JP7093524B2 - 蛍光標識多糖、およびその調製方法と用途 - Google Patents

Description

本発明は、医療用生物学的検出の技術分野に関し、具体的には、蛍光標識多糖、およびその調製方法と用途に関する。

蛍光標識技術とは、蛍光を発光可能な物質が共有結合または物理吸着などの手段により研究対象分子のある基に標識されて、その蛍光特性を利用して研究対象の情報を示すことである。蛍光標識試薬は研究対象（多糖、核酸、タンパク質、ポリペプチドなど）と吸着または共有結合すると、その蛍光特性が変化して、係る研究対象の性能に関する情報を示す。現代医学、生物学技術の継続的な発展、新規蛍光標識染料の開発および各種の先端蛍光検出技術や機器、たとえばフローサイトメトリー（ＦＣＭ）、レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＣＭ）などの適用に伴い、非放射性標識技術である蛍光標識は、操作しやすく、安定性が高く、感度が高く、選択性に優れたなどの特徴を有し、細胞内外物質の検出、組織および生きている動物の標識イメージング、薬物分析、病理モデル研究や疾患早期診断などに幅広く使用され得、生物医学研究の分野において重要な役割を果たす。

多糖は、複数の単糖分子を脱水重合して、グリコシド結合を介して連結させた糖鎖である。多糖は、重要な生体高分子であり、生体においてエネルギーを貯蔵したり構造を構成したりする役割を果たす。近年、糖化学および糖鎖生物学の継続的な発展に伴い、植物、海洋生物や菌類など、様々な漢方薬由来の多糖は生物学的活性を有する天然物の重要なタイプとして現れる。大量の研究を重ねた結果、漢方薬由来の多糖が細胞内の様々な生命活動の調節に関与して媒介し、抗腫瘍、抗菌、免疫調節、血糖降下、抗ウイルス、酸化防止、血中脂質降下、抗凝固、抗低酸素、抗老化などの生物学的活性を有するとともに、生体への毒性や副作用が小さいことを見出した。このため、多糖検出は糖類に基づく薬物研究や開発にとって大きな意義がある。蛍光検出法は、感度が高く、選択性に優れて、動的応答範囲が広く、生体内で検出できるなどの利点を有するので、多糖検出に幅広く使用されている。多糖そのものは発光基と蛍光基がないため、多糖の蛍光検出には、蛍光を発光する物質を多糖の還元末端に連結して、蛍光物質を検出することにより多糖に対する定性・定量的研究を行う。

従来、市販蛍光染料は、多数あり、スペクトル分布範囲が極めて広く、青色から赤色までカバーしているとともに、市販品として入手できる。しかし、従来の蛍光染料には、複数の問題が存在し、たとえば、蛍光染料のストークスシフトが一般に３０ｎｍ以下であるため、蛍光染料が消光しやすく、信号が不安定で、且つ異なる蛍光信号を区別しにくく、それによって糖分子への蛍光検出が制限されてしまう。

そのため、本発明が解決しようとする技術的課題は、ストークスシフトが小さく、蛍光信号が不安定で、異なる蛍光信号を効果的に区別できないという従来技術による蛍光標識多糖の欠陥を解消することにある。

このため、本発明は、式Ｉに示される構造を有する蛍光染料が多糖に共有結合されてなる蛍光標識多糖を提供する。

（式中、Ｘはハロゲンであり、Ｒ_１は水素、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基および複素環基から選ばれる１種である。）
上記した蛍光標識多糖において、前記多糖を臭化シアンで活性化させて、前記多糖のヒドロキシ基位置にシアノ基を連結させ、前記シアノ基を前記蛍光染料のアミノ基に連結されるようにしてもよい。
上記した蛍光標識多糖において、前記ＸはＢｒであるようにしてもよい。

