JP7118349B2 - c-MET阻害剤の結晶形、及びその塩形、並びに調製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、粉末X線回折スペクトルが以下の2θ角:4.54°±0.2°、13.70°±0.2°、17.84±0.2°、21.24°±0.2°及び26.62±0.2°において特徴的な回折ピークを有する式(I)で表される化合物のA結晶形を提供する。
本発明に記載の式(I)で表される化合物の塩形及び結晶形の製造工程が簡単で、かつ、前記結晶形は比較的に安定し、高温高湿度に耐え、製剤化に便利である。
別途に説明しない限り、本明細書で用いられる以下の用語及び連語は以下の意味を含む。一つの特定の連語又は用語は、特別に定義されない場合、不確定又は不明瞭ではなく、普通の定義として理解されるべきである。本明細書で商品名が出た場合、相応の商品又はその活性成分を指す。
(R)-CBS:(3aR)-1-メチル-3,3-ジフェニル-3a,4,5,6-テトラヒドロピロロ[1,2-c][1,3,2]オキサゾボラン、
DIEA:N,N-ジイソプロピルエチルアミン、
DMF:N,N-ジメチルホルムアミド、
THF:テトラヒドロフラン、
Pd(dppf)Cl2:1,1´-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II)ジクロリド、
Pd(PPh3)2Cl2:ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ジクロリド。
計器の型番:ブルカーD8advanceX線回折計
測定方法:約10~20mgの試料をXRPDの検出に用いる。
詳細なXRPDパラメーターは下記の通りである。
X線管:Cu、kα、(λ=1.54056Å)
管電圧:40kV、管電流:40mA
発散スリット:0.60mm
センサスリット:10.50mm
散乱防止スリット:7.10mm
走査範囲:3又は4~40deg
ステップ角:0.02deg
ステップ幅:0.12秒
試料パン回転速度:15rpm
計器の型番:TADSCQ2000示差走査熱量計
測定方法:試料(0.5~1mg)をDSCアルミニウム製坩堝に量り取り測定を行い、50mL/minのN2条件で、10℃/minの昇温速度で、試料を室温(25℃)から300℃又は350℃まで加熱する。
計器の型番:TAQ5000熱重量分析計
測定方法:試料(2~5mg)をTGA白金坩堝に量り取り測定を行い、25mL/minのN2条件で、10℃/minの昇温速度で、試料を室温(25℃)から300℃、350℃又は重量が20%減少するまで加熱する。
計器の型番:DVSAdvantage-1(SMS)
測定条件:約10~15mgの試料を測定に使用する。
平衡化dm/dt:0.01%/min:(時間:10min~最長180min)
乾燥:0%RHで、120min
RH(%)勾配の測定:10%
RH(%)勾配の測定範囲:0%~90%~0%
計器の型番:Agilent1200高速液体クロマトグラフ
-30℃の窒素ガスの保護下で、攪拌しながら化合物1-A(4Kg、25.19mol)のジクロロメタン(20L)溶液にジイソプロピルエチルアミン(2.9Kg、22.67mol)及びメタンスルホニルクロリド(2.2Kg、19.51mol)を滴下した。滴下完了後、-10℃下で1時間攪拌した。LCMSにより反応が完了したことを検出した。反応液を飽和塩化アンモニウム溶液(12L×2)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、中間体1-Bを得、精製せず、直接的に次のステップで使用した。LCMS(ESI)m/z:316.0[M+Na]+。
