JP7093524B2 - 蛍光標識多糖、およびその調製方法と用途 - Google Patents
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Description
上記した蛍光標識多糖において、前記多糖を臭化シアンで活性化させて、前記多糖のヒドロキシ基位置にシアノ基を連結させ、前記シアノ基を前記蛍光染料のアミノ基に連結されるようにしてもよい。
上記した蛍光標識多糖において、前記XはBrであるようにしてもよい。
本発明は、
多糖を水に溶解した後、飽和臭化シアン溶液を加えて3-20分間反応させ、反応が終了して得られた溶液を純化処理するステップ(1)と、
ステップ(1)で得られた純化溶液を乾固するまで濃縮させて、0.1-0.3Mのホウ砂溶液を溶解させ、式Iに示される蛍光染料を加えて、遮光下で反応させ、蛍光標識多糖を得るステップ(2)とを含む、上記蛍光標識多糖の調製方法を提供する。
フェニルヒドラジンと3-メチル-2-ブタノンのモル比が1:(1.0-1.2)となるように、フェニルヒドラジンを氷酢酸に加えて撹拌し、3-メチル-2-ブタノンをゆっくりと滴下して、滴下終了後、60-65℃に加熱して、3-4時間反応させ、抽出、濃縮、精製をして、中間体I’-1を得る、中間体I’-1を調製するステップ(1)と、
中間体I’-1と1,2-ジブロモエチレンのモル比が1:(1.5-2.0)となるように、中間体I’-1と1,2-ジブロモエチレンをトルエンに加えて、窒素ガスで保護し、加熱還流反応を16-18時間行い、冷却させて固体として中間体I’-2を析出させる、中間体I’-2を調製するステップ(2)と、
シクロヘキサノン、N,N-ジメチルホルムアミド、オキシ塩化リンのモル比が1: (1.0-1.1):(1.0-1.05)となるように、乾燥させたN,N-ジメチルホルムアミドを乾燥ジクロロメタンに加えて、氷浴下でオキシ塩化リンのジクロロメタン溶液を加えて撹拌し、シクロヘキサノンを加えて氷浴を取り除き、加熱還流反応を2-3時間行い、反応液を砕氷に注入して、一晩静置し、固体として中間体I’-4を析出させる、中間体I’-4を調製するステップ(3)と、
中間体I’-2と中間体I’-4をn-ブタノールとトルエンの混合液に加えて、加熱還流を2-3時間行い、固体を析出させて、濾過して中間体I’-5を得る、中間体I’-5を調製するステップ(4)と、
中間体I’-5とBr-R1-NH2をアミノ置換反応させて、反応過程にNaOHを加えて化合物Iを製造する、化合物Iを調製するステップ(5)とを含み、
合成スキームは以下のとおりである。
式Iに示される蛍光染料が大きなストークスシフトを有し、蛍光染料分子の発光波長と励起波長をさらに分けるため、蛍光標識多糖は、蛍光検出に用いられる合、優れた蛍光安定性、高蛍光量子収率、またイメージング結果の高信号対雑音比といった利点を有する。また、長いストークスシフトは各種蛍光染料分子の区別し易さの向上に寄与し、多重蛍光検出に適用でき、このため、異なる蛍光で標識された複数種の多糖分子の検出を実現できる。また、本発明に係る蛍光標識多糖は、液相チッププローブとして生体内外の糖類分子を検出することに適しており、液相チップの検出対象や蛍光標識プローブの種類を増やす。
フェニルヒドラジンと3-メチル-2-ブタノンのモル比が1:1.1となるように、フェニルヒドラジンを氷酢酸に加えて撹拌し、3-メチル-2-ブタノンをゆっくりと滴下して、滴下終了後、62.5℃に加熱して、3-4時間反応させ、抽出、濃縮、精製をして、中間体I’-1を得た。
中間体1-1と1,2-ジブロモエチレンのモル比が1:1.75となるように、中間体I’-1と1,2-ジブロモエチレンをトルエンに加えて、窒素ガスで保護し、加熱還流反応を17時間行い、冷却させて固体として中間体1’-2を析出させた。
シクロヘキサノン、N,N-ジメチルホルムアミド、オキシ塩化リンのモル比が1:1.05:1.025となるように、乾燥させたN,N-ジメチルホルムアミドを乾燥ジクロロメタンに加えて、氷浴下でオキシ塩化リンのジクロロメタン溶液を加えて撹拌し、シクロヘキサノンを加えて氷浴を取り除き、加熱還流反応を2.5時間行い、反応液を砕氷に注入して、一晩静置し、固体として中間体1’-4を析出させた。
中間体I’-2と中間体I’-4をn-ブタノールとトルエンの混合液に加えて、加熱還流を2.5時間行い、固体を析出させて、濾過して中間体I’-5を得た。
中間体I’-5を原料として、一般的なアミノ置換反応を行った。中間体I’-5にBr-CH3-NH2を加えて反応させ、さらにNaOHを加えて、目的化合物Bを得た。化合物Bの核磁気スペクトルは図1に示される。
質量スペクトル(MS+):752.07(M+)