上記した蛍光標識多糖において、前記蛍光染料は、式Ａ～式Ｇに示される構造を有するようにしてもよい。

上記した蛍光標識多糖において、前記多糖は、グルカン、キトサン、ペクチン多糖、マイタケ多糖、霊芝多糖、シイタケ多糖およびスピルリナ多糖から選ばれる少なくとも１種であるようにしてもよい。
本発明は、
多糖を水に溶解した後、飽和臭化シアン溶液を加えて３－２０分間反応させ、反応が終了して得られた溶液を純化処理するステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた純化溶液を乾固するまで濃縮させて、０．１－０．３Ｍのホウ砂溶液を溶解させ、式Ｉに示される蛍光染料を加えて、遮光下で反応させ、蛍光標識多糖を得るステップ（２）とを含む、上記蛍光標識多糖の調製方法を提供する。

上記した調製方法において、前記ステップ（１）では、前記反応がｐＨ＞１０の条件下で行われ、および／または、反応時間が５－１０分間に制御されるようにしてもよい。

上記した調製方法において、前記ステップ（２）では、前記ホウ砂溶液の濃度が約０．２Ｍであり、前記ホウ砂溶液の使用量と前記多糖の使用量の比（ｍＬ：ｍｇ）が（０．１～１）：１であるようにしてもよい。

上記した調製方法において、前記式Ｉに示される蛍光染料は、
フェニルヒドラジンと３－メチル－２－ブタノンのモル比が１：（１．０－１．２）となるように、フェニルヒドラジンを氷酢酸に加えて撹拌し、３－メチル－２－ブタノンをゆっくりと滴下して、滴下終了後、６０－６５℃に加熱して、３－４時間反応させ、抽出、濃縮、精製をして、中間体Ｉ’－１を得る、中間体Ｉ’－１を調製するステップ（１）と、
中間体Ｉ’－１と１,２－ジブロモエチレンのモル比が１：（１．５－２．０）となるように、中間体Ｉ’－１と１,２－ジブロモエチレンをトルエンに加えて、窒素ガスで保護し、加熱還流反応を１６－１８時間行い、冷却させて固体として中間体Ｉ’－２を析出させる、中間体Ｉ’－２を調製するステップ（２）と、
シクロヘキサノン、Ｎ,Ｎ－ジメチルホルムアミド、オキシ塩化リンのモル比が１： （１．０－１．１）：（１．０－１．０５）となるように、乾燥させたＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミドを乾燥ジクロロメタンに加えて、氷浴下でオキシ塩化リンのジクロロメタン溶液を加えて撹拌し、シクロヘキサノンを加えて氷浴を取り除き、加熱還流反応を２－３時間行い、反応液を砕氷に注入して、一晩静置し、固体として中間体Ｉ’－４を析出させる、中間体Ｉ’－４を調製するステップ（３）と、
中間体Ｉ’－２と中間体Ｉ’－４をｎ－ブタノールとトルエンの混合液に加えて、加熱還流を２－３時間行い、固体を析出させて、濾過して中間体Ｉ’－５を得る、中間体Ｉ’－５を調製するステップ（4）と、
中間体Ｉ’－５とＢｒ－Ｒ_１－ＮＨ_２をアミノ置換反応させて、反応過程にＮａＯＨを加えて化合物Ｉを製造する、化合物Ｉを調製するステップ（5）とを含み、
合成スキームは以下のとおりである。

