JP7094881B2 - 大腸癌発症可能性の判定方法 - Google Patents
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Description
本願は、2016年7月8日に出願されたPCT/JP2016/70330および2017年1月19日に日本に出願された特願2017-007725号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
[1]ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
ヒト潰瘍性大腸炎患者から採取された生体試料から回収されたDNA中の、表1~4に記載のメチル化可変領域番号1~112で表される各メチル化可変領域中に存在する1個以上のCpGサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
を有し、
前記メチル化可変領域の平均メチル化率が、当該メチル化可変領域中のCpGサイトのうち、前記測定工程においてメチル化率が測定された全てのCpGサイトのメチル化率の平均値であり、
前記基準値が、各メチル化可変領域の平均メチル化率に対してそれぞれ設定された、発癌潰瘍性大腸炎患者と非癌潰瘍性大腸炎患者を識別するための値であり、
前記多変量判別式が、前記メチル化可変領域番号1~112で表されるメチル化可変領域のうちの1か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、
大腸癌発症可能性の判定方法。
[3] 前記測定工程において、前記多変量判別式がその平均メチル化率を変数として含むメチル化可変領域中に存在する1個以上のCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[1]の大腸癌発症可能性の判定方法。
[4] 前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号1~112で表されるメチル化可変領域から選択される2か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記[3]の大腸癌発症可能性の判定方法。
[5] 前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号1~112で表されるメチル化可変領域から選択される3か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記[3]の大腸癌発症可能性の判定方法。
[6] 前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号1~58で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される1か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記[3]の大腸癌発症可能性の判定方法。
[7] 前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号1~11で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される1か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記[3]の大腸癌発症可能性の判定方法。
ヒト潰瘍性大腸炎患者から採取された生体試料から回収されたDNA中の、配列番号1~80で表される塩基配列中のCpGサイトからなる群より選択される1か所以上のCpGサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
を有し、
前記基準値が、各CpGサイトのメチル化率に対してそれぞれ設定された、発癌潰瘍性大腸炎患者と非癌潰瘍性大腸炎患者を識別するための値であり、
前記多変量判別式が、前記配列番号1~80で表される塩基配列中のCpGサイトのうち少なくとも1か所のCpGサイトのメチル化率を変数として含む、
大腸癌発症可能性の判定方法。
[9]前記測定工程において、2~10個のCpGサイトのメチル化率を測定する、前記[8]の大腸癌発症可能性の判定方法。
[10] 前記判定工程において、配列番号1、2、11、12、14~18、21~24、26、27、29、31、45、64、65、67、77、79、及び80で表される塩基配列中のCpGサイトのうち1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号3~10、13、19、20、25、28、30、32~44、46~63、66、68~76、及び78で表される塩基配列中のCpGサイトのうち1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]又は[9]の大腸癌発症可能性の判定方法。
[11] 前記測定工程において、配列番号1~32で表される塩基配列中のCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号1、2、11、12、14~18、21~24、26、27、29、及び31で表される塩基配列中のCpGサイトのうち1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号3~10、13、19、20、25、28、30、及び32で表される塩基配列中のCpGサイトのうち1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
