドの除去後、同一の緩衝液および条件を用いて
、ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ（ＣｌａＩ部位でも消化されている）に対して個別に反
応を行った。Ｂａｌ３１酵素を、７５℃で１０分間のインキュベーションによっ
て不活化し、ＤＮＡを沈殿させ、より少量のＴＥ緩衝液中に再懸濁した。平滑末
端を確認するために、ＤＮＡを、過剰なｄＮＴＰの存在下でＴ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼでさらに処理した。ＳａｌＩでのｐＢＲ３２２ ＤＮＡ（コントロール）
の消化後、１０分間または１５分間処理したサンプルにおいて満足な分解（約１
５０ｂｐ）が認められた。１０分間または１５分間処理したｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａ
ｍ−ｒＩＴＲサンプルを、上記の平滑末端化ＰａｃＩリンカーにライゲートした
（ｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−Ｂａｍを参照のこと）。ライゲーション物を沈殿
によって精製し、過剰なＰａｃＩで消化し、ＬＭＰアガロースゲルでリンカーか
ら分離した。複製後、ＤＮＡを、コンピテントＤＨ５αに形質転換し、コロニー
を分析した。ほぼ所望の長さの欠失を示した１０個のクローン選択し、これらを
Ｔ−トラック配列決定（Ｔ７配列決定キット、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ）によってさらに分析した。ｒＩＴＲのすぐ下流に挿入されたＰａｃＩリン
カーを有するクローンを見出した。ＰａｃＩでの消化後、ＩＴＲに結合したクロ
ーン＃２は、２８ｂｐであり、クローン＃８は２７ｂｐである。

【００２５】 ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ９７０８２１１
６）。コスミドベクターｐＷＥ１５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、より大き
なＡｄ５インサートをクローニングした。第１に、固有のＰａｃＩ部位を含むリ
ンカーを、ｐＷＥ１５のＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ｐＷＥ１５．Ｐａｃを作製
した。このために、ｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−Ｂａｍにおいて記載した二本鎖
ＰａｃＩオリゴであるがさらにそのＥｃｏＲＩ突出末端を有するものを使用した
。次いで、以下のフラグメントを電気的溶出によってアガロースゲルから単離し
た：ＰａｃＩ消化ｐＷＥ１５．Ｐａｃ、ＰａｃＩおよびＢａｍＨＩ消化ｐＢｒ／
Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−Ｂａｍ、ならびにＢａｍＨＩおよびＰａｃＩ消化ｐＢｒ／Ａ
ｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ＃２。これらのフラグメントを共にライゲートし、λファ
ージパッケージング抽出（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、製造元のプロトコー
ルにしたがってパッケージングした。宿主細菌への感染後、プレート上でコロニ
ーを増殖させ、完全なインサートの存在について分析した。ｐＷＥ／Ａｄ．Ａｆ
ｌＩＩ−ｒＩＴＲは、３５３４（ＡｆｌＩＩ部位）から右側のＩＴＲ（ほとんど
の３‘Ｇ残基を欠く）を含む塩基までの全アデノウイルス５型配列を含む。

【００２６】 ｐＷＥ／Ａｄ．Δ５‘。構築物ｐＷＥ／Ａｄ．Δ５’は、２つのアデノウイル
スＩＴＲおよび３５１０と３５９３８ｂｐとの間の全アデノウイルス配列（すな
わち、Ｅ１およびパッケージングシグナル以外の完全なアデノウイルスゲノム）
を含む本発明の複製分子の例である。ｐＷＥ／Ａｄ．Δ５‘を、３つのフラグメ
ント由来のコスミドベクターバックグラウンドに作製した。第１に、Ａｄ由来の
５’ＩＴＲを、以下のプライマー： ＩＴＲ−ＥＰＨ：５‘−ＣＧＧ−ＡＡＴ−ＴＣＴ−ＴＡＡＴＴＡ−ＡＧＴ−ＴＡ
Ａ−ＣＡＴ−ＣＡＴ−ＣＡＡ−ＴＡＡ−ＴＡＴ−ＡＣＣ−３’および ＩＴＲ−ＰＩＸ：５‘−ＡＣＧ−ＧＣＧ−ＣＧＣ−ＣＴＴ−ＡＡＧ−ＣＣＡ−Ｃ
ＧＣ−ＣＣＡ−ＣＡＣ−ＡＴＴ−ＴＣＡ−ＧＴＡ−ＣＧＴ−ＡＣＴ−ＡＧＴ−Ｃ
ＴＡ−ＣＧＴ−ＣＡＣ−ＣＣＧ−ＣＣＣ−ＣＧＴ−ＴＣＣ−３’を用いて増幅し
た。得られたＰＣＲフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＡｓｃＩで消化し、同一
の酵素で消化したベクターｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ）にクローニングした。得られた構築物をｐＮＥＢ／ＩＴＲ−ｐＩＸと呼
ぶ。配列決定により、ＧｅｎＢａｎｋの予想配列（アクセッション番号Ｍ７３２
６０／Ｍ２９９７８）との１つのミスマッチ（すなわち、過剰なＧ残基がＡｆｌ
ＩＩ部位のすぐ上流に見出された）以外はｐＩＸプロモーター（３５１１〜３５
３８のＡｄ５配列）に連結した左側のＩＴＲ中のＡｄ５配列（１〜１０３のＡｄ
５配列）の正確な増幅が確認された。このＩＴＲ−ｐＩＸフラグメントを、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＡｆｌＩＩで単離し、Ａｄ５配列３５３９〜２１５６７を含むＥｃ
ｏＲＩ−ＡｆｌＩＩベクターにライゲートした。後者のフラグメントを、ｐＢｒ
／Ａｄ．Ｃｌａ−ＢａｍのＥｃｏＲＩでの消化およびＡｆｌＩＩでの部分消化に
よって得た。得られたクローンを、ｐＡｄ／ＬＩＴＲ（Δ５‘）−ＢａｍＨＩと
呼ぶ。最終的な構築物ｐＷＥ／Ａｄ．Δ５’を、ＰａｃＩで消化したコスミドベ
クターｐＷＥ１５．Ｐａｃ（前出）の、ＰａｃＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＡｄ
／ＬＩＴＲ（Δ５‘）−ＢａｍＨＩおよびＰａｃＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＢ
ｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ．ｐａｃ＃２（前出）へのライゲーションによって
作製した。

