JP7139248B2 - 孤発性大腸癌発症可能性の判定方法 - Google Patents
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Description
本願は、2016年9月29日に出願されたPCT/JP2016/078810および2017年3月31に日本に出願された特願2017-072674に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
[1] 孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたDNA中の、表1~7に記載のメチル化可変領域番号1~121で表される各メチル化可変領域中に存在する1個以上のCpGサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
を有し、
前記メチル化可変領域の平均メチル化率が、当該メチル化可変領域中のCpGサイトのうち、前記測定工程においてメチル化率が測定された全てのCpGサイトのメチル化率の平均値であり、
前記基準値が、各メチル化可変領域の平均メチル化率に対してそれぞれ設定された、孤発性大腸癌患者と非孤発性大腸癌患者を識別するための値であり、
前記多変量判別式が、前記メチル化可変領域番号1~121で表されるメチル化可変領域のうちの1か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、
孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[3] 前記測定工程において、前記多変量判別式がその平均メチル化率を変数として含むメチル化可変領域中に存在する1個以上のCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[1]の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[4] 前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号1~121で表されるメチル化可変領域から選択される2か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記[3]の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[5] 前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号1~121で表されるメチル化可変領域から選択される3か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記[3]の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[6] 前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号1~52で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される1か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記[3]の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[7] 前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号1~15で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される1か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記[3]の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたDNA中の、配列番号1~93で表される塩基配列中のCpGサイトからなる群より選択される1か所以上のCpGサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
を有し、
前記基準値が、各CpGサイトのメチル化率に対してそれぞれ設定された、孤発性大腸癌患者と非孤発性大腸癌患者を識別するための値であり、
前記多変量判別式が、前記配列番号1~93で表される塩基配列中のCpGサイトのうち1か所以上のCpGサイトのメチル化率を変数として含む、孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[9] 前記測定工程において、2~10個のCpGサイトのメチル化率を測定する、前記[8]の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[10] 前記判定工程において、配列番号1、4、6、10、11、13、14、17~20、23~27、29、30、32、33、35、36、39、41~48、50~54、59、65~68、70~77、79~86、90、及び91で表される塩基配列中のCpGサイトのうち少なくとも1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号2、3、5、7~9、12、15、16、21、22、28、31、34、37、38、40、49、55~58、60~64、69、78、87~89、92、及び93で表される塩基配列中のCpGサイトのうち少なくとも1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]又は[9]の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[11] 