本発明は、上記した蛍光標識多糖の蛍光プローブの製造における用途を提供する。

本発明の技術案は、下記利点を有する。

１．本発明に係る蛍光標識多糖は、式Ｉに示される構造を有する蛍光染料が多糖に共有結合されてなる。蛍光標識多糖は、血清などの検出環境での安定性が高く、また生体適合性が高く、毒性が低いため、細胞内外、組織や生きている動物に対する多糖検出に幅広く適用でき、多糖吸収、代謝***の検出や薬理学的研究などの分野において重要な意義がある。
式Ｉに示される蛍光染料が大きなストークスシフトを有し、蛍光染料分子の発光波長と励起波長をさらに分けるため、蛍光標識多糖は、蛍光検出に用いられる合、優れた蛍光安定性、高蛍光量子収率、またイメージング結果の高信号対雑音比といった利点を有する。また、長いストークスシフトは各種蛍光染料分子の区別し易さの向上に寄与し、多重蛍光検出に適用でき、このため、異なる蛍光で標識された複数種の多糖分子の検出を実現できる。また、本発明に係る蛍光標識多糖は、液相チッププローブとして生体内外の糖類分子を検出することに適しており、液相チップの検出対象や蛍光標識プローブの種類を増やす。

２．本発明に係る蛍光標識多糖の調製方法は、合成用の原料を入手しやすく、反応条件が温和で、操作しやすく、反応の選択性が高く、反応して調製された蛍光標識多糖は、高蛍光収率、高蛍光安定性および生物学的活性を兼ね備える。

本発明の実施形態または従来技術における技術案をより明瞭に説明するために、以下、実施形態または従来技術の説明に使用される図面を簡単に説明するが、勿論、以下の説明における図面は本発明の実施方式の一部に過ぎず、当業者であれば、創造的な努力を必要とせずに、これら図面に基づいてほかの図面を想到しうる。
実施例１における化合物Ｂの１Ｈ核磁気スペクトルである。 各濃度の本発明の実験例２において調製された蛍光標識グルカンによるＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の細胞活性への影響の検出ヒストグラムである。 各濃度の本発明の実験例３において調製された蛍光標識キトサンによるＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の細胞活性への影響の検出ヒストグラムである。 本発明の実験例２において調製された蛍光標識グルカンの、ＰＢＳまたは血清で各時間インキュベートしたときの化学純度図である。 本発明の実験例３において調製された蛍光標識キトサンの、ＰＢＳまたは血清で各時間インキュベートしたときの化学純度図である。 蛍光標識多糖のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞での蛍光強度の検出結果である。

以下、図面を参照しながら、本発明の技術案を明瞭かつ完全に説明するが、勿論、説明される実施例は本発明の実施例の一部に過ぎず、すべての実施例ではない。本発明における実施例に基づいて、当業者が創造的な努力を必要とせずに想到しうるすべてのほかの実施例は本発明の保護範囲に含まれる。また、互いに矛盾しない限り、以下に説明される本発明の各種実施形態における技術的特徴は組み合わせることができる。

本発明の実施例に使用される試薬などの基礎化学原料はすべて、中国国内の化学品市場から購入したり、関連する中間体製造工場に依頼して調製させたりすることができる。

核磁気共鳴装置（Ｂｒｕｋｅｒ ＤＲＸ－５００）、高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ２４４５）、γカウンタ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ１４７０）、元素分析計（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ２４０Ｃ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（米国Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、高速遠心分離機（米国ベックマン・コールター製Ｊ２－ＨＳ）。下記実施例における細胞はすべて上海生命科学研究院細胞所から購入される。

実施例１

本実施例は、下記式Ｂに示される構造を有する蛍光染料を提供する。

式Ｂに示した蛍光染料の合成スキームは以下のとおりである。

（１）中間体Ｉ’－１の調製
フェニルヒドラジンと３－メチル－２－ブタノンのモル比が１：１．１となるように、フェニルヒドラジンを氷酢酸に加えて撹拌し、３－メチル－２－ブタノンをゆっくりと滴下して、滴下終了後、６２．５℃に加熱して、３－４時間反応させ、抽出、濃縮、精製をして、中間体Ｉ’－１を得た。

（２）中間体Ｉ’－２の調製
中間体１－１と１,２－ジブロモエチレンのモル比が１：１．７５となるように、中間体Ｉ’－１と１,２－ジブロモエチレンをトルエンに加えて、窒素ガスで保護し、加熱還流反応を１７時間行い、冷却させて固体として中間体１’－２を析出させた。