【００２７】 ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲΔＥ２Ａ。このコスミドは、Ｅ２Ａのコ
ード配列の欠失以外はｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ寄託番
号Ｐ９７０８２１１６）と本質的に同一である。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒ
ＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ９７０８２１１６）からのＥ２Ａコード配列の欠
失を、以下のように行った。左側および右側でＥ２Ａコード領域に隣接するアデ
ノウイルス配列を、製造元のプロトコールにしたがって、Ｅｘｐａｎｄ ＰＣＲ
システム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いたＰＣＲ反応においてプラスミドｐＢ
Ｒ／Ａｄ．Ｓａｌ．ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ９７０８２１１９）から増
幅した。以下のプライマーを使用した。 右隣接配列（Ａｄ５ヌクレオチド２４０３３〜２５１８０に対応する）： ΔＥ２Ａ．ＳｎａＢＩ：５‘−ＧＧＣ．ＧＴＡ．ＣＧＴ．ＡＧＣ．ＣＣＴ．ＧＴ
Ｃ．ＧＡＡ．ＡＧ−３’ ΔＥ２Ａ．ＤＢＰ−ｓｔａｒｔ：５‘−ＣＣＡ．ＡＴＧ．ＣＡＴ．ＴＣＧ．ＡＡ
Ｇ．ＴＡＣ．ＴＴＣ．ＣＴＴ．ＣＴＣ．ＣＴＡ．ＴＡＧ．ＧＣ−３’。 複製ＤＮＡフラグメントを、ＳｎａＢＩおよびＮｓｉＩ（ＮｓｉＩを、プライマ
ーΔＥ２Ａ．ＤＢＰ−ｓｔａｒｔ（下線）において産生した）で消化した。 左隣接配列（Ａｄ５ヌクレオチド２１５５７〜２２４４２に対応する）： ΔＥ２Ａ．ＤＢＰ−ｓｔｏｐ：５‘−ＣＣＡ．ＡＴＧ．ＣＡＴ．ＡＣＧ．ＧＣＧ
．ＣＡＧ．ＡＣＧ．Ｇ−３’ ΔＥ２Ａ．ＢａｍＨＩ：５‘−ＧＡＧ．ＧＴＧ．ＧＡＴ．ＣＣＣ．ＡＴＧ．ＧＡ
Ｃ．ＧＡＧ−３’。 複製ＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＮｓｉＩ（ＮｓｉＩを、プライマ
ーΔＥ２Ａ．ＤＢＰ−ｓｔｏｐ（下線）において産生した）で消化した。次いで
、消化したＤＮＡフラグメントを、ＳｎａＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＢｒ／Ａｄ．Ｓ
ａｌ−ｒＩＴＲにライゲートして、ｐＢＲ．Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲΔＥ２Ａを
得た。配列決定により、プラスミドｐＢＲ．Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲΔＥ２Ａ中
に固有のＮｓｉＩ部位を有するＤＢＰコード配列の正確な置換を確認した。

【００２８】 次に、コスミドｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲΔＥ２Ａを作製した。プ
ラスミドｐＢＲ．Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲΔＥ２Ａを、ＢａｍＨＩおよびＳｐｅ
Ｉで消化した。Ｅ２Ａコード領域が固有のＮｓｉＩ部位で置換された３．９Ｋｂ
のフラグメントを単離した。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲコスミドを、
ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで消化した。Ｅ２Ａコード配列を含むＢａｍＨＩ／Ｓ
ｐｅＩフラグメントが取り除かれた３５Ｋｂのフラグメントを単離した。フラグ
メントを、製造元のプロトコールにしたがってλファージを用いてライゲートお
よびパッケージングし、コスミドｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲΔＥ２Ａ
を得た。

【００２９】 ｐＶＡ。ｐＶＡ（３．７ｋｂ）は、アデノウイルス５型のＶＡＩおよびＶＡＩ
Ｉ領域（ヌクレオチド１０５５５〜１１０７５）を含むｐＵＣ１１９プラスミド
である。アデノウイルス５型のＶＡ遺伝子を、プライマー５‘−ＡＣＧＣＧＴＣ
ＧＡＣＣＴＣＴＧＧＣＣＧＧＴＣＡＧＧＣＧＣＧＣＧＣＡＡ−３’および５‘−
ＡＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＴＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＡＴＧＣ−３
’を用いて野生型アデノウイルス５型由来の単離ＤＮＡについてＰＣＲによって
クローン化した。製造元の説明書にしたがってｅｘｐａｎｄ ｌｏｎｇ Ｔｅｍ
ｐｌａｔｅ^ＴＭＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｎｇｅｒ）を用いてＰＣＲを行った。
プライマー中に存在する得られたフラグメントを、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで
消化して、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ消化ｐＵＣ１１９にライゲートした。

【００３０】 細胞培養。２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、１９７７ｂ）およびＨ
ｅＬａ細胞（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１２，２６４、１９５２）を、・１０％
熱変性ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂｒｅｄａ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中
、３７℃、１０％ＣＯ_２で培養した。ＰＥＲ．Ｃ６細胞の接着培養物を、１０％
ウシ胎児血清およびＭｇＣｌ_２（１０ｍＭ）を補充したＤＭＥＭ培地中、３７℃
、１０％ＣＯ_２で増殖させた。ＰＥＲ．Ｃ６細胞の懸濁培養物を、１×Ｌ−グル
タミン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ^ＴＭ５２５（以後Ｅｘ
−Ｃｅｌｌ^ＴＭと呼ぶ）中、３７℃、１０％ＣＯ_２で、６ウェル皿（Ｇｒｅｉｎ
ｅｒ、Ａｌｐｈｅｎ ａａｎ ｄｅ Ｒｉｊｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ
ｓ）での静置培養またはＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎ
ｇ）での１００ＲＰＭの震盪培養のいずれかによって培養した。

【００３１】 トランスフェクション。単層培養物のトランスフェクション。ＨｅＬａ細胞お
よび２９３細胞を、製造元の説明書にしたがってリン酸カルシウムトランスフェ
クション系（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｌｍｅｒｅ）を用いてト
ランスフェクトした。ＰＥＲ．Ｃ６細胞の単層を、製造元の説明書にしたがって
、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ^ＴＭ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂ
ｒｅｄａ）を用いてトランスフェクトした。

【００３２】 懸濁培養物のトランスフェクション。対数増殖期のＰＥＲ．Ｃ６細胞を、遠心
分離（３０００ｇ、保持時間５分間）で回収した。細胞を、２×１０^６細胞／ｍ
ｌの濃度でトランスフェクション混合物（下記）に再懸濁し、３７℃、１０％Ｃ
Ｏ_２で３時間インキュベートした。別記しない限り、トランスフェクションを、
連続的震盪（１００ＲＰＭ）で行った。ＤＭＲＩＥ−Ｃ^ＴＭ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｒｅｄａ）でのトランスフェクション用に、トランスフ
ェクション混合物を、製造元の説明書にしたがって。ＤＭＥＭ中に作製した。ト
ランスフェクション混合物中での３時間のインキュベーション後、細胞を遠心分
離（３０００ｇ、保持時間５分間）で回収し、新鮮なＥｘ−Ｃｅｌｌ^ＴＭ培地に
１０^６細胞／ｍｌの最終濃度に再懸濁した。ＦｕＧＥＮＥ^ＴＭ６（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）でのトランスフェクションを、製造元の説明書に
したがって、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ^ＴＭ培地中に作製したトランスフェクション混合物
を用いて行った。トランスフェクション混合物との３時間のインキュベーション
後、細胞を、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ^ＴＭ培地で１０^６細胞／ｍｌの最終濃度に希釈した
。トランスフェクション混合物を、ポリ（２−（ジメチルアミノ）エチル−１０
−４−アミノブチル）ホスファゼン（ＰＰＺ）を用いて以下のように作製した。
ＰＰＺのストック溶液（２．４ｍｇ／ｍｌ）を、Ｈｅｐｅｓ中への固体化合物の
溶解（５ｍＭ、ｐＨ＝７．３）によって作製した。ＰＰＺの化学式は、