窒素ガスの保護下で、中間体1-B(5.45Kg、18.58mol)及び2-クロロピリミジン-5-オール(2.42Kg、18.56mol)のDMF(25L)溶液に、炭酸カリウム(1.54Kg、11.15mol)を添加した。反応液を90℃下で16時間反応させ、LCMSにより反応が完了したことを検出した。反応液を水(75L)に注ぎ、16時間攪拌した後濾過し、ケーキを水(20L)に入れ、16時間攪拌し、濾過し、ケーキを乾燥させて中間体1-Cを得た。LCMS(ESI)m/z:328.1[M+H]+;1HNMR(400MHz、CDCl3)δppm1.21~1.36(m、2H)1.44~1.49(m、9H)1.81(brd、J=12.10Hz、2H)1.91~2.08(m、1H)2.75(brt、J=11.98Hz、2H)3.90(d、J=6.24Hz、2H)4.01~4.37(m、2H)8.28(s、2H)。
-30℃、窒素ガスの保護下で、(R)-CBS(12.5L、1mol/L)及びボランジメチルスルフィド(5L、10mol/L)の混合溶液の中に、化合物1-D(5Kg、25.19mol)のテトラヒドロフラン(5L)溶液を添加した。反応液を-30℃下で1時間反応させ、LCMSにより反応が完了したことを検出した。反応液にメタノール(10L)を滴下して反応をクエンチングさせた後、減圧濃縮し、残留物に酢酸エチル(2L)及びn-ヘキサン(20)を添加して溶解させた後、塩酸(10L、2mol/L)を添加して1時間攪拌し、濾過し、濾液を塩酸(12L×3、2mol/L)及び飽和食塩水(15L)で洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して中間体1-Eを得た。1HNMR(400MHz、DMSO-d6)δppm1.31(d、J=6.53Hz、3H)、4.61~4.84(m、1H)、5.30(d、J=4.39Hz、1H)、7.25~7.31(m、1H)、7.31~7.37(m、1H)、7.41(brd、J=7.65Hz、1H)、7.53(s、1H)。
窒素ガスの保護下で、中間体1-E(1.2Kg、5.97mol)のトルエン(30L)溶液に、順次に3-フルオロ-1-ヒドロ-ピリジン-2-オン(723.39g、6.4mol)、トリブチルホスフィン(1.39Kg、6.88mol)及びアゾジカルボニルジピペリジン(1.74Kg、6.89mol)を添加した。反応液を90℃に昇温させ、2時間反応させ、LCMSにより反応が完了したことを検出した。反応液を室温に冷却させた後遠心分離し、濾液を塩酸(9L×2、4mol/L)で洗浄した後減圧濃縮し、残留物にメチルtert-ブチルエーテル(12L)を添加して溶解させた後、塩酸(9L×3、4mol/L)及び飽和食塩水(9L×2)でそれぞれ洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後減圧濃縮し、残留物にn-ヘキサン(10L)を添加して16時間攪拌した後濾過し、ケーキを乾燥させ、中間体1-Fを得た。LCMS(ESI)m/z:297.9[M+H]+;1HNMR(400MHz、DMSO-d6)δppm1.74(d、J=7.09Hz、3H)、6.10(td、J=7.24、4.58Hz、1H)、6.46(q、J=7.01Hz、1H)、6.95(dt、J=7.09、1.53Hz、1H)、7.08(ddd、J=9.20、7.43、1.71Hz、1H)、7.22~7.32(m、2H)、7.43~7.53(m、2H)。
窒素ガスの保護下で、中間体1-F(2kg、6.75mol)、ビス(ピナコラト)ジボロン(1.89kg、7.43mol)、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ジクロリド(48.51g、67.54mmol)及び酢酸カリウム(1.34kg、13.51mol)の1,4-ジオキサン(20L)溶液を90℃に昇温させて2時間反応させ、LCMSにより反応が完了したことを検出した。化合物1-Gの反応液を精製せず、直接的に次のステップで使用した。
