CN110078844B - 一种识别肼的近红外荧光聚合物探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种识别肼的近红外荧光聚合物探针及其制备方法和应用,具体公开了式Ⅰ结构的近红外荧光聚合物探针。本发明提供的聚合物探针是由近红外荧光分子与生物相容性壳聚糖经过化学反应而成,其中,近红外荧光分子作为近红外荧光响应单元,能够与肼发生化学反应发出红光,实现对肼的特异性响应。壳聚糖作为聚合物的主链构成单元,赋予聚合物良好的水溶性和生物相容性。本发明提供的近红外荧光聚合物探针可用于水溶液中、活细胞内及活体内的肼检测及成像,在环境监测、生物成像与传感方面具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于高分子材料与化学传感器领域,具体涉及一种识别肼的近红外荧光聚合物探针及其制备方法和应用。
背景技术
肼(N2H4)又称联氨,是一种有强还原性的化工原料,在工业生产中有着广泛的应用,可用来生产防腐剂、抗氧剂、除草剂和植物生长调节剂等。另外,N2H4具有很高的燃烧热,可用作火箭和燃料电池的燃料。然而N2H4是一种有毒物质,在生产、运输应用过程中的泄露会导致对环境的污染。在活体细胞中没有内生的肼,但是肼可以通过呼吸或皮肤接触而被人体吸收,对人体的肝脏、肺、肾脏和中枢神经***造成严重的破坏。考虑到肼对人体的危害,美国环保署已经将肼列为可能的致癌物质之一,它的含量在很低值10ppb时就可能引发癌症。因此,实现对环境和生物样品中微量肼含量的准确检测具有重要的研究意义。
目前,一些用于肼检测的小分子荧光探针已有报道。专利CN2018113640004和专利CN2017108918744涉及的探针荧光最大发射波长仅560nm,离理想的近红外成像窗口650-900nm差距较大,这会给细胞带来光致毒性,还会诱导组织自发荧光干扰(短波长的发射光成为组织中生物荧光分子的激发光),其他报道的荧光探针多是非水溶性的荧光有机小分子。这些荧光小分子在生物环境中容易被生物酶破坏,限制了其在生命科学、医学等领域中的应用。因此,设计合成出适合于细胞内肼水平检测、使用量少、安全低毒的探针,实现对细胞内肼的监测并进一步辅助相应疾病和病理的研究,是本领域人员需要不断去探索和创造的内容。
发明内容
为了克服现有技术中的上述缺陷,本发明旨在提供一种识别肼的近红外荧光聚合物探针及其制备方法。本发明的核心在于利用方酸菁近红外荧光和壳聚糖生物相容性。与小分子荧光探针相比,本发明的聚合物探针是以壳聚糖聚合物链为基础,利用多个肼-方酸菁识别位点和邻近羟基的协同结合作用,利用弱的超分子相互作用来富集低浓度肼污染物。因此,肼与接枝方酸菁衍生物的特异性化学反应显著加快,缩短荧光响应时间(小于1min)、提高检测灵敏度。
本发明的第一目的是提供一种识别肼的近红外荧光聚合物探针,解决现有肼传感器细胞光毒性和稳定性问题。本发明所述的识别肼的近红外荧光聚合物探针,其具有式Ⅰ的通式结构:
式Ⅰ
其中n=30~120。
本发明第二个目的是提供一种识别肼的近红外荧光聚合物探针的制备方法,具体步骤为:将壳聚糖和近红外荧光分子混合,在组合催化剂作用下进行酰化反应,得到含肼响应荧光功能受体分子的壳聚糖衍生物探针。
优选的,所述近红外荧光分子具有式Ⅱ结构:
优选的,所述壳聚糖与近红外荧光分子Ⅱ的质量份数分别为:壳聚糖1~3份,近红外荧光分子5~10份。
优选的,所述壳聚糖的分子量Mw为5kDa~20kDa,脱乙酰度为0.8~0.95。
优选的,所述组合催化剂为N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺。
优选的,所述N-羟基丁二酰亚胺、近红外荧光分子Ⅱ与1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺的摩尔比为1:1: 3~5。
优选的,所述酰化反应在室温条件下进行,反应时间为12~48h。
本发明的第三个目的是提供一种识别肼的近红外荧光聚合物探针在特异性检测水溶液中肼的应用。