【化１】 である。

【００３３】 トランスフェクション混合物を、５００μｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ^ＴＭ培地に表示
量のＰＰＺの添加によって作製した。この溶液を、表示量のＤＮＡを含む同体積
のＥｘ−Ｃｅｌｌ^ＴＭと混合した。混合物を、１時間インキュベートし、これを
使用して２×１０^６ＰＥＲ．Ｃ６細胞のペレットを再懸濁した。細胞を、トラン
スフェクション混合物と３時間インキュベートして、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ^ＴＭ培地で
１０^６細胞／ｍｌの最終濃度に希釈した。４８時間後にトランスフェクトされた
細胞を回収し、β−ガラクトシダーゼ活性について分析した。

【００３４】 β−ガラクトシダーゼ活性アッセイ。細胞を、２つの異なる方法でβ−ガラク
トシダーゼ活性について染色した。感染単位数の組織化学的分析および同定では
、以下の手順を使用した。細胞を、ＰＢＳ（ＮＰＢＩ、Ｅｍｍｅｒ−Ｃｏｍｐａ
ｓｃｕｕｍ）で２回洗浄し、０．２％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、Ｚｗｉ
ｊｎｄｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のＰＢＳ溶液で１０分間
固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｘ−Ｇａｌ溶液（０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）中、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、５ｍＭ Ｋ_２Ｆｅ（ＣＮ） _６ 、５ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）_６・３Ｈ_２Ｏおよび４０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌ
（５−ブロモー４−クロロ−３−インドリル−ｂ−ガラクトピラノシド、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈ
ｅｒｌａｎｄｓ））で染色した。３７℃で一晩の染色後、青色細胞を、光学顕微
鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＫ２−ＴＲ）で計数した。ＰＥＲ．Ｃ６の懸濁培養にお
けるβ−ガラクトシダーゼ活性の定量については、製造元のプロトコールにした
がって、ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒＴＭ ＬａｃＺ／Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓ
ｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、
Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用した。各サンプルのβ
−ガラクトシダーゼ活性を、１０μｌの細胞懸濁液におけるβ−ガラクトシダー
ゼ活性と、既知濃度の精製β−ガラクトシダーゼの連続希釈物との比較によって
評価した。

【００３５】 組換えＡＡＶ滴定。ＨｅＬａ細胞を、４×１０^４細胞／ｃｍ^２で播種した。培
地を、ｒＡＡＶおよびアデノウイルスｔｓ１４９（２０ｐｆｕ／細胞）の連続希
釈物を含む新鮮な培地と翌日に交換した。４時間後、培地を新鮮な培地と交換し
、細胞を３７℃、１０％ＣＯ_２で２４時間インキュベートし、その後β−ガラク
トシダーゼ染色を行った。組換えＡＡＶ株の力価を、青色細胞が得られた最も高
い希釈度由来の青色細胞数を計数し、この数に希釈係数を乗じることによって計
算した。

【００３６】 接着細胞に対する組換えＡＡＶ産生。細胞を、翌日に７０％の密集度に達する
ように播種した。次いで、細胞をｐＡＣＶ−βｇａｌおよびｐＩＭ４５（１：４
ｗ／ｗの比）でトランスフェクトし、アデノウイルスヘルパーウイルスｔｓ１４
９（ｍ．ｏ．ｉ．＝２０）、Ｅ１欠失アデノウイルスヘルパーウイルスＩＧ．Ａ
ｄ．ＭＬＰ．Ｌｕｃ（Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ｓｌ．、１９９６）で感染させる
か、アデノウイルスヘルパープラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。後者の
場合、アデノウイルスヘルパー遺伝子プラスミドの総数は、ｐＡＣＶ−βｇａｌ
とｐＩＭ４５ ＤＮＡとの総数の１．５倍（ｗ／ｗ）であった。１つを超えるア
デノウイルスヘルパーウイルスを使用した場合、等量（ｗ／ｗ）の異なるアデノ
ウイルスヘルパープラスミドを使用した。接着ＰＥＲ．Ｃ６ｔｓＥ２Ａ．ｃ５−
９に対する組換えＡＡＶ産生を、いくつかの修正以外はＰＥＲ．Ｃ６細胞株につ
いて記載のように行った。細胞株を、３９℃、１０％ＣＯ_２で増殖させた。トラ
ンスフェクション前に、３９℃、１０％ＣＯ_２で翌日に７０％の密集度となるよ
うに細胞を播種した。次いで、細胞を、３２℃、１０％ＣＯ_２で１日間培養した
。次いで、ＰＥＲ．Ｃ６株で記載のように、細胞を、３７℃、１０％ＣＯ_２でト
ランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に組換えＡＡＶを回
収した。培養培地から細胞を掻き取り、３回の凍結融解サイクルに供した。細胞
片を遠心分離した（２０００ＲＰＭ、保持時間１０分）。アデノウイルスｔｓ１
４９またはＥ１欠失アデノウイルスベクターを使用した場合、上清を、５６℃で
１時間熱変性させた。アデノウイルスＤＮＡフラグメントを使用してアデノウイ
ルス産生を補完する場合、上清を熱変性させなかった。全ての上清を濾過（０．
４５μＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）し、−２０℃で保存した。

【００３７】 実施例１。初期領域１および初期領域２Ａを欠失した組換えアデノウイルスベ
クター産生用の産生細胞株の作製。 本明細書中に、初期領域１（Ｅ１）および初期領域２Ａ（Ｅ２Ａ）を欠失した組
換えアデノウイルスベクター産生用の細胞株の作製を記載する。産生細胞株は、
それぞれＥ１およびＥ２Ａ遺伝子の構成性発現によるトランスでの組換えアデノ
ウイルスベクター由来のＥ１およびＥ２Ａ欠失を補完する。予め確立されたＡｄ
５−Ｅ１形質転換ヒト胚網膜芽細胞株ＰＥＲ．Ｃ６（ＷＯ ９７／００３２６）
およびＡｄ５形質転換ヒト胚腎細胞株２９３（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、１
９７７ｂ）に、Ｅ２Ａ発現カセットをさらに付与した。

