JP7077263B2 - 二重特異性ｈｅｒ２抗体及び使用方法 - Google Patents

二重特異性ｈｅｒ２抗体及び使用方法 Download PDF

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Description

本発明は、二重特異性ＨＥＲ２抗体、新規ＨＥＲ２変異体、それらの製造方法、該抗体を含有する薬学的組成物及びその使用に関する。
腫瘍関連抗原に対して特異的な抗体は、損傷を受けていない健常細胞及び組織を残しつつ、それらは腫瘍細胞の選択的破壊を媒介するゆえに、がん治療における貴重なアプローチである。
受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーのメンバーは、細胞増殖、分化及び生存の重要なメディエーターである。受容体ファミリーは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２又はｐｌ８５”ｅ”）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４又はｔｙｒｏ２）を含む４つの異なるメンバーを含む。ＨＥＲ２は膜貫通表面結合受容体チロシンキナーゼであり、通常、細胞の増殖及び分化をもたらすシグナル伝達経路に関与している。ＨＥＲ２は、それが乳がん患者の約四分の一で過剰発現されることが見出されたので、乳がんの治療のための有望な標的である（Bange et al, 2001, Nature Medicine 7:548）。
マウスモノクローナル抗体４Ｄ５は、ＨＥＲ２の生理学的レベルを発現する細胞に影響を与えることなく、ＨＥＲ２を過剰発現するがん細胞において特異的にＨＥＲ２を標的とする。ヒト化（４Ｄ５）モノクローナル抗体（たＨｕ４Ｄ５）は、１９９８年後半にＦＤＡの販売認可を得たハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２、米国特許第５８２１３３７号）として商業的に知られている。
ハーセプチンは、ＨＥＲ２陽性乳がんの治療のために開発された最初のモノクローナル抗体であり、それらは現在ＨＥＲ２陰性乳がんを有する患者の場合と同じになるように患者の生存時間を増加させている。ハーセプチン治療の前に、短い生存転帰が、ＨＥＲ２陰性疾患の患者に比べて、ＨＥＲ２陽性乳がんと診断された患者に対して期待された。ＣＬＥＯＰＡＴＲＡ試験では、ＰＥＲＪＥＴＡはハーセプチンと化学療法と組み合わせて、ハーセプチンよりも更にこの攻撃的な疾患を有する患者の生存時間の延長を示した。
ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡＴＭ、ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４、米国特許第７８６２８１７号）はヒト化モノクローナル抗体であり、腫瘍増殖及び生存に役割を果たしていると考えられているプロセスである、ＨＥＲ２受容体の細胞の表面上の他のＨＥＲ受容体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４）とのペアリング（二量化）を防ぐために特別に設計されている。ＰＥＲＪＥＴＡ、ハーセプチン及び化学療法の組み合わせは、ＨＥＲシグナル伝達経路のより包括的な遮断を提供すると考えられる。ＰＥＲＪＥＴＡは、ＨＥＲ２陽性転移性又は局所的に再発性の切除不能乳がんを有する成人患者においてハーセプチン（トラスツズマブ）とドセタキセルと組み合わせて承認され、２０１３年９月にネオアジュバント乳がん治療のためのＦＤＡの承認を得た。トラスツズマブは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに結合する一方、ペルツズマブは、二量体化のために不可欠なＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する。
Li et al (Cancer Research. 2013) は、トラスツズマブ耐性を克服するＥｒｂＢ２に対する二重特異性、二価抗体を記載している。そこに記載された二重特異性、二価抗体は、天然型トラスツズマブ及びペルツズマブ配列に基づいている。
驚くべきことに、本願の発明者は、天然型トラスツズマブ及びペルツズマブの配列を最適化し、二つの異なる改良された二重特異性、一価抗体フォーマットでこれらの最適化された変異体を組み合わせると、単一特異的抗体のｒｈｕＭＡｂ２Ｃ４とＨＵ４Ｄ５の組み合わせと比較して改良された特性をもたらすことを見いだした。更に、抗体は、それらが、一価であり、２つの単一特異性抗体ペルツズマブ及びトラスツズマブと同じ分子量を有しているので、Ｌｉらに開示された二価抗体フォーマットより優れている。従って、新規二重特異的フォーマットは、古典的な単一特異性抗体の利点を有する当該技術分野で知られている二重特異性ＨＥＲ２抗体の優れた特性を兼ね備える。本発明の新規な二重特異性ＨＥＲ２抗体は、二つの異なるＨＥＲ２エピトープに対して一価であり、二価親抗体と同様の結合活性効果をもたらす。対照的に、四価抗体は、細胞上のＨＥＲ２に対するそれらの結合活性が異なってもよい。新規二重特異性ＨＥＲ２抗体の結合活性効果は、ＨＥＲ２及び／又はＡＤＣＣの阻害が所望され得ない正常組織又は心臓組織におけるなどの低ＨＥＲ２発現を有する細胞型において優れた安全性・ウィンドウをもたらし得る。
更に、本明細書中に記載の二重特異性抗体は、親の１５０ＫＤのＩｇＧ１抗体の拡散定数に一致する、それらの天然のＩｇＧアーキテクチャに起因した二価親抗体と同じ拡散定数を有する。天然のＩｇＧのアーキテクチャに起因して、更に、免疫原性のリスク及び抗薬物抗体の形成を低減することが期待できる。大事なことを言い忘れていたが、四価二重特異性抗体と比較して、ＨＥＲ２細胞外ドメインとの免疫複合体の形成の危険性は、一価及び親抗体に同等であることによって低減される。免疫複合体は、抗原提示細胞によって取り込まれた複合体の増強免疫原性をもたらすことができ、免疫複合体が腎臓に沈着された場合、最終的に腎毒性を誘発することができる。
本発明の一態様では、一価の二重特異性抗体が生成され、ここで、ＩｇＧ分子のＦａｂ断片の一つは、クロスオーバーＦａｂ断片により置換される。クロスオーバーＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されるＦａｂ断片である。クロスオーバーＦａｂ断片を含む二重特異性抗体フォーマットは、例えば、ＷＯ２００９０８０２５２、ＷＯ２００９０８０２５３、ＷＯ２００９０８０２５１、ＷＯ２００９０８０２５４、ＷＯ２０１０／１３６１７２、ＷＯ２０１０／１４５７９２及びＷＯ２０１３／０２６８３１に記載される。天然型トラスツズマブ配列は、自発的な化学修飾に対する抗体のＣＤＲの安定性を改善するために、それらのＣＤＲにおいて最適化されており、得られた配列は誤対合を避けるためにフレームワークが移植され、二重特異性抗体は糖鎖を操作され、増強されたＦｃγＲＩＩＩ結合を有するＨＥＲ２に特異的に結合する非常に強力な二重特異性抗体が得られ、ＮＫ細胞又は単球／マクロファージなどの免疫エフェクター細胞の増強された動員をもたらし；最後に、それらは、従来の親のＨｅｒ２抗体に匹敵する高収率及び副生成物のほんの低い割合で製造することができる。ＨＥＲ２二重特異ＣｒｏｓｓＭＡｂ抗体の場合には、ペルツズマブ及びトラスツズマブの両方が同等のフレームワーク領域に基づいているという事実に起因する軽鎖の鎖誤対合は、完全に新規抗体フレームワークにＣＤＲを移植することによって克服された。
本発明の別の態様において、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶ及びＩＩに特異的に結合する一価二重特異性抗体が提供され、２つの結合部分は、親トラスツズマブとペルツズマブ軽鎖のコンセンサスに基づく同一の軽鎖を含み、対応するペルツズマブ重鎖はリモデリングされている。このいわゆる「共通の軽鎖」原理、即ち、１つの軽鎖を共有するが、依然として別々の特異性を持つ二つのバインダーを組み合わせることの使用により、軽鎖誤対合を防止し、この特定のケースでは親抗体のエピトープ特異性を保持する。その結果、製造時により少ない副生成物を生じ、高収率でＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子の均一な調製を容易にする。驚くべきことに、本発明の発明者は、一価共通軽鎖フォーマットの二重特異性ＨＥＲ２抗体は、親抗体の組み合わせと比較して、ペルツズマブエピトープに対する増加した親和性を有し、細胞増殖における優れた阻害効果及び細胞依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘導を示すことを見いだした。補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、最適な治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂの）機能のために非常に重要であり、化学療法後においてもなお完全に保存されている。しかしながら、この活性は幾つかの抗体によって生み出されるが抗体の全てによってではない。
概要
本発明は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第一抗原結合部位及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第二抗原結合部位を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体に関し、ここで、前記二重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶの両方に対して一価である。一実施態様において、二重特異性抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をペルツズマブ又はトラスツズマブの組み合わせよりも高度に誘導する。このような一実施態様において、二重特異性抗体の補体依存性細胞傷害は、ＬＤＨアッセイ又は補体アッセイによって決定され、同じアッセイによって決定される場合、ペルツズマブとトラスツズマブの組み合わせの補体依存性細胞傷害に対して比較される。一実施態様において、補体依存性細胞傷害は、インビトロで、がん細胞において、好ましくは乳がん細胞において決定される。一態様において、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的に結合可能な第一Ｆａｂ分子、
及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合可能な第二Ｆａｂ分子を含み、ここで、第一Ｆａｂ分子の可変軽鎖の配列は、第二Ｆａｂ分子の可変軽鎖の配列と同一である。一態様において、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、（ａ）配列番号５５、配列番号５８及び配列番号１４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号７７、配列番号１５及び配列番号６０からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５６、配列番号５９及び配列番号１６からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む第一重鎖、及び（ｂ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３０及び配列番号７９からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む第二重鎖；及び（ｃ）第一及び第二軽鎖を含み、ここで、第一及び第二軽鎖の可変軽鎖は、配列番号８９、配列番号９０及び配列番号１９を含む。一態様において、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖、配列番号６４、配列番号７０及び配列番号６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一重鎖、並びに配列番号９２及び配列番号１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二重鎖を含む。一態様において、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的に結合可能な第一Ｆａｂ分子、
及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合可能な第二Ｆａｂ分子を含み、ここで、少なくとも一のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される。一態様において、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む第一Ｆａｂ分子、及び配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号７９の重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１０７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む第二Ｆａｂ分子を含む。一態様において、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む第一Ｆａｂ分子、及び配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号７９、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８７、配列番号８８からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１０４、配列番号１０３及び配列番号１５８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む第二Ｆａｂ分子を含む。一態様において、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む第一Ｆａｂ分子、及び配列番号１０５のアミノ酸配列及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む第二Ｆａｂ分子を含む。
第二の目的では、本発明は、本発明の二重特異性抗体を含有する薬学的組成物に関する。
第三の目的において、本発明は、がんの治療のための本発明の二重特異性抗体に関する。別の実施態様では、医薬としての二重特異性抗体の使用が提供される。好ましくは、使用は、がんの治療用である。
更なる目的において、本発明は、本発明の二重特異性抗体の重鎖をコードする配列を含む核酸配列、本発明の二重特異性抗体の軽鎖をコードする配列を含む核酸配列、本発明の核酸配列を含む発現ベクター、及び本発明のベクターを含む原核生物又は真核生物宿主細胞に関する。加えて、抗体が生成されるように宿主細胞を培養することを含む抗体を生成する方法が提供される。
２＋２ ＩｇＧ－ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の模式図。抗体は、各抗原結合部位に対して二価であり、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２受容体の２つの異なるパラトープに結合することができる（抗原１＝トラスツズマブ特異性、即ちＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶ；抗原２＝ＨＥＲ２のペルツズマブ特異的細胞外ドメインＩＩ）（Ａ）：単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が、ＶＨ－ＶＬ（ＴｖＡＢ１２、配列番号１２３及び１２４）の順で重鎖にＣ末端で融合される。（Ｂ）：単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が、ＶＬ－ＶＨ（ＴｖＡＢ１３、配列番号１２５及び１２６）の順で軽鎖にＮ末端で融合される。（Ｃ）：単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が、ＶＬ－ＶＨ（ＴｖＡＢ１６：配列番号１２７及び１２８、ＴｖＡＢ２０：配列番号１３１及び１３２）の順で軽鎖にＣ末端で融合される。（Ｄ）：単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が、ＶＬ－ＶＨ（ＴｖＡＢ１７、配列番号１２９及び１３０）の順で重鎖にＣ末端で融合される。 ２＋２ ＩｇＧ－ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の精製。（Ａ）：２６／６０スーパーデックス２００カラム上でのＴｖＡｂ１２（配列番号１２３及び１２４）のサイズ排除精製。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーに由来する主ピーク画分のＳＤＳ－Ｐａｇｅ分析（ＮＲ＝非還元、Ｒ＝還元条件）。 ２＋２ ＩｇＧ－ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の精製。（Ａ）：２６／６０スーパーデックス２００カラム上でのＴｖＡｂ１６（配列番号１２７及び１２８）のサイズ排除精製。（Ｂ）：サイズ排除クロマトグラフィーに由来する主ピーク画分のＳＤＳ－Ｐａｇｅ分析（ＮＲ＝非還元、Ｒ＝還元条件）。 ２＋２ ＩｇＧ－ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の精製。（Ａ）：２６／６０スーパーデックス２００カラム上でのＴｖＡｂ２０（配列番号１３１及び１３２）のサイズ排除精製。主生成物ピークは「１」でマークされる。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーに由来する主ピーク画分のＳＤＳ－Ｐａｇｅ分析（ＮＲ＝非還元、Ｒ＝還元条件）。 ＳＰＲ法（ＰｒｏｔｅＯｎ装置）によって測定されるトラスツズマブ変異体のオフ速度（Ｏｆｆ－ｒａｔｅ）；４０ｍＭのヒスチジン緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０において、４０℃で、１、２、又は３ヶ月間試料をインキュベートした後。変異体のオフ速度は調査期間にわたって変化しない。“６０２”：重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＴ３１Ｖ変異。 ＳＰＲ法（ＰｒｏｔｅＯｎ装置）によって測定されるトラスツズマブ変異体のオフ速度（Ｏｆｆ－ｒａｔｅ）；４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、異なるｐＨにおいて、４０℃で、１、２、又は３ヶ月間試料をインキュベートした後。Ｎ３０Ｓ変異体のオフ速度は非常に遅かったため、高度の不確実性を含む。“６０２”：重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＴ３１Ｖ変異、“Ｎ３０Ｔ”：重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＮ３０Ｔ変異、“Ｎ３０Ｓ”：重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＮ３０Ｓ変異。（Ａ）：ｐＨ５．０、（Ｂ）：ｐＨ６．０、（Ｃ）：ｐＨ７．４。 ストレス後のトラスツズマブ及びトラスツズマブ安定化変異体のＫＬＰ－４細胞への結合。トラスツズマブ及び３つの異なる安定化トラスツズマブ変異体が、４０℃で異なるｐＨを有する緩衝液中で１、２及び３月間インキュベートされた。ストレスを受けた抗体は、フローサイトメトリーによりＫＰＬ－４細胞への結合について時点ゼロにおいて抗体と比較して試験された。“６０２”：重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＴ３１Ｖ変異、“Ｎ３０Ｔ”：重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＮ３０Ｔ変異、“Ｎ３０Ｓ”：重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＮ３０Ｓ変異。 ストレス後のトラスツズマブ及びトラスツズマブ安定化変異体のＫＬＰ－４細胞への結合。トラスツズマブ及び２つ安定化変異体のＧＡ６０２（軽鎖、重鎖及びＴ３１Ｖ変異におけるＤ９８Ｅ変異）及びＧＡ６０３（重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＴ３１Ｖ変異並びにＦｃＲＮ変異Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ）が、４０℃で緩衝液１（４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）又は緩衝液２（２４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中で１、２及び３月間インキュベートされた。ストレスを受けた抗体は、フローサイトメトリーによりＫＰＬ－４細胞への結合について時点ゼロでの抗体と比較して試験された。 ＫＬＰ－４細胞におけるストレス後のトラスツズマブＧＡ６０２及びＧＡ６０３によるＡＤＣＣ誘導トラスツズマブ及び２つ安定化変異体のＧＡ６０２（軽鎖、重鎖及びＴ３１Ｖ変異におけるＤ９８Ｅ変異）及びＧＡ６０３（重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＴ３１Ｖ変異並びにＦｃＲＮ変異Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ）が、４０℃で緩衝液１（４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）又は緩衝液２（２４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中で１、２及び３月間インキュベートされた。ストレスを受けた抗体は、ＫＰＬ－４細胞において４時間後ＡＤＣＣについて時点ゼロでの抗体と比較して試験された。 １＋１フォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の模式図。（Ａ）：単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）ベースの分子（Ｂ）：クロスオーバーＦａｂ（ｘＦａｂ）ベースの分子。 ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＰｅｒ（配列番号１０９、１１０、９６、８６）の精製。（Ａ）：還元及び非還元条件下での精製された抗体分子を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥ。（Ｂ）：精製されたＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＰｅｒのＨＰ－ＳＥＣ分析。 抗体分子の完全性及び純度を推定する、ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＴｒａ（上、配列番号１１９、１２０、１２１，１２２）及びＣｒｏｓｓＭａｂ－ＣＤＲＧ（下、配列番号１０９、１１０、１１１、１１２）のスペクトルのＱ－ＴＯＦ質量分析の比較。 インキュベーションの５日後Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）アッセイで測定される非糖鎖操作ＨＥＲ２ ＣｒｏｓｓＭａｂ（配列番号１１９、１２０、１２１、１２２）による増殖阻害。（Ａ）ＢＴ４７４細胞（Ｂ）Ｎ８７細胞。 標的細胞として（Ａ）ＫＰＬ－４、（Ｂ）Ｔ４７Ｄ及び（Ｃ）Ｃａｌｕ－３を用いた異なるＨＥＲ２特異的抗体により誘導されるＡＤＣＣ（Ｅ：Ｔ＝２５：１、エフェクターヒトＰＢＭＣ、培養時間は４時間）。“ＨＥＲ２ ｃｒｏｓｓｍａｂ ｗｔ”：配列番号１１９、１２０、１２１，１２２、非糖鎖操作型；“ＨＥＲ２ ｃｒｏｓｓｍａｂ ｇ２”：配列番号１１９、１２０、１２１，１２２、糖鎖操作型。 Ｃａｌｕ３非小細胞肺癌異種移植片における異なる抗Ｈｅｒ２抗体の抗腫瘍活性（実験：ＢｉｓｐｅｃＨｅｒ２＿ＰＺ＿Ｃａｌｕ３＿００１）。Ｃａｌｕ３異種移植片腫瘍を有するＳＣＩＤベージュマウスは、７週間示された投与量で週１回腹腔内に処置された。ゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）、ヒトＩｇＥを標的とするヒト化ＩｇＧ１抗体を対照として使用された。エンドポイント（８５日目）での中央値に基づく統計的分析は、ゾレアに比べて、二重特異性ＨＥＲ２抗体は８７．５％（ｓ．）；ＯｍｎｉＥ（配列番号１４５、１４６）は４３．７％（ｎ．ｓ．）；Ｃｒｏｓｓｍａｂ＿００３（配列番号１１９、１２０、１２１１２２、非糖鎖操作型）は９２．１％（ｓ．）；ＴｖＡｂ１２（配列番号１２３及び１２４）は５９．８％（ｎ．ｓ．）及びＴｖＡｂ２０（配列番号１３１及び１３２）は１２．６％（ｎ．ｓ．）腫瘍増殖を抑制したことを明らかにする。腫瘍増殖曲線は平均値＋／－ＳＥＭとして示される（各群においてｎ＝８）。 ＫＰＬ－４乳がん異種移植片における異なる抗Ｈｅｒ２抗体の抗腫瘍活性（実験：Ｂｉｓｐｅｃ．Ｈｅｒ２＿ＰＺ＿ＫＰＬ－４＿００２）。ＫＰＬ－４異種移植片腫瘍を有するＳＣＩＤベージュマウスは、５週間示された投与量で週１回腹腔内に処置された。ゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）、ヒトＩｇＥを標的とするヒト化ＩｇＧ１抗体を対照として使用された。エンドポイント（５９日目）での中央値に基づく統計的分析は、ゾレアに比べて、二重特異性ＨＥＲ２抗体は１２０．８％（ｓ．）；Ｃｒｏｓｓｍａｂ＿００３（配列番号１１９、１２０、１２１１２２、非糖鎖操作型）は１２０．６％（ｓ．）；ＴｖＡｂ１２（配列番号１２３及び１２４）は７０．１％（ｓ．）；ＴｖＡｂ２０（配列番号１３１及び１３２）は８３．４％（ｓ．）腫瘍増殖を抑制したことを明らかにする。ＯｍｎｉＥ（配列番号１４５、１４６）は、腫瘍増殖に有意な影響を及ぼさなかった。腫瘍増殖曲線は平均値＋／－ＳＥＭとして示される（各群においてｎ＝９）。 ＫＰＬ－４乳がん異種移植片における異なる抗Ｈｅｒ２＿００５ ｃｒｏｓｓｍａｂ抗体（配列番号１１９、１２０、１２１１２２、非糖鎖操作型）の抗腫瘍活性（実験：Ｂｉｓｐｅｃ．Ｈｅｒ２＿ＰＺ＿ＫＰＬ－４＿００３）。ＫＰＬ－４異種移植片腫瘍を有するＳＣＩＤベージュマウスは、５週間１から２０ｍｇ／ｋｇの範囲のｃｒｏｓｓｍａｂの漸増用量で週１回腹腔内に処置された。ゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）、ヒトＩｇＥを標的とするヒト化ＩｇＧ１抗体を対照として使用された。エンドポイント（７０日目）での中央値に基づく統計的分析は、ゾレアに比べて、二重特異性ＨＥＲ２抗体は、１２１．８％（ｓ．）腫瘍増殖を抑制し；Ｈｅｒ２ ｃｒｏｓｓｍａｂ＿００５は１ｍｇ／ｋｇの用量で２５．１％（ｎ．ｓ．）；５ｍｇ／ｋｇで１１２．３％（ｓ．）；１０ｍｇ／ｋｇで１０９．５％（ｓ．）及び２０ｍｇ／ｋｇで１２１．８％（ｓ．）．腫瘍増殖を抑制したことを明らかにする。腫瘍増殖曲線は平均値＋／－ＳＥＭとして示される（各群においてｎ＝１０）。 ＫＰＬ－４乳がん異種移植片における異なる抗Ｈｅｒ２抗体の抗腫瘍活性（実験：Ｂｉｓｐｅｃ．Ｈｅｒ２＿ＰＺ＿ＫＰＬ－４＿００９）。ＫＰＬ－４異種移植片腫瘍を有するＳＣＩＤベージュマウスは、４週間異なる化合物により週１回腹腔内に処置された。ゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）、ヒトＩｇＥを標的とするヒト化ＩｇＧ１抗体を対照として使用された。エンドポイント（７０日目）での中央値に基づく統計的分析は、ゾレアに比べて、二重特異性ＨＥＲ２抗体は、（それぞれ５ｍｇ／ｋｇで投与された）は８３．２％（ｓ．）腫瘍増殖を抑制し、両方ともそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇの用量で与えられると１０９．５％（ｓ．）腫瘍増殖を抑制したことを明らかにする。二つの異なる用量（５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）で与えられたＴｖＡｂ１６（配列番号１２７及び１２８）は有意な抗腫瘍効果を有しなかった。ＴｖＡｂ２０（配列番号１３１及び１３２）は、５ｍｇ／ｋｇの用量で７５．３％（ｓ．）及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で５９．８％（ｎ．ｓ．）腫瘍増殖を抑制した。腫瘍増殖曲線は平均値＋／－ＳＥＭとして示される（各群においてｎ＝１０）。 最初のペルツズマブ／トラスツズマブハイブリッド軽鎖のＳＰＲ分析。ペルツズマブ、トラスツズマブ、及びトラスツズマブＣＤＲ３領域のアミノ酸残基を保有する最初のペルツズマブハイブリッドのＬＣを有する配列の組み合わせのＳＰＲベースの動力学解析。滑らかな線は、１：１相互作用モデルへのデータのグローバルフィットを表す。ＰｅｒｔｕｚｕｍａｂＴｒａｓＬ３：配列番号２６、ペルツズマブＴｒａｓ Ｙ９１Ｈ：配列番号２８。 新たに同定された共通の軽鎖ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）、配列番号５４と組み合わせたペルツズマブ及びトラスツズマブのＨＣのＳＰＲ分析。示されるのは、異なる濃度でのＨｅｒ２に対する両抗体の結合である。滑らかな線は、１：１相互作用モデルへのデータのグローバルフィットを表す。 ファージディスプレイによって同定された親和性成熟ペルツズマブクローンの特徴付け。同定された親和性成熟されたクローンのＳＰＲ分析。示されるのは、異なる濃度でのＨｅｒ２に対する細菌のＦａｂの結合である。滑らかな線は、１：１相互作用モデルへのデータのグローバルフィットを表す。Ｂ２：配列番号６６、Ｄ１：配列番号６２、Ｅ１：配列番号６８、Ｃ８：配列番号７２、Ｇ２：配列番号７０、Ａ１：配列番号７４。 共通の軽鎖を有する二重特異性ＨＥＲ２抗体の模式図。 共通の軽鎖を有する二重特異性ＨＥＲ２抗体の精製及び分析特性評価。精製方法はアフィニティー工程（プロテインＡ）とその後のサイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含む。最終生成物は分析され、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム）によって特性評価された。