[12] 前記判定工程において、配列番号1、2、11、12、14~18、21~24、26、27、29、及び31で表される塩基配列中のCpGサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるCpGサイトの数と、配列番号3~10、13、19、20、25、28、30、及び32で表される塩基配列中のCpGサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるCpGサイトの数との和が3以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[11]のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
[13] 前記測定工程において、配列番号1~16で表される塩基配列中のCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号1、2、11、12、14~16で表される塩基配列中のCpGサイトのうち1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号3~10、13で表される塩基配列中のCpGサイトのうち1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
[14] 前記判定工程において、配列番号1、2、11、12、14~16で表される塩基配列中のCpGサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるCpGサイトの数と、配列番号3~10、13で表される塩基配列中のCpGサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるCpGサイトの数との和が3以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]及び[13]のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
[15] 前記測定工程において、配列番号1~9で表される塩基配列中のCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号1及び2で表される塩基配列中のCpGサイトのうち1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号3~9で表される塩基配列中のCpGサイトのうち1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
[16] 前記判定工程において、配列番号1及び2で表される塩基配列中のCpGサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるCpGサイトの数と、配列番号3~9で表される塩基配列中のCpGサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるCpGサイトの数との和が3以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]及び[15]のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
[17] 前記測定工程において、配列番号33~66で表される塩基配列中のCpGサイトからなる群より選択される1か所以上のCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号45、64、及び65で表される塩基配列中のCpGサイトのうち1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号33~44、46~63、及び66で表される塩基配列中のCpGサイトのうち1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
[18] 前記判定工程において、配列番号45、64、及び65で表される塩基配列中のCpGサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるCpGサイトの数と、配列番号33~44、46~63、及び66で表される塩基配列中のCpGサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるCpGサイトの数との和が2以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]及び[17]のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
[19] 前記測定工程において、配列番号33、35、36、43、67~80で表される塩基配列中のCpGサイトからなる群より選択される1か所以上のCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号67、77、79、及び80で表される塩基配列中のCpGサイトのうち1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号33、35、36、43、68~76、及び78で表される塩基配列中のCpGサイトのうち1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