前記測定工程において、配列番号1~54で表される塩基配列中のCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号1、4、6、10、11、13、14、17~20、23~27、29、30、32、33、35、36、39、41~48、及び50~54で表される塩基配列中のCpGサイトのうち少なくとも1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号2、3、5、7~9、12、15、16、21、22、28、31、34、37、38、40、及び49で表される塩基配列中のCpGサイトのうち少なくとも1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[12] 前記判定工程において、配列番号1、4、6、10、11、13、14、17~20、23~27、29、30、32、33、35、36、39、41~48、及び50~54で表される塩基配列中のCpGサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるCpGサイトの数と、配列番号2、3、5、7~9、12、15、16、21、22、28、31、34、37、38、40、及び49で表される塩基配列中のCpGサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるCpGサイトの数との和が3以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[11]のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[13] 前記測定工程において、配列番号1~8で表される塩基配列中のCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号1、4、及び6で表される塩基配列中のCpGサイトのうち少なくとも1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号2、3、5、7、及び8で表される塩基配列中のCpGサイトのうち少なくとも1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[14] 前記判定工程において、配列番号1、4、及び6で表される塩基配列中のCpGサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるCpGサイトの数と、配列番号2、3、5、7、及び8で表される塩基配列中のCpGサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるCpGサイトの数との和が3以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]、及び[13]のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[15] 前記測定工程において、配列番号55~87で表される塩基配列中のCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号59、65~68、70~77、及び79~86で表される塩基配列中のCpGサイトのうち少なくとも1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号55~58、60~64、69、78、及び87で表される塩基配列中のCpGサイトのうち少なくとも1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[16] 前記判定工程において、配列番号59、65~68、70~77、及び79~86で表される塩基配列中のCpGサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるCpGサイトの数と、配列番号55~58、60~64、69、78、及び87で表される塩基配列中のCpGサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるCpGサイトの数との和が2以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]、及び[15]のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[17] 前記測定工程において、配列番号88~93で表される塩基配列中のCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号90及び91で表される塩基配列中のCpGサイトのうち少なくとも1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号88、89、92、及び93で表される塩基配列中のCpGサイトのうち少なくとも1か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[18] 前記判定工程において、配列番号90及び91で表される塩基配列中のCpGサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるCpGサイトの数と、配列番号88、89、92、及び93で表される塩基配列中のCpGサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるCpGサイトの数との和が2以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]~[10]、及び[17]のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[19] 前記和が5以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[12]、[14]、[16]、又は[18]の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[20] 前記多変量判別式が、配列番号55~87で表される塩基配列中のCpGサイトからなる群より選択される1か所以上のCpGサイトのメチル化率を変数として含み、 