（Ａ）：Ｄ１ｄｅｒ（配列番号６４）を含む、（Ｂ）：Ｇ２（配列番号７０）を含む、（Ｃ）：Ｅ１（配列番号６８）を含む。 Ｈｅｒ２のノックアウト変異体のＳＰＲ分析。トラスツズマブ及びペルツズマブのノックアウト変異体の両方への結合のセンサグラムが示される。滑らかな線は、１：１相互作用モデルへのデータのグローバルフィットを表す。 共通の軽鎖クローン変異体を有する二重特異性ＨＥＲ２抗体のＫＰＬ－４細胞への結合。ＫＰＬ－４細胞は漸増濃度の示された抗体により染色された。抗体は、ＦＩＴＣ標識抗ヒト二次により検出され、蛍光はフローサイトメトリーによって測定された。“Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ”：配列番号６４、５４、９２、“Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｇ２／２”：配列番号７０、５４、９２、“Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｅ１／１”：配列番号６８、５４、９２；“ＧＡ ６０４”：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２． 共通の軽鎖クローン変異体を有する二重特異ＨＥＲ２抗体によるＢＴ４７４、Ｎ８７、及びＳｋＢｒ３細胞の増殖阻害。ＢＴ４７４（Ａ）、Ｎ８７（Ｂ）、及びＳｋＢｒ３（Ｃ）細胞は、３つの異なるＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ変異体で処置された。対照として、トラスツズマブ、ペルツズマブ及び両方の組み合わせが含まれた。５日後、増殖の阻害はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏで測定された。“Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ”：配列番号６４、５４、９２、“Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｇ２／２”：配列番号７０、５４、９２、“Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｅ１／１”：配列番号６８、５４、９２；“ＧＡ ６０４”：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２． 共通の軽鎖変異体を有する二重特異ＨＥＲ２抗体によるＫＰＬ－４細胞及びＭＤＡ－ＭＢ２３１の死滅（Ａ）ＰＢＭＣによるＫＰＬ－４細胞の抗体依存性死滅（Ｅ：Ｔ ２５：１）は、４時間後にＬＤＨ放出を測定することにより決定された。（Ｂ）ＰＢＭＣによるＫＰＬ－４細胞の抗体依存性死滅（Ｅ：Ｔ ５：１）は、２４時間後にＬＤＨ放出を測定することにより決定された。“Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ”：配列番号６４、５４、９２、“Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｇ２／２”：配列番号７０、５４、９２、“Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｅ１／１”：配列番号６８、５４、９２；“ＧＡ ６０４”：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２． 共通の軽鎖クローン変異体を有する二重特異ＨＥＲ２抗体によるＢＴ４７４細胞の増殖阻害。ＢＴ４７４細胞は異なるハーセプチン変異体で処置された。対照として、トラスツズマブ、ペルツズマブ及び両方の組み合わせが含まれた。６日後、増殖の阻害はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏで測定された。“Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ ｗｔ”：配列番号６４、５４、９２、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ Ｇ２”：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。 ＢＴ－４７４細胞上のＨｅｒ２抗体とのＣ１ｑ結合。ＢＴ４７４細胞は３つのハーセプチン変異体とインキュベートされた。対照として、トラスツズマブ、ペルツズマブ及び両方の組み合わせが含まれた。“Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ ｗｔ”：配列番号６４、５４、９２、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ Ｇ２”：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。 ＢＴ－４７４細胞におけるＣＤＣ活性化（ＬＤＨ放出）。ＢＴ４７４細胞は３つのハーセプチン変異体とインキュベートされた。対照として、トラスツズマブ、ペルツズマブ及び両方の組み合わせが含まれた。“Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ ｗｔ”：配列番号６４、５４、９２、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ Ｇ２”：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２． ＢＴ－４７４細胞のＣＤＣ媒介性死滅（ＡＣＥＡ）。ＢＴ４７４細胞は３つのハーセプチン変異体とインキュベートされた。対照として、トラスツズマブ、ペルツズマブ及び両方の組み合わせが含まれた。“Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ ｗｔ”：配列番号６４、５４、９２、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ Ｇ２”：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。 二重特異性抗体のインビボ活性。異なるＨｅｒ２二重特異性分子（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置後のマウス異種移植モデルにおける腫瘍体積は、トラスツズマブ、ペルツズマブ及び両方の組み合わせによる処置と比較された。“Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ”：配列番号６４、５４、９２．“対照”：ゾレア、非ＨＥＲ２結合抗体。
本発明の実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
開示全体を通して、用語「ＥｒｂＢ２」、「ＥｒｂＢ２受容体」、「ｃ－Ｅｒｂ－Ｂ２」及び「ＨＥＲ２」は互換的に使用され、別途指示がない限り、天然配列のＥｒｂＢ２ヒトポリペプチド、又はその機能的誘導体を指す。「ｂｅｒ２」、「ｅｒｂＢ２」及び「ｃ－ｅｒｂＢ２」は、対応するヒト遺伝子を指す。
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬのヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当該技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための特定の事例的及び具体的な実施態様を以下に記載する。
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つものである。
用語「二重特異性ＨＥＲ２抗体」及び「ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体」は、交換可能に使用され、抗体がＨＥＲ２を発現する細胞を標的とした診断薬及び／又は治療剤として有用であるように十分な親和性で、細胞外ドメインＩＩ及びＩＶのそれぞれ両方においてＨＥＲ２に結合することができる二重特異性抗体を指す。一実施態様において、細胞外ドメインＩＩ及びＩＶの両方においてＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体の、関連のない、非ＨＥＲ２タンパク質への結合の程度は、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイ（例えばビアコア）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、ＨＥＲ２に対する抗体の結合の約１０％未満である。ある実施態様において、ＨＥＲ２へ結合する二重特異性抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ未満、例えば、１０－８Ｍから１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍから１０－１３Ｍ）を有する。
本明細書において用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載される。更に、抗体断片は、ＶＨドメインの特徴、即ち、ＶＬドメインと一緒に機能的な抗原結合部位へアセンブルすることができる特徴、又はＶＬドメインの特徴、即ち、ＶＨドメインと一緒に機能的な抗原結合部位へアセンブルすることができる特徴を有し、それによって、完全長抗体の抗原結合性を付与する単鎖ポリペプチドを含む。
本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ断片」は、軽鎖のＶＬドメイン及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片、及び重鎖のＶＨドメイン及び第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は少なくとも一のＦａｂ断片を含み、重鎖と軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換される。可変領域又は定常領域のどちらかの交換に起因して、前記Ｆａｂ断片はまた「クロス－Ｆａｂ」断片、又は「ｘＦａｂ」断片又は「クロスオーバーＦａｂ」断片とも言う。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖の構成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換され、即ちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖及び重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖を含む。クロスオーバーＦａｂ分子はＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも言う。一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されるとき、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖及び軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含む。クロスオーバーＦａｂ分子はＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも言う。
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーがＮ末端からＣ末端の方向に以下の順：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカーＶＨ－ＣＬを有し；前記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは、３２から５０の間のアミノ酸のポリペプチドである。単鎖Ｆａｂ断片のａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及びｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬは、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。更に、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けに従い、可変重鎖における位置４４及び可変軽鎖における位置１００）を介して鎖間ジスルフィド結合の生成によって安定化され得る。用語「Ｎ末端」は、Ｎ末端の最後のアミノ酸を示す。用語「Ｃ末端」は、Ｃ末端の最後のアミノ酸を示す。
「融合される」又は「連結される」とはその成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、直接又は一つ以上のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されていることを意味する。
本明細書にて使用される用語「リンカー」はペプチドリンカーであり、好ましくは、少なくとも５アミノ酸の長さ、好ましくは５から１００の長さ、より好ましくは１０から５０のアミノ酸の長さを持つアミノ酸を有するペプチドである。一実施態様において、前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、ここで、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５及びｍ＝０、１、２又は３）、好ましくはｘ＝４及びｎ＝２又は３、より好ましくはｘ＝４、ｎ＝２である。一実施態様において、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ），又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプの１つに割り当てることができ、そのうち幾つかは更にγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）などのサブタイプに分割され得る。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの何れかに割り当てることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結された２つのＦａｂ分子及びＦｃドメインから本質的になる。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原に対する結合を、５０％又はそれ以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原に対する結合を、５０％又はそれ以上遮断する。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全体に相補的であり特異的に結合する領域を含む抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと呼ばれる抗原の特定の部分にのみ結合することができる。抗原結合ドメインは、例えば、一以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により与えられうる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来し、通常組換えＤＮＡ技術により調製される抗体を指す。ウサギ可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明に包含される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、特にＣ１ｑの結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）の結合に関して、本発明に係る特性を生成するために、定常領域が元の抗体のものから修飾又は変更されたものである。このようなキメラ抗体は、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメント及び免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の生成物である。キメラ抗体を生産するための方法は、今は当該技術分野においてよく知られている一般的な組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を含む。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第５，２０２，２３８号及び第５，２０４，２４４号を参照。
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死若しくは破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など；抗生物質；小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）；及び様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体Ｆｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合性及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体－依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）；サイトカイン分泌；抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原の取込み；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
本明細書で使用される場合、「操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒ、ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」なる用語は、天然に生じるか又は組換えのポリペプチド又はその断片のペプチド骨格の何れかの修飾又は翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、アミノ酸配列の、グリコシル化パターンの、又は個々のアミノ酸の側鎖基のアミノ酸配列の修飾、並びにこれらのアプローチの組み合せが含まれる。
「アミノ酸変異」なる用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。最終コンストラクトが所望の特徴、例えばＦｃ受容体への結合の減少又は別のペプチドとの会合の増加を有することを条件として、置換、欠失、挿入、及び修飾の何れかの組合せが最終コンストラクトに到達するために成されても良い。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ－及び／又はカルボキシ末端の欠失及びアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変更する目的のために、非保存的アミノ酸置換、即ち一のアミノ酸を、異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸と置換することが特に所望される。アミノ酸置換は、２０の標準的アミノ酸の非天然に生じるアミノ酸又は天然に生じるアミノ酸誘導体による置換を含む（例えば４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）。アミノ酸変異は、当分野でよく知られた遺伝学的又は化学的方法を使用して生成されうる。遺伝学的方法は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含みうる。化学的修飾など、遺伝子工学以外の方法によるアミノ酸の側鎖基の改変方法がまた有用でありうることが意図される。本明細書において同一のアミノ酸変異を示すために様々な名称が使用されてもよい。例えば、Ｆｃドメインの位置３２９のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示すことができる。
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、例えば、所望の治療的又は予防的結果を達成するために、必要な用量及び期間で有効な量を指す。
用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、若干異なる場合があるものの、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端へ伸展するように定義されている。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。本明細書で使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの一つ、即ち、安定に自己会合可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧのＦｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧのＨＣ２及びＩｇＧのＣＨ３定常ドメインを含む。
「Ｆｃドメインの第一及び第二のサブユニットの会合を促進する修飾」とは、ホモ二量体を形成するＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの同一のポリペプチドとの会合を減少又は防止するペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書において使用される会合を促進する修飾は、会合が望まれる２つのＦｃドメインサブユニット（即ちＦｃドメインの第一及び第２サブユニット）のそれぞれに対して行われた別々の修飾を特に含み、該修飾は２つのＦｃドメインのサブユニットの会合を促進するように互いに相補的である。例えば、会合促進修飾は、その会合をそれぞれ立体的又は静電気的に好ましくするために、Ｆｃドメインの一方又は双方の構造又は電荷を改変しうる。従って、（ヘテロ）二量体化が、各サブユニットの各々に融合した更なる成分（例えば抗原結合部分）が同一ではないという意味で非同一であるかもしれない、第一Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第二Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの間に生じる。幾つかの実施態様では、会合促進修飾は、Ｆｃドメイン中にアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、高頻度可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４に現れる。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する初代形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は、親細胞と、核酸含有物において完全に同一ではなく、変異を含む場合もある。元来の形質転換細胞において、スクリーニング又は選択された場合に、同様の機能又は生物活性を有する変異子孫がここに含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。本発明に係るキメラ及びヒト化抗体についても述べたように、本発明で使用される「ヒト化抗体」はまた、とりわけＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して、例えば「クラススイッチ」即ちＦｃ部分の変化又は変異（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）によって、本発明に係る特性を生み出すために、定常領域で修飾された抗体を含む。
本発明で使用される場合、用語「組換えヒト抗体」は、宿主細胞に形質移入された組換え発現ベクターを使用して発現したヒト免疫グロブリン遺伝子又は抗体用にトランスジェニックである動物（例えばマウス）から、又はＮＳ０又はＣＨＯ細胞等の宿主細胞から単離された抗体等、組換え手段により調製、発現、生成又は単離された全てのヒト抗体を含むことを意図している。このような組換えヒト抗体は再配置された形態で可変及び定常領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、インビボで体細胞超変異にさらされている。よって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列から誘導され、関連しているが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しないであろう配列である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについては、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについては、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の別の形態は、特にＣ１ｑの結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）の結合に関して、本発明に係る特性を生成するために、定常領域が元の抗体のものから更に修飾又は変更されたものである。
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般に超可変ループから及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を有し、後者は最も高い配列可変性のものであり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４－３４、Ｌ２の５０－５６、Ｌ３の８９－９７、Ｈ１の３１－３５Ｂ、Ｈ２の５０－６５、及びＨ３の９５－１０２で生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分への参照において本明細書で互換的に使用される。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)及びChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記述されており、そこで本定義は、相互に対して比較するときにアミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを意味する何れかの定義の適用は、本明細書において定義され、使用される場合の用語の範囲内にあることを意図している。上記の引用文献の各々によって定義されるように、ＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基が、比較として以下の表１に記載されている。特定のＣＤＲを含む正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変わるであろう。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列を付与する特定のＣＤＲを含む残基を、常套的に決定できる。
Figure 0007077263000001
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能である可変領域配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列それ自体を超えた任意の実験データに頼ることなく、任意の可変領域配列に対してこのＫａｂａｔの番号付けシステムを一義的に割り当てることができる。本明細書で用いる場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」とは、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)で明記されている番号付けシステムを指す。特記されない限り、抗体可変領域内の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの参照は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。
ＶＨのＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは、一般に高頻度可変ループからのアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」をも含む。ＳＤＲは、省略された（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ－）ＣＤＲ、又はａ－ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ－ＣＤＲ（ａ－ＣＤＲ－Ｌ１、ａ－ＣＤＲ－Ｌ２、ａ－ＣＤＲ－Ｌ３、ａ－ＣＤＲ－Ｈ１、ａ－ＣＤＲ－Ｈ２、及びａ－ＣＤＲ－Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１－３４、Ｌ２の５０－５５、Ｌ３の８９－９６、Ｈ１の３１－３５Ｂ、Ｈ２の５０－５８、及びＨ３の９５－１０２で生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照のこと）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
「イムノコンジュゲート」は、一以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬物を含む。
「個体」又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。ある実施態様において、個体又は被験体はヒトである。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色***置に存在している。
「ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、即ち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」なる修飾語句は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないと解釈されるべきものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的製剤中に存在してもよい。
「天然型抗体」は、天然に存在する様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの何れかに割り当てることができる。
用語「添付文書」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
「交差反応性が実質的に無い」とは、分子（例えば抗体）が、分子の実際の標的抗原とは異なる抗原（例えば、標的抗原に密接に関連した抗原）を、特にその標的抗原と比較した場合に、認識しないか又は特異的に結合しないことを意味する。例えば、抗体が実際の標的抗原とは異なる抗原に対して約１０％未満から約５％未満が結合する場合があり、又は約１０％、９％、８％７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満、好ましくは約２％、１％又は０．５％未満、最も好ましくは約０．２％又は０．１％未満の、実際の標的抗原とは異なる抗原からなる量において、実際の標的抗原とは異なる前記抗原に結合しうる。
「参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムはジェネンテク社、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通して公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、特にデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ－２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと一致しない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、直前のパラグラフに記載したように、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを用いて得られる。
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被験体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容可能な担体」は、被験体に非毒性であり、有効成分以外の製剤処方中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においての何れかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
本明細書で使用する用語「がん」は、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫などの増殖性疾患を意味し、上記癌の任意の難治性バージョン、又は上記がんのうちの一又は複数の組み合わせを含む。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co. 91頁、 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
「抗体の抗原結合部位」は、本明細書で使用されるとき、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部位は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、ここで定義する超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、ＮからＣ末端に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する領域であり、抗体の特性を定める。ＣＤＲ及びＦＲは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的定義に従って決定され、及び／又は「超可変ループ」からの残基である。
抗体特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。天然の抗体は、例えば、単一特異性である。本明細書で使用する用語「単一特異性」抗体は、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する一以上の結合部位を有する抗体である。
本発明による「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。本発明の抗体は、ＨＥＲ２の２つの異なるエピトープ、即ち、ＨＥＲ２の．細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに対して特異的である。本明細書で使用する用語「二重特異性」抗体は、各々が同じ抗原の異なるエピトープに結合する少なくとも二つの結合部位を有する抗体である。
二重特異性抗体はまたＨＥＲ２を発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
本出願の中で使用する用語「価」は、抗体分子における指定された数の結合部位の存在を示す。このように、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、抗体分子において、それぞれ、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位が存在することを意味する。本発明による二重特異性抗体は、少なくとも二価であり、三価又は多価（例えば四価又は六価）であり得る。
本発明の抗体は、２つ以上の結合部位を有し、二重特異性である。つまり、抗体は２つ以上の結合部位がある場合でさえ（即ち、抗体が三価又は多価であること）、二重特異性であってもよい。本発明の二重特異性抗体は、例えば、多価単鎖抗体、ダイアボディ及びトリアボディ並びに付加的抗原結合部位（例えば、単鎖Ｆｖ、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、Ｆａｂ断片、又は（Ｆａｂ）２）が一以上のペプチドリンカーを介して連結される完全長抗体の定常ドメイン構造を有する抗体を含む。抗体は、単一の種からの完全長とすることができ、又はキメラ化若しくはヒト化されることができる。
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
用語「アミノ酸」は、本出願で使用される場合、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に生じるカルボキシα－アミノ酸の群を示す。
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」なる表現は相互に交換可能に用いられ、かかる標記は子孫を含む。よって、「形質転換体」や「形質転換細胞」のような用語には、初代対象細胞と何世代移行したかを問わずそれから由来した培養物とを含む。また、全ての子孫は、意図的な又は不慮の突然変異により、ＤＮＡ量において、厳密には同一でない可能性もあると理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされた場合、同じ機能又は生物活性を有する変異子孫も含まれる。
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当該技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための特定の事例的及び具体的な実施態様を以下に記載する。
本明細書において使用される場合、用語「結合」又は「特異的に結合」とは、インビトロにおけるアッセイ、好ましくは表面プラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ，ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）における抗原のエピトープへの抗体の結合を指す。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって定義される。結合又は特異的に結合は、１０－８ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０－９Ｍから１０－１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）を意味する。
細胞死受容体への抗体の結合は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって調べることができる。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって定義される。
用語「エピトープ」とは、抗体に対して特異的に結合できる何れかのポリペプチド決定基を包含する。ある実施態様においては、エピトープ決定基は、分子、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの化学的活性表面基を含み、そしてある実施態様においては、特定の三次元構造特性及び／又は比電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。
本明細書で使用される場合、用語、「操作する」、「操作された」、「操作すること」、とりわけ、接頭辞の「ｇｌｙｃｏ－」が付いた用語、ならびに「グリコシル化操作」は、天然に存在するポリペプチド又は組換えポリペプチド又はその断片のグリコシル化パターンの任意の操作を含むと見なされる。グリコシル化操作には、細胞中で発現される糖タンパク質のグリコシル化の変化を達成するためのオリゴ糖合成経路の遺伝子操作を含む、細胞のグリコシル化機構の代謝的操作を含む。更に、グリコシル化操作は、グリコシル化における変異及び細胞環境の影響を含む。一実施態様において、グリコシル化操作は、糖転移酵素活性の変化である。特定の実施態様では、操作が変更されたグルコサミニル転移酵素活性及び／又はフコース転移酵素活性をもたらす。
ＩＩ．組成物及び方法
一態様において、本発明は、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体に基づいています。本発明の抗体は、例えば、がんの治療のために有用である。
Ａ．共通の軽鎖によりＨＥＲ２と特異的に結合する例示的な二重特異性抗体
本発明の一態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供され、抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的に結合する第一の結合部分及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合する第二の結合部分を含む。本発明の発明者らは、驚くべきことに、一価の二重特異性抗体を生成し、ここで両方の結合部分が、腫瘍細胞増殖の阻害の観点で親の単一特異性抗体の有効性を保持し、かつＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに対する増加した親和性を有する共通の軽鎖を共有する。親抗体の両方の結合特性を保持する共通の軽鎖を有する二重特異性分子の生成は、ハイブリッド軽鎖の共通のＣＤＲが、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶの両方に対して結合特異性を保持する必要があるので容易ではない。このいわゆる「共通の軽鎖」原理、即ち、１つの軽鎖を共有するが、依然として別々の特異性を持つ二つのバインダーを組み合わせることの使用により、軽鎖誤対合を防止し、この特定のケースでは親抗体のエピトープ特異性を保持する。その結果、製造時により少ない副生成物を生じ、高収率でＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子の均一な調製を容易にする。ペルツズマブの重鎖は更に最適化され、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩへの親和性の観点からより強力な分子をもたらした。加えて、トラスツズマブ重鎖は、ＣＤＲ中に特定の変異を導入することによって安定化されている。得られる分子は、親のペルツズマブ及びトラスツズマブである単一特異性抗体よりも優れている。一価共通軽鎖フォーマットの二重特異性ＨＥＲ２抗体は、親抗体の組み合わせと比較して、ペルツズマブエピトープに対する増加した親和性を有し、細胞増殖における優れた阻害効果を示す。
一実施態様において、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的に結合可能な第一Ｆａｂ分子、及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合可能な第二Ｆａｂ分子を含む二重特異性抗体が提供され、ここで、第一Ｆａｂ分子の可変軽鎖の配列は、第二Ｆａｂ分子の可変軽鎖の配列と同一である（即ち、第一及び第二のＦａｂ分子は共通の軽鎖を含む）。
一実施態様において、本発明は、
（ａ）配列番号５５の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号７７の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号５６の重鎖ＣＤＲ３
を含む第一重鎖、
（ａ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３
を含む第二重鎖、及び
（ａ）配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号９０の軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む第一及び第二軽鎖
を含むＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
一実施態様において、本発明は、
（ａ）配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号６０の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３
を含む第一重鎖、
（ａ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３
を含む第二重鎖、及び
（ａ）配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号９０の軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む第一及び第二軽鎖
を含むＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
一実施態様において、本発明は、
（ａ）配列番号５８の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号５９の重鎖ＣＤＲ３
を含む第一重鎖、
（ａ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３
を含む第二重鎖、及び
（ａ）配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号９０の軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む第一及び第二軽鎖
を含むＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
一実施態様において、上記実施態様の何れかに記載の第二の重鎖は、ストレス条件下でＨＥＲ２に対して保持された結合をもたらす、ＣＤＲに高い化学的安定性を付与するアミノ酸配列中の少なくとも一の修飾を有する。本明細書において有用な修飾は、例えば、Ｄ９８Ｅ、Ｄ９８Ｎ、Ｄ９８Ｔ、Ｇ９９Ａ又はＧ９９Ｓである。驚くべきことに本発明者らは、ＣＤＲの幾つかの修正は、分子の安定性を向上させるだけでなく、ＨＥＲ２に対する結合親和性を改善することを見い出した。
従って、一実施態様において、本発明は、
（ａ）配列番号５５の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号７７の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号５６の重鎖ＣＤＲ３
を含む第一重鎖、
（ａ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号７９の重鎖ＣＤＲ３
を含む第二重鎖、及び
（ａ）配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号９０の軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む第一及び第二軽鎖
を含むＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
一実施態様において、本発明は、
（ａ）配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号６０の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３
を含む第一重鎖、
（ａ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号７９の重鎖ＣＤＲ３
を含む第二重鎖、及び
（ａ）配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号９０の軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む第一及び第二軽鎖
を含むＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
一実施態様において、本発明は、
（ａ）配列番号５８の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号５９の重鎖ＣＤＲ３
を含む第一重鎖、
（ａ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号７９の重鎖ＣＤＲ３
を含む第二重鎖、及び
（ａ）配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号９０の軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む第一及び第二軽鎖
を含むＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖（即ち、共通の軽鎖）、配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一の重鎖、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二の重鎖を含む。
一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖（即ち、共通の軽鎖）、配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一の重鎖、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二の重鎖を含む。
一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖（即ち、共通の軽鎖）、配列番号６８のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一の重鎖、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二の重鎖を含む。
一実施態様において、上記実施態様の何れかに記載の第二の重鎖は、ＣＤＲに安定性と、標的、例えば、Ｄ９８Ｅ、Ｄ９８Ｎ、Ｄ９８Ｔ、Ｇ９９Ａ又はＧ９９Ｓに対する結合とを付与するアミノ酸配列中の少なくとも一の修飾を有する。
従って、一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖（即ち、共通の軽鎖）、配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一の重鎖、及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二の重鎖を含む。
一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖（即ち、共通の軽鎖）、配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一の重鎖、及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二の重鎖を含む。
一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖（即ち、共通の軽鎖）、配列番号６８のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一の重鎖、及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二の重鎖を含む。
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第一の重鎖定常領域を含む。
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第二の重鎖定常領域を含む。
別の実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第一の軽鎖定常領域を含む。
別の実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第二の軽鎖定常領域を含む。
一実施態様において、配列番号５４、１１３、６４、１１４、８２、１１６、９２及び１１５を含む二重特異性抗体が提供される。
一実施態様において、配列番号５４、１１３、６４、１１４、８２、１１６、９６及び１１５を含む二重特異性抗体が提供される。
一実施態様において、以下のセクションＦで概説したように、上記実施形態の何れかに記載の二重特異性抗体は糖鎖を操作される。一実施態様において、以下のセクションＤで概説したように、上記実施形態の何れかに記載の二重特異性抗体は、ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの改変を含む。
Ｂ．クロスオーバーＦａｂ断片を含む例示的なＨＥＲ２二重特異性抗体
本発明の一実施態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供され、抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的に結合する第一の結合部分及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合する第二の結合部分を含む。本発明の発明者らは、結合部分の１つが、クロスオーバーＦａｂ断片である、第二の一価二重特異性抗体フォーマットを生成した。本発明の一態様では、一価の二重特異性抗体が生成され、ここで、ＩｇＧ分子のＦａｂ断片の一つは、クロスオーバーＦａｂ断片により置換される。クロスオーバーＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されるＦａｂ断片である。クロスオーバーＦａｂ断片を含む二重特異性抗体フォーマットは、例えば、ＷＯ２００９０８０２５２、ＷＯ２００９０８０２５３、ＷＯ２００９０８０２５１、ＷＯ２００９０８０２５４、ＷＯ２０１０／１３６１７２、ＷＯ２０１０／１４５７９２及びＷＯ２０１３／０２６８３１に記載される。天然型トラスツズマブ配列は、安定性及び親和性を向上させるために、可変重鎖及び可変軽鎖の両方のＣＤＲに改変を導入することによって最適化されており、得られた配列は二重特異的分子中の軽鎖の誤対合を回避するためにフレームワークが移植され、二重特異性抗体は糖鎖を操作され、高収率で生産することができるＨＥＲ２を標的とする非常に強力な二重特異性抗体とほんの低い割合の副生成物が得られる。加えて、各親抗体の組み合わせと比較して、腫瘍細胞増殖の優れた阻害を示す。
一実施態様において、本発明は、
（ａ）配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第一の抗原結合部位、及び
（ａ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０８の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号７９の重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１０７の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第二の抗原結合部位
を含むＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第一の抗原結合部位及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第二の抗原結合部位を含む。
一実施態様において、本発明は、
（ａ）配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第一の抗原結合部位、及び
（ａ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号７９の重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第二の抗原結合部位
を含むＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第一の抗原結合部位及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番１１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第二の抗原結合部位を含む。
一実施態様において、本発明は、
（ａ）配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第一の抗原結合部位、及び
（ａ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号７９、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８７、配列番号８８からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１０４、配列番号１０３及び配列番号１５８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第二の抗原結合部位
を含むＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第一の重鎖定常領域を含む。
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、Ｃ末端リジンが除去されている、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第一の重鎖定常領域を含む。
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第二の重鎖定常領域を含む。
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、Ｃ末端リジンが除去されている、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第二の重鎖定常領域を含む。
別の実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第一の軽鎖定常領域を含む。
別の実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第二の軽鎖定常領域を含む。
一実施態様において、配列番号１０９、１１０、１１１及び１１２を含む二重特異性抗体が提供される。
一実施態様において、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は
Ｆｃドメイン、
ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第一の抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、
ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第二の抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片を含み、
ここで、少なくとも一のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される。
上記の二重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに対して１つの結合部位及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに対して１つの結合部位を有する二価であるので、この形式は「１＋１」フォーマットと呼ばれる。従って、このセクションで説明される二重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに対して一価であり、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに対して一価である。「１＋１」フォーマットを有する二重特異性抗体の例示的構造が図１０に示される。可変領域又は定常領域のどちらかの交換に起因して、上記のＦａｂ断片はまた「クロス－Ｆａｂ」断片、又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも言う。「１＋１」フォーマットのＩｇＧ分子はＣｒｏｓｓｍａｂフォーマットとも言う（Schaefer et al. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:11187-92を参照）。