[20] 前記判定工程において、配列番号67、77、79、及び80で表される塩基配列中のCpGサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるCpGサイトの数と、配列番号33、35、36、43、68~76、及び78で表される塩基配列中のCpGサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるCpGサイトの数との和が2以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]及び[19]のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
[21] 前記和が5以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[12]、[14]、[16]、[18]、又は[20]の大腸癌発症可能性の判定方法。
[22] 前記多変量判別式が、配列番号33~66で表される塩基配列中のCpGサイトからなる群より選択される1か所以上のCpGサイトのメチル化率を変数として含み、 前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]又は[9]の大腸癌発症可能性の判定方法。
[23] 前記多変量判別式が、配列番号33、35、36、43、67~80で表される塩基配列中のCpGサイトからなる群より選択される1か所以上のCpGサイトのメチル化率を変数として含み、
前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]又は[9]の大腸癌発症可能性の判定方法。
[24] 前記多変量判別式が、ロジスティック回帰式、線形判別式、ナイーブベイズ分類器で作成された式、又はサポートベクターマシンで作成された式である、前記[1]~[23]のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
[25] 前記生体試料が、腸管組織である、前記[1]~[24]のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
[26] 前記生体試料が、直腸粘膜組織である、前記[1]~[25]のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
採取具と、採取補助具とを備え、
前記採取具は、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第1の挟持面が形成されている板状の第1の挟持片と、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第2の挟持面が形成されている板状の第2の挟持片と、
前記第1の挟持片と前記第2の挟持片を、互いに対向した状態で、前記第1の挟持面及び前記第2の挟持面が形成されていない端部において連結する連結部と、
を有し、
前記第1の挟持面及び前記第2の挟持面の少なくとも一方がカップ形状であり、
前記採取補助具は、
側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
前記スリットの幅が、前記第1の挟持片の一方の端部と前記第2の挟持片の一方の端部の幅よりも広く、
前記採取具導入部の大きい方の外径が30~70mmであり、回転軸方向の長さが50~150mmである、大腸粘膜採取用キットによって採取されたものである、前記[26]の大腸癌発症可能性の判定方法。
[28] 前記採取具が、
前記第1の挟持片の中心部よりも前記第1の挟持面が形成されている端部側に、第1の屈曲部を有し、
前記第2の挟持片の中心部よりも前記第2の挟持面が形成されている端部側に、第2の屈曲部を有する、前記[27]の大腸癌発症可能性の判定方法。
[29] 採取具と、採取補助具とを備える大腸粘膜採取用キットであり、
前記採取具は、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第1の挟持面が形成されている板状の第1の挟持片と、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第2の挟持面が形成されている板状の第2の挟持片と、
前記第1の挟持片と前記第2の挟持片を、互いに対向した状態で、前記第1の挟持面及び前記第2の挟持面が形成されていない端部において連結する連結部と、
を有し、
前記第1の挟持面及び前記第2の挟持面の少なくとも一方がカップ形状であり、
前記採取補助具は、
側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
前記スリットの幅が、前記第1の挟持片の一方の端部と前記第2の挟持片の一方の端部の幅よりも広く、
前記採取具導入部の大きい方の外径が30~70mmであり、回転軸方向の長さが50~150mmである、大腸粘膜採取用キット。
[30] 前記採取具が、
前記第1の挟持片の中心部よりも前記第1の挟持面が形成されている端部側に、第1の屈曲部を有し、
前記第2の挟持片の中心部よりも前記第2の挟持面が形成されている端部側に、第2の屈曲部を有する、前記[29]の大腸粘膜採取用キット。