【００３８】 アデノウイルスＥ２Ａ遺伝子は、一本鎖ＤＮＡと高親和性を有する７２ｋＤａ
ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードする。この特徴のために、ＤＢＰの
構成性発現は、細胞毒性を示す。ｔｓ１２５Ｅ２Ａ変異体は、アミノ酸４１３で
Ｐｒｏ→Ｓｅｒ置換するＤＢＰをコードする（Ｖｌｉｅｔ ｖａｎ ｄｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．、１９７５）。この変異により、ＤＢＰをコードするｔｓ１２５Ｅ２
Ａは、３２℃の許容温度で完全に活性であるが、３９℃の非許容温度ではｓｓＤ
ＮＡに結合しない。これにより、３９℃の非許容温度で機能的でなく且つ毒性を
示さないが、３２℃の許容温度への温度の変更後機能的になるＥ２Ａを構成性発
現する細胞株の作製が可能である。

【００３９】 Ａ．野生型Ｅ２Ａまたは温度感受性ｔｓ１２５Ｅ２Ａを発現するプラスミドの
作製。ｐｃＤＮＡ３ｗｔＥ２Ａ。完全な野生型初期領域２Ａ（Ｅ２Ａ）コード領
域を、供給元（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の標準的なプロトコ
ールにしたがって、Ｅｘｐａｎｄ^ＴＭＬｏｎｇ Ｔｅｍｐｌｅｔｅ ＰＣＲシス
テムを用い、プライマーＤＢＰｐｃｒ１およびＤＢＰｐｃｒ２を用いて、プラス
ミドｐＢＲ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ９７０８２１２２
）から複製した。ＰＣＲを、Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔｒｉｏ Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏ
ｃｋを用いて、以下のプログラムで行った：９４℃で２分間を１サイクル、９４
℃で１０秒間＋５１℃で３０秒間＋６８℃で２分間を１サイクル、９４℃で１０
秒間＋５８℃で３０秒間、６８℃で２分間を１０サイクル、９４℃で１０秒間＋
５８℃で３０秒間＋６８℃で２分間およびサイクルごとに１０秒間の伸長を２０
サイクル、６８℃で５分間を１サイクル。プライマーＤＢＰｐｃｒ１：ＣＧＧ
ＧＡＴ ＣＣＧ ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＡ ＧＴＣ ＧＧＧ ＡＡＧ
ＡＧＧ ＡＧ（５‘→３’）は、固有のＢａｍＨＩ制限部位（下線）、Ｋｏｚａ
ｋ配列（斜体）の５‘およびＥ２Ａコード配列の開始コドンを含む。プライマー
ＤＢＰｐｃｒ２：ＣＧＧ ＡＡＴ ＴＣＴ ＴＡＡ ＡＡＡ ＴＣＡ ＡＡＧ
ＧＧＧ ＴＴＣ ＴＧＣ ＣＧＣ（５’→３‘）は、固有のＥｃｏＲＩ制限部位
（下線）、Ｅ２Ａコード配列の終止コドンの３’を含む。太字は、Ｅ２Ａコード
領域由来の配列をいう。ＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化
し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクロ
ーン化し、ｐｃＤＮＡ３ｗｔＥ２Ａを得た。

【００４０】 ｐｃＤＮＡ３ｔｓＥ２Ａ。完全なｔｓ１２５Ｅ２Ａコード配列を、温度感受性
アデノウイルス変異体Ｈ５ｔｓ１２５（Ｅｎｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｇｉｎｓｂ
ｅｒｇ、１９７２、Ｖｌｉｅｔ ｖａｎ ｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９７５）か
ら単離したＤＮＡから増幅させた。ＰＣＲ増幅の手順は、ｗｔＥ２Ａの増幅の手
順と同一である。ＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、Ｂａ
ｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し
て、ｐｃＤＮＡ３ｔｓＥ２Ａを得た。ｗｔＥ２ＡおよびｔｓＥ２Ａのコード配列
を、配列決定によって確認した。

【００４１】 Ｂ．３２℃、３７℃、および３９℃で培養した組換えアデノウイルスベクター
産生用の産生細胞の増殖特性。 ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、１０％ＣＯ_２内、３２℃、３７℃、または３９℃のいず
れかの温度で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）および１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ_２が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣ
Ｏ ＢＲＬ）で培養した。０日目、全体で１×１０^６のＰＥＲ．Ｃ６細胞を２５
ｃｍ^２組織培養用フラスコ（Ｎｕｎｃ）に播種し、細胞を３２℃、３７℃、また
は３９℃のいずれかで培養した。１〜８日目に細胞を計数した。図３は３９℃に
おけるＰＥＲ．Ｃ６細胞培養の増殖率および最終細胞密度と３７℃の場合との比
較を示す。３２℃におけるＰＥＲ．Ｃ６培養の増殖率および最終密度は３７℃ま
たは３９℃のものと比較して僅かに減少した。顕著な細胞死は、いずれのインキ
ュベーション温度でも観察されなかった。したがって、ＰＥＲ．Ｃ６細胞は、ｔ
ｓ１２５Ｅ２Ａにとって許容温度である３２℃および非許容温度である３９℃の
両方でかなり良好に機能する。

【００４２】 Ｃ．Ｅ２Ａ発現ベクターによるＰＥＲ．Ｃ６および２９３のトランスフェクシ
ョン；コロニー形成および細胞株の産生 トランスフェクション前日に、２×１０^６ＰＥＲ．Ｃ６細胞を１０％ＦＢＳお
よび１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２が加えられたＤＭＥを含む６ｃｍ組織培養皿（Ｇｒｅ
ｉｎｅｒ）に播種し、１０％ＣＯ_２、３７℃でインキュベートした。翌日、３９
℃かつ１０％ＣＯ_２中で細胞に対してトランスフェクションを行うこと以外は供
給元（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）の標準プロトコールにもとづいて、Ｌｉｐｏｆｅｃ
ｔＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ（登録商標）試薬キットを用いて組織培養皿あたり３μ
ｇ、５μｇ、または８μｇのｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３ｗｔＥ２Ａまたはｐｃ
ＤＮＡｔｓＥ２ＡプラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクションさせた。トラ
ンスフェクション後、細胞をｔｓ１２５Ｅ２Ａの非許容温度である３９℃に一定
して保った。３日後、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および０．２５ｍ
ｇ／ｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）が加えられたＤＭＥに細胞を置き、ト
ランスフェクション１０日後に最初のＧ４１８耐性コロニーが出現した。表１に
示すように、ｐｃＤＮＡ３のトランスフェクション後に得られたコロニー全数（
〜２００コロニー）またはｐｃＤＮＡ３ｔｓＥ２Ａのトランスフェクション後に
得られたコロニー全数（〜１００コロニー）とｐｃＤＮＡ３ｗｔＥ２Ａのトラン
スフェクション後に得られたコロニー全数（たったの４コロニー）との間に著し
い差があった。これらの結果は、構成的に発現されたＥ２Ａの毒性がＥ２Ａ（ｔ
ｓ１２５Ｅ２Ａ）の温度感受性突然変異株を用い、かつ細胞を非許容温度である
３９℃で培養することによって克服することができることを示している。