窒素ガスの保護下で、化合物1-Gの反応液に、順次に中間体1-C(2.44kg、7.43mol)、炭酸ナトリウム(1.43kg、13.51mol)、Pd(dppf)Cl2(299.60g、405.22mmol)及び水(4L)を添加し、反応液を100℃に昇温させ、16時間反応させた。LCMSにより反応が完了したことを検出した。反応液を80℃に冷却した後濾過し、攪拌しながら濾液に水(12L)を滴下し、16時間攪拌した後、濾過し、ケーキを水で洗浄し、乾燥させた後、メチルtert-ブチルエーテル(35L)及びアセトン(1L)を添加し、16時間攪拌し、濾過し、ケーキを収集して乾燥させ、中間体1-Hを得た。LCMS(ESI)m/z:531.1[M+Na]+;1HNMR(400MHz、DMSO-d6)δppm1.10~1.26(m、2H)1.40(s、9H)1.77(brd、J=7.15Hz、5H)1.97(brd、J=3.64Hz、1H)2.63~2.90(m、2H)3.88~4.03(m、2H)4.06(d、J=6.40Hz、2H)、6.17~6.36(m、2H)、7.31~7.63(m、4H)、8.17~8.30(m、2H)、8.64(s、2H)。
30℃、窒素ガスの保護下で、中間体1-H(2.63kg、5.17mol)のDMF(27L)溶液に1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルイミダゾリン-2,4-ジオン(1kg、3.5mol)を添加し、反応液を30℃で1時間反応させ、LCMSにより反応が完了したことを検出した。反応液に水(16.2L)を滴下した後16時間攪拌し、濾過し、ケーキを水で洗浄した後乾燥させ、ケーキをアセトン(17.6L)の中に入れ、加熱して還流し、1時間撹拌した後、水(12L)を滴下して16時間撹拌し、濾過し、ケーキを乾燥させ、中間体1-Iを得た。LCMS(ESI)m/z:611.1[M+Na]+;1HNMR(400MHz、DMSO-d6)δppm1.10~1.27(m、2H)、1.40(s、9H)、1.71~1.87(m、5H)、1.93~2.06(m、1H)、2.67~2.85(m、2H)、3.99(brd、J=11.67Hz、2H)、4.07(brd、J=6.27Hz、2H)、6.23(q、J=6.86Hz、1H)、7.42~7.57(m、2H)、7.71(dd、J=9.29、1.76Hz、1H)、7.85(s、1H)、8.18~8.30(m、2H)、8.65(s、2H)。
窒素ガスの保護下で、中間体1-I(2.1kg、3.58mol)、ビス(ピナコラト)ジボロン(1.82kg、7.17mol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(127.09g、110mmol)及び酢酸カリウム(719.68g、7.16mol)の1,2-ジメトキシエタン(21L)の溶液を85℃に昇温させて2時間反応させ、LCMSにより反応が完了したことを検出した。化合物1-Kの反応液を精製せず、直接的に次のステップで使用した。
窒素ガスの保護下で、化合物1-Jの反応液に順次に2-ブロモピリジン-4-カルボニトリル(707g、3.86mol)、炭酸ナトリウム(741g、6.99mol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(163g、141mmol)及び水(4.2L)を添加し、反応液を85℃に昇温させ、16時間反応させた。LCMSにより反応が完了したことを検出した。反応液を50℃に冷却させた後反応液に水(12.6L)を滴下し、16時間攪拌し、濾過し、ケーキを乾燥させた後イソプロパノール:水=30:1の混合溶媒を添加して3回スラリー化し、固体を収集して乾燥させ、中間体1-Kを得た。LCMS(ESI)m/z:633.2[M+Na]+;1HNMR(400MHz、DMSO-d6)δppm1.09~1.26(m、2H)、1.40(s、9H)、1.76(brd、J=11.17Hz、2H)、1.91(d、J=7.15Hz、3H)、1.93~2.05(m、1H)、2.57~2.92(m、2H)3.98(brd、J=10.92Hz、2H)、4.05(d、J=6.40Hz、2H)、6.35(q、J=7.03Hz、1H)、7.47~7.56(m、2H)、7.73(dd、J=5.02、1.00Hz、1H)、8.19(dd、J=11.29、2.13Hz、1H)、8.22~8.27(m、1H)、8.30(s、1H)、8.40(s、1H)、8.48(s、1H)、8.64(s、2H)、8.79(d、J=5.02Hz、1H)。