前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]又は[9]の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[21] 前記多変量判別式が、配列番号88~93で表される塩基配列中のCpGサイトからなる群より選択される1か所以上のCpGサイトのメチル化率を変数として含み、 前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むCpGサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記[8]又は[9]の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[22] 前記多変量判別式が、ロジスティック回帰式、線形判別式、ナイーブベイズ分類器で作成された式、又はサポートベクターマシンで作成された式である、前記[8]~[21]のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[23] 前記生体試料が、腸管組織である、前記[8]~[22]のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[24] 前記生体試料が、直腸粘膜組織である、前記[8]~[23]のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
採取具と、採取補助具とを備え、
前記採取具は、一対の板状体である第1の挟持片と第2の挟持片とからなり、
前記第1の挟持片と前記第2の挟持片は、それぞれ、挟持部と把持部とバネ部と固定部とから構成されており、
前記採取補助具は、
側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
前記スリットの幅が、前記第1の挟持片と前記第2の挟持片が挟持部側の端部同士で接着した状態の幅よりも広く、
前記採取具導入部の大きい方の外径が30~70mmであり、回転軸方向の長さが50~150mmである、大腸粘膜採取用キットによって採取されたものである、前記[24]の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[26] 前記第1の挟持片の挟持部のうち第2の挟持片と対向する面の端部と、前記第2の挟持片の挟持部のうち第1の挟持片と対向する面の端部と、の少なくとも一方に窪み部が設けられている、前記[25]の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
[27] 採取具と、採取補助具とを備える大腸粘膜採取用キットであり、
前記採取具は、
一対の板状体である第1の挟持片と第2の挟持片とからなり、
前記第1の挟持片と前記第2の挟持片は、それぞれ、挟持部と把持部とバネ部と固定部とから構成されており、
前記採取補助具は、
側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
前記スリットの幅が、前記第1の挟持片と前記第2の挟持片が挟持部側の端部同士で接着した状態の幅よりも広く、
前記採取具導入部の大きい方の外径が30~70mmであり、回転軸方向の長さが50~150mmである、大腸粘膜採取用キット。
[28] 前記第1の挟持片の挟持部のうち第2の挟持片と対向する面の端部と、前記第2の挟持片の挟持部のうち第1の挟持片と対向する面の端部と、の少なくとも一方に窪み部が設けられている、前記[27]の大腸粘膜採取用キット。
[29] 配列番号1~93で表される塩基配列中のCpGサイトからなる群より選択される1か所以上のCpGサイトを含む部分塩基配列を有するDNA断片からなり、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定するために用いられる、DNAメチル化率分析用マーカー。
また、本発明に係る直腸粘膜採取用キットにより、患者の肛門から比較的安全かつ簡便に直腸粘膜を採取することができる。
本発明に係る孤発性大腸癌発症可能性の判定方法(以下、「本発明に係る判定方法」ということがある。)は、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、ゲノムDNA中のCpGサイト又はDMRのうち、メチル化率が、大腸癌を発症しておらず、かつ他の大腸疾患の自覚症状もない健常者群と、孤発性大腸癌を発症した大腸癌患者群とで差があるものをマーカーとすることを特徴とする。これらのマーカーとなるCpGサイトのメチル化率又はDMRの平均メチル化率を指標として、ヒト被検者が大腸癌を発症している可能性の高低を判定する。特定のCpGサイトのメチル化率又は特定のDMRの平均メチル化率を、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定するために用いられるマーカーとすることにより、視認判別が非常に困難である早期孤発性大腸癌をより客観的かつ感度よく検出することができ、早期発見が期待できる。
本発明に係る大腸粘膜採取用キットは、直腸粘膜を挟んで採取するための採取具と、肛門を拡張し、当該採取具を肛門から大腸粘膜表面へ到達させるための採取補助具とを備える。以下、図1~3を参照しながら、本発明に係る大腸粘膜採取用キットについて説明する。
健常者8名(男性5名、女性3名)と、内視鏡検査での生検組織による病理診断により、潰瘍性大腸炎等の他の大腸の炎症性疾患は発症していないが、孤発性大腸癌と診断された大腸癌患者6名(男性3名、女性3名)とから採取された大腸粘膜中のDNAに対して、CpGサイトのメチル化率を網羅的に解析した。
(1)生検及びDNA抽出
同一被検者の大腸3か所から粘膜組織を採取し、-80℃で冷凍保存した。採取部位は、大腸癌患者は盲腸、横行結腸、直腸、及び癌部とし、健常者は盲腸、横行結腸、及び直腸とした。採取した組織を細断し、QIAmp DNA kit(Qiagen社製)を使用してDNAを抽出した。