（３）中間体Ｉ’－４の調製
シクロヘキサノン、Ｎ,Ｎ－ジメチルホルムアミド、オキシ塩化リンのモル比が１：１．０５：１．０２５となるように、乾燥させたＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミドを乾燥ジクロロメタンに加えて、氷浴下でオキシ塩化リンのジクロロメタン溶液を加えて撹拌し、シクロヘキサノンを加えて氷浴を取り除き、加熱還流反応を２．５時間行い、反応液を砕氷に注入して、一晩静置し、固体として中間体１’－４を析出させた。

（４）中間体Ｉ’－５の調製
中間体Ｉ’－２と中間体Ｉ’－４をｎ－ブタノールとトルエンの混合液に加えて、加熱還流を２．５時間行い、固体を析出させて、濾過して中間体Ｉ’－５を得た。

（５）化合物Ｂの調製
中間体Ｉ’－５を原料として、一般的なアミノ置換反応を行った。中間体Ｉ’－５にＢｒ－ＣＨ_３－ＮＨ_２を加えて反応させ、さらにＮａＯＨを加えて、目的化合物Ｂを得た。化合物Ｂの核磁気スペクトルは図１に示される。

元素分析の計算値：Ｃ３５Ｈ３９Ｂｒ３Ｎ４
質量スペクトル（ＭＳ＋）：７５２．０７（Ｍ＋）
ｍ／ｚ：７５４．０７（１００．０％）,７５６．０７（９７．７％）,７５５．０７（３９．３％）,７５７．０７（３８．７％）,７５２．０７（３４．２％）,７５８．０７（３２．０％）,７５３．０８（１３．１％）,７５９．０７（１２．２％）,７５６．０８（７．１％）,７５８．０８（７．０％）,７５４．０８（２．４％）,７６０．０７（２．４％）。
元素分析：Ｃ、５５．６５；Ｈ、５．２０；Ｂｒ、３１．７３；Ｎ、７．４２。

実施例２

本実施例は蛍光標識多糖を提供し、多糖はグルカン（ｓｉｇｍａ社購入、
品番００２６８）、蛍光染料の分子構造は以下のとおりであった。

蛍光標識多糖の製造方法は、下記ステップを含む。
１、飽和臭化シアン溶液および０．２ＭのＮａＯＨ溶液を調製する。
２、グルカン２０ｍｇを秤量して、グルカンを蒸留水１ｍｌに溶解し、十分に撹拌して溶解させ、臭化シアン溶液４ｍｌを加えて、７ｍｉｎ連続してＮａＯＨ溶液を１回ずつ２５μＩ加えて（ｐＨ＞１０に保持）、溶液の変化を観察し、沈殿が見られると、実験に失敗したことを示し、再操作する。
３、前のステップで得られた反応液について蒸留水を１－２日間透析させ、２－３ｈごとに透析外液を交換し、袋内の溶液を乾固するまで濃縮させて、ｐＨ＝８の０．２ＭＮａ_２Ｂ_４Ｏ_７．１２Ｈ_２Ｏ（ホウ砂）５～１０ｍｌを加えて、濃縮物を溶解させた後、式Ａに示される蛍光染料（約１．５ｍｇ）を少量加え、遮光下で一晩反応させる。前のステップで得られた溶液を４０℃の水浴に移して、遮光下で２４ｈ反応させ続ける。反応終了後、遠心分離して、上澄みを用いて蒸留水を遮光下で２日間透析させ、遠心分離後、凍結乾燥させて、蛍光標識グルカンを得る。蛍光染料で多糖を標識する方法の模式図を以下に示す。