【００４３】 各トランスフェクションから、いくつかのコロニーをピペットによって組織
培養皿から細胞をこすり取った。続いて、剥がされた細胞を２４ウェル組織培養
皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に入れ、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および０
．２５ｍｇ／ｌのＧ４１８が加えられたＤＭＥ中で、３９℃、１０％ＣＯ_２で培
養した。表１に示すように、ｐｃＤＮＡ３トランスフェクションコロニーの１０
０％（４／４）およびｐｃＤＮＡ３ｔｓＥ２Ａトランスフェクションコロニーの
８２％（３７／４５）が安定な細胞株を確立した（残りの８個のｐｃＤＮＡ３ｔ
ｓＥ２Ａトランスフェクションコロニーはゆっくりと増殖し、破棄された）。対
照的に、１個のｐｃＤＮＡ３ｗｔＥ２Ａトランスフェクションコロニーを確立す
ることができただけである。他の３つは採取直後に死滅した。

【００４４】 次に、異なる細胞株のＥ２Ａ発現レベルをウェスタンブロッティングによっ
て決定した。細胞株を６ウェル組織培養皿に播種し、準集密的な培養株をＰＢＳ
（ＮＰＢＩ）で２回洗浄して溶解し、ＲＩＰＡ（１％ＮＰ−４０、０．５％デオ
キシコール酸ナトリウム、および０．１％ＳＤＳを含むＰＢＳで、さらに１ｍＭ
フェニルメチルスルホニルフルオリドおよび０．１ｍｇ／ｍｌトリプシン阻害剤
を添加）にこすり取った。氷上で１５分間インキュベーションした後、ライセー
トを遠心によって取り除いた。タンパク質濃度は、供給元（ＢｉｏＲａｄ）の標
準プロトコールにもとづいてＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによって決定し
た。等量の全細胞抽出物を１０％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画化した
。タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移
し、αＤＢＰモノクローナル抗体Ｂ６（Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９８３
）とインキュベートした。２次抗体は西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マ
ウス抗体（ＢｉｏＲａｄ）であった。ウェスタンブロッティング法および抗体の
インキュベーションは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅによって提供されたプロトコールに
もとづいて実施した。抗体複合体は、製造元（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のプロトコー
ルにもとづいてＥＣＬ検出システムによって可視化した。図３は、ｐｃＤＮＡ３
ｔｓＥ２Ａトランスフェクション由来の細胞株全てが７２ｋＤａのＥＺＡタンパ
ク質を発現することを示す（上段のパネル、レーン４〜１４； 中段のパネル、
レーン１〜１３； 下段のパネル、レーン１〜１２）。対照的に、ｐｃＤＮＡ３
ｗｔＥ２Ａトランスフェクション由来の細胞株のみがＥ２Ａタンパク質を発現す
ることができなかった（レーン２）。ｐｃＤＮＡ３トランスフェクション由来の
細胞株からの抽出物ではＥ２Ａタンパク質が検出されず（レーン１）、負の対照
として用いられる。ＰＥＲ．Ｃ６細胞の抽出物はｐｃＤＮＡ３ｗｔＥ２Ａによっ
て過渡的にトランスフェクションされ（レーン３）、ウェスタンブロット法の正
の対照として用いられた。これらのデータは、ｗｔＥ２Ａの構成的発現が細胞に
とって毒性を有し、またこの毒性がＥ２Ａのｔｓ１２５突然変異株を用いること
によって回避することができることを確証している。

【００４５】 ＰＥＲ．Ｃ６細胞とは対照的に、３９℃で２９３細胞を培養することは問題
がある。したがって、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３ｗｔＥ２Ａ、またはｐｃＤＮ
Ａ３ｔｓＥ２Ａのいずれかによる２９３細胞のトランスフェクションを、ＤＢＰ
をコードするｔｓ１２５Ｅ２Ａの半許容温度である３７℃でＣＯ_２下で行った。
トランスフェクション前日、２９３細胞を、１０％ＦＢＳおよび１０ｍＭ Ｍｇ
ｃｌ２を補充した６ｃｍ組織培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ）あたり３．６×１０^５細
胞の密度で播種した。トランスフェクション開始５時間前、細胞に新鮮な培地を
与えた。細胞は、供給元（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）の標準的なプロトコールにもと
づいてリン酸カルシウムトランスフェクションシステムによってｐｃＤＮＡ３、
ｐｃＤＮＡ３ｗｔＥ２Ａ、またはｐｃＤＮＡ３ｔｓＥ２ＡプラスミドＤＮＡのい
ずれかの７．２μｇによってトランスフェクションした。トランスフェクション
の２日後、細胞を選択培地、すなわち、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、
および０．２５ｍｇ／ｌのＧ４１８が加えられたＤＭＥＭに置いた。トランスフ
ェクション１２日後に最初のコロニーが出現した。表２に示すように、ｐｃＤＮ
Ａ３のトランスフェクション後に得られたコロニー全数（〜１００コロニー）お
よびｐｃＤＮＡ３ｔｓＥ２Ａのトランスフェクション後に得られたコロニー全数
（〜２５コロニー）は、ｐｃＤＮＡ３ｗｔＥ２Ａのトランスフェクション後に得
られたコロニー全数（たったの２コロニー）よりも著しく多かった。これらの結
果は、構成的に発現されたＥＳＡが細胞にとって毒性を有し、またこの毒性がｔ
ｓ１２５Ｅ２Ａの使用によって回避することができることを再び示している。さ
らに、このことはＰＥＲ．Ｃ６細胞に特有なものではないことを示すが、一般に
真核細胞（例えば、２９３細胞）に適用されることを示している。

【００４６】 Ｄ．ｔｓ１２５Ｅ２Ａを構成的に発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞によるＡｄ５．ｄ
ｌ８０２におけるＥ２Ａ欠失の補完 アデノウイルスＡｄ５．ｄｌ８０２は、Ｅ２Ａコード領域の主要部分が欠失し
たＡｄ５由来ベクターであり、機能的ＤＢＰを産生しない（Ｒｉｃｅ ａｎｄ
Ｋｌｅｓｓｉｎｇ， １９８５）。Ａｄ５．ｄｌ８０２は、ｔｓ１２５Ｅ２Ａを
構成的に発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞のＥ２Ａトランス補完活性を試験するために
用いられた。親ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはＰＥＲ．Ｃ６ｔｓＥ２Ａクローン３−９
を、１０％ＦＢＳおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２が加えられたＤＭＥ中で、３９℃
、１０％ＣＯ_２で２５ｃｍ^２フラスコ内で培養し、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）５
でＡｄ５．ｄｌ８０２による感染または膜擬感染のいずれかを行った。続いて、
感染細胞を３２℃で培養し、細胞を、細胞の形態およびフラスコからの細胞の剥
離における変化を決定することで細胞変性効果（ＣＰＥ）の発現によってスクリ
ーニングした。表３は、２日以内にＰＥＲ．Ｃ６ｔｓＥ２Ａクローン３−９が感
染したＡｄ５．ｄｌ８０２において完全なＣＰＥ発現が行われたことを示してい
る。これらのデータは、ｔｓ１２５Ｅ２Ａを構成的に発現しているＰＥＲ．Ｃ６
細胞が許容温度３２℃でＡｄ５．ｄｌ８０２ベクターのＥ２Ａ欠失に対してトラ
ンスで補完することを示す。