窒素ガスの保護下で、中間体1-K(2.4kg、3.93mol)をバッチにメタンスルホン酸(758.66g、7.89mol)のメタノール(7.2L)溶液に添加し、反応液を50℃に昇温させ、2時間攪拌し、LCMSにより中間体1-Kの消耗が完了した後ことを検出した後、順次に反応液にメタノール(16.8L)、酢酸ナトリウム(645.54g、7.87mol)、ホルムアルデヒド(639.63g、7.88mol、37%の水溶液)及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(1.25kg、5.91mol)を添加し、反応溶液を16時間撹拌反応させ、LCMSにより反応が完了したことを検出した。反応液を濾過し、濾液に順次にアンモニア水(3L)及び水(4.5L)を滴下し、6時間攪拌し、濾過し、ケーキを水で洗浄した後乾燥させた。固体をテトラヒドロフラン(13L)に入れ、50℃に昇温させて溶解させ、チオ尿素樹脂(650g)を添加して2時間撹拌した後、濾過し、濾液にチオ尿素樹脂(650g)を添加し、50℃で2時間撹拌した後濾過し、濾液にチオ尿素樹脂(650g)を添加し、50℃で16時間撹拌した後濾過し、更に濾液に活性炭素粉末(150g)を添加し66℃に昇温させ、2時間攪拌した。濾過し、濾液を減圧濃縮し、残留物に酢酸エチル(16.8L)を添加し、全部溶解するまで還流温度下で攪拌し、熱いうちに濾過し、濾液をゆっくりと20℃に冷却させた後濾過し、ケーキを収集して乾燥させ、式(I)の化合物を得た。LCMS(ESI)m/z:525.2[M+H]+;1HNMR(400MHz、CD3OD)δppm8.72(d、J=5.01Hz、1H)、8.52(s、2H)、8.38(s、1H)、8.24~8.33(m、2H)、8.06~8.15(m、2H)、7.46~7.57(m、3H)、6.49(q、J=7.17Hz、1H)、4.03(d、J=5.75Hz、2H)、2.95(brd、J=11.74Hz、2H)、2.31(s、3H)、2.04~2.14(m、2H)、1.96(d、J=7.09Hz、3H)、1.80~1.92(m、3H)、1.40~1.58(m、2H)。
式(I)の化合物(850g)を酢酸エチル(6.8L)に添加し、還流温度まで昇温させ、2時間攪拌した後、反応液をゆっくりと35℃に冷却させて16時間攪拌し、濾過し、ケーキを収集して乾燥させ、式(I)の化合物のA結晶形を得た。1HNMR(400MHz、DMSO-d6)δppm1.23~1.40(m、2H)、1.65~1.78(m、3H)、1.79~1.89(m、2H)、1.91(d、J=7.21Hz、3H)、2.15(s、3H)、2.78(brd、J=11.25Hz、2H)、4.03(d、J=5.99Hz、2H)、6.35(d、J=7.09Hz、1H)、7.46~7.58(m、2H)、7.73(dd、J=5.01、1.22Hz、1H)、8.18(dd、J=11.31、2.14Hz、1H)、8.21~8.27(m、1H)、8.30(s、1H)、8.40(d、J=1.34Hz、1H)、8.48(s、1H)、8.63(s、2H)、8.79(d、J=5.01Hz、1H)。
式(I)の化合物のA結晶形を約10mg秤量し、安定性試験条件下に置き、それぞれ10日目、1ヶ月目と2ヶ月目でサンプリングして分析し、実験結果は表6に示したとおりであった。
式(II)の化合物のB結晶形を約10mg秤量し、安定性試験条件下に置き、それぞれ5日間、10日間と1ヶ月目でサンプリングして分析し、実験結果は表7に示した通りであった。
式(III)の化合物のC結晶形を約10mg秤量し、安定性試験条件下に置き、それぞれ5日間、10日間と1ヶ月目でサンプリングして分析し、実験結果は表8に示した通りであった。
3本の乾いた栓付きのガラス計量ボトル(外径は50mmであり、高さは30mmである)を下部に飽和塩化アンモニウム溶液を置いた乾燥機に入れ、計量ボトルは開口して置き、乾燥機の蓋を覆い、乾燥機を25℃のサーモスタットに入れ、一晩放置した。