実施例３

本実施例は蛍光標識多糖を提供し、多糖はキトサン（ｓｉｇｍａから購入、品番４４８８６９）であり、蛍光染料の分子構造は以下に示される。

蛍光標識多糖の調製方法は、下記ステップを含む。
１、飽和臭化シアン溶液および０．２ＭのＮａＯＨ溶液を調製する。
２、キトサン１０ｍｇを秤量して、キトサンを蒸留水１ｍｌに溶解し、十分に撹拌して溶解させ、臭化シアン溶液４ｍｌを加えて、９ｍｉｎ連続してＮａＯＨ溶液を１回ずつ２５μＩ加えて（ｐＨ＞１０に保持）、溶液の変化を観察し、沈殿が見られると、実験に失敗したことを示し、再操作する。
３、前のステップで得られた反応液について蒸留水を１－２日間透析させ、２－３ｈごとに透析外液を交換し、袋内の溶液を乾固するまで濃縮させ、ｐＨ＝８の０．２Ｍ Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７．１２Ｈ_２Ｏ（ホウ砂）１～１０ｍｌを加えて、濃縮物を溶解させた後、式Ａに示される蛍光染料（約１．５ｍｇ）を少量加え、遮光下で一晩反応させる。前のステップで得られた溶液を４０℃の水浴に移して、遮光下で２４ｈ反応させ続ける。反応終了後、遠心分離して、上澄みを用いて蒸留水を遮光下で２日間透析させ、遠心分離後、凍結乾燥させて、蛍光標識キトサンを得る。

実験例１ 蛍光染料の蛍光性質検出

１、測定対象化合物Ｂを正確に秤量して、５０体積％のエタノール溶液を用いて濃度１．０×１０^－５ｍｏｌ／Ｌの溶液を調製し、その蛍光スペクトルを測定して、化合物の近赤外スペクトルにおける最大吸収波長λ_ａｂｓを得た。

２、測定された近赤外スペクトルにおける最大吸収波長を、蛍光スペクトルの励起波長として、蛍光スペクトルを測定した。測定対象化合物を称量して、濃度１．０×１０^－６ｍｏｌ／Ｌのエタノール：水（５０：５０、ｖ／ｖ）溶液を調製し、その発光スペクトルの発光波長λｅｍを測定して、ストークスシフトを算出して、表１に示した。

３、蛍光染料のモル吸光係数の測定
紫外可視吸収スペクトルを利用して化合物のモル吸光係数を測定した。計算式は式（１）に示される。

式中、Ａは紫外吸収値、εはモル吸光係数、ｃは化合物の濃度、ｌは検出用の石英セルの厚みである。

４、蛍光染料の蛍光量子収率の測定
２０℃で蛍光染料の蛍光量子収率を測定して、硫酸キニーネ（溶媒０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４、量子収率０．５６）を参照物とし、蛍光染料と参照物質の希溶液について同じ励起条件で得られた蛍光積分強度と該励起波長での紫外吸収値を測量することによって、蛍光量子収率を算出した。生成物を無水エタノールに溶解した。
計算式は式（２）に示される。

式中、Φは被測定物の量子収率であり、下付き文字Ｒは参照物を示す。Ｉは蛍光積分強度、Ａは紫外吸収値である。ηは溶媒屈折率である。一般的には、紫外吸収値Ａ、Ａ_ｒがともに０．１未満であることが要求される。

表１から明らかなように、式Ｂに示される蛍光染料は、蛍光量子収率が＞８５％であり、ストークスシフトが大きく、多糖などの生物分子を標識して蛍光プローブを製造することに適し、蛍光性能が安定しており、蛍光量子率が高いとともに、イメージングの信号対雑音比が高い核酸分子検出を実現できた。