【００４７】 Ｅ．ＰＥＲ．Ｃ６ｔｓＥ２Ａ細胞株の無血清懸濁培養。 ヒト遺伝子治療のために組換えアデノウイルスベクターを大規模で産生するこ
とは、任意のヒトまたは動物構成物質を欠いている培地で、産生細胞株、好まし
くは懸濁培養のアッセイおよびスケールアップ可能な培養方法を必要とする。そ
の目的のために、いくつかのＰＥＲ．Ｃ６ｔｓＥ２Ａクローンを懸濁培養した。
例えば、細胞株ＰＥＲ．Ｃ６ｔｓＥ２Ａｃ５−９（ｃ５〜９と表す）を３９℃、
１０％ＣＯ_２で１０％ＦＢＳおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２が加えられたＤＭＥを
含む１７５ｃｍ^２フラスコ（Ｎｕｎｃ）で培養した。準集密性（７０〜８０％集
密）で、細胞をＰＢＳ（ＮＰＢＩ）で洗浄し、培地を１×Ｌ−グルタミン（ＧＩ
ＢＣＯ ＢＲＬ）が加えられた２５ｍｌの無血清懸濁培地Ｅｘ−ｃｅｌｌ（登録
商標）５２５（ＪＲＨ）（以下Ｅｘ−ｃｅｌｌ（登録商標）と示す）と置き換え
た。２日後、細胞を軽く叩くことでフラスコから剥離し、該細胞を５分間、１０
００ｒｐｍで遠心した。細胞ペレットを、５ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）
に再懸濁し、０．５ｍｌ細胞懸濁液を１２ｍｌの新鮮なＥｘ−ｃｅｌｌ（登録商
標）とともに、８０ｃｍ^２組織培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）に移した。２日後、細
胞を収集し（全ての細胞が懸濁状態にある）、Ｂｕｒｋｅｒ細胞計数器で計数し
た。次に、２０ｍｌＥｘ−ｃｅｌｌ（登録商標）の全容量において１ｍｌあたり
３×１０^５細胞密度で、細胞を１２５ｍｌ組織培養エルレンマイヤー（Ｃｏｒｎ
ｉｎｇ）に播種した。細胞を、３９℃、１０％ＣＯ_２下、オービタルシェーカー
（ＧＦＬ）で１２５ｒｐｍでさらに培養した。１〜６日目に細胞をＢｕｒｋｅｒ
細胞計数器で計数した。図４では、８つの培養から得た平均増殖曲線を示す。Ｐ
ＥＲ．Ｃ６ｔｓＥ２Ａｃ５−９は、無血清懸濁培養で良好に機能する。培養５日
以内で１ｍｌあたり約２×１０^６細胞の最大細胞密度が達成された。

【００４８】 実施例２。組換えＡＡＶの産生細胞としてのＰＥＲ細胞。 ＰＥＲ細胞はヒト網膜細胞由来である。網膜はＡＡＶ複製を持続させる能力が
あることで知られている。したがって、本発明者らはＰＥＲ細胞細胞が組換えＡ
ＡＶ産生を許すかどうかを確かめる。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（登録商標）
を用いてＰＥＲ．Ｃ６細胞をパッケージングプラスミドｐＩＭ４５、ｒＡＡＶ−
ベクターｐＡＣＶ−βｇａｌ（比１０：１ｗ／ｗ）でトランスフェクションし、
アデノウイルスｔｓ１４９を感染させた。組換えＡＡＶを二日後に単離し、アデ
ノウイルス感染ＨｅＬａ細胞で滴定した。ＰＥＲ．Ｃ６細胞で産生されたｐＡＣ
Ｖ−βｇａｌは、１ｍｌあたり２×１０^７感染単位（ＩＵ）または細胞あたり２
０ＩＵの力価を有した。このシステムで得られた細胞あたりのウイルスの収量は
、パッケージングプラスミドｐＩＭ４５による２９３細胞株で報告されたもの（
Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７）に匹敵するか、もしくはそれより
も良好である。同時に、発現されたＥ１タンパク質のパターンおよびレベルがｒ
ＡＡＶ産生にとって十分なものであるかどうかについて分析した。この問題に取
り組むために、ＰＥＲ．Ｃ６細胞をパッケージングプラスミドｐＩＭ４５、ｒＡ
ＡＶ−ベクターｐＡＣＶ−βｇａｌ（比１０：１ｗ／ｗ）でトランスフェクショ
ンし、Ｅ１欠失アデノウイルスベクターＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．Ｌｕｃ（Ｖｉｎｃ
ｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６）を感染させた。Ｅ１欠失アデノウイルスベ
クターＩＧ．Ａｄ．ＭＬＰ．Ｌｕｃを用いたｒＡＶＶの収量は、２×１０^７ＡＩ
Ｕ／ｍｌであり、アデノウイルスｔｓ１４９と同様であった。この結果は、ＰＥ
Ｒ．Ｃ６におけるＥ１発現のパターンおよびレベルともに十分なｒＡＡＶ産生を
可能とするものであることを示している。

【００４９】 ＰＥＲ．Ｃ６上での組換えＡＡＶによるウイルスベクター非存在下での産生。
ウイルスよりもむしろヘルパーとしてアデノウイルスＤＮＡを用いた組換えＡＡ
Ｖの産生が報告されている（ＷＯ ９６／４０２４０、ＷＯ ９７／１７４５８
、（Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａ
ｌ．， １９９６； ｌａｓｅｒ ｉｒｉｄｏｔｏｍｙ ｅｔ ａｌ．， １９
９７； Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８ａ））。この研究は２９３細胞株
のみで行われた。本発明者らは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞株が組換えＡＡＶを産生する
ために使用することができるかどうかについての判断も望んだ。この目的のため
に、本発明者らはＥ１領域以外の全てのアデノウイルス遺伝子を含む２つの構築
物ｐＷＥ／Ａｄ．Ｄ５‘およびｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲを試験した
。既に述べたように、構築物ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲはＥ１領域以
外の全てのアデノウイルス遺伝子を含むが、タンパク質ＩＸ遺伝子のプロモータ
ーに欠失がある。一方、ｐＷＥ／Ａｄ．Ｄ５’は左側ＩＴＲおよび完全長のタン
パク質ＩＸプロモーターを含む。組換えＡＡＶは両方のアデノウイルスＤＮＡフ
ラグメントで産生することができた。組換えＡＡＶの収量は両構築物で異なった
。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲを用いた組換えＡＡＶの収量は、ｐＷＥ
／Ａｄ．Ｄ５‘を用いたものよりも著しく高かった（表４）。収量における違い
についての１つの理由は、２つの異なるプラスミド由来の関連タンパク質の発現
で違いがあるためである。他の理由は、アデノウイルス５タンパク質ＩＸの発現
が組換えＡＡＶ産生に対してネガティブに影響することである。