一実施態様において、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は
Ｆｃドメイン、
重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、及び
ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片
を含む。
一実施態様において、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は
Ｆｃドメイン、
ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、及び 重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片
を含む。
一実施態様において、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は
Ｆｃドメイン、
ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、及び
Ｆａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換される、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片
を含む。
一実施態様において、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は
Ｆｃドメイン、
ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、及び
重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片
を含む。
一実施態様において、上記実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２に特異的に結合する前記二重特異性抗体は、２つのＦａｂ断片がＮ末端に融合されたＦｃドメインを含み、ここで、少なくとも一のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される。一実施態様において、２つのＦａｂ断片は、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインのＮ末端に融合される。一実施形態において、免疫グロブリンのヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。一実施態様において、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片、及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施態様において、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施態様において、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。別の実施態様において、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
一実施態様において、上記実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な１つの結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子、及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な１つの結合部位を含み、ここで、ＩｇＧ分子の一方のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される。
一実施態様において、上記実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な１つの結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子、及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な１つの結合部位を含み、ここで、ＩｇＧ分子の一方のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換される。この抗体フォーマットはＣｒｏｓｓＭａｂ（ＶＨＶＬ）とも呼ばれる。
一実施態様において、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な結合部位を含むＩｇＧ分子の一方のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換される。
一実施態様において、上記実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な１つの結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子、及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な１つの結合部位を含み、ここで、ＩｇＧ分子の一方のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される。この抗体フォーマットはＣｒｏｓｓＭａｂ（ＣＨ１ＣＬ）とも呼ばれる。
一実施態様において、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な結合部位を含むＩｇＧ分子の一方のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される。
一実施態様において、上記実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な１つの結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子、及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な１つの結合部位を含み、ここで、ＩｇＧ分子の一方のアーム（Ｆａｂ断片）の完全なＶＨ－ＣＨ１及びＣＬ－ＣＬドメインが交換される。これは、Ｆａｂ断片の少なくとも一方が軽鎖（ＶＬＣＬ）を介してＦｃドメインのＮ末端に融合されることを意味する。一実施態様において、他方のＦａｂ断片は、重鎖（ＶＨＣＨ１）を介してＦｃドメインのＮ末端に融合される。この抗体フォーマットはＣｒｏｓｓＭａｂＦａｂとも呼ばれる。
一実施態様において、両方のＦａｂ断片は、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインのＮ末端に融合される。
一実施態様において、以下のセクションＦで概説したように、上記実施形態の何れかに記載の二重特異性抗体は糖鎖を操作される。一実施態様において、以下のセクションＤで概説したように、上記実施形態の何れかに記載の二重特異性抗体は、ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの改変を含む。
Ｃ．ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの修飾
本発明の二重特異性ＨＥＲ２抗体は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なる抗原結合部分を含み、よってＦｃドメインの２つのサブユニットは典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及び続く二量体化は、２つのポリペプチドの複数の可能な組合せをもたらす。組換え発現において本発明の二重特異性抗体の収率と純度を向上させるために、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインにおいて所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することは有利であろう。
従って、特定の実施態様において、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第一及び第二のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。従って、一実施態様では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
特定の実施態様において、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一つにおけるノブ修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方におけるホール修飾を含む、いわゆるノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）修飾である。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、本方法は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、突起が空洞内に配置することができるように、第一のポリペプチドの界面での突起（「ノブ」）及び第二ポリペプチドの界面における対応する空洞（「穴」）を導入することを含む。突起は、第一のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。突起と同一又はより小さい大きさの相補的な空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置換することによって第二ポリペプチドの界面に作成される。
従って、特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインの第一サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第二のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能である第一サブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、及びＦｃドメインの第二のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより第一のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が配置可能である第二のサブユニット内のＣＨ３ドメイン内の空洞を生成する。
突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を改変することにより、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により作製することができる。
具体的な実施態様において、Ｆｃドメインの第一サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６でトレオニン残基がトリプトファン残基と置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第二サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置４０７でチロシン残基がバリン残基と置換される（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様において、Ｆｃドメインの第二サブユニットにおいて、更に位置３６６でトレオニン残基がセリン残基と置換され（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８でロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）。
更なる実施態様において、Ｆｃドメインの第一サブユニットにおいて、位置３５４でセリン残基がシステイン残基と置換され（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第二サブユニットにおいて、位置３４９でチロシン残基がシステイン残基と置換される（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、更に二量体を安定化させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
代わりの実施態様において、Ｆｃドメインの第一及び第二サブユニットの会合を促進する修飾は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されるように、静電的ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面にて、荷電したアミノ酸残基による一又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。
一実施態様において、上記実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第一の抗原結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子、及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第二の抗原結合部位を含み、ここで、第一の重鎖のＦｃ部分は、第一の二量体化モジュールを含み、かつ第二の重鎖のＦｃ部分は、第二の二量体化モジュールを含み、ＩｇＧ分子の２つの重鎖のヘテロ二量体化を可能としている。
更に好ましい実施態様において、ノブ・イントゥ・ホールの戦略に従い、第一の二量体化モジュールはノブを含み、第二の二量体化モジュールはホールを含む（Carter P.;Ridgway J.B.B.;Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2,Number 1, February 1996 , pp. 73-73(1)を参照）。
Ｄ．核酸配列、ベクター及び方法
本発明は更に、本明細書に記載されるＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドは、二重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して結合し、機能性二重特異性抗体を形成する。例えば、Ｆａｂ断片の軽鎖部分は、Ｆａｂ断片の重鎖部分、抗原結合部分、Ｆｃドメインサブユニット及び任意で別のＦａｂ断片（の部分）を含んでなる二重特異性抗体の部分に由来する別々のポリヌクレオチドによりコードされ得る。共発現されると、重鎖ポリペプチドが軽鎖ポリペプチドと会合し、Ｆａｂ断片を形成する。別の実施例では、２つのＦｃドメインサブユニットの一方、及び場合によっては一以上のＦａｂ断片（の一部）を含む本明細書に提供される二重特異性抗体の部分は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方、及び場合によってはＦａｂ断片（の一部）を含む本明細書に提供される二重特異性抗体の部分に由来する別々のポリヌクレオチドによりコードされ得る。共発現されると、Ｆｃドメインのサブユニットが会合しＦｃドメインを形成する。
一実施態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号６３、６７及び６９に示される第一可変重鎖配列をコードする配列を含む。一実施態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号９１及び１３３に示される第二可変重鎖配列をコードする配列を含む。
一実施態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号５３に示される可変軽鎖配列をコードする配列を含む。
別の実施態様において、本発明は、二重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号８３、８５、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、６３、６７、６９、５３、２１及び２３に示されるポリペプチド配列をコードする配列を含む。
別の実施態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号６３、６７及び６９のアミノ酸配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％，又は９９％同一である第一可変重鎖配列をコードする配列を含む。
別の実施態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号９１及び１３３のアミノ酸配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％，又は９９％同一である第二可変重鎖配列をコードする配列を含む。
別の実施態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号５３のアミノ酸配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％，又は９９％同一である可変軽鎖配列をコードする配列を含む。
ある実施態様において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
本発明の更なる目的には、本発明の核酸配列を含む発現ベクター、及び本発明のベクターを含む原核又は真核宿主細胞に関する。加えて、抗体が生成されるように宿主細胞を培養することを含む抗体を生成する方法が提供される。
Ｅ．Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメインの修飾
一態様において、上記実施形態の何れかに記載のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、Ｆｃ部分が修飾されている免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含む。修飾されたＦｃ部分は、野生型Ｆｃ部分と比較してＦｃγ受容体に対する低下した結合親和性を有する。
本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含むポリペプチド鎖の対からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、二量体であり、その各サブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。
本発明による一実施態様において、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧのＦｃドメインである。特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインである。別の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。より具体的な実施態様において、Ｆｃドメインは位置Ｓ２２８（Ｋａｂａｔ番号付け）でのアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。より特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含む、ＩｇＧ４のＦｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のインビトロでのＦａｂの腕交換を減少させる（Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)を参照）。更なる特定の実施態様において、Ｆｃドメインはヒトである。
Ｆｃドメインは、その標的組織における良好な蓄積及び好ましい組織－血液分配比率に寄与する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態学的特性を本発明の二重特異性抗体に付与する。しかし、同時期に、好適な抗原保有細胞に対するよりもむしろＦｃ受容体を発現する細胞に対する本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を導く。従って、特定の実施態様において、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比べた場合、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。そのような一実施態様において、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異的抗体）は、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインを含む本発明の二重特異的抗体）と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性が５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満を示し、及び／又は天然型ＩｇＧ１のＦｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインを含む本発明の二重特異的抗体）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一実施態様において、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異的抗体）はＦｃ受容体に実質的に結合しない及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃγ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も特異的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様において、Ｆｃ受容体は抑制性Ｆｃ受容体である。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、抑制性ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃｇＲＩＩＢである。一実施態様において、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌の一又は複数である。特定の実施態様において、エフェクター機能とはＡＤＣＣである。一実施態様において、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較した場合、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に類似の結合親和性を示す。ＦｃＲｎに対する実質的に類似の結合親和性は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異的抗体）が、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインを含む本発明の二重特異的抗体）の、ＦｃＲｎに対しての約７０％を超える、具体的には約８０％を超える、より具体的には約９０％を超える結合親和性を示すときに達成される。
ある実施形態では、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を低下させ及び／又はエフェクター機能を低下させるように操作される。特定の実施態様において、本発明の二重特異的抗体のＦｃドメインはＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、同一の一以上のアミノ酸置換がＦｃドメインの２つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様において、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を減少させる。一実施態様において、アミノ酸置換は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍減少させる。Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を減少させる複数のアミノ酸変異が存在する実施態様において、これらのアミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は更に少なくとも５０倍減少させ得る。一実施態様において、操作されたＦｃドメインを含む本発明の二重特異的抗体は、非操作型Ｆｃドメインを含んでなる本発明の二重特異的抗体と比較した場合、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満、具体的には１０％未満、より具体的には５％未満を示す。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃγ受容体である。幾つかの実施態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体は抑制性Ｆｃ受容体である。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、抑制性ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃｇＲＩＩＢである。幾つかの実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も特異的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体の各々に対する結合が減少する。幾つかの実施態様において、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性もまた減少する。一実施態様において、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に類似な結合、即ち、前記受容体への免疫グロブリンの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含んでなる本発明の二重特異的抗体）が、ＦｃＲｎに対し、非操作型形態のＦｃドメイン（又は前記非操作型形態のＦｃドメインを含んでなる本発明の二重特異的抗体）の約７０％より大きな結合親和性を呈する場合に達成される。Ｆｃドメイン又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異的抗体は、約８０％を越える、又は更に約９０％を越えるそのような活性を示す場合がある。ある実施態様において、本発明の二重特異的抗体のＦｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して低下したエフェクター機能を有するように操作される。エフェクター機能の減少は、限定されないが、以下の一つ又は複数を含み得る：抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の減少、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の減少、サイトカイン分泌の減少、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの減少、ＮＫ細胞への結合の減少、マクロファージへの結合の減少、単球への結合の減少、多形核細胞への結合の減少、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシスの減少、樹状細胞成熟の減少、又はＴ細胞プライミングの減少。一実施態様において、エフェクター機能の減少は、ＣＤＣの減少、ＡＤＣＣの減少、ＡＤＣＰの減少、及びサイトカイン分泌の減少の一又は複数である。特定の実施態様において、エフェクター機能の低下とはＡＤＣＣの低下である。一実施態様において、ＡＤＣＣの減少は、非操作型Ｆｃドメイン（又は非操作型Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異的抗体）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