m/z:754.07(100.0%),756.07(97.7%),755.07(39.3%),757.07(38.7%),752.07(34.2%),758.07(32.0%),753.08(13.1%),759.07(12.2%),756.08(7.1%),758.08(7.0%),754.08(2.4%),760.07(2.4%)。
元素分析:C、55.65;H、5.20;Br、31.73;N、7.42。
1、飽和臭化シアン溶液および0.2MのNaOH溶液を調製する。
2、グルカン20mgを秤量して、グルカンを蒸留水1mlに溶解し、十分に撹拌して溶解させ、臭化シアン溶液4mlを加えて、7min連続してNaOH溶液を1回ずつ25μI加えて(pH>10に保持)、溶液の変化を観察し、沈殿が見られると、実験に失敗したことを示し、再操作する。
3、前のステップで得られた反応液について蒸留水を1-2日間透析させ、2-3hごとに透析外液を交換し、袋内の溶液を乾固するまで濃縮させて、pH=8の0.2MNa2B4O7.12H2O(ホウ砂)5~10mlを加えて、濃縮物を溶解させた後、式Aに示される蛍光染料(約1.5mg)を少量加え、遮光下で一晩反応させる。前のステップで得られた溶液を40℃の水浴に移して、遮光下で24h反応させ続ける。反応終了後、遠心分離して、上澄みを用いて蒸留水を遮光下で2日間透析させ、遠心分離後、凍結乾燥させて、蛍光標識グルカンを得る。蛍光染料で多糖を標識する方法の模式図を以下に示す。
1、飽和臭化シアン溶液および0.2MのNaOH溶液を調製する。
2、キトサン10mgを秤量して、キトサンを蒸留水1mlに溶解し、十分に撹拌して溶解させ、臭化シアン溶液4mlを加えて、9min連続してNaOH溶液を1回ずつ25μI加えて(pH>10に保持)、溶液の変化を観察し、沈殿が見られると、実験に失敗したことを示し、再操作する。
3、前のステップで得られた反応液について蒸留水を1-2日間透析させ、2-3hごとに透析外液を交換し、袋内の溶液を乾固するまで濃縮させ、pH=8の0.2M Na2B4O7.12H2O(ホウ砂)1~10mlを加えて、濃縮物を溶解させた後、式Aに示される蛍光染料(約1.5mg)を少量加え、遮光下で一晩反応させる。前のステップで得られた溶液を40℃の水浴に移して、遮光下で24h反応させ続ける。反応終了後、遠心分離して、上澄みを用いて蒸留水を遮光下で2日間透析させ、遠心分離後、凍結乾燥させて、蛍光標識キトサンを得る。
紫外可視吸収スペクトルを利用して化合物のモル吸光係数を測定した。計算式は式(1)に示される。
20℃で蛍光染料の蛍光量子収率を測定して、硫酸キニーネ(溶媒0.1M H2SO4、量子収率0.56)を参照物とし、蛍光染料と参照物質の希溶液について同じ励起条件で得られた蛍光積分強度と該励起波長での紫外吸収値を測量することによって、蛍光量子収率を算出した。生成物を無水エタノールに溶解した。
計算式は式(2)に示される。
実施例2で調製された蛍光標識グルカンと実施例3で調製された蛍光標識キトサンのHEK-293T(ヒト胚性腎細胞)における細胞毒性をMTT実験により測定し、測定には下記ステップを含む。
(1)1ウェルあたり5×103個の細胞/100μLの密度で、HEK-293T細胞を96ウェルプレートに接種して、培地をDMEMとし、5%CO2を含む37℃の恒温インキュベータにおいて一晩培養した。
(2)実施例2で調製された蛍光標識グルカン、および実施例3で調製された蛍光標識キトサンをジメチルスルホキシド(DMSO)で溶解させて、濃度0.1mol/Lの母液を調製し、DMEM培地を用いて希釈して、濃度がそれぞれ80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L及び5μmol/Lの溶液にして使用時まで保管し、別にDMEM培地を等体積の脱イオン水に加えて希釈し、ここで蛍光標識多糖の濃度を0μmol/Lにした。
(3)ステップ(1)の96ウェルプレートにおける原培地を上記ステップ(2)で調製された薬液濃度がそれぞれ0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/Lおよび80μmol/LのDMEM培地に交換し、1ウェルあたり200μLとし、各薬物濃度ごとに6個のウェルを設置した。次に、96ウェルプレートを5%C〇2を含有する37℃の恒温インキュベータに入れて、それぞれ3h、6h、12hおよび24hインキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルにMTT(5mg/mL)20μLを加えて4h培養し続けた。培養終了後、培地を吸い取り、1ウェルにDMSO 150μLを加えて、シェーカーにおいて、結晶が完全に溶解するまで10min振動させた。酵素標識法を用いて490nmでの各ウェルの吸光度値を測定し、実験結果を少なくとも三回の独立実験の平均値とした。