得られたDNAの濃度は次のようにして求めた。すなわち、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(Life Technologies社製)を用いて各サンプルの蛍光強度を測定し、キット付属のλ-DNAの検量線を用いて濃度を算出した。
次に、各サンプルをTE(pH8.0)にて1ng/μLに希釈し、Illumina FFPE QC Kit(Illumina社製)及びFast SYBR Green Master Mix(Life Technologies社製)を用いてリアルタイムPCRを行い、Ct値を求めた。サンプルとポジティブコントロールとのCt値の差(以下、ΔCt値)をサンプルごとに算出し、品質を評価した。ΔCt値が5未満のサンプルは品質良好と判断し、以降のステップに進めた。
EZ DNA Methylation Kit(ZYMO RESEARCH社製)を使用して、DNAサンプルに対してバイサルファイト処理を実施した。その後、Infinium HD FFPE Restore Kit(Illumina社製)を使用して、分解DNAを修復した。
DNAをアルカリ変性した後、中和させ、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit(Illumina社製)の全ゲノム増幅用の酵素とプライマーを添加し、37℃のIncubation Oven(Illumina社製)で20時間以上、等温で反応させることによって、全ゲノムを増幅させた。
全ゲノム増幅したDNAに、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit(Illumina社製)の断片化用の酵素を添加し、Microsample Incubator(SciGene)で37℃、1時間反応させた。断片化したDNAに、共沈剤と2-プロパノールを加えて遠心分離処理し、DNAを沈澱させた。
沈澱させたDNAに、Hybridization bufferを加え、48℃のHybridization Oven(Illumina社製)で1時間反応させ、DNAを溶解させた。溶解させたDNAを95℃のMicrosample Incubator(SciGene社製)で20分間インキュベートして1本鎖に変性させた後、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit(Illumina社製)のBeadChip上に分注した。48℃のHybridization Ovenで16時間以上反応させ、BeadChip上のプローブと1本鎖DNAをハイブリダイズした。
ハイブリダイゼーション後のBeadChip上のプローブを伸長反応させ、蛍光色素を結合させた。次いで、当該BeadChipをiSCANシステム(Illumina社製)でスキャンし、メチル化蛍光強度及び非メチル化蛍光強度を測定した。実験終了時に、スキャンデータが全て揃っていること、及びスキャンが正常に行われたことを確認した。
DNAメチル化解析ソフトウェアGenomeStudio(Version:V2011.1)を用いてスキャンデータを解析した。DNAメチル化レベル(β値)は、次の式により算出した。
[メチル化蛍光強度]÷ ([メチル化蛍光強度]+[非メチル化蛍光強度]+100)
Normalization: 有り(Controls)
Subtract Background: 有り
Content Descriptor: HumanMethylation450_15017482_v.1.2.bpm
Normalization: 有り(Controls)
Subtract Background: 有り
Content Descriptor: HumanMethylation450_15017482_v.1.2.bpm
Ref Group: 比較解析4. Group-3
Error Model: Illumina custom
Compute False Discovery Rate: 無し
DNAメチル化レベルの定量及び比較解析の結果を用いて、統計解析ソフトウェアR(Version: 3.0.1、64bit、Windows(登録商標))を用いて、DiffScoreの算出、クラスター解析及び主成分分析を実施した。
> data.dist<-as.dist(1-cor(data.frame,use="pairwise.complete.obs",method="p"))> hclust(data.dist,method="complete")
# data.frame: CpG(行)x サンプル(列)から成るデータフレーム
# 1-ピアソン相関係数を距離として定義し、complete linkage法により実施
> prcomp(t(data.frame),scale=T)
# data.frame: CpG(行)x サンプル(列)から成るデータフレーム
(1)CpGバイオマーカー候補の抽出
網羅的DNAメチル化解析データからCpGバイオマーカー候補を選定する手段として、DiffScore及びΔβ値に基づいた絞り込みが報告されている(BMC Med genomics vol.4, p.50, 2011; Sex Dev vol.5, p.70, 2011)。前者の報告ではDiffScoreの絶対値が30超、及びΔβ値の絶対値が0.2超に設定し、後者の報告ではDiffScoreの絶対値が30超、及びΔβ値の絶対値が0.3超に設定して、バイオマーカー候補を抽出している。これらの方法に準じて、BeadChipに搭載されている485,577個のCpGサイトからバイオマーカー候補を抽出した。