実験例２ 蛍光標識多糖の毒性検出

１． 細胞毒性実験
実施例２で調製された蛍光標識グルカンと実施例３で調製された蛍光標識キトサンのＨＥＫ－２９３Ｔ（ヒト胚性腎細胞）における細胞毒性をＭＴＴ実験により測定し、測定には下記ステップを含む。
（１）１ウェルあたり５×１０^３個の細胞／１００μＬの密度で、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに接種して、培地をＤＭＥＭとし、５％ＣＯ_２を含む３７℃の恒温インキュベータにおいて一晩培養した。
（２）実施例２で調製された蛍光標識グルカン、および実施例３で調製された蛍光標識キトサンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解させて、濃度０．１ｍｏｌ／Ｌの母液を調製し、ＤＭＥＭ培地を用いて希釈して、濃度がそれぞれ８０μｍｏｌ／Ｌ、４０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ及び５μｍｏｌ／Ｌの溶液にして使用時まで保管し、別にＤＭＥＭ培地を等体積の脱イオン水に加えて希釈し、ここで蛍光標識多糖の濃度を０μｍｏｌ／Ｌにした。
（３）ステップ（１）の９６ウェルプレートにおける原培地を上記ステップ（２）で調製された薬液濃度がそれぞれ０μｍｏｌ／Ｌ、５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌ、４０μｍｏｌ／Ｌおよび８０μｍｏｌ／ＬのＤＭＥＭ培地に交換し、１ウェルあたり２００μＬとし、各薬物濃度ごとに６個のウェルを設置した。次に、９６ウェルプレートを５％Ｃ〇_２を含有する３７℃の恒温インキュベータに入れて、それぞれ３ｈ、６ｈ、１２ｈおよび２４ｈインキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルにＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを加えて４ｈ培養し続けた。培養終了後、培地を吸い取り、１ウェルにＤＭＳＯ １５０μＬを加えて、シェーカーにおいて、結晶が完全に溶解するまで１０ｍｉｎ振動させた。酵素標識法を用いて４９０ｎｍでの各ウェルの吸光度値を測定し、実験結果を少なくとも三回の独立実験の平均値とした。

各薬物濃度および各インキュベート時間では、蛍光標識グルカンによるＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の生存率への影響のヒストグラムを図２に示し、蛍光標識キトサンによるＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の生存率への影響のヒストグラムを図３に示した。薬物作用時間の延長および化合物濃度の増大に伴う細胞生存率の変化が有意ではなく、且つ２４ｈ内で、細胞生存率がすべて９０％より大きく、このことから、蛍光標識多糖はＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に対して安全で低毒性であり、優れた生体適合性を有すると判定できた。

実験例３ 蛍光標識多糖の安定性実験

（１）４つのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）緩衝液８００μＬと実施例２で調製された蛍光標識グルカン溶液２００μＬとを準備してそれぞれ混合し、３７℃で０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ加熱した。少量の上記溶液を希釈して、放射性高速液体により標識生成物の安定性を検出し、高速液体条件として、水（濃度０．１体積％のＴＦＡ含有）を移動相Ａ、ＣＨ_３ＣＮ（濃度０．１体積％のＴＦＡ含有）を移動相Ｂとして、０ｍｉｎ→３ｍｉｎ、移動相Ａ：移動相Ｂの体積比８０：２０→８０：２０；３ｍｉｎ→２５ｍｉｎ、移動相Ａ：移動相Ｂの体積比８０：２０→１０：９０；２５ｍｉｎ→３０ｍｉｎ、移動相Ａ：移動相Ｂの体積比１０：９０→８０：２０；移動相の流速を１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度を２５℃に制御するようなプロセスに従って、勾配溶出を行った。次に、４つのマウス血清（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ社から購入）８００μＬと実施例２で調製された式蛍光標識グルカン溶液２００μＬを準備してそれぞれ混合し、３７℃で０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ加熱し、次に、上記溶液１００μＬを取り、アセトニトリル１００μＬを加えて、高速遠心分離機を用いて１００００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上層の澄み液について、高速液体クロマトグラフィーにより標識生成物の安定性を検出し、高速液体条件として、水（濃度０．１体積％のＴＦＡ含有）を移動相Ａ、ＣＨ_３ＣＮ（濃度０．１体積％のＴＦＡ含有）を移動相Ｂとし、０ｍｉｎ―３ｍｉｎ、移動相Ａ：移動相Ｂの体積比８０：２０→８０：２０；３ｍｉｎ→２５ｍｉｎ、移動相Ａ：移動相Ｂの体積比８０：２０→４０：９０；２５ｍｉｎ→３０ｍｉｎ、移動相Ａ：移動相Ｂの体積比１０：９０→８０：２０；移動相の流速を１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度を２５℃に制御するようなプロセスに従って、勾配溶出を行った。図４は、蛍光標識グルカンの、ＰＢＳまたは血清において各時間インキュベートしたときの液体クロマトグラフィーによる化学純度図である。
（２）ステップ（１）における検出方法を用いて、蛍光標識キトサンの、ＰＢＳまたは血清において各時間インキュベートしたときの化学純度を測定し、結果を図５に示した。