[31] 前記第1の挟持面と前記第2の挟持面の両方がカップ形状である、前記[29]又は[30]の大腸粘膜採取用キット。
[32] 前記採取補助具が、回転軸方向に貫通孔を有し、前記採取具導入部の大きい方の外径が30~70mm、回転軸方向の長さが50~150mmであり、
前記カップ形状の辺縁部の内径が2~3mmである、前記[29]~[31]のいずれかの大腸粘膜採取用キット。
[33] 前記第1の挟持面と前記第2の挟持面の辺縁部が鋸歯状である、前記[29]~[32]のいずれかの大腸粘膜採取用キット。
[34] 配列番号1~80で表される塩基配列中のCpGサイトからなる群より選択される1か所以上のCpGサイトを含む部分塩基配列を有するDNA断片からなり、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定するために用いられる、DNAメチル化率分析用マーカー。
ゲノムDNA中のCpGサイトのシトシン塩基は、5位の炭素がメチル化修飾を受け得る。本発明及び本願明細書において、CpGサイトのメチル化率とは、一の生物個体から採取された生体試料中のCpGサイトのうち、メチル化されているシトシン塩基(メチル化シトシン)量とメチル化されていないシトシン塩基(非メチル化シトシン)量とを測定し、両者の和に対するメチル化シトシン量の割合(%)を意味する。また、本発明及び本願明細書において、DMRの平均メチル化率とは、DMRに存在する複数のCpGサイトのメチル化率の相加平均値(算術平均値)又は相乗平均値(幾何平均値)を意味するが、これ以外の平均値でもよい。
本発明に係る大腸粘膜採取用キットは、直腸粘膜を挟んで採取するための採取具と、肛門を拡張し、当該採取具を肛門から大腸粘膜表面へ到達させるための採取補助具とを備える。以下、図1~5を参照しながら、本発明に係る大腸粘膜採取用キットについて説明する。
潰瘍性大腸炎患者のうち、内視鏡検査での生検組織による病理診断により大腸癌と診断され、外科手術を施行した患者(UC癌患者)8名(男性7名、女性1名)と、内科的治療不応潰瘍性大腸炎患者であり、癌以外で外科手術を施行した患者(非癌UC患者)8名(男性7名、女性1名)とから採取された大腸粘膜中のDNAに対して、CpGサイトのメチル化率を網羅的に解析した。なお、UC癌患者8名の平均年齢は47.1±12.4歳であり、罹病期間の平均は11.4±7.3年であった。非癌UC患者8名の平均年齢は44.3±16.4歳であり、罹病期間の平均は6.5±5.2年であった。
(1)生検及びDNA抽出
同一患者の大腸3か所から粘膜組織を採取し、常法に従いホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルを作製した。採取部位は、UC癌患者は盲腸、直腸、及び癌部とし、非癌UC患者は盲腸、横行結腸、直腸とした。FFPEサンプルから切片を切り出し、QIAmp DNA FFPE tissue kit(Qiagen社製)を使用してDNAを抽出した。
得られたDNAの濃度は次のようにして求めた。すなわち、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(Life Technologies社製)を用いて各サンプルの蛍光強度を測定し、キット付属のλ-DNAの検量線を用いて濃度を算出した。
次に、各サンプルをTE(pH8.0)にて1ng/μLに希釈し、Illumina FFPE QC Kit(Illumina社製)及びFast SYBR Green Master Mix(Life Technologies社製)を用いてリアルタイムPCRを行い、Ct値を求めた。サンプルとポジティブコントロールとのCt値の差(以下、ΔCt値)をサンプルごとに算出し、品質を評価した。ΔCt値が5未満のサンプルは品質良好と判断し、以降のステップに進めた。
EZ DNA Methylation Kit(ZYMO RESEARCH社製)を使用して、DNAサンプルに対してバイサルファイト処理を実施した。
バイサルファイト処理後のDNAに対して、Infinium HD FFPE Restore Kit(Illumina社製)を使用し、分解DNAを修復した。修復されたDNAをアルカリ変性した後、中和させ、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit(Illumina社製)の全ゲノム増幅用の酵素とプライマーを添加し、37℃のIncubation Oven(Illumina社製)で20時間以上、等温で反応させることによって、全ゲノムを増幅させた。
全ゲノム増幅したDNAに、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit(Illumina社製)の断片化用の酵素を添加し、Microsample Incubator(SciGene)で37℃、1時間反応させた。断片化したDNAに、共沈剤と2-プロパノールを加えて遠心分離処理し、DNAを沈澱させた。
沈澱させたDNAに、Hybridization bufferを加え、48℃のHybridization Oven(Illumina社製)で1時間反応させ、DNAを溶解させた。溶解させたDNAを95℃のMicrosample Incubator(SciGene社製)で20分間インキュベートして1本鎖に変性させた後、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit(Illumina社製)のBeadChip上に分注した。48℃のHybridization Ovenで16時間以上反応させ、BeadChip上のプローブと1本鎖DNAをハイブリダイズした。