一実施態様において、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置でアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の位置でアミノ酸置換を含む。幾つかの実施態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。そのような一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一実施態様において、Ｆｃドメインは位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換を含む。より特異的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換、及びＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む。より特異的な実施態様では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインはアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）を含む。そのような一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３に記載され、その全体が参照により本明細書に援用されるように、アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ＩｇＧ１のＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほとんど完全に消滅させる。ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３はまた、このような変異体Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などその特性を決定するための方法を記載する。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及びエフェクター機能の減少を呈示する。従って、幾つかの実施態様において、本発明の二重特異的抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ４のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一実施態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はそのエフェクター機能を更に低下させるために、一実施態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｌ２３５でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。別の実施態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｐ２３９でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む。このようなＩｇＧ４のＦｃドメイン変異体とそのＦｃγ受容体結合特性はＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施態様において、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の減少を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び必要に応じてＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び必要に応じてＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。
ある実施態様において、ＦｃドメインのＮ－グリコシル化は除かれている。そのような一つの実施態様において、Ｆｃドメインは位置Ｎ２９７でのアミノ酸変異、とりわけアラニンでアスパラギンを置換するアミノ酸置換（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸でアスパラギンを置換するアミノ酸置換（Ｎ２９７Ｄ）を含む。
本明細書中及びＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３に記述されたＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の減少を伴うＦｃドメインはまた、一以上のＦｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の置換を持つものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の二以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で知られている遺伝子的又は化学的方法を用いて、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードするＤＮＡ配列、ＰＣＲ、遺伝子合成等の部位特異的変異誘発を含むことができる。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって検証することができる。
Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）など標準的な計測機器を使用してＥＬＩＳＡによって又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって容易に決定することができ、そのようなＦｃ受容体は、組換え発現によって得ることができる。適切なこのような結合アッセイが本明細書に記載されている。代わりに、Ｆｃドメイン又はＦｃ受容体に対するＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞などを使用して評価することができる。
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能は、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイが本明細書に記載されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号：Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５，８２１，３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記述されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示される動物モデルにおいてインビボで評価することができる。
幾つかの実施態様において、補体成分に対する、具体的にはＣ１ｑに対するＦｃドメインの結合が低下する。従って、Ｆｃドメインがエフェクター機能が減少するように操作される幾つかの実施態様において、前記低下たエフェクター機能は減少したＣＤＣを含む。本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができそれ故にＣＤＣ活性を有するかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)；及び Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照）。
次のセクションでは、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を減少させるＦｃドメインの改変を含む本発明の二重特異性抗体の好ましい実施態様を説明する。
Ｆ．抗体変異体
ある実施態様において、上述されるものに加えて、本明細書で提供される二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体が意図される。例えば、二重特異性抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体は、二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
１．置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様において、一以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換は、表Ｂの「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表Ｂの「例示的置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
Figure 0007077263000002
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とする。
置換された変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の超可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
改変（例えば、置換）を、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築しそこから再選択することによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次に、二次ライブラリーが作製される。次に、前記ライブラリーはスクリーニングされて、所望の親和性を有る任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入するするもう一つの方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３がしばしば標的にされる。
ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個又は３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が該アミノ酸位に導入されて、最初の置換に対する機能的感受性を実証してもよい。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００又はそれよりも多い残基を含有するポリペプチドまでの長さに及ぶアミノ－及び／又はカルボキシル末端融合物、ならびに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
２．グリコシル化変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される二重特異性抗体は、抗体がグリコシル化される程度が増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は削除は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作り出される又は取り除かれるようにアミノ酸配列を変化させることにより都合よく実現しうる。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合する糖は改変され得る。哺乳動物細胞により産生された未処置の抗体は典型的には、一般的にはＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ連結により結合している分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な糖、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様では、本発明の二重特異性抗体におけるオリゴ糖の改変は、ある種の改善された特性を有する抗体変更体を生み出すためになされうる。
一実施態様では、Ｆｃ領域に結合している（直接的に又は間接的に）フコースを欠く糖構造を有する二重特異性抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％又は２０％～４０％まででもよい。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により測定された場合、Ａｓｎ２９７に結合している全てのグリコ構造体（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造体）の合計と比べたＡｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指すが；しかしながら、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流又は下流のおよそ±３アミノ酸に、即ち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。そのようなフコシル化変異体は改善されたＡＤＣＣ機能を有することがある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「非フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ａ１）、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２号（Ａ１）、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、アルファ－１、６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
二重特異性抗体変異体は、例えば、二重特異性抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。そのような二重特異性抗体変異体は減少したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は改善されたＣＤＣ機能を有しうる。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
３．システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、二重特異性抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作二重特異性抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、二重特異性抗体のアクセス可能な部位で存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基はそれにより抗体の接触可能部位に置かれ、この基を使用して抗体を、薬物部分又はリンカー薬物部分などの他の部分にコンジュゲートさせて、イムノコンジュゲートを作り出しうる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
Ｇ．組換え法及び組成物
本発明の二重特異性抗体は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成）又は組換え生成によって得ることができる。組換え生成のために、例えば上述したように、二重特異性抗体（又は断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様において、本発明の一以上のポリヌクレオチドを含むベクタ－、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法は、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、二重特異性抗体（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボでの組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部でもよく、核酸断片であっても良い発現ベクターは、二重特異性抗体（断片）をコードするポリヌクレオチド（即ちコーディング領域）がプロモーター及び／又は他の転写又は翻訳調節要素と作動可能に結合してクローン化される発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合には、コード領域の一部と考えられ得るが、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。二以上のコード領域が、単一ポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の二重特異性抗体（断片）、又は変異体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合され又は融合されない異種性コーディング領域をコードしうる。異種性コーディング領域は、限定するものではないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、例えばポリペプチドなど遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下に遺伝子産物の発現を配置するように、一以上の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコーディング領域及びそれに結合するプロモーターのような）二つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び二つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合にポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合される。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターに加えて、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動的に結合することができる。好適なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン－Ａと連結した最初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及び（例えばラウス肉腫ウイルスなど）レトロウイルスを含む。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギα－グロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を調節することができる他の配列に由来するものを含む。更なる好適な転写調節領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えばプロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、様々な転写制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定するものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）を含む。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）など染色体組み込み要素など他の特徴を含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コーディング領域は、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの分泌を指示する、分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコーディング領域を伴い得る。例えば、二重特異性抗体の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが本発明の二重特異性抗体又はその断片をコードする核酸の上流に配置されうる。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは一旦粗面小胞体を横切って成長するタンパク質鎖の排出が開始すると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、一般に、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。ある実施態様において、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後の精製を容易にし（例えば、ヒスチジンタグ）又は二重特異性抗体の標識化における補助のために使用されうる短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、ポリヌクレオチドをコードする二重特異性抗体（断片）の中又は末端に含まれうる。
更なる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞が提供される。更なる実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれ関連して本明細書に記載される特徴の何れかを単独又は組み合わせて組み込むことができる。一つのそのような実施態様において、宿主細胞は、本発明の二重特異性抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされる）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明の二重特異性抗体又はその断片を生成するよう操作できる何れかの種類の細胞システムを指す。二重特異性抗体の複製及び発現の補助に好適な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は、適切である場合、特定の発現ベクターを用いて形質移入又は形質導入されてよく、多量のベクター含有細胞は、例えば臨床用途に、十分な量の二重特異性抗体を得るために、大規模発酵槽に播種して増殖させることができる。好適な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要ない場合には、ポリペプチドは細菌で産生することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、グリコシル化経路が、「ヒト化」されている菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合した哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞の他の例は、ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７）；ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）系（例えば、Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)）に記載されているような２９３又は２９３Ｔ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載されているようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス***腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)に記載）、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、また、トランスジェニック生物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらのシステムにおいて外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖のどちらかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された産物が重鎖及び軽鎖の両方を有している抗体であるように、抗体鎖の他方を発現するように操作されうる。
一実施態様において、本発明による二重特異性抗体を生産する方法が提供され、その方法は、本明細書に与えられるように、二重特異性抗体の発現に適した条件下で、二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から二重特異性抗体を回収することを含む。
二重特異性抗体の構成要素は、遺伝的に互いに融合されている。二重特異性抗体は、その成分が、お互いに直接的に又はリンカー配列を介して互いに間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成物と長さは、当該技術分野において周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験され得る。二重特異性抗体の別々の構成要素間のリンカー配列の例は、本明細書に与えられる配列中に見いだされる。また、更なる配列が、所望であれば、融合体の個々の成分を分離するための切断部位、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を組み込むために含まれていてもよい。
ある実施態様では、二重特異性抗体のＦａｂ断片を形成する部分は、抗原決定基に結合できる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域が、天然に又は非天然に生じる抗体及びその断片の一部を形成し、及びそれに由来しうる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は当分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照）。非天然に生じる抗体は、固相－ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に生産されるか（例えば米国特許第４，１８６，５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含んでなるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５，９６９，１０８号を参照）によって得られうる。
何れかの動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域が、本発明の二重特異性抗体で用いることができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。二重特異性抗体がヒトでの使用を意図する場合、抗体の定常領域はヒトに由来するキメラ形態の抗体が使用され得る。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体も、当分野でよく知られている方法に従って調製することができる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，５６５，３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、限定されなが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体の機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴うか又は伴わない、ヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用に重要な残基）のみを移植ヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植する、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様部分（section）で「覆い隠す」ことを含む。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５，５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号、及び第７，０８７，４０９号；Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 31(3):169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフティングを記述）；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)（「リサーフェシング」を記述）；Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野で周知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、それに由来することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原投与に応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成され得る（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991））。ファージは典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として又はＦａｂ断片としての何れかで抗体断片を提示する。
ある実施態様において、本発明で有用なＦａｂ断片は、例えば、その全内容が出典明示によりここに援用される、米国特許第２００４／０１３２０６６号に開示されている方法に従い、高められた結合親和性を有するように操作されている。特定の抗原決定基に結合する本発明において有用な二重特異性抗体の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００システムで解析される）（Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)））及び伝統的な結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）の何れかによって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメインを同定するために使用されうる。ある実施態様では、このような競合する抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば線状又はコンホメーションエピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。典型的な競合アッセイにおいて、固定化抗原は、抗原に結合する第一の標識された抗体、及び抗原へ結合について第一の抗体と競合する能力について試験されている未標識の第二の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化抗原が、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。もし、固定化抗原に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、抗原への結合において、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
本明細書で記載のように調製される二重特異性抗体は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性等の要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、二重特異性抗体が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明の二重特異性抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、実施例に本質的に記載されるように二重特異性抗体を単離するために使用されうる。二重特異性抗体の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む様々なよく知られた分析方法の何れかによって決定されうる。