前記54CpGセット又は8CpGセットを用いて、全23サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行ったところ、図4及び5に示すように、いずれのCpGセットでも、クラスター解析では、全ての大腸癌患者サンプルが同一クラスター(図中、枠内)に集積した。また、図6及び7に示すように、主成分分析(縦軸は第2主成分)では、大腸癌患者サンプル(黒丸は非癌部から採取したサンプル、黒四角は癌部から採取したサンプル)と健常者(非癌)サンプル(黒三角)が第1主成分(横軸)方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、いずれのCpGセットでも、大腸癌患者サンプルと健常者サンプルを明確に区別することができた。これらの結果から、表24及び25に記載の54CpGは、ヒト被検者における孤発性大腸癌の発症のバイオマーカーとして極めて有用であり、これらを用いることにより、ヒト被検者の孤発性大腸癌の発症の有無、特に大腸疾患の自覚症状のないヒト被検者の孤発性大腸癌の発症の有無を高い感度と特異度によって判定できることが明らかである。
健常者28名と、内視鏡検査での生検組織による病理診断により、潰瘍性大腸炎等の他の大腸の炎症性疾患は発症していないが、孤発性大腸癌と診断された大腸癌患者20名とから採取された直腸粘膜中のDNAに対して、CpGサイトのメチル化率を網羅的に解析した。
次いで、網羅的DNAメチル化解析データからCpGバイオマーカー候補を抽出した。 具体的には、まず、866,895個のCpGサイトから、Δβ値の絶対値が0.15超である142個のCpGサイトを抽出した。
[モデル2]142個のCpGサイトから選んだ3個のCpGの全ての組み合わせに基づく、467,180個のロジスティック回帰モデル。
前記33CpGセットのメチル化レベルに基づき、全48サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析(図8)では、大腸癌患者サンプルの殆どが同一クラスター(図中、枠内)に集積した。また、主成分分析(図9、縦軸は第2主成分)では、大腸癌患者サンプル(●)と健常者サンプル(▲)が第1主成分(横軸)方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、33CpGセットを用いて大腸癌患者20サンプルと健常者28サンプルを明確に区別することができた。
前記33CpGセットのうち、配列番号57で表される塩基配列中のCpGサイト(cg01105403)、配列番号63で表される塩基配列中のCpGサイト(cg06829686)、及び配列番号77で表される塩基配列中のCpGサイト(cg14629397)の3個のCpGサイトのメチル化率をマーカーとした場合の、孤発性大腸癌発症の有無の判定の精度を調べた。
実施例1及び実施例2において求めた直腸粘膜サンプルのDNAメチル化レベル(β値)から、CpGバイオマーカー候補を抽出した。
具体的には、まず、866,895個のCpGサイトから、孤発性大腸癌と診断された大腸癌患者26サンプル及び健常者36サンプルのΔβの絶対値が0.15超である42個のCpGサイトを抽出した。
[モデル2]42個のCpGサイトから選んだ3個のCpGの全ての組み合わせに基づく、11,480個のロジスティック回帰モデル。
[基準2]感度が95%超、特異度が85%超、判別式の係数p値が0.05未満、かつAIC(赤池の情報量基準)が30未満。
前記6CpGセットのメチル化レベルに基づき、全62サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析(図11)では、大腸癌患者サンプルの多くは数個のクラスター(図中、枠内)に集積した。また、主成分分析(図12、縦軸は第2主成分)では、大腸癌患者サンプル(●)と健常者サンプル(▲)は、第1主成分(横軸)方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、主成分分析では6CpGセットを用いて大腸癌患者20サンプルと健常者28サンプルを明確に区別することができた。
実施例2において取得した大腸癌患者20名及び健常者28名の直腸から採取した検体の各DMRの平均メチル化率(平均β値;各DMR中に存在するCpGサイトのメチル化レベル(β値)の相加平均値)から、DMRバイオマーカー候補を抽出した。
具体的には、まず、866,895個のCpGサイトのメチル化データ(IDAT形式)を、ChAMPパイプライン(Bioinformatics、30、428、2014;http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ChAMP.html)に入力し、大腸癌患者と健常者の2群間で有意と判定されたDMR4,232か所を抽出した。この中でΔβ値([平均β値(癌直腸)]-[平均β値(非癌直腸)])の絶対値が0.05超である121か所(DMR番号1~121)をDMRバイオマーカー候補とした。この121か所のDMR(121DMRセット)の結果を表28~31に示す。
前記121DMRセットのメチル化率に基づき、実施例2の全48サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析では、大多数の大腸癌患者サンプルが同一クラスター(図13中、枠内)に集積した。また、主成分分析(図14)では、大腸癌患者サンプル(●)と健常者サンプル(▲)が第1主成分方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。
Claims (7)
- 孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
ヒト被検者から採取された直腸粘膜組織から回収されたDNA中の、表1に記載のメチル化可変領域(DMR)から選択される3か所以上の各DMR中に存在する1個以上のCpGサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたCpGサイトのメチル化率を用いて、前記選択された3か所以上の各DMRの平均メチル化率を算出する算出工程と、
前記算出工程において算出された各DMRの平均メチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程を有し、