本发明的第四个目的是提供一种识别肼的近红外荧光聚合物探针在特异性检测细胞内源性或外源性肼的应用。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
1)本发明提供的荧光探针是生物相容性的,探针结构中的壳聚糖组分保证了探针的水溶性和细胞相容性;
2) 本发明提供的近红外荧光聚合物探针含有的生色团以化学键结合在高分子中,不容易脱落;
3)本发明提供的近红外荧光聚合物探针含有的生色团分布均匀,含量稳定,发光性能和光导性能良好;
4)本发明提供的近红外荧光聚合物探针,具有良好的光稳定性,其吸收波长为633nm,发射波长为689nm,在生物安全近红外(NIR)窗口600-900nm范围内,具有荧光“关-开”型响应,能大大消除检测时检测背景对结果的干扰,提高检测的准确度;
5)本发明提供的方酸菁类染料的“关-开型”肼探针及其对肼溶液具有良好的响应,能够实现对细胞内肼的检测,具有成本低廉、响应灵敏、易于推广和应用等优点。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为本发明的识别肼的近红外荧光聚合物探针的紫外-可见吸收光谱图;
图2是本发明实施例1中探针随不同量肼的加入荧光谱图的变化图;
图3是本发明实施例1中探针与2当量肼在1min内,689nm处荧光强度值随时间变化的变化图;
图4是本发明实施例1中探针对不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图,其中a是不同金属阳离子及肼与探针的荧光强度变化图,b是不同阴离子及肼与探针的荧光强度变化图,c是不同分子及肼与探针的荧光强度变化图;
图5是本发明实施例1中探针在HeLa细胞中肼响应的荧光成像图,其中(a)是参照组,(b)是实验组。
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图,仅以示意方式说明本发明的基本结构,因此其仅显示与本发明有关的构成。
本发明的一种识别肼的近红外荧光聚合物探针,其分子通式结构如式Ⅰ。
式Ⅰ
本发明提供的一种识别肼的近红外荧光聚合物探针的制备方法包括如下步骤:
以壳聚糖作为聚合物主链,近红外荧光分子为可激活荧光功能分子,通过壳聚糖的氨基与近红外荧光分子的羧基发生酰胺化反应为壳聚糖引入具有能够特异性识别肼而“开启”近红外荧光分子,得到能识别肼的近红外荧光聚合物探针。
本发明使用的近红外荧光分子具有式Ⅱ结构:
式Ⅱ
壳聚糖是天然生物高分子,来源极为广泛、安全无毒,价格低廉,与合成高分子相比,具有良好的生物相容性和生物可降解性,因此,以壳聚糖为原料,制得的聚合物探针作为溶液或细胞中肼探针具有很高的环境友好性和生物安全性。
实施例1识别肼的近红外荧光聚合物探针的制备
取3.0g壳聚糖(Mw=10kDa,DA=0.85)溶于25mLN,N’-二甲基甲酰胺中(DMF),在通氮气保护下加入5.0g近红外荧光分子Ⅱ和5mL含0.01molN-羟基丁二酰亚胺(NHS),再加入0.04mol1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC),室温条件下搅拌反应24h。在去离子水中透析两天、真空冷冻干燥,得到目标探针,放于紫外吸收光谱仪中进行测试,得到图1所示紫外-可见吸收光谱,可见目标近红外荧光探针在水溶液中的最大吸收峰位于633nm处。
实施例2近红外荧光聚合物探针与不同当量的N2H4反应的荧光光谱变化
向实施例1制备的探针溶液(5μmol/L)中加入不同当量(0~3equiv)的肼溶液,混合均匀,然后振荡30min,进行荧光滴定测试。由图2可见,随着肼的逐渐加入,探针在698nm处的荧光峰值逐渐增强。当荧光强度达到最大值时,比探针空白液的荧光强度增强约20倍。
实施例3近红外荧光聚合物探针对肼的响应时间测试
用移液枪分别取40μL探针母液(1mmol/L)、360μL DMF、120μL肼溶液(1mmol/L)、3480mL蒸馏水置于洁净干燥的小瓶子中,加完后立即振荡摇匀,并开始计时,每5s测一次溶液的荧光强度,一直测到第1min,进行荧光滴定测试,得到的荧光谱图见图3。实验结果证明,本发明的近红外荧光聚合物探针与肼反应1分钟后其荧光强度就已经趋于稳定。