ハイブリダイゼーション後のBeadChip上のプローブを伸長反応させ、蛍光色素を結合させた。次いで、当該BeadChipをiSCANシステム(Illumina社製)でスキャンし、メチル化蛍光強度及び非メチル化蛍光強度を測定した。実験終了時に、スキャンデータが全て揃っていること、及びスキャンが正常に行われたことを確認した。
DNAメチル化解析ソフトウェアGenomeStudio(Version:V2011.1)を用いてスキャンデータを解析した。DNAメチル化レベル(β値)は、次の式により算出した。
[メチル化蛍光強度]÷ ([メチル化蛍光強度]+[非メチル化蛍光強度]+100)
Normalization: 有り(Controls)
Subtract Background: 有り
Content Descriptor: HumanMethylation450_15017482_v.1.2.bpm
Normalization: 有り(Controls)
Subtract Background: 有り
Content Descriptor: HumanMethylation450_15017482_v.1.2.bpm
Ref Group: 比較解析4. Group-3
Error Model: Illumina custom
Compute False Discovery Rate: 無し
DNAメチル化レベルの定量及び比較解析の結果を用いて、統計解析ソフトウェアR(Version: 3.0.1、64bit、Windows(登録商標))を用いて、DiffScoreの算出、クラスター解析及び主成分分析を実施した。
> data.dist<-as.dist(1-cor(data.frame,use="pairwise.complete.obs",method="p"))> hclust(data.dist,method="complete")
# data.frame: CpG(行)x サンプル(列)から成るデータフレーム
# 1-ピアソン相関係数を距離として定義し、complete linkage法により実施
> prcomp(t(data.frame),scale=T)
# data.frame: CpG(行)x サンプル(列)から成るデータフレーム
(1)CpGバイオマーカー候補の抽出
網羅的DNAメチル化解析データからGpGバイオマーカー候補を選定する手段として、DiffScore及びΔβ値に基づいた絞り込みが報告されている(BMC Med genomics vol.4, p.50, 2011; Sex Dev vol.5, p.70, 2011)。前者はDiffScoreの絶対値が30超、及びΔβ値の絶対値が0.2超に設定し、後者はDiffScoreの絶対値が30超、及びΔβ値の絶対値が0.3超に設定して、バイオマーカー候補を抽出している。これらの方法に準じて、BeadChipに搭載されている485,577個のCpGサイトからバイオマーカー候補を抽出した。
次に、この72,905個のCpGサイトの中から、Δβ値の絶対値が0.3超である32個のCpGサイトを抽出した。以下、この32個のCpGサイトをまとめて「32CpGセット」という。この時点で、特許文献1に記載されている各遺伝子領域に位置するCpGサイトは、全て除外されてしまった。
さらに、癌患者を取りこぼしなく判別することを目的に、癌患者サンプル内でDNAメチル化レベルの変動が少ないものを絞り込んだ。すなわち、UC癌患者24サンプル(3部位×各部位8サンプル)のβ値の不偏分散varを求め、不偏分散varの値が0.05より小さい16個のCpGサイトを選抜した。以下、この16個のCpGサイトをまとめて「16CpGセット」という。16CpGセットからさらに、不偏分散varの値が0.03より小さい9個のCpGサイトを絞り込んだ。以下、この9個のCpGサイトをまとめて「9CpGセット」という。
前記32CpGセット、16CpGセット、9CpGセットを用いて、全48サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行ったところ、図6A、6C、及び6Eに示すように、いずれのCpGセットでも、クラスター解析では、全てのUC癌患者サンプルが同一クラスター(図中、枠内)に集積した。また、図6B、6D、及び6Fに示すように、主成分分析(縦軸は第2主成分)では、UC癌患者サンプル(●)と非癌UC患者サンプル(▲)が第1主成分(横軸)方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、いずれのCpGセットでも、UC癌患者24サンプルと非癌UC患者24サンプルを明確に区別することができた。一方、特許文献1に記載されている各遺伝子領域に位置するCpGサイトから選抜された27個のCpGサイトを用いて、同様にクラスター解析及び主成分分析を行ったところ、図7A及び7Bに示すように、UC癌患者サンプルと非癌UC患者サンプルを明確に区別することは出来なかった。これらの結果から、表17に記載の32CpGは、潰瘍性大腸炎患者における大腸癌の発症のバイオマーカーとして極めて有用であり、これらを用いることにより、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌の発症の有無を高い感度と特異度によって判定できることが明らかである。