前記基準値が、前記選択された3か所以上の各DMRの平均メチル化率に対してそれぞれ設定された、孤発性大腸癌患者と非孤発性大腸癌患者を識別するための値であり、
前記判定工程において、前記選択された3か所以上の各DMRの平均メチル化率と前記予め設定された基準値に基づいて判定する場合、DMR番号8~15で表されるDMRの平均メチル化率が予め設定された基準値以下である、且つ、DMR番号1~7で表されるDMRの平均メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定し、
前記判定工程において、前記選択された3か所以上の各DMRの平均メチル化率と前記予め設定された多変量判別式に基づいて判定する場合、前記算出工程において算出された各DMRの平均メチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が前記予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定し、
前記多変量判別式が、前記選択された3か所以上の各DMRの平均メチル化率を変数として含み、
前記基準判別値が、前記多変量判別式に用いられるDMRについて、孤発性大腸癌患者 の前記判別値と、非孤発性大腸癌患者を識別することができる値として実験的に求められた閾値であり、
前記選択された3か所以上のDMRが、DMR番号6、8及び4で表されるDMR;DMR番号6、8及び11で表されるDMR;DMR番号4、6及び11で表されるDMR;又はDMR番号4、8及び11で表されるDMRを含む、
孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
- 孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
ヒト被検者から採取された直腸粘膜組織から回収されたDNA中の、表2~4に記載の塩基配列から選択される3つ以上の塩基配列中のCpGサイトであって、括弧内のCGであるCpGサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程を有し、
前記基準値が、各CpGサイトのメチル化率に対してそれぞれ設定された、孤発性大腸癌患者と非孤発性大腸癌患者を識別するための値であり、
前記判定工程において、前記測定されたメチル化率と前記予め設定された基準値に基づいて判定する場合、配列番号59、65~68、70~77、及び79~86で表される塩基配列中のCpGサイトのメチル化率が予め設定された基準値以下である、且つ、配列番号55~58、60~64、69、78、及び87で表される塩基配列中のCpGサイトのメチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定し、
前記判定工程において、前記測定されたメチル化率と前記予め設定された多変量判別式に基づいて判定する場合、前記測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定し、
前記多変量判別式が、前記選択された3つ以上の塩基配列中のCpGサイトのメチル化率を変数として含み、
前記基準判別値が、前記多変量判別式に用いられるCpGサイトについて、孤発性大腸癌患者の前記判別値と、非孤発性大腸癌患者を識別することができる値として実験的に求められた閾値であり、
前記選択された3つ以上の塩基配列は、塩基配列番号57、63及び77で表される塩基配列を含む、
孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
- 前記多変量判別式が、ロジスティック回帰式、線形判別式、ナイーブベイズ分類器で作成された式、又はサポートベクターマシンで作成された式である、請求項1又は2に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
- 前記直腸粘膜組織が、
採取具と、採取補助具とを備え、
前記採取具は、一対の板状体である第1の挟持片と第2の挟持片とからなり、
前記第1の挟持片と前記第2の挟持片は、それぞれ、挟持部と把持部とバネ部と固定部とから構成されており、
前記採取補助具は、
側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい手元辺縁部近傍に連結しており、
前記採取具導入部の回転軸方向と前記把持部の中心軸方向との角度が90°超、120°以下であり、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい先端辺縁部の端部から前記手元辺縁部に向かって前記側壁の回転軸方向の一部分まで設けられており、
前記スリットの幅が、前記第1の挟持片と前記第2の挟持片が挟持部側の端部同士で接着した状態の幅よりも広く、かつ前記先端辺縁部において7~25mmであり、
前記採取具導入部の大きい方の外径が30~70mmであり、回転軸方向の長さが50~150mmである、大腸粘膜採取用キットによって採取されたものである、請求項1又は2に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。 - 前記採取具が、前記第1の挟持片の挟持部のうち第2の挟持片と対向する面の端部と、前記第2の挟持片の挟持部のうち第1の挟持片と対向する面の端部と、の少なくとも一方に窪み部が設けられている、請求項4に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
- 前記採取具導入部の回転軸方向と前記採取部の中心軸方向との角度が95~110°である、請求項4に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
- 前記採取具導入部の回転軸方向と前記採取部の中心軸方向との角度が95~105°である、請求項6に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
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