(2)ステップ(1)における検出方法を用いて、蛍光標識キトサンの、PBSまたは血清において各時間インキュベートしたときの化学純度を測定し、結果を図5に示した。
(2)1×105個/ウェルで、スライド(スライドは75%エタノールに5min浸漬することで消毒し、Assitent社から購入したものである)を備えた12ウェルプレートに接種して、一晩培養した。
(3)細胞上清を吸い取り、培地で最終濃度1mg/mlに希釈された、実施例2で調製された蛍光標識グルカンと実施例3で調製された蛍光標識キトサンをそれぞれ加えて、細胞インキュベータにおいてさらに24h培養した。
(4)培養を停止して、ウェルプレートにおけるスライドを新しい12ウェルプレートに移し、PBST(0.1%のTween-20含有)を加えて3-4回リンスし、4%ポリオキシメチレンを加えて室温で15min固定し、PBSTで3-4回リンスし、最終濃度1μg/mlのDAPI(米国Cellsignaling社から購入)溶液を加えて、37℃で15minインキュベートし、PBSで3-4回リンスし、封入して、レーザー共焦点顕微鏡(日本オリンパス社から購入)下で観察した。
Claims (10)
- 請求項1に記載の蛍光標識多糖の調製方法であって、
多糖を水に溶解した後、飽和臭化シアン溶液を加えて、3-20分間反応させ、反応が終了して得られた溶液を純化処理するステップ(1)と、
ステップ(1)で得られた純化溶液を乾固するまで濃縮させて、0.1-0.3Mのホウ砂溶液で溶解させ、式Iに示される蛍光染料を加えて、遮光下で反応させ、蛍光標識多糖を得るステップ(2)とを含む、ことを特徴とする調製方法。 - 前記ステップ(1)では、前記反応がpH>10の条件下で行われ、および/または、反応時間が5-10分間に制御される、ことを特徴とする請求項2に記載の調製方法。
- 前記ステップ(2)では、前記ホウ砂溶液の濃度が約0.2Mであり、前記ホウ砂溶液の使用量と前記多糖の使用量の比(mL:mg)が(0.1~1):1である、ことを特徴とする請求項2または3に記載の調製方法。
- 前記式Iに示される蛍光染料は、
フェニルヒドラジンを氷酢酸に加えて撹拌し、フェニルヒドラジンと3-メチル-2-ブタノンのモル比が1:(1.0-1.2)となるように、3-メチル-2-ブタノンをゆっくりと滴下して、滴下終了後、60-65℃に加熱して、3-4時間反応させ、抽出、濃縮、精製をして、中間体I’-1を得る、中間体I’-1を調製するステップ(1)と、
中間体I’-1と1,2-ジブロモエチレンのモル比が1:(1.5-2.0)となるように、中間体I’-1と1,2-ジブロモエチレンをトルエンに加えて、窒素ガスで保護し、加熱還流反応を16-18時間行い、冷却させて固体として中間体I’-2を析出させる、中間体I’-2を調製するステップ(2)と、
シクロヘキサノン、N,N-ジメチルホルムアミド、オキシ塩化リンのモル比が1:(1.0-1.1):(1.0-1.05)となるように、乾燥させたN,N-ジメチルホルムアミドを乾燥ジクロロメタンに加えて、氷浴下でオキシ塩化リンのジクロロメタン溶液を加えて撹拌し、シクロヘキサノンを加えて氷浴を取り除き、加熱還流反応を2-3時間行い、反応液を砕氷に注入して、一晩静置し、固体として中間体I’-4を析出させる、中間体I’-4を調製するステップ(3)と、
中間体I’-2と中間体I’-4をn-ブタノールとトルエンの混合液に加えて、加熱還流を2-3時間行い、固体を析出させて、濾過して中間体I’-5を得る、中間体I’-5を調製するステップ(4)と、
中間体1’-5とBr-R1-NH2をアミノ置換反応させて、反応過程にNaOHを加えて化合物Iを製造する、化合物Iを調製するステップ(5)とによって調製され、
合成スキームは以下に示される、ことを特徴とする請求項2から4のいずれか1項に記載の調製方法。
- 前記多糖を臭化シアンで活性化させて、前記多糖のヒドロキシ基位置にシアノ基を連結させ、前記シアノ基を前記蛍光染料のアミノ基に連結させる、ことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記XはBrである、ことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記多糖は、グルカン、キトサン、ペクチン多糖、マイタケ多糖、霊芝多糖、シイタケ多糖およびスピルリナ多糖から選ばれる少なくとも1種である、ことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 請求項1に記載の蛍光標識多糖の蛍光プローブの製造における使用。
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