図４および図５からわかるように、インキュベートの進行に伴い、蛍光標識キトサンと蛍光標識グルカンのＰＢＳおよび血清での放射性化学純度がわずかに低下したが、４ｈになっても、ＰＢＳと血清での化学純度は９５％より高かった。これは、蛍光標識アミノ酸が体外で優れた安定性を有し、さらなるインビボ実験研究に適することを示した。

実験例４ 蛍光標識多糖の蛍光強度検出図

（１）ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベータにおいて対数期まで培養した。
（２）１×１０^５個／ウェルで、スライド（スライドは７５％エタノールに５ｍｉｎ浸漬することで消毒し、Ａｓｓｉｔｅｎｔ社から購入したものである）を備えた１２ウェルプレートに接種して、一晩培養した。
（３）細胞上清を吸い取り、培地で最終濃度１ｍｇ／ｍｌに希釈された、実施例２で調製された蛍光標識グルカンと実施例３で調製された蛍光標識キトサンをそれぞれ加えて、細胞インキュベータにおいてさらに２４ｈ培養した。
（４）培養を停止して、ウェルプレートにおけるスライドを新しい１２ウェルプレートに移し、ＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ－２０含有）を加えて３－４回リンスし、４％ポリオキシメチレンを加えて室温で１５ｍｉｎ固定し、ＰＢＳＴで３－４回リンスし、最終濃度１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（米国Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ社から購入）溶液を加えて、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＰＢＳで３－４回リンスし、封入して、レーザー共焦点顕微鏡（日本オリンパス社から購入）下で観察した。

図６は蛍光標識多糖のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞での蛍光強度の検出結果を示しており、図中に、蛍光標識グルカンのＨＥＫ－２９３Ｔ細胞での蛍光検出結果、蛍光標識キトサンのＨＥＫ－２９３Ｔ細胞での蛍光検出結果、およびＨＥＫ－２９３Ｔ細胞のＤＡＰＩ染色結果が左から右へ順次示されている。図６からわかるように、蛍光標識グルカンと蛍光標識キトサンでインキュベートした細胞のいずれにも、明らかな蛍光強度が検出されており、それは、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞が上記蛍光標識多糖を取り込み、且つ多糖は蛍光染料により標識されると高蛍光発光強度を有することを示した。

勿論、上記実施例は、明瞭に説明するために例示したものに過ぎず、実施形態を限定するものではない。当業者であれば、上記説明に基づいて様々な変化または改良をすることができる。ここですべての実施形態を説明するのが不可能なことである。これら実施形態に基づいて容易に想到しうる変化または改良も本発明の保護範囲に含まれる。

Claims (10)

1. 蛍光標識多糖であって、式Ｉに示される構造を有する蛍光染料が多糖に共有結合されてなることを特徴とする蛍光標識多糖。
   

   