重量増加の百分率=100%×(m3-m2)/(m2-m1)
式(I)の化合物のA結晶形10mgを秤量してガラス瓶入れ、溶媒1mLを添加し、25℃±2℃で5分ごとに30秒間激しく振とうし、30分以内の溶解を観察した。対応するデータを表に記録した。
試薬と消耗品
c-MET(InvItrogenPV3143)
Tracer236(LotNumber:10815978)
Eu-AntI-HIsAB(MAbAntI6HIS-K)
PerkInElmer社のEnvIson 665nm及び615nmで検出
384ウェルプレート_検出プレート(PerkInElmer#6007299)
本実験はLantha Screen TMEuキナーゼ結合実験(Lantha Screen TMEu KInase BIndIng Assay)を利用し、図1に示すように、Eu標識抗体を添加することによりAlexaFluorコンジュゲート又はキナーゼ「トレーサー」の結合を検出した。トレーサーと抗体をキナーゼと組み合わせると、高度なFRETが得られるが、トレーサーの代わりにキナーゼ阻害剤化合物を使用すると、FRETの損失を引き起こした。
1)抗体Eu-Anti-HisAB、酵素c-MET、トレーサーTracer236を希釈した。
2)化合物の調製:10mMの試験化合物と参照化合物を100%のDMSOで0.667mMに希釈し、全自動マイクロプレート前処理システムECHOを使用して、8個濃度勾配で3倍に希釈し、同じ条件で2つのウェルを調製し、ウェルあたり75nLであった。
3)化合物プレートに7.5μL抗体(1/375nM)とキナーゼ(10nM)の混合物を添加し、更に7.5uLのTracer(60nM)を添加した。反応の最終の濃度:c-MET:5nM、Tracer236:30nM、Eu-Anti-HisAB(MAbAnti6HIS-K):1/750nM。
4)4℃で60分間インキュベートした後、マルチラベルマイクロプレート検出器EnvisIonによってデータを読み取った(665nm/615nmの信号値はPrism5でデータを分析し;Ex励起光:Lasermirror446、Em放射光:615and665nMである)。
本実験は、AKTを過剰発現する前立腺癌細胞LNCaPに対する式(I)の化合物の阻害効果を研究することを目的としている。
1.細胞の培養:DMEM培地、ウシ胎児血清、DPBS
2.細胞株:MHCC97-H
3.検出試薬:生細胞検出キットCellTIter-Glo
4.その他の主な消耗品と試薬:化合物希釈プレート、ミドルプレート、検出プレート、DMSO
1.細胞プレートの製造
MHCC97-H細胞を、各ウェルに500個の細胞が含まれるように384ウェルプレートに接種した。細胞プレートを二酸化炭素インキュベーターで一晩培養した。
Echoで9個の化合物濃度で4倍に希釈し、同じ条件で2つのウェルを設置した。
化合物を細胞プレートに移し、化合物の初期濃度は10μMであった。細胞プレートを二酸化炭素インキュベーターに入れ、3日間培養した。
Promega Cell Titer-Glo試薬を細胞プレートに添加し、室温で10分間インキュベートして発光信号を安定させた。Perkin Elmer EnvisIonマルチマーカーアナライザーでデータを読み取った。
細胞の培養
MHCC97H細胞を体外で単層培養し、培養条件はRPMI1640培地に10%の熱不活化ウシ胎児血清、1%のペニシリン-ストレプトマイシン二重抗体を添加し、37℃の5%のCO2で培養した。週2回でトリプシン-EDTAを使用して従来の消化処理して継代した。細胞が指数増殖期にあるとき、細胞を収集し、数を数え、播種した。
BALB/cヌードマウス、オス。6~8週齢、体重は18~22gであった。
5×106個のMHCC97H細胞を含む0.2mlの細胞懸濁液を各マウスの右背部に皮下接種した。平均腫瘍体積が約172mm3に達した場合、グループ投与を開始した。
実験指標は、腫瘍の成長が阻害されるか、遅延又は治癒されるかを調査するものである。