Ｈ．アッセイ
本明細書で提供されるＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、当技術分野で公知の様々なアッセイによって、同定され、その物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
１．親和性アッセイ
ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体の親和性は、実施例に記載の方法に従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）のような標準的な器具類を使用して決定することができ、そしてそのような受容体又は標的タンパク質は、組換え発現によって得ることができる。代替的に、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体の結合を、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価することができる。結合親和性を測定するための具体的な実例であり、例示的な実施態様は、以下及び下記実施例に記載されている。
一実施態様によれば、ＫＤは２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥヘルスケア）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定される。
Ｆｃ部分とＦｃ受容体との相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグ付組換えＦｃ受容体が、ＣＭ５チップ上に固定化された抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社）によって捕捉され、二重特異性コンストラクトは分析物として使用される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＧＥヘルスケア）を、提供者の指示書に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ抗体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で４０μｇ／ｍｌに希釈し、結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ６５００になるように５μｌ／分の流速で注入した。リガンドの注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。続いて、Ｆｃ受容体は６０秒間４又は１０ｎＭで捕捉される。動力学測定のために、二重特異性コンストラクトの４倍段階希釈（５００ｎＭから４０００ｎＭ）が、ＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で２５℃で約３０μｌ／分の流量で１２０秒間注入される。
標的抗原に対する親和性を決定するため、二重特異性コンストラクトは、抗ペンタＨｉｓ抗体について記載したように活性化ＣＭ５センサーチップ表面に固定化されている抗ヒトＦａｂ特異的抗体（ＧＥヘルスケア）に捕捉される。結合したタンパク質の最終的な量は約１２０００ＲＵである。二重特異性コンストラクトは３００ｎＭで９０秒間で捕捉される。標的抗原は、３０μｌの／分の流速で２５０～１０００ｎＭの濃度範囲で１８０秒間フローセルを通過する。解離は１８０秒間モニターされる。
バルクの屈折率の差は、参照フローセル上で得られた応答を差し引くことにより補正される。定常状態応答を用いて、ラングミュア結合等温線の非線形曲線フィッティングによって解離定数ＫＤを導出した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ－ｔｏ－ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）エバリュエーションソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照。
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様において、本発明の二重特異性抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
別の態様において、競合アッセイを、ＨＥＲ２への結合について、特異的抗ＨＥＲ２と競合する抗体を同定するために用いることができる。ある実施態様において、このような競合する抗体は、特異的抗ＨＥＲ２抗体により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。更なる方法が実施例のセクションに記載される。
３．活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそのＨＥＲ２に結合する二重特異性抗体を同定するために提供される。生物学的活性は、例えば、ＤＮＡの断片化、アポトーシスの誘導及び標的細胞の溶解を含み得る。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。一実施態様において、前記活性は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘導である。一実施態様において、前記二重特異性抗体は、ペルツズマブ及びトラスツズマブ単独よりも高度にＣＤＣを誘導する。一実施態様において、前記二重特異性抗体は、ペルツズマブ及びトラスツズマブ単独よりも少なくとも約１０倍高度に、少なくとも約２０倍高度に、少なくとも約３０倍高度にＣＤＣを誘導する。別の実施態様において、前記二重特異性抗体は、ＣＤＣをペルツズマブ又はトラスツズマブの組み合わせよりも高度に誘導する。別の実施態様において、前記二重特異性抗体は、ＣＤＣをペルツズマブ又はトラスツズマブの組み合わせよりも約３０％、４０％、５０％若しくは６０％、又は少なくとも３０％から７０％、又は少なくとも４０％から６０％高度に誘導する。補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを、非加熱処理血清又は市販の補体画分を用いて行うことができる（例えば、Lazar, G. A. et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc. Natl Acad. Sci. USA 103, 4005-4010 (2006)を参照）。標的細胞の死滅は、アラマーブルーなどの幾つかの細胞の生存試薬によって評価することができる（Lazar, G. A. et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc. Natl Acad. Sci. USA 103, 4005-4010 (2006), Idusogie, E. E. et al. Engineered antibodies with increased activity to recruit complement. J. Immunol. 166, 2571-2575 (2001)）、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（例えば、Zhao, X. et al. Targeting C-type lectin-like molecule-1 for antibody-mediated immunotherapy in acute myeloid leukemia. Haematologica 95, 71-78 (2009)を参照）、ＬＤＨ放出（例えば、Konishi, E., Kitai, Y. & Kondo, T. Utilization of complement-dependent cytotoxicity to measure low levels of antibodies: application to nonstructural protein 1 in a model of Japanese encephalitis virus. Clin. Vaccine Immunol. 15, 88-94(2008) 及びここに開示される実施例）又はカルセインＡＭ放出。幾つかの実施態様において、前記程度のＣＤＣの誘導は、ＬＤＨ放出アッセイ又は細胞性抗原に結合した本発明の抗体への補体タンパク質Ｃ１ｑの結合を測定する補体アッセイにより決定される。二重特異性抗体のＣＤＣ誘導はその後、ペルツズマブ又はトラスツズマブの何れか単独、又はペルツズマブ及びトラスツズマブの組み合わせのＣＤＣの誘導と比較され、ここでＣＤＣ誘導についての全ての値は同じ細胞株と同じ各抗体濃度を用いた同じアッセイでアッセイされる。マイクロタイタープレートで実行した場合、二重特異性抗体及び対照（ペルツズマブ又はトラスツズマブ単独、又はペルツズマブ及びトラスツズマブとの組み合わせの何れか）のＣＤＣを誘導する能力は、好ましくは、同じアッセイを使用して、同じマイクロタイタープレートで測定される。例示的なアッセイが、例えば、実施例１８又は１９に開示される。一実施態様において、ＣＤＣの前記誘導は、がん細胞において、例えば乳がん細胞において測定される。
ある実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、そのような生物学的活性について試験される。細胞溶解（例えばＬＤＨ放出の測定による）又はアポトーシス（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して）を検出するためのアッセイは、当該分野で周知である。ＡＤＣＣ又はＣＤＣを測定するアッセイはまた、全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２００４／０６５５４０（その中の実施例１を参照）に記載される。
Ｉ．薬学的製剤
本明細書に記載のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するかかる二重特異性抗体と任意の薬学的に許容可能な一以上の担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA(1980)）とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。特定の例示的ｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒＨｕＰＨ２０を含めて、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの一以上の付加的なグルコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン－酢酸緩衝液を含む。
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
活性成分は、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション技術により、又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル、及びポリ－（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル内に封入され得る。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
持続性放出調製物を調製することができる。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより達成することができる。
Ｊ．治療方法及び組成物
本明細書で提供される任意の二重特異性抗体の何れかを治療方法に使用することができる。
一態様では、医薬として使用するためのＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。更なる態様では、がんを治療することにおける使用のためのＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。ある実施態様において、治療の方法における使用のためのＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。ある実施態様において、本発明は、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体の有効量を個体に投与することを含む、癌に罹患した個体を治療する方法における使用のためのＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも一の付加的治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製におけるＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体の使用を提供する。一実施態様において、医薬はがんの治療のためのものである。更なる実施態様において、医薬は、がんを有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、がんを治療する方法で使用するためのものである。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも一の付加的治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
更なる態様にて、本発明は、がんを治療する方法を提供する。一実施態様において、本方法はがんに罹患した個体に、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体の有効量を投与することを含む。一つのそのような実施態様において、本方法は、後述するように、少なくとも一の付加的治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
更なる態様において、本発明は、例えば、上の治療方法の何れかにおいて使用するための、本明細書に提供されるＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体の何れかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書に提供されるＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体の何れかと薬学的に許容可能な担体とを含む。別の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書に提供されるＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体の何れかと、例えば、下に記載されるような、少なくとも一の付加的治療剤とを含む。
本発明の二重特異性抗体は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、及び鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
本発明の二重特異性抗体は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。これに関連した考慮因子としては、治療すべき具体的な疾患、治療すべき具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師にとって既知の他の因子が挙げられる。二重特異性抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
疾患の予防又は治療のために、本発明の二重特異性抗体の好適な用量は、治療する疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、二重特異性抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴、及び二重特異性抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。二重特異性抗体は一時的又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、その二重特異性抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な１日投薬量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。病態に応じて数日間又はより長い日数にわたる反復投与について、治療は、一般に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されるであろう。１つの例示される二重特異性抗体の用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。故に、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇの１回以上の用量が患者に投与されてもよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば二重特異性抗体の約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷投与量の後に一以上の低投与量が投与され得る。しかしながら、他の投与レジメンも有益であり得る。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
上記の製剤又は治療方法の何れかが、本発明のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体の代わりか又は加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
Ｋ．製造品
本発明の別の態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベル又は容器上にある又は容器に付属する添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の二重特異性抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明の二重特異性抗体を含有する組成物を中に収容する第一の容器と（ｂ）更なる細胞障害剤又は別の治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物を更に含んでいてもよい。別法として、又は加えて、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含んでもよい。
上記の製造品何れかが、本発明のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体の代わりか又は加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
Ｌ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、一以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書のＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０ ４２５２３５ Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び５７８０５８８号及び７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、５７１４５８６号、５７３９１１６号、５７６７２８５号、５７７０７０１号、５７７０７１０号、５７７３００１号、及び５８７７２９６号を参照；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)）；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含む一以上の薬物とコンジュゲートしている。
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomyciｎ）、エノマイシン（enomycin）、及びトリコテセン（tricothecenes）を含むがこれらの限定されない酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートされた本明細書に記載される抗体を含む。
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成する本明細書に記載される抗体を含む。放射性コンジュゲートの産生には種々の放射性同位元素が利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。検出のために放射性コンジュゲートを使用するとき、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
抗体と細胞傷害性薬物のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン－２，６－ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、リシンイムノトキシンを調製することができる。炭素－１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレン－トリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーChari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５２０８０２０号）を使用してもよい。
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＰＢ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に意図する。
ＩＩＩ．実施例
以下は本発明の方法及び組成物の例である。種々の他の実施態様は、上記に示す一般的な説明を前提として実施することができることが理解される。
前述の発明は、理解を明確にする目的のために、例示と実施例によりある程度詳細に記載してきたが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示内容は、参照によりその全体が援用される。
実施例１：材料と方法
特に明記しない限り、以下の一般的な方法が適用されている：
組換えＤＮＡ技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記述されるように、標準的な方法がＤＮＡを操作するために使用された。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。
ＤＮＡ及びタンパク質配列分析及び配列データ管理
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の塩基配列に関する一般情報については、Kabat, E., A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に与えられる。抗体鎖のアミノ酸はＥＵ番号付けに従って番号付けされる（Edelman, G.M., et al., PNAS 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242）。ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ソフトウェアパッケージバージョン１０．２及びＩｎｆｏｍａｘ’ｓ Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅのバージョン８．０が配列の作成、マッピング、解析、注解及び図解のために使用された。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った二本鎖配列決定により決定した。
実施例２：２＋２ ＩｇＧ－ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の生成。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により調製された。特異な制限酵素切断部位に隣接する遺伝子セグメントがｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングされた。プラスミドＤＮＡを形質転換した細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニング遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
発現プラスミドの構築
以下の発現ベクターを、全ての重鎖及び軽鎖をコードする発現プラスミドの構築のために使用した。ベクターは、以下の要素からなる：
－ 選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
－ エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ、
－ 大腸菌でこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点
－ 大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ－ラクタマーゼ遺伝子、
－ ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ヒト免疫グロブリン１ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、及び
重鎖又は軽鎖を含む免疫グロブリン遺伝子は遺伝子合成により調製され、上記のようにｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングされた。可変重鎖コンストラクトは、固有の制限部位を用いて方向性クローニングによって構築された。可変軽鎖コンストラクトは、ＶＬ及びＣＬを含む遺伝子合成として発注され、固有の制限部位を用いて方向性クローニングによって構築された。最終的な発現ベクターは、大腸菌細胞に形質転換し、発現プラスミドＤＮＡを単離し（ミニプレップ）、制限酵素分析及びＤＮＡ配列決定に供した。正しいクローンを１５０ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地中で増殖させ、再びプラスミドＤＮＡを単離し（マキシプレップ）、配列の完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。
ＨＥＫ２９３細胞における免疫グロブリン変異体の一過性発現
組換え免疫グロブリン変異体は、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）の指示に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現システムを使用して、ヒト胎児腎臓２９３－Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。小規模試験発現のため、０．５×１０６のＨＥＫ２９３Ｆ細胞／ｍｌの３０ｍｌをトランスフェクションの一日前に播種した。翌日、プラスミドＤＮＡ（培養体積のｍｌ当たり１μｇのＤＮＡ）が、１．２ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ低血清培地（Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）と混合され、続いて、４０μｌの２９３ＦｅｃｔｉｎＴＭトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）が添加された。混合物を室温で１５分間インキュベートし、細胞に滴下した。トランスフェクションの一日後、各フラスコに、３００μｌのＬ－グルタミン（２００ｍＭ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びｆｅｅｄ７（Ｌ－アスパラギン、アミノ酸、微量元素、ＨｙＰｅｐ１５１０、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、エタノールアミン、微量元素、Ｄ－グルコース、ＲＰＭＩを含まないフリースタイル培地を含む）の６００μｌが供給された。トランスフェクションの三日後、細胞濃度、培地中の細胞濃度、生存能力及びグルコース濃度を、自動化された細胞生存率分析器（Ｖｉ－ＣＥＬＬＴＭ ＸＲ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びグルコースメーター（Ａｃｃｕ－ＣＨＥＫ（登録商標）Ｓｅｎｓｏｒ ｃｏｍｆｏｒｔ，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。加えて、各フラスコに、Ｌ－グルタミンを３００μｌ、供給した非必須アミノ酸溶液（ＰＡＮＴＭ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を３００μｌ、ピルビン酸ナトリウムを３００μｌ（１００ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｆｅｅｄ７を１．２ｍｌ及びグルコース（Ｄ－（＋）－グルコース溶液４５％、シグマ）を５ｇ／Ｌ、供給した。最後に、トランスフェクションの６日後、抗体は、周囲温度で１５分間、Ｘ３Ｒ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ（Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）で３５００ｒｐｍで遠心分離により回収し、上清を滅菌Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルターユニット（０．２２ｍｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＬＵＳ ＰＥＳメンブラン，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を通して濾過し、更に使用するまで－２０℃で保存した。５Ｌまでの大規模なトランスフェクションは、直線的にスケーリングされた。