【００５０】 ＰＥＲ．Ｃ６の組換えＡＡＶ産生のための最小必要条件。 ＰＥＲ．Ｃ６細胞上の組換えＡＡＶ産生のための最小必要条件を決定するため
に、ＡＡＶ産生に悪影響を及ぼすことが知られているアデノウイルス遺伝子のプ
ラスミドクローンを得た（すなわち、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、およびＶＡ）。し
たがって、ＡＡＶ産生に影響を与えることが公知の全てのアデノウイルス遺伝子
は、ＰＥＲ．Ｃ６に既に存在しているＥ１領域とともにすぐに利用できるので、
ＰＥＲ．Ｃ６上での組換えＡＡＶ産生に対するそれらの影響について試験した。
ＨｅＬａ細胞とは対照的に、ＰＥＲ．Ｃ６細胞はｐＩＭ４５およびｐＡＣＶ−β
ｇａｌによってトランスフェクションした場合に少量ではあるが検出可能な量の
組換えＡＡＶを産生した。組換えＡＡＶの効率的な産生は、別のヘルパー機能コ
ード遺伝子のトランスフェクションを要求した。３つの発現カセット全てまたは
ｐＥ２およびｐＶＡのトランスフェクションによって、組換えＡＡＶが最も多く
得られた（表４）。ｐＥ２ａ単独またはｐＥ４ｏｒｆ６と一緒のトランスフェク
ションでは、組換えＡＡＶの収量は±１０％であった。Ｅ４のみ、またはＶＡの
みのトランスフェクションでは有意な量のＡＡＶを産生することはなかった（表
４）。特別のアデノウイルスヘルパー遺伝子が加えられていないＰＥＲ．Ｃ６ｔ
ｓＥ２Ａでの産生によって、１．３×１０^３の力価が得られた。ｐＥｏｒｆ６お
よびｐＶＡのみ、またはｐＥ２Ａとの組み合わせを加えることで、組換えＡＡＶ
の収量が増加した。最も高い収量は、構築物ｐＷＥ／Ａｄ．ａｆｌＩＩ−ｒＩＴ
Ｒを用いて得られた。

【００５１】 組換えＡＡＶの大量産生 哺乳類細胞を大量に増殖させるためにいくつかのシステムが考え出された。そ
れらは、限定されるものではないが、回転ボトル培養、セルキューブおよびバイ
オリアクターを含む。それらのシステムの各々は、利点と欠点とを有している。
細胞が懸濁状態で増殖するバイオリアクターは、標準化およびよりいっそう大量
に規模を拡大することが最も容易である。しかし、１つの欠点は懸濁状態の細胞
が容易にトランスフェクションされないということである。多種多様な異なる細
胞の最適な増殖を支持するために、多くの異なる細胞培養培地が開発されている
。これらの培地のほとんどがダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に変更を
加えたものに基づいており、ウシ血清が補充されている。本発明者らは所定の無
血清培地を用いて懸濁培養にＰＥＲ．Ｃ６細胞を適合させた。無血清培養は、品
質にばらつきがあり、かつ外来の作用因子が含まれる天然由来の血清に依存しな
いので完全に明確にすることができるという利点を有する。無血清培地は、血清
中の細胞増殖用必須成分の代用となる添加物が含まれる。本発明者らは、細胞が
無血清Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）培地で培養される場合よりも細胞がＤＭＥＭ
で培養される場合のほうが多くのトランスフェクション試薬、特にリポゾームが
よりいっそう良好に機能することを観察した（不図示）。しかし、懸濁状態で増
殖するＰＥＲ．Ｃ６細胞のトランスフェクションは非リポゾーム試薬ＦｕＧＥＮ
Ｅ（登録商標）６を用いることによって、またはリポゾーム：ＤＮＡ複合体（Ｄ
ＭＲＩＥ−Ｃ）とＥｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）媒体との接触によって達成するこ
とができる（表５）。別のトランスフェクション試薬は、ポリ（オルガノ）ホス
ファゼンである。これらの試薬によって細胞がトランスフェクションされる能力
については、たいして知られていない。懸濁状態のＰＥＲ細胞のトランスフェク
ションに対する上記試薬の使用について調べるために、本発明者らは一定量のＤ
ＮＡとともに増量の化合物ポリ（２−（ジメチルアミノ）エチル）−１０−４−
アミノブチル）ホスファゼン（ＰＰＺ）によるトランスフェクションを実施した
。培地を希釈する前に、細胞を３時間にわたってトランスフェクション混合物に
晒した。Ｘ−Ｇａｌ染色およびフルオロメトリー分析で測定されるような懸濁細
胞のトランスフェクションは、添加したＰＰＺの量に依存し（表６および表７）
、３２０μｇＰＰＺ（表６）および１６０μｇＰＰＺ（表７）で５％Ｘ−Ｇａｌ
陽性細胞に達した。トランスフェクション混合物中のＰＰＺがよりいっそう多い
ことは、細胞が大量に失われることに関係した。

【００５２】 次に、本発明者らは組換えＤＮＡの大量生産に対するＰＥＲ細胞の潜在能力を
評価した。大量生産潜在能を最初に癒着性ＰＥＲ．Ｃ６細胞について評価した。
１０枚の１７０ｃｍ^２（Ｇｒｅｉｎｅｒ）皿に対して、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ
に１皿あたり２×１０^７のＰＥＲ．Ｃ６を播種した。細胞をｐＡＣＶ−βｇａｌ
、ｐＩＭ４５、およびｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ（それぞれ２：８：
３０μｇ）でトランスフェクションした。以下のプロトコールを用いてウイルス
を４８時間後に収集した。培地を細胞から除去し、細胞をこすり取って回収し４
ｍｌ／皿の新鮮なＤＭＥＭに入れた。細胞懸濁液を２回凍結融解し、続いて３７
℃、３０分間にわたってＤＮａｓｅＩ（１００μｇ／ｍｌ）とともにインキュベ
ートした。懸濁液をさらに２回凍結融解サイクルに供し、その後に細胞の破片を
遠心（３，０００ｒｐｍ、１０分間）で取り除いた。上澄みを１３．３ｍｌの飽
和（ＮＨ_４）２ＳＯ_４とともにインキュベートした（４℃、１０分間）。ＳＷ２
７．１ローターを用いて１０，０００ｒｐｍ（４℃、１５分間）で遠心すること
によって沈殿物を取り除いた。飽和（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４をさらに２６．６ｍｌ加
えて上清をインキュベートし、さらに４℃で２０分間インキュベートした。ウイ
ルスはＳＷ２７．１ローターを用いて１２，０００ｒｐｍ（４℃、３０分間）で
遠心することによってペレットにした。ペレットを５ｍｌのＰＢＳ（ＮＰＢＩ）
に再懸濁し、２本の管（Ｑｕｉｃｋ−Ｓｅａｌ Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ ｔｕ
ｂｅ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｍｉｊｄｒｅｃｈｔ，
Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に等しく分けた。ウイルス懸濁液を等量のＯ
ｐｔｉＰｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ Ａｓ， Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒ
ｗａｙ）によってアンダーレイした。密閉した管を８０度の角度で回転させた（
２０分間、１０ｒｐｍ）。ウイルスは、Ｖｔｉ８０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて密度勾配遠心（３時間、７１，０００ｒｐｍ
）で分離した。分画を回収（１分画あたり２００μｌ）、組換えＡＡＶの存在に
ついて滴定した。陽性の分画をプール（±４００〜６００μｌ）し、１５ｍｌＰ
ＢＳ（ＮＰＢＩ）で希釈し、続いてセントリプラス１００（Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕ
ｓ １００）およびセントリコン１００（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １００）（Ａｍ
ｉｃｏｎ， Ｃａｐｅｌｌｅ Ａ／Ｄ Ｉｊｓｓｅｌ）でそれぞれ濃縮した。濃
縮した分画を滴定したところ、１ｍｌあたり８．５×１０^９感染単位の力価を有
することがわかった。