Claims (11)
- 粉末X線回折スペクトルが以下の2θ角:4.54°±0.2°、13.70°±0.2°、15.14±0.2°、17.84±0.2°、18.40°±0.2°、21.24°±0.2°、24.06°±0.2°、26.62±0.2°及び27.44±0.2°において特徴的な回折ピークを有し、
及び/又は示差走査熱量曲線は171.90℃±3℃において一つの吸熱ピークの開始点を有し、
及び/又は熱重量分析曲線は223.23℃±3℃の際に重量が0.1870%減少し、305.06℃±3℃の際に重量が10.22%減少する、請求項1に記載のA結晶形を有する結晶。 - 粉末X線回折スペクトルが以下の2θ角:4.538°、9.021°、11.300°、13.699°、15.141°、16.640°、17.840°、18.399°、19.039°、19.620°、20.441°、21.241°、22.598°、24.060°、24.962°、25.660°、26.621°、27.440°、28.258°、29.159°、31.081°、32.465°、34.780°、35.400°、36.920°及び38.760°において特徴的な回折ピークを有する、請求項1又は2に記載のA結晶形を有する結晶。
- 粉末X線回折スペクトルは以下の2θ角:4.34°±0.2°、6.50°±0.2°、8.65°±0.2°、10.82°±0.2°、12.99°±0.2°、15.35°±0.2°、17.96°±0.2°及び25.50°±0.2°において特徴的な回折ピークを有し、
及び/又は示差走査熱量曲線は43.98℃±3℃及び219.64℃±3℃において吸熱ピークの開始点を有し、
及び/又は熱重量分析曲線は73.64℃±3℃の際に重量が0.5270%減少し、230.90℃±3℃の際に重量が1.542%減少する、請求項5に記載のB結晶形を有する結晶。 - 粉末X線回折スペクトルは以下の2θ角:4.335°、6.502°、8.645°、10.816°、12.986°、15.349°、15.782°、16.109°、17.955°、18.447°、19.057°、19.534°、19.816°、20.531°、21.16°、22.265°、22.752°、23.907°、24.407°、25.499°、26.248°、26.886°、27.725°、28.004°、28.653°、29.127°、29.779°、30.432°、31.064°、33.734°及び37.02°において特徴的な回折ピークを有する、請求項5又は6に記載のB結晶形を有する結晶。
- 粉末X線回折スペクトルは以下の2θ角:6.94°±0.2°、9.94°±0.2°、17.29°±0.2°、18.04°±0.2°、19.08°±0.2°、21.05°±0.2°、24.12°±0.2°及び24.73°±0.2°において特徴的な回折ピークを有し、
及び/又は示差走査熱量曲線は198.16℃±3℃において一つの吸熱ピークの開始点を有し、
及び/又は熱重量分析曲線は204.73℃±3℃の際に重量が0.4541%減少する、請求項8に記載のC結晶形を有する結晶。 - 粉末X線回折スペクトルは以下の2θ角:6.94°、9.94°、13.36°、15.271°、16.83°、17.286°、18.038°、18.767°、19.082°、20.605°、21.054°、21.884°、22.615°、23.228°、24.118°、24.728°、25.182°、25.813°、28.182°、30.757°、31.498°、33.318°、33.77°及び34.595°において特徴的な回折ピークを有する、請求項8又は9に記載のC結晶形を有する結晶。
- 癌を治療する医薬の製造における請求項1~3のいずれか一項に記載のA結晶形を有する結晶、又は請求項4に記載の化合物、又は請求項5~7のいずれか一項に記載のB結晶形を有する結晶、又は請求項8~10のいずれか一項に記載のC結晶形を有する結晶の使用。
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