二重特異性抗体及び対照抗体の精製
二重特異性抗体は、プロテインＡ－セファロースＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する親和性クロマトグラフィー及びスーパーデックス２００サイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製された。簡潔には、無菌ろ過した細胞培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４，１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４，１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２．７ｍＭのＫＣｌ，ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＴｒａｐプロテインＡＨＰ（５ｍｌ）カラムに適用した。非結合タンパク質は、平衡緩衝液を用いて洗浄した。抗体及び抗体変異体は、０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ２．８で溶出し、タンパク質を含む画分は、０．１ｍｌの１Ｍトリス、ｐＨ８．５で中和した。次いで、溶出したタンパク質画分をプールし、アミコンウルトラ遠心濾過装置（ＭＷＣＯ：３０Ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で３ｍｌの体積まで濃縮し、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化した、スーパーデックス２００ＨｉＬｏａｄ １２０ｍｌ １６／６０又は２６／６０ゲル濾過カラムにロードした。５％未満の高分子量凝集体を含有する精製二重特異性抗体及び対照抗体を含む画分がプールされ、－８０℃で１．０ｍｇ／ｍｌの一定分量として保存した。
タンパク質の定量
タンパク質は、プレパックされたポロス（登録商標）ＡプロテインＡカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を装着し、自動化されたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００システム（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｉｄｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーにより定量した。全ての試料は緩衝液Ａ（０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４・［２Ｈ２Ｏ］、ｐＨ７．４）にロードされ、緩衝液Ｂ（０．１Ｍのクエン酸、０．２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．５）で溶出した。タンパク質濃度を決定するために、吸光係数１．６２を全ての試料に使用した。
精製タンパク質の分析
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。二重特異性抗体及び対照抗体の純度及び分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４－ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及びクーマシーブリリアントブルーによる染色により分析された。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した（４－２０％のトリスグリシン・ゲル）。二重特異性及び対照抗体試料の凝集体含量は、２５℃で２００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０の泳動用緩衝液中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分析的サイズ排除カラムを使用して高性能ＳＥＣにより分析された。２５μｇのタンパク質が流速０．５ｍｌ／分でカラムに注入され、５０分間にわたり均一濃度で溶出された。還元された二重特異性抗体軽鎖と重鎖のアミノ酸主鎖の完全性は、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）による酵素処理によるＮ－グリカンの除去後にナノエレクトロスプレーＱ－ＴＯＦ質量分析法により検証された。
分析用ＨＰＬＣ
抗体は、ＴＳＫ－ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷゲル濾過カラム（７．５ｍｍ ＩＤｘ３０ｃｍ，ＴｏｓｏＨａａｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を装着したＡｇｉｌｅｎｔ１１００ ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分析した。１８μｌの溶出したタンパク質を緩衝液Ａ（３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５中の０．０５ＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４）中でカラムにロードし、サイズに基づいて分離した。
還元及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
溶出したタンパク質の７μｌを２×試料緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）と混合し、別の７μｌは１０％の還元剤（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料還元剤，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含む２×試料緩衝液と混合した。試料は１０分間、７０℃まで加熱し、プレキャストＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４－１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）上でロードした。ゲルは、２００Ｖで１２５ｍＡで４５分間流した。その後、ゲルは、ミリポア水で３回洗浄し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）。ゲルを、ミリポア水で一晩脱色した。
図１のａ）からｄ）は、２＋２ ＩｇＧ－ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の異なる変異体を模式的に示す。全ての二重特異性抗体は、それぞれの抗原結合部位に対して二価であり、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２受容体の異なる２つのパラトープに結合する（抗原１＝トラスツズマブ特異性；抗原２＝ペルツズマブ特異性）。本明細書中に記載の２＋２ ＩｇＧ－ｓｃＦｖフォーマットの全ての二重特異性抗体は、非フレームワーク移植、非ＣＤＲ最適化、非糖鎖操作型であり、Ｆｃ部分に任意の変異を有しない。
図２から４は、２＋２ ＩｇＧ－ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の変異体の例示的サイズ排除精製グラフ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及び分析用ＨＰＬＣを示す。ＴｖＡＢ１７、ＴｖＡＢ１３及びハーセプチン－ｓｃＦｖ＿ＡからＥのデータは示されず；２＋２ ＩｇＧ－ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の全ての変異体は同じ品質で生成された。
Figure 0007077263000003
Figure 0007077263000004
Figure 0007077263000005
Figure 0007077263000006
実施例３：２＋２ ＩｇＧ－ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体による増殖阻害アッセイ。
細胞株
ＭＤＡ－ＭＢ１７５ ＶＩＩ細胞は、１０％ウシ胎児血清及び２ｍＬのＬ－グルタミンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）中で維持された。細胞株の増殖は、標準的な細胞培養プロトコルに従った。
増殖を阻害する二重特異性抗体の能力は、細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－１７５ ＶＩＩにおいて評価された。ＭＤＡ－ＭＢ－１７５ ＶＩＩは、１０％ウシ胎児血清、２ｍＬのＬ－グルタミンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養された。対数増殖期の細胞を分離し、計数し、２ｘ１０ｅ４細胞を９６ウェル細胞培養プレートのウェル当たり１００μＬの培地中に播種した。細胞はインキュベーター中で一晩維持され、翌日、培地で希釈された各抗体の１００μＬを細胞の希釈系列の形式で添加した。６日間の総インキュベーションの後、細胞増殖を、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をアッセイで評価した。アッセイを製造業者によって推奨されるように行った。
Figure 0007077263000007
実施例４：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ安定化
重鎖の位置９８でのアスパラギン酸異性化部位及び軽鎖の位置３０でのアスパラギンの脱アミド部位はトラスツズマブの安定性ホットスポットである。これら二つの位置は、抗体の抗原結合能力の安定性及び完全性に影響を与える。この問題は、コハク酸ナトリウム又はヒスチジン緩衝液の何れかを使用して凍結乾燥製剤を導入することによって克服された。安定性及び貯蔵半減期を増加させるために、我々は、それらの不安定性の既知の原因をアミノ酸又はより高度の固有の安定性を有するべきであるアミノ酸ストレッチにより置き換えることを意図した。私たちは、重鎖におけるＡｓｐ９８のＧｌｕによる置換、及び軽鎖におけるＡｓｎ３０のＳｅｒ並びにＴｈｒ３１のＶａｌによる置換を試験した。これらの変異は、Ｄ９８Ｅ、Ｎ３０Ｓ、及びＴ３１Ｖと略記される。Ｔ３１ＶはＮ３０の脱アミド化に直接影響を与えないが、アスパラギンのＣ末端側に隣接する残基がポリペプチド鎖の安定性に影響を与えるだろうと仮定された。
抗体の試料は、３つの緩衝液：４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０、４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０、又は４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４のうちの一つにおいて、４０℃で、１、２、又は３月の何れかの期間にわたってインキュベートされた。この期間中のタンパク質濃度は、常に１ｍｇ／ｍｌであった。指示した時点の後、試料が採取され、液体窒素中で衝撃凍結し（shock frozen）、その後更なる分析まで－８０℃で保存した。この分析は、ＰｒｏｔｅｏｎのＸＰＲ３６装置（ＢｉｏＲａｄ）で行った。Ｈｅｒ２のおよそ７００ＲＵは、それぞれ、アミンカップリングを使用してＧＬＭチップの２つのチャネル上に固定化した（垂直方向）。トラスツズマブ変異体を、１００μｌ／分で水平方向で注入することにより、６つの異なる分析物濃度（１００、５０、２５、１２．５、６．２５、０ｎＭ）で二重に測定した。会合速度は、１８０秒間記録され、解離速度は６００秒間記録された。再生は、１５０μｌ／分で６０秒間、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５及び５０ｍＭのＮａＯＨの２つのパルスによって行った（水平方向）。合計で４つの異なるトラスツズマブ変異体が測定された。最初の実験において（表３及び４）、非修飾トラスツズマブ及び変異体６０２（重鎖のＤ９８Ｅ及び軽鎖のＴ３１Ｖ）が試験された。２回目の実験において、非修飾トラスツズマブ及び変異体６０２（重鎖のＤ９８Ｅ及び軽鎖のＴ３１Ｖ）及び変異体ＶＨ：Ｄ９８Ｅ／ＶＬ：Ｎ３０Ｓ ＶＨ：Ｄ９８Ｅ／ＶＬ：Ｎ３０Ｔが試験された（表５、６、７）。
結果：
全ての変異体は、親トラスツズマブ分子として組換えＨＥＲ２抗原に対して同じ親和性を示す。４０℃でｐＨ５又はｐＨ６に曝露後、トラスツズマブは、、オフ速度が高められ、オン速度を変えずに維持することによって主に駆動され、～５倍親和性を失った。変異体６０２は、ｐＨストレス前後にほとんど区別がつかないの親和性を示した。変異体Ｎ３０Ｓは、親トラスツズマブと比較して最初からより高い親和性を有し、ストレス状態の間ほぼ一定であった。Ｎ３０Ｓ、Ｎ３０Ｔ、又はＶ（ＶＬ）の何れかと一緒に変異体Ｄ９８Ｅ（ＶＨ）が更なる実験に使用された。結果は図５及び図６並びに以下の表に示される。
Figure 0007077263000008
Figure 0007077263000009
Figure 0007077263000010
Figure 0007077263000011
Figure 0007077263000012
実施例５：ストレス後のトラスツズマブ及びトラスツズマブ安定化変異体のＫＬＰ－４細胞への結合
結合
ＫＰＬ－４細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。０．２Ｍｉｏ細胞を、９６ウェル丸底プレートに播種した。細胞をペレットにするために、プレートを４００×ｇで３分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を希釈した抗体４０μｌに再懸濁した。プレートは、抗体の結合を可能にするために４℃で３０分間インキュベートした。未結合抗体を除去するために、細胞を再び遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。抗体を検出するために、細胞を、希釈した二次ヤギ抗ヒトＦｃ特異的ＦＩＴＣ標識二次抗体１２μｌ中に再懸濁し（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９－０９６－０９８）、４℃で３０分間再びインキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液２００μｌに再懸濁し、蛍光をＢＤ ＣａｎｔｏＩＩを用いて測定した。
ＡＤＣＣ
標的細胞を回収し、洗浄し、カルセイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、ＡＩＭＶ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させ、３×１０４細胞／ウェルの濃度で播種した。各抗体希釈液を細胞に三通りで添加し、エフェクター細胞（末梢血単核エフェクター細胞［ＰＢＭＣ］）の添加前に１０分間インキュベートした。エフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）細胞は、次いで、指示されたＥ：Ｔ比で３７℃で指示された時間インキュベートされた（全試料について三通り）。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いでホウ酸緩衝液で溶解した。カルセイン保持率はＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ３ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒで測定された。ＡＤＣＣは、以下の式を用いて計算された。
Figure 0007077263000013
抗体無しでエフェクター細胞と共にインキュベートした標的細胞に対応する自発的放出は、０％細胞毒性として定義され、最大放出（１％トリトンＸ－１００で溶解した標的細胞）は、１００％細胞毒性として定義された。三通りの各実験のＡＤＣＣの平均割合及び標準偏差が計算された。
結果を図７から９に示す。
実施例６：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣｒｏｓｓＭａｂの生成及び誤対合の減少を達成するための新規ＬＣ０６ベースのフレームワークにおけるフレームワーク移植
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により調製された。ｓｃＦｖ抗体断片のＣ末端付着を有する重鎖又は軽鎖、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異を有する「ノブ・イントゥー・ホール」抗体重鎖及び未修飾ＶＨドメインと組み合わせて、ＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を有する「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖、交差Ｃカッパドメイン又はｓｃＦａｂ抗体断片並びに未修飾抗体軽鎖又はＣＨ１ドメイン交換軽鎖をコードする遺伝子セグメントは特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位（ＢａｍＨＩ－ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ－ＸｍｎＩ又はＢａｍＨＩ－ＫｐｎＩ）により隣接され、ｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングされた。プラスミドＤＮＡを形質転換した細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニング遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。全てのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）をコードする５’末端ＤＮＡ配列を含んでいた。
発現プラスミドの構築
全ての「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖並びに抗体軽鎖をコードする発現プラスミドの構築のために使用された発現ベクターは以下の要素を含む：
－ 選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
－ エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ、
－ 大腸菌でこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点
－ 大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ－ラクタマーゼ遺伝子、
－ ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ヒト免疫グロブリン１ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、及び
－ 固有のＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限部位。
ｓｃＦｖ抗体断片のＣ末端付着を有する重鎖又は軽鎖、未修飾ＶＨドメインを有する「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖、交差Ｃカッパドメイン又はｓｃＦａｂ抗体断片並びに未修飾抗体軽鎖又はＣＨ１ドメイン交換軽鎖は遺伝子合成により調製され、記載のようにｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングされた。合成されたＤＮＡセグメント及び発現ベクターを保有するｐＧ１８（ａｍｐＲ）プラスミドを、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ及びＸｍｎＩ又はＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。ｓｃＦｖ抗体断片のＣ末端付着を有する精製された重鎖又は軽鎖、「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖及び未修飾又はドメイン交換軽鎖をコードするＤＮＡセグメントは、次いで、単離された発現ベクターＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ／ＸｍｎＩ又はＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ断片に連結され、最終発現ベクターが得られた。最終的な発現ベクターは、大腸菌細胞に形質転換し、発現プラスミドＤＮＡを単離し（ミニプレップ）、制限酵素分析及びＤＮＡ配列決定に供した。正しいクローンを１５０ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地中で増殖させ、再びプラスミドＤＮＡを単離し（マキシプレップ）、配列の完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。
ＨＥＫ２９３細胞における二重特異性抗体の一過性発現
組換え二重特異性抗体は、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）の指示に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現システムを使用して、ヒト胎児腎臓２９３－Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。簡単に説明すると、懸濁液ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３－Ｆ細胞を３７℃／８％ＣＯ２でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（登録商標）２９３発現培地中で培養し、トランスフェクションの１日前に細胞を１×１０６生細胞／ｍｌの密度で新鮮な培地に播種した。トランスフェクションのために、ＤＮＡを、２９３－ＦｒｅｅＴＭトランスフェクション試薬（Ｍｅｒｃｋ，ＵＳＡ）１６２．５μｌ、「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖１及び２を１：１のプラスミド比でｓｃＦａｂをコードするＤＮＡのＮ末端付着を有する重鎖１２５μｇ、及び２５０ｍｌの最終トランスフェクション体積中１：１：１のモル比の軽鎖プラスミドＤＮＡを使用して１０ｍｌのダルベッコＰＢＳ（ＰＡＡ，Ａｕｓｔｒｉａ）中で調製した。Ｃｒｏｓｓ Ｍａｂｓのトランスフェクションのために、「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖１：未修飾軽鎖：Ｃカッパドメイン交換「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖２：ＣＨ１ドメイン交換軽鎖のプラスミド比１：１：１：１、１：１：１：２、１：１：１：４、１：１：１：８が調製された。ＣＨ１－ＶＬ軽鎖プラスミド比は、ＣＥ－ＳＤＳ及びＱ－ＴＯＦ分光法の組み合わせを用いて鎖対の最適化を評価するために、１倍、２倍、４倍及び８倍のモル比で使用した。抗体を含有する細胞培養上清は、トランスフェクション後７日目に３０分間１４０００×ｇでの遠心分離により回収し、無菌フィルター（０．２２μｍ）を通して濾過した。上清を精製まで－２０℃で保存した。得られた抗体の配列を以下の表８に示す。
二重特異性＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞抗体の糖鎖操作誘導体の調製
二重特異性＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞抗体の糖鎖操作誘導体は、リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用して哺乳動物抗体の重鎖及び軽鎖の発現ベクターを用いて、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞をコトランスフェクトすることによって産生された。指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞は、リン酸カルシウム法によりトランスフェクトされた。糖操作抗体の産生のために、細胞を融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現のためのプラスミド及びマンノシダーゼＩＩ発現のための第二のプラスミドそれぞれでコトランスフェクトした。上記の材料と方法のセクションに記載したように、二重特異性抗体のプラスミド比が添加された。細胞を、１０％のＦＣＳを補填したＤＭＥＭ培養培地を使用してＴフラスコ中で付着単層培養として増殖させ、それらが５０及び８０％集密になるときに形質移入した。Ｔ７５フラスコのトランスフェクションでは、ＦＣＳ（最終１０％ｖ／ｖで）（最終的には２５０／ｍｌのネオマイシン）を補填した約１４ｍｌのＤＭＥＭ培養培地に形質移入の２４時間前に７．５（から８）００万細胞を播種し、細胞を５％ＣＯ２大気のインキュベーター中に３７℃で一晩置く。トランスフェクトされる各Ｔ７５フラスコに対して、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液は、４７μｇの総プラスミドベクターＤＮＡ、２３５μｌの１ＭのＣａＣｌ２溶液を混合し、４６９μｌの最終容積まで水を加えることにより調製された。この溶液に、４６９μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ７．０５）を加え、直ぐに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置した。懸濁液を、２％のＦＣＳを補填した約１２ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりにＴ７５フラスコに加えた。細胞を約１７から２０時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、ついで培地を約１２ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置換した。馴化培地は、トランスフェクション後５から７日目に回収され、２１０～３００＊ｇで５分間遠心分離し、０．２２μｍの滅菌フィルターでろ過し（１２００ｒｐｍで５分間遠心分離、続いて４０００ｒｐｍで１０分間の２回目の遠心分離）し、４℃で保存した。
糖操作抗体は精製され、非糖操作抗体について上述したように処方した。フコースの量を決定するために、下記のように、抗体のＦｃ領域に付着したオリゴ糖を分析した。
フレームワーク移植
原理：トラスツズマブ及びペルツズマブの同様のフレームワークは、軽鎖の誤対合を可能とする：トラスツズマブ及びペルツズマブの両方がＶＨＩＩＩ ＶＬｋＩフレームワークを有し、従って、両方の重鎖に対する軽鎖界面親和性は同じである。
ｃｒｏｓｓＭａｂ Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ二重特異性抗体において、軽鎖の誤対合を回避するために、「ＣｒｏｓｓＭａｂＸＰｅｒ Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ」のトラスツズマブのフレームワークは、非関連抗体ＬＣ０６のフレームワークと交換された。トラスツズマブは、生殖系列ｈＶＨ３＿６６及びｈＶＫ１Ｄ＿３９に関連するが、抗体ＬＣ０６は生殖系列ｈＶｂａｓｅ＿ＶＨ１＿１、生殖系列ｈＶＬ＿３にそれぞれ対応する。ペルツズマブはｈＶＨ３＿２３及びｈＶＫ１Ｄ＿１３に関連し、トラスツズマブと比較して非常に類似したフレームワークシステムを示している。
ＬＣ０６の両方の生殖系列アクセプターフレームワークは、トラスツズマブフレームワークとは異なり、特に、トラスツズマブカッパ軽鎖に比べＬＣ０６ラムダ軽鎖は異なる。トラスツズマブの抗体のＦａｂ結晶構造が重ね合わされ、フレームワークの互換性が構造的に評価されている。トラスツズマブ軽鎖のＣＤＲＩ、ＩＩ及びＩＩＩが、ＬＣ０６の新しいラムダフレームワークに移植された。含まれる変異は、Ｄ９８Ｅ及びＮ３０Ｓであり、Ｎ３０Ｓ改変によるＨｅｒ２細胞外ドメインに対する親和性の増加を理由として、Ｎ３０ＳがＴ３１Ｖのために使用された。ＣＤＲ移植によって引き起こされたＫｄの任意の減少は、Ｎ３０Ｓ変異の使用によって補正することができると考えられた。アクセプターフレームワークの一部順応が、それらの生物学的活性コンホメーションのＣＤＲを得るために必要であった；例えば、軽鎖のＫａｂａｔ位置７１でのＡ（ＬＣ０６ラムダ）はＦ（トラスツズマブカッパ）に復帰変異されている。ペルツズマブの元のＶＨＩＩＩ－ＶＬｋＩ（カッパＩファミリー）フレームワークが維持された。得られた二重特異性抗体は、「ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＣＤＲＧ Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ」として示され、配列は以下の表８に示される。
Figure 0007077263000014
Figure 0007077263000015
Figure 0007077263000016
Figure 0007077263000017
Figure 0007077263000018
Figure 0007077263000019
Figure 0007077263000020
二重特異性抗体の精製