实施例4 近红外荧光聚合物探针对不同检测物种的选择性研究
取实施例1制备的近红外荧光聚合物探针溶于DMF中,配制成浓度为1mmol/L的探针母液;用蒸馏水作溶剂,配制各种浓度同样为1mmol/L的检测物种金属阳离子K+,Ca2+,Na+,Mg2+, Zn2+,Fe3+,Co2+,Mn2+,Cu2+;阴离子F-,Cl-,Br-,I-,S2-,SO4 2-,SCN-,CO32-,NO3-,Ac-和分子NH3·H2O, H2O2,N(C2H5)3,NH2OH,NH2CONH2储备液。用移液枪分别加入体积比为1:3的探针和检测物种,然后用DMF和二次蒸馏水稀释(VDMF:VH2O=1:9),使得探针和检测物种在荧光比色皿中的最终浓度分别为10μmol/L和30μmol/L。将配制好的溶液摇匀,反应5min,然后测试它们的荧光光谱。由图4可看出,肼与探针作用后,具有良好的选择性,荧光强度增强13倍左右,而其它的检测物种对探针的荧光几乎没有影响。
实施例5:近红外荧光聚合物探针对细胞中肼的荧光成像
从实施例2 中荧光探针母液(5μmol/L)中取出10 μL加入到育有HeLa细胞、并含有1mLPBS培养基的培养皿中,孵育30分钟,制备两份参照组;在其中一组参照组样品中加入10μmol/L的肼,继续孵育20分钟,作为实验组。随后分别用共聚焦显微镜对参照组和实验组进行荧光成像,使用激发波长为630nm的光源激发,收集650-800 nm范围的荧光,结果如图5所示。实验结果表明在参照组的荧光成像中,几乎观察不到荧光;然而,在实验组中,可以观察到明显的红色荧光,荧光显著增强,说明本发明的识别肼的近红外荧光聚合物探针可以通过共聚焦显微镜检测细胞环境中的肼,具有潜在的实际应用价值。
本发明提供的一种识别肼的近红外荧光聚合物探针是一种方酸菁衍生物,其含有的乙酰基与肼会发生缩合反应生成腙,进而使得原有PET 效应消失而产生荧光,进而获得荧光“关-开”型的荧光响应,大大提高了检测的灵敏度。
以上述依据本发明的理想实施例为启示,通过上述的说明内容,相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内,进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容,必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (9)
2.权利要求1所述的识别肼的近红外荧光聚合物探针的制备方法,其特征在于,包括步骤:将壳聚糖和近红外荧光分子混合,在组合催化剂作用下进行酰化反应,得到含肼响应荧光功能受体分子的壳聚糖衍生物探针。
4.根据权利要求2所述的识别肼的近红外荧光聚合物探针的制备方法,其特征在于,所述壳聚糖与近红外荧光分子的质量份数分别为:壳聚糖1~3份,近红外荧光分子5~10份。
5.根据权利要求2所述的识别肼的近红外荧光聚合物探针的制备方法,其特征在于,所述组合催化剂为N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺。
6.根据权利要求5所述的识别肼的近红外荧光聚合物探针的制备方法,其特征在于,所述N-羟基丁二酰亚胺、近红外荧光分子与1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺的摩尔比为1:1:3~5。
7.根据权利要求2所述的识别肼的近红外荧光聚合物探针的制备方法,其特征在于,所述酰化反应在室温条件下进行,反应时间为12~48h。
8.根据权利要求2所述的识别肼的近红外荧光聚合物探针的制备方法,其特征在于,所述壳聚糖的分子量Mw为5kDa~20kDa,脱乙酰度为0.8~0.95。
9.权利要求1所述的识别肼的近红外荧光聚合物探针在特异性检测水溶液中肼的应用。
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