【００５３】

【表１】

【００５４】

【表２】

【００５５】

【表３】

【００５６】

【表４】

【００５７】

【表５】

【００５８】

【表６】

【００５９】

【表７】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｗｔＡＡＶの構造およびゲノムの構成を示す図である。

【図２】ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、２５ｃｍ^３の組織培養フラスコあたり１×１０^６ 細胞の密度で播種し、３２℃、３７℃、または３９℃のいずれかで培養した。表
示の時点で、細胞をＢｕｒｋｅｒ細胞計数器で計数した。ＰＥＲ．Ｃ６は、３２
℃、３７℃、および３９℃のいずれでも良好に増殖する。

【図３】ｐｃＤＮＡ３（上段のパネル、レーン１）、ｐｃＤＮＡ３ｗｔＥ２Ａ（
上段のパネル、レーン２）、ｐｃＤＮＡ３ｔｓＥ２Ａ（上段のパネル、レーン４
〜１４、中段のパネル、レーン１〜１３、および下段のパネル、レーン１〜１２
）のいずれかでトランスフェクトしたＰＥＲ．Ｃ６、またはｐｃＤＮＡ３ｔｓＥ
２Ａ（上段のパネル、レーン３）で一時的にトランスフェクトしたＰＥＲ．Ｃ６
細胞から作製した細胞株由来の３５ｍｇの全細胞抽出物を用いたウェスタンブロ
ットを示す図である。ブロットを、Ｅ２Ａ遺伝子産物に特異的な抗体（Ｂ６ ａ
ＤＢＰ）で探索し、ＥＣＬ検出系を用いて視覚化した。全てのＰＥＲ．Ｃ６ｔｓ
Ｅ２Ａ細胞株は、ｔｓＥ２Ａコード温度感受性ＤＢＰタンパク質を発現する。

【図４】ｔｓＥ２Ａ発現細胞株ＰＥＲ．Ｃ６ｔｓＥ２Ａ．ｃ５−９を、無血清Ｅ
ｘ−ｃｅｌｌ^ＴＭの懸濁液中で培養した。表示の時点で、細胞をＢｕｒｋｅｒ細
胞計数器で計数した。８つの独立した培養物の結果を示す。ＰＥＲ．Ｃ６ｔｓＥ
２Ａは、無血清Ｅｘ−ｃｅｌｌ^ＴＭ培地の懸濁液中で十分に増殖する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 7/00 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 7/00 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:93） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA04 DA02 EA02 EA06 GA13 GA18 HA12 HA17 4B065 AA93X AA95Y AB01 AC20 BA02 BA25 BB32 BD01 BD14 CA44

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 関連するヘルパーウイルスを産生しないで組換えアデノ関連ウイ
   ルス（ＡＡＶ）の産生が可能なＡＡＶヘルパー機能を提供する少なくとも１つの
   遺伝子産物をコードする核酸が付与された、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）パッ
   ケージング細胞。
2. 【請求項２】 前記核酸がアデノウイルス遺伝子産物をコードする、請求項１に
   記載の細胞。
3. 【請求項３】 前記遺伝子産物がアデノウイルスＥ１またはその機能的フラグメ
   ントを含む、請求項２に記載の細胞。
4. 【請求項４】 前記遺伝子産物がアデノウイルスＥ２Ａまたはその機能的フラグ
   メントを含み、前記Ｅ２Ａがアデノウイルスｔｓ１２５由来であることが好まし
   い、請求項２に記載の細胞。
5. 【請求項５】 さらに必要なヘルパー機能をコードする少なくとも１つのさらな
   る核酸がさらに付与された、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の細胞。
6. 【請求項６】 前記遺伝子産物がアデノウイルスＥ１またはその機能的フラグメ
   ントをコードし、少なくとも１つの前記さらなる核酸がアデノウイルスＥ２Ａま
   たはその機能的フラグメントをコードし、前記Ｅ２Ａはアデノウイルスｔｓ１２
   ５由来であることが好ましい、請求項５に記載の細胞。
7. 【請求項７】 アデノウイルスＥ４ｏｒｆ６またはその機能的フラグメントをコ
   ードする核酸をさらに含む、請求項６に記載の細胞。
8. 【請求項８】 ヒト胚網膜芽細胞由来である、請求項１〜請求項７のいずれか１
   項に記載の細胞。
9. 【請求項９】 Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
   ｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＡＭＲ）でアクセッション番号９６０２２９４０
   ＥＣＡＣＣで寄託されているＰＥＲ．Ｃ６細胞またはそれに由来する細胞を含む
   、請求項８に記載の細胞。
10. 【請求項１０】 コスミドｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ（ＣＡＭＲのＥ
    ＣＡＣＣ寄託番号ｐ９７０８２１１６）を含む、請求項１〜請求項９のいずれか
    １項に記載の細胞。
11. 【請求項１１】 コスミドｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲΔＥ２Ａを含む
    、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の細胞。
12. 【請求項１２】 プラスミドｐｃＤＮＡ３ｗｔＥ２Ａを含む、請求項１〜請求項
    １１のいずれか１項に記載の細胞。
13. 【請求項１３】 請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の細胞を含む、細
    胞培養法。
14. 【請求項１４】 任意のヒトまたは動物成分を欠く培地を含む、請求項１３に記
    載の細胞培養法。
15. 【請求項１５】 懸濁細胞培養または他の大量培養を含む、請求項１３または請
    求項１４に記載の細胞培養法。
16. 【請求項１６】 、請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の細胞または請
    求項１３〜請求項１５のいずれか１項に記載の細胞培地法を使用して組換えアデ
    ノ関連ウイルスを産生する方法。