実施例1の潰瘍性大腸炎患者とは別に、内視鏡検査での生検組織による病理診断により大腸癌と診断され、外科手術を施行した患者(UC癌患者)24名と、内科的治療不応潰瘍性大腸炎患者であり、癌以外で外科手術を施行した患者(非癌UC患者)24名とから採取された大腸粘膜中のDNAに対して、CpGサイトのメチル化率を網羅的に解析した。
次いで、網羅的DNAメチル化解析データからCpGバイオマーカー候補を抽出した。 具体的には、まず、485,577個のCpGサイトから、Δβ値の絶対値が0.2超である324個のCpGサイトを抽出した。
(1)324個のCpGサイトから2群のt-test検定で上位100個のCpGサイトを選択し、100個のCpGから選んだ3個のCpG全ての組み合わせに基づく161,700個のロジスティック回帰モデル。(2)324個のCpGサイトから選んだ2個のCpGの全ての組み合わせに基づく、52,326個のロジスティック回帰モデル。
[基準1]感度が90%超、特異度が90%超、かつ判別式の係数p値が0.05未満。[基準2]感度が90%超、特異度が90%超、判別式の係数p値が0.05未満、かつAIC(赤池の情報量基準)が30未満。
[基準3]感度が95%超、特異度が85%超、かつ判別式の係数p値が0.05未満。[基準4]感度が95%超、特異度が85%超、判別式の係数p値が0.05未満、かつAICが30未満。
前記34CpGセットのメチル化レベルに基づき、全48サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析(図8A)では、大多数のUC癌患者サンプルが同一クラスター(図中、枠内)に集積した。また、主成分分析(図8B、縦軸は第2主成分)では、UC癌患者サンプル(●)と非癌UC患者サンプル(▲)が第1主成分(横軸)方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、いずれのCpGセットでも、UC癌患者24サンプルと非癌UC患者24サンプルを明確に区別することができた。
前記34CpGセットのうち、配列番号34で表される塩基配列中のCpGサイト(cg10931190)、配列番号37で表される塩基配列中のCpGサイト(cg13677149)、及び配列番号56で表される塩基配列中のCpGサイト(cg14516100)の3個のCpGサイトのメチル化率をマーカーとした場合の、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の有無の判定の精度を調べた。
実施例1において求めた潰瘍性大腸炎患者の直腸から採取した検体の各CpGサイトのDNAメチル化レベル(β値)と、実施例2において求めた潰瘍性大腸炎患者の各CpGサイトのDNAメチル化レベル(β値)から、CpGバイオマーカー候補を抽出した。
具体的には、まず、485,577個のCpGサイトから、Δβ値の絶対値が0.2超である172個のCpGサイトを抽出した。次いで、この172個のCpGサイトから、実施例2と同様にして、2種類のロジスティック回帰モデルを作成し、前記4つの基準のそれぞれについて、上位10CpGサイトを選択した。この結果、表11及び表12に記載の18個のCpGサイト(18CpGセット)が選抜された。各CpGサイトの結果を表19に示す。
前記18CpGセットのメチル化レベルに基づき、全64サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析(図10A)では、大多数のUC癌患者サンプルが同一クラスター(図中、枠内)に集積した。また、主成分分析(図10B、縦軸は第2主成分)では、UC癌患者サンプル(●)と非癌UC患者サンプル(▲)が第1主成分(横軸)方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、いずれのCpGセットでも、UC癌患者32サンプルと非癌UC患者32サンプルを明確に区別することができた。
実施例2において取得したUC癌患者24名及び非癌UC患者24名の直腸から採取した検体の各DMRの平均メチル化率(平均β値;各DMR中に存在するCpGサイトのメチル化レベル(β値)の相加平均値)から、DMRバイオマーカー候補を抽出した。
具体的には、まず、485,577個のCpGサイトのメチル化データ(IDAT形式)を、ChAMPパイプライン(Bioinformatics、30、428、2014;http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ChAMP.html)に入力し、UC癌患者と非癌UC患者の2群間で有意と判定されたDMR2,549か所を抽出した。この中でΔβ値([平均β値(UC癌)]-[平均β値(非癌UC)])の絶対値を0.15超に設定したところ、39か所に絞り込まれた。さらにΔβ値の絶対値が0.1超である484か所のうち、実施例1で取得したUC癌患者と非癌UC患者とのΔβ値が0.15超である80か所を追加し、総数112か所(DMR番号1~112)をDMRバイオマーカー候補とした。この112か所のDMR(112DMRセット)の結果を表20~22に示す。
前記112DMRセットのメチル化率に基づき、実施例2の全48サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析では、大多数のUC癌患者サンプルが同一クラスター(図11中、枠内)に集積した。また、主成分分析(図12)では、UC癌患者サンプル(●)と非癌UC患者サンプル(▲)が第1主成分方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。