   
   （式中、Ｘはハロゲンであり、Ｒ_１は、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基および複素環基から選ばれる１種である。）
2. 請求項１に記載の蛍光標識多糖の調製方法であって、
   多糖を水に溶解した後、飽和臭化シアン溶液を加えて、３－２０分間反応させ、反応が終了して得られた溶液を純化処理するステップ（１）と、
   ステップ（１）で得られた純化溶液を乾固するまで濃縮させて、０．１－０．３Ｍのホウ砂溶液で溶解させ、式Ｉに示される蛍光染料を加えて、遮光下で反応させ、蛍光標識多糖を得るステップ（２）とを含む、ことを特徴とする調製方法。
3. 前記ステップ（１）では、前記反応がｐＨ＞１０の条件下で行われ、および／または、反応時間が５－１０分間に制御される、ことを特徴とする請求項２に記載の調製方法。
4. 前記ステップ（２）では、前記ホウ砂溶液の濃度が約０．２Ｍであり、前記ホウ砂溶液の使用量と前記多糖の使用量の比（ｍＬ：ｍｇ）が（０．１～１）：１である、ことを特徴とする請求項２または３に記載の調製方法。
5. 前記式Ｉに示される蛍光染料は、
   フェニルヒドラジンを氷酢酸に加えて撹拌し、フェニルヒドラジンと３－メチル－２－ブタノンのモル比が１：（１．０－１．２）となるように、３－メチル－２－ブタノンをゆっくりと滴下して、滴下終了後、６０－６５℃に加熱して、３－４時間反応させ、抽出、濃縮、精製をして、中間体Ｉ’－１を得る、中間体Ｉ’－１を調製するステップ（１）と、
   中間体Ｉ’－１と１,２－ジブロモエチレンのモル比が１：（１．５－２．０）となるように、中間体Ｉ’－１と１,２－ジブロモエチレンをトルエンに加えて、窒素ガスで保護し、加熱還流反応を１６－１８時間行い、冷却させて固体として中間体Ｉ’－２を析出させる、中間体Ｉ’－２を調製するステップ（２）と、
   シクロヘキサノン、Ｎ,Ｎ－ジメチルホルムアミド、オキシ塩化リンのモル比が１：（１．０－１．１）：（１．０－１．０５）となるように、乾燥させたＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミドを乾燥ジクロロメタンに加えて、氷浴下でオキシ塩化リンのジクロロメタン溶液を加えて撹拌し、シクロヘキサノンを加えて氷浴を取り除き、加熱還流反応を２－３時間行い、反応液を砕氷に注入して、一晩静置し、固体として中間体Ｉ’－４を析出させる、中間体Ｉ’－４を調製するステップ（３）と、
   中間体Ｉ’－２と中間体Ｉ’－４をｎ－ブタノールとトルエンの混合液に加えて、加熱還流を２－３時間行い、固体を析出させて、濾過して中間体Ｉ’－５を得る、中間体Ｉ’－５を調製するステップ（４）と、
   中間体１’－５とＢｒ－Ｒ_１－ＮＨ_２をアミノ置換反応させて、反応過程にＮａＯＨを加えて化合物Ｉを製造する、化合物Ｉを調製するステップ（５）とによって調製され、
   合成スキームは以下に示される、ことを特徴とする請求項２から４のいずれか１項に記載の調製方法。
   

   
6. 前記多糖を臭化シアンで活性化させて、前記多糖のヒドロキシ基位置にシアノ基を連結させ、前記シアノ基を前記蛍光染料のアミノ基に連結させる、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
7. 前記ＸはＢｒである、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
8. 前記蛍光染料は式Ｂ～式Ｇに示される構造を有する、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
   

   

   

   
   
9. 前記多糖は、グルカン、キトサン、ペクチン多糖、マイタケ多糖、霊芝多糖、シイタケ多糖およびスピルリナ多糖から選ばれる少なくとも１種である、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
10. 請求項１に記載の蛍光標識多糖の蛍光プローブの製造における使用。

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