前記112DMRセットのうち、DMR番号2(SIX10)、10(CEP112)、55(HNF4A)の領域のメチル化率をマーカーとした場合の、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の有無の判定の精度を調べた。
Claims (5)
- 採取具と、採取補助具とを備える大腸粘膜採取用キットであり、
前記採取具は、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第1の挟持面が形成されている板状の第1の挟持片と、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第2の挟持面が形成されている板状の第2の挟持片と、
前記第1の挟持片と前記第2の挟持片を、互いに対向した状態で、前記第1の挟持面及び前記第2の挟持面が形成されていない端部において連結する連結部と、
を有し、
前記第1の挟持片は、中心部よりも前記第1の挟持面が形成されている端部側に、一回屈曲する第1の屈曲部を有し、
前記第2の挟持片は、中心部よりも前記第2の挟持面が形成されている端部側に、一回屈曲する第2の屈曲部を有し、
前記屈曲の角度は、前記挟持片の中心部から前記連結部を載せた仮想平面に対して25~35°であり、
前記第1の挟持面及び前記第2の挟持面の両方がカップ形状であり、
前記第1の挟持面の辺縁部と前記第2の挟持面の辺縁部の内径が、1~5mmであり、
前記第1の挟持片と前記第2の挟持片の長さが、50~250mmであり、
前記第1の屈曲部から前記第1の挟持面の先端部までの長さ、及び前記第2の屈曲部から前記第2の挟持面の先端部までの長さが、30~50mmであり、
前記第1の挟持片と前記第2の挟持片のいずれか一方の内側に突起部を、他方に筒部を有しており、前記突起部と前記筒部は、前記屈曲部近傍に、互いに対向して嵌合するように設けられており、
前記採取補助具は、
回転軸方向に貫通孔を有し、かつ側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい先端辺縁部から外径が大きい手元辺縁部に向かって、前記側壁の回転軸方向の一部分に設けられており、
前記スリットの幅が、前記第1の挟持面と前記第2の挟持面が接した状態における幅よりも広く、かつ前記先端辺縁部において7~15mmであり、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の前記手元辺縁部近傍のうちの前記スリットと円周方向において近い側に連結しており、
前記手元辺縁部の外径が30~70mmであり、前記採取具導入部の回転軸方向の長さが50~150mmである、大腸粘膜採取用キット。 - 前記カップ形状の辺縁部の内径が2~3mmである、請求項1に記載の大腸粘膜採取用キット。
- 一方の端部に大腸粘膜を挟持する第1の挟持面が形成されている板状の第1の挟持片と、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第2の挟持面が形成されている板状の第2の挟持片と、
前記第1の挟持片と前記第2の挟持片を、互いに対向した状態で、前記第1の挟持面及び前記第2の挟持面が形成されていない端部において連結する連結部と、
を有し、
前記第1の挟持片は、中心部よりも前記第1の挟持面が形成されている端部側に、一回屈曲する第1の屈曲部を有し、
前記第2の挟持片は、中心部よりも前記第2の挟持面が形成されている端部側に、一回屈曲する第2の屈曲部を有し、
前記屈曲の角度は、前記挟持片の中心部から前記連結部を載せた仮想平面に対して25~35°であり、
前記第1の挟持面及び前記第2の挟持面の両方がカップ形状であり、
前記第1の挟持面の辺縁部と前記第2の挟持面の辺縁部の内径が、1~5mmであり、
前記第1の挟持片と前記第2の挟持片の長さが、50~250mmであり、
前記第1の屈曲部から前記第1の挟持面の先端部までの長さ、及び前記第2の屈曲部から前記第2の挟持面の先端部までの長さが、30~50mmであり、
前記第1の挟持片と前記第2の挟持片のいずれか一方の内側に突起部を、他方に筒部を有しており、前記突起部と前記筒部は、前記屈曲部近傍に、互いに対向して嵌合するように設けられており、
請求項1又は2に記載の大腸粘膜採取用キットに用いられる、採取具。 - 回転軸方向に貫通孔を有し、かつ側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい先端辺縁部の端部から前記手元辺縁部に向かって、前記側壁の回転軸方向の一部分に設けられており、
前記スリットの幅が、前記先端辺縁部において7~15mmであり、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の前記手元辺縁部近傍のうちの前記スリットと円周方向において近い側に連結しており、
前記手元辺縁部の外径が30~70mmであり、前記採取具導入部の回転軸方向の長さが50~150mmである、
請求項1又は2に記載の大腸粘膜採取用キットに用いられる、採取補助具。 - 前記スリットの前記手元辺縁部側の幅が10~20mmである、請求項4に記載の採取補助具。
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