二重特異性抗体は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ－セファロースＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する親和性クロマトグラフィー及びスーパーデックス２００サイズ排除クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）により細胞培養上清から精製された。簡潔には、無菌ろ過した細胞培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂に捕獲し、平衡化緩衝液で洗浄し、ｐＨ３．０で２５ｍＭのクエン酸ナトリウムにより溶出した。溶出したタンパク質画分をプールし、２Ｍトリス、ｐＨ９．０を用いて中和し、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したスーパーデックス２００ ２６／６０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。サイズ排除クロマトグラフィー画分をＣＥ－ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）で分析し、二重特異性抗体を含有する画分をプールし、－８０℃で保存した。
精製タンパク質の分析
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。二重特異性及び対照抗体の純度、完全性及び分子量は、マイクロ流体Ｌａｂｃｈｉｐ技術（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を用いて、ＣＥ－ＳＤＳにより分析した。５μｌのタンパク質溶液をＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔキットを使用して製造元の指示に従ってＣＥ－ＳＤＳ分析のために調製され、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐを使用して、ＬａｂｃｈｉｐＧＸＩＩシステム上で分析した。データは、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸソフトウェアバージョン３．０．６１８．０を使用して分析した。二重特異性及び対照抗体試料の凝集体含量は、２５℃で２００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０の泳動用緩衝液中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分析的サイズ排除カラムを使用して高性能ＳＥＣにより分析された。２５μｇのタンパク質が流速０．５ｍｌ／分でカラムに注入され、５０分間にわたり均一濃度で溶出された。
質量分析法
還元された二重特異性抗体軽鎖と重鎖のアミノ酸主鎖の完全性は、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）による酵素処理によるＮ－グリカンの除去後にナノエレクトロスプレーＱ－ＴＯＦ質量分析法により検証された。重鎖及び軽鎖の誤対合の量も定量した。
表面プラズモン共鳴
機器：ビアコアＴ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
ソフトウエア：ビアコア Ｔ１００コントロール、バージョン２．０２／２．０３
ビアコア Ｔ１００評価バージョン２．０２／２．０３
ビアコア Ｂ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ）
ソフトウエア：ビアコア Ｂ３０００ コントロール、バージョン４．１．２
ＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎ、バージョン４．１．１
アッセイフォーマット チップ：ＣＭ５－チップ
＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞－分子の動力学定数及び得られた親和性は、「トラスツズマブ」－及び「ペルツズマブ」－機能性のそれぞれ両方について測定された。これら二つの機能は、アミン結合された親ＭＡｂ「トラスツズマブ」（ＦＣ１／２）又は「ペルツズマブ」（ＦＣ３／４）の何れかとのＨｅｒ２の事前複合体形成を経由して区別された。親ＭＡｂとＨｅｒ２の複合体形成は、Ｈｅｒ２ ＥＣＤの注入後に開始した。
事前複合体化親Ｍａｂ「トラスツズマブ」／Ｈｅｒ２の結果、全ての「トラスツズマブ」－結合部位は飽和しているが、全ての「ペルツズマブ」－結合部位は利用可能であり、逆の場合も同じである。最後に、分析されるべき「＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞」－分子の結合は、毎回漸増濃度を用いる注入を介して測定された。観察された会合及び解離は、ラングミュア１：１結合モデルにより計算された。測定中Ｈｅｒ２の解離を最小限に抑えるために、動力学定数はＴ＝２５℃で測定された。
捕獲分子のアミンカップリング
製造業者の説明書に従ったフローセル１から４の標準的なアミンカップリング：ＣＭ５チップ、Ｔ＝２５℃、泳動用緩衝液：ＨＢＳ－Ｎ緩衝液：ＥＤＣ／ＮＨＳの混合物による活性化、８００ＲＵを目標；親Ａｂｓ「トラスツズマブ」又は「ペルツズマブ」は、カップリング緩衝液酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、ｃ＝２－３μｇ／ｍＬで希釈された；最後に、残りの活性化カルボキシル基は１Ｍエタノールアミンの注入によりブロックされた。
（アミン結合された親のｍＡｂ「トラスツズマブ」又は「ペルツズマブ」の何れかを用いた）フローセル１及び３のチップ表面は、可能な緩衝液作用又は非特異的結合を補正するための基準対照表面として用いられた。
２５℃での＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞分子の動力学的特性評価
泳動用緩衝液：ＰＢＳ
全ての試料は泳動用緩衝液＋１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで希釈した。
フローセル２と４におけるＨＥＲ２ ＥＣＤの捕獲：ｃ＝１００ｎＭ、流速５μＬ／分、時間１２０秒。
分析物試料：５つの濃度（ｃ＝３００、１００、３３．３３、１１．１１及び３，７ｎＭ）で分析される＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞－分子の古典的な濃度系列は、５０μｌ／分の流速で注入された。各濃度に対してシングルス、重複として１回；結合時間：１８０秒、解離時間：９００秒。
最終的な再生は、アミン結合Ｍａｂ「トラスツズマブ」に対して１０ｍＭのグリシンｐＨ２．５、アミン結合Ｍａｂ「ペルツズマブ」に対して２５ｍＭのＮａＯＨ、接触時間は各６０秒、流速３０μｌ／分を用いて各サイクル後に行った。
動力学的パラメータは、二重基準（対照基準：Ｍａｂトラスツズマブ及びペルツズマブのそれぞれに対する分析物の結合；フローセル：１それぞれ３）を用いて算出し、濃度「０」は、ブランクとして使用した。計算は、「ラングミュア結合１：１」モデル、ＲＩ（屈折率）＝０を用いて行った。
結果：二重特異性、二価＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞抗体分子の発現＆精製
上記の材料及び方法に記載される手順に従って、二重特異性、二価＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞抗体分子ＯＡｓｃＦａｂ１、ＯＡｓｃＦａｂ２、ＯＡｓｃＦａｂＰｅｒ１、ＯＡｓｃＦａｂＰｅｒ２、ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＰｅｒ、ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＴｒａ及びＣｒｏｓｓＭａｂ－ＣＤＲＧが発現され精製される。各分子において、ＶＨ及びＶＬの一部は、可変軽鎖における変異Ｔ３１Ｖ又はＮ３０Ｔ及び重鎖における変異Ｄ９８Ｅを有する最適化されたトラスツズマブ配列及びペルツズマブの親配列それぞれに基づいている。抗体の模式構造を図１０に示す。配列を上記表８に示す。
＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞抗体分子、ＯＡｓｃＦａｂ１ Ｈｅｒ２ ＧｌｙＭａｂ、ＯＡｓｃＦａｂ２ Ｈｅｒ２ ＧｌｙＭａｂ、ＯＡｓｃＦａｂＰｅｒ１ Ｈｅｒ２ ＧｌｙＭａｂ、ＯＡｓｃＦａｂＰｅｒ２ Ｈｅｒ２ ＧｌｙＭａｂ（全て糖鎖操作され、「ノブ・イントゥー・ホール」、Ｄ９８Ｅ及びＴ３１Ｖ変異を保有するトラスツズマブｓｃＦａｂを有する）、ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＰｅｒ Ｈｅｒ２ ＧｌｙＭａｂ、ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＴｒａ Ｈｅｒ２ ＧｌｙＭａｂ（両方とも糖鎖操作され「ノブ・イントゥー・ホール」、Ｄ９８Ｅ及びＴ３１Ｖ変異を保有するトラスツズマブｃｒｏｓｓ－Ｆａｂを有する、及びＣｒｏｓｓＭａｂ－ＣＤＲＧ Ｈｅｒ２ ＧｌｙＭａｂ（糖鎖操作され、「ノブ・イントゥー・ホール」、ＣＤＲ移植される、Ｄ９８Ｅ及びＴ３１Ｖ変異を保有するトラスツズマブｃｒｏｓｓ－Ｆａｂを有する）の発現はウェスタンブロッティング及びＨＰ－ＳＥＣによって確認された（図１１）。ＯＡｓｃＦａｂ１、ＯＡｓｃＦａｂ２、ＯＡｓｃＦａｂＰｅｒ１、ＯＡｓｃＦａｂＰｅｒ２、ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＰｅｒ、ＣｒｏｓｓＭａｂ Ｘｔｒａ及びＣｒｏｓｓＭａｂ－ＣＤＲＧの精製は、表９に示した収率をもたらした。全てのＯＡｓｃＦａｂコンストラクトは、精製後９０％未満のモノマーを示し、これらの分子の純度の減少は、発現においてプラスミドの比を最適化することにより増加されることはできなかった（データ非表示）。ただし、発現におけるプラスミド鎖比の最適化は、以下に説明するようにＣｒｏｓｓＭａｂ抗体の精製後に存在する単量体画分を増加させることが判明した。
Figure 0007077263000021
実施例７：二重特異性、二価＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞抗体分子の発現＆精製、発現において使用されるプラスミド比の最適化
ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＴｒａ
上記の材料及び方法に記載される手順に従って、二重特異性、二価＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞抗体分子ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＴｒａは、１：１：１：１、１：１：１：２、１：１：１：４及び１：１：１：８のモルプラスミド比を用いて発現させ精製された。ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＴｒａの発現をウェスタンブロットで確認した。細胞培養上清のプロテインＡ精製後、コンストラクトは、１：１：１：１等モルプラスミド比で、Ｑ－ＴＯＦ ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約７３％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；１１％がペルツズマブ及びＸトラスツズマブ重鎖と対をなす２×ペルツズマブ軽鎖を含み；９％が重鎖ホール－ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がＸトラスツズマブに由来する）インタクトなＸトラスツズマブ抗体であり；４％がペルツズマブ軽鎖のみと組み合わされたＸトラスツズマブ重鎖ホール－ホール会合であり；３％が１ｘＸトラスツズマブ軽鎖及び１ｘペルツズマブ軽鎖とのＸトラスツズマブ重鎖ホール－ホール会合であることを示した。
交差トラスツズマブ軽鎖（ＸＨｅｒＬＣ）のモル比が２倍発現される１：１：１：２のプラスミド比では、Ｑ－ＴＯＦ ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約８１％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；１％がペルツズマブ及びＸトラスツズマブ重鎖と対をなす２×ペルツズマブ軽鎖を含み；１６％が重鎖ホール－ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がＸトラスツズマブに由来する）インタクトなＸトラスツズマブ抗体であり；ペルツズマブ軽鎖のみと組み合わされたＸトラスツズマブ重鎖ホール－ホール会合は検出されず；１％が１ｘＸトラスツズマブ軽鎖及び１ｘペルツズマブ軽鎖とのＸトラスツズマブ重鎖ホール－ホール会合であることを示した。
交差トラスツズマブ軽鎖のモル比が４倍発現される１：１：１：４のプラスミド比では、Ｑ－ＴＯＦ ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約６４％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；ペルツズマブ及びＸトラスツズマブ重鎖と対をなす２ｘペルツズマブ軽鎖は検出されず、しかしペルツズマブ及びＸトラスツズマブ重鎖と対をなす１２％の２ｘＸトラスツズマブ軽鎖が初めてこの比率で検出され；２４％が重鎖ホール－ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がＸトラスツズマブに由来する）インタクトなＸトラスツズマブ抗体であり；ペルツズマブ軽鎖のみと組み合わされたＸトラスツズマブ重鎖ホール－ホール会合は検出されず；１ｘＸトラスツズマブ軽鎖及び１ｘペルツズマブ軽鎖とのＸトラスツズマブ重鎖ホール－ホール会合は検出されないことを示した。
交差トラスツズマブ軽鎖のモル比が８倍発現される１：１：１：８のプラスミド比では、Ｑ－ＴＯＦ ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約４５％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；ペルツズマブ及びＸトラスツズマブ重鎖と対をなす２ｘペルツズマブ軽鎖は検出されず、しかしペルツズマブ及びＸトラスツズマブ重鎖と対をなす２８％の２ｘＸトラスツズマブ軽鎖が初めてこの比率で検出され；２７％が重鎖ホール－ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がＸトラスツズマブに由来する）インタクトなＸトラスツズマブ抗体であり；ペルツズマブ軽鎖のみと組み合わされたＸトラスツズマブ重鎖ホール－ホール会合は検出されず；１ｘＸトラスツズマブ軽鎖及び１ｘペルツズマブ軽鎖とのＸトラスツズマブ重鎖ホール－ホール会合は検出されないことを示した。
Figure 0007077263000022
ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＰｅｒ
細胞培養上清のプロテインＡ精製後、コンストラクトは、１：１：１：１等モルプラスミド比で、Ｑ－ＴＯＦ ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約８５％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；２％がＸペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対をなす２×Ｘペルツズマブ軽鎖を含み；１％が重鎖ホール－ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がトラスツズマブに由来する）インタクトなトラスツズマブ抗体であり；１２％がＸペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対合した２ｘトラスツズマブ軽鎖であることを示した。更なる種は検出されなかった。
交差トラスツズマブ軽鎖（ＸＨｅｒＬＣ）のモル比が２倍発現される１：１：１：２のプラスミド比では、Ｑ－ＴＯＦ ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約８９％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；７％がＸペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対をなす２×Ｘペルツズマブ軽鎖を含み；重鎖ホール－ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がトラスツズマブに由来する）インタクトなトラスツズマブ抗体は検出されず；４％がＸペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対合した２ｘトラスツズマブ軽鎖であることを示した。
交差トラスツズマブ軽鎖（ＸＨｅｒＬＣ）のモル比が４倍発現される１：１：１：４のプラスミド比では、Ｑ－ＴＯＦ ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約７４％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；２５％がＸペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対をなす２×Ｘペルツズマブ軽鎖を含み；重鎖ホール－ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がトラスツズマブに由来する）インタクトなトラスツズマブ抗体は検出されず；１％がＸペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対合した２ｘトラスツズマブ軽鎖であることを示した。
交差トラスツズマブ軽鎖（ＸＨｅｒＬＣ）のモル比が８倍発現される１：１：１：８のプラスミド比では、Ｑ－ＴＯＦ ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約５２％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；４８％がＸペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対をなす２×Ｘペルツズマブ軽鎖を含み；重鎖ホール－ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がトラスツズマブに由来する）インタクトなトラスツズマブ抗体は検出されず；Ｘペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対合した２ｘトラスツズマブ軽鎖は検出されないことを示した。
ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＣＤＲＧ
細胞培養上清のプロテインＡ精製後、コンストラクトは、１：１：１等モルプラスミド比では、Ｑ－ＴＯＦ ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約９５％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；５％がＸＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ及びトラスツズマブ（ＨｅｒＣＤＲＧ）重鎖と対をなす２×ＸＰｅｒｔｕｚｕｍａｂの軽鎖を含むことを示した。
更なる種は検出されず、従って、プラスミド比の更なる最適化は行われなかった。副生成物のプロフィールを比較するために、抗体ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＨｅｒ及びＣｒｏｓｓＭａｂ－ＣＤＲＧに関して行われたＭＳスペクトルを図１２に見ることができる。
Figure 0007077263000023
Figure 0007077263000024
実施例８：両方の抗原に対する二重特異性抗体の同時結合
上記のように二重特異性抗体の結合を、ＢＩＡｃｏｒｅにより分析した。
別々のアッセイフォーマットでは、試料（ＣｒｏｓｓＭａｂＸＰｅｒ並びにＯＡｓｃＦａｂ１及びＯＡｓｃＦａｂ２について）は、トラスツズマブの機能並びにペルツズマブ特異性であることが証明された。ＣｒｏｓｓＭａｂＸＰｅｒは、陽性対照と同程度に動力学的定数及び得られた親和性を示した。トラスツズマブ媒介型結合についてのわずかに減少したｋａ－速度定数を除き、ＯＡｓｃＦａｂ１及びＯＡｓｃＦａｂ２は、陽性対照、即ち親Ｍａｂと同程度に、動力学的定数及び得られた親和性を示した。
陽性対照の一部の二価の結合は－ＣＭ５チップ上のリガンド密度に応じてこの例に示された二つの実験における解離速度定数の変化を引き起こす可能性がある。
Figure 0007077263000025
実施例９：１＋１ Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣｒｏｓｓＭＡｂ及び糖鎖操作Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ Ｃｒｏｓｓｍａｂのインビトロでの評価
増殖阻害アッセイ
ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＨＥＲ２ ＣｒｏｓｓＭａｂ（ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＴｒａ Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ、配列番号１１９、１２０、１２１、１２２）、トラスツズマブ、ペルツズマブ又はトラスツズマブ／ペルツズマブの組み合わせの存在下で５日間のインキュベーション後、（Ａ）ＢＴ４７４及び（Ｂ）Ｎ８７細胞の代謝活性と増殖を測定するために使用した。染料の生物学的還元は、酸化型（青）の量を低減し、同時に蛍光中間体（赤）を増加させる。
標的細胞を、回収し、洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＣＳ＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁し、１×１０４細胞／ウェルの濃度で播種した。それぞれの抗体希釈液を添加する前に、細胞を細胞インキュベーター中で３時間インキュベートした。プレートを穏やかに振盪し、細胞インキュベーター中で５日間インキュベートした。
２５μｌ／ウェルのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅをプレートに添加し、インキュベーター中で７時間インキュベートした。
吸光度をＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ３ １４２０マルチラベルカウンターで５８４ｎｍ及び６１２ｎｍでモニターした。
増殖阻害の割合を計算するために、非処理対照試料がアッセイに含められ、１００％増殖として定義された。三通りの各実験の平均割合及び増殖阻害が計算された。
結果を図１３に示す。
ＡＤＣＣアッセイ
ＨＥＲ２ ＣｒｏｓｓＭａｂ（ＣｒｏｓｓＭａｂ－ＸＴｒａ Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ、配列番号１１９、１２０、１２１、１２２）、トラスツズマブ、ペルツズマブ又はトラスツズマブ／ペルツズマブの組み合わせにより媒介されるＡＤＣＣは、ＫＰＬ－４（Ａ）、Ｔ４７Ｄ（Ｂ）及びＣａｌｕ－３（Ｃ）において評価された。
標的細胞を回収し、洗浄し、ＡＩＭＶ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させ、３×１０４細胞／ウェルの濃度で播種した。各抗体希釈液を細胞に三通りで添加し、エフェクター細胞（末梢血単核エフェクター細胞［ＰＢＭＣ］）の添加前に１０分間インキュベートした。エフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）細胞は、次いで、２５：１のＥ：Ｔ比で３７℃で４時間インキュベートされた（全試料について三通り）。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出は、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。ＡＤＣＣは、以下の式を用いて計算された。
Figure 0007077263000026
抗体無しでエフェクター細胞と共にインキュベートした標的細胞に対応する自発的放出は、０％細胞毒性として定義され、最大放出（１％トリトンＸ－１００で溶解した標的細胞）は、１００％細胞毒性として定義された。三通りの各実験のＡＤＣＣの平均割合及び標準偏差が計算された。結果を図１４に示す。
実施例１０：ＨＥＲ２ ＣｒｏｓｓＭａｂのインビボ特性評価：Ｃａｌｕ３肺がん及びＫＰＬ４乳癌異種移植片における腫瘍増殖に関するＨＥＲ２を標的とする二重特異性抗体の効果
インビトロ培養細胞－Ｃａｌｕ３
このヒト肺腺癌細胞株は、肺がんを有するヒト白人男性から樹立されている。細胞は、Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手し、ワーキング・セル・バンクのために社内で継代された。腫瘍細胞は、５％ＣＯ２で水飽和大気中、３７℃で１０％ウシ胎児血清グルタミン（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＲＰＭＩ培地（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で常套的に培養される。培養継代は、トリプシン／ＥＤＴＡ １×（ＰＡＮ）を用いて行い、２回／週、分割する。細胞継代Ｐ６がインビトロ研究に使用される。
インビトロ培養細胞－ＫＰＬ－４
このヒト乳がん細胞株は、炎症性皮膚転移を有する乳がん患者の悪性胸水から樹立されている。細胞は、Ｊ．Ｋｕｒｅｂａｙａｓｈｉ教授によって提供された（Ｋａｗａｓａｋｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｋｕｒａｓｈｉｋｉ，Ｊａｐａｎ）。腫瘍細胞は、５％ＣＯ２で水飽和大気中、３７℃で１０％ウシ胎児血清グルタミン（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び２ｍＭのＬ－グルタミン（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＤＭＥＭ培地（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で常套的に培養される。培養継代は、トリプシン／ＥＤＴＡ １×（ＰＡＮ）を用いて行い、２回／週、分割する。細胞継代Ｐ６がインビトロ研究に使用される。
動物
雌ＳＣＩＤベージュ（Ｃ．Ｂ．－１７）マウス；年齢１０－１２週；体重１８～２０ｇ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）又は雌ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス；年齢８－１０週；体重＞２０ｇ（Ｂｏｍｈｏｌｔｇａｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）は、国際ガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って１２時間明／１２時間暗黒の日々のサイクルによる特定病原体を含まない条件下で維持された。到着後、動物は、新しい環境に慣れるため、及び観察のために、１週間動物施設の検疫部で収容される。継続的な健康管理が定期的に実施される。ダイエット食品（Ａｌｔｒｏｍｉｎ）及び水（ｐＨ２．５－３に酸性化）が自由に与えられる。実験的研究は地方政府によってレビューされ承認された；登録番号５５．２－１－５４－２５３１．２－３－０８ ＳＣＩＤベージュ同所性げっ歯類の乳癌モデル及び２１１－２５３１．２－１６／００。１．２．２皮下腫瘍モデル。
腫瘍細胞の注入
注入の日に、腫瘍細胞は培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＴｒｉＦｌａｓｋ）から回収され（トリプシン－ＥＤＴＡ）、び５０ｍｌの培地に移され、１回洗浄され、ＰＢＳに再懸濁される。ＰＢＳによる更なる洗浄工程及びろ過（セルストレイナー；Ｆａｌｃｏｎφ１００μｍ）の後に、最終の細胞力価を１．５ｘ１０８／ｍｌに調整される。腫瘍細胞懸濁液は、細胞凝集を避けるため移送ピペットを用いて慎重に混合される。麻酔は、プレインキュベーションチャンバー（プレクシグラス）、個々のマウスの鼻マスク（シリコン）及び可燃性又は爆発性でない麻酔化合物イソフルラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ－Ｕｐｊｏｈｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて小動物用のＳｔｅｐｈｅｎｓ吸入器を使用して閉鎖循環系で実行される。注入の２日前に、ＳＣＩＤベージュマウスの外被は剃毛される。Ｃａｌｕ３細胞の皮下注射のために、麻酔をかけた動物の皮膚は慎重に解剖学的鉗子で持ち上げられ、１００μｌの細胞懸濁液（＝５．０×１０ｅ６細胞）が動物の右脇腹に皮下注射される。細胞懸濁液は、幅広の注射針（０．４５×２５ｍｍ）を使用して、１．０ｍｌのツベルクリン注射器（Ｂｒａｕｎ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）に充填される。ＫＰＬ－４細胞（３×１０ｅ６細胞）は、各麻酔マウスの右の最後から２番目の鼠径部乳腺脂肪体に２０μｌの容量で同所注入される。同所性移植のため、細胞懸濁液は、ハミルトンマイクロシリンジ及び３０Ｇｘ１／２”針を用いて乳頭下の皮膚を介して注入される。
モニタリング
動物は、副作用の臨床症状の検出のために毎日管理される。モニタリングのため、実験を通して、動物の体重を毎週２回記録し、週２回腫瘍体積をキャリパーで測定する。腫瘍体積は、ＮＣＩプロトコルに従って算出された（腫瘍重量＝１／２ａｂ２、「ａ」及び「ｂ」は、それぞれ腫瘍の長径、短径である）。終了基準はクリティカルな腫瘍塊（上限１．７ｇ又は＞１．５ｃｍ）、ベースラインから２０％以上の体重減少、動物の腫瘍潰瘍又は悪い全身状態であった。動物に対する研究の除外基準が説明され、対応する「Ｔｉｅｒｖｅｒｓｕｃｈｓａｎｚｅｉｇｅ」で承認される。
動物の治療
マウスは、腫瘍体積において、ＫＰＬ－４については平均が７０ｍｍ３、Ｃａｌｕ３については平均が１００ｍｍ３で無作為化された。マウスは、腹腔内に１０ｍｌ／ｋｇの量で週一回処置された。併用治療のために、トラスツズマブが最初に与えられ、その２４時間後にペルツズマブが与えられた。
結果は、表１４から１７及び図１５から１８に示される。
Figure 0007077263000027
Figure 0007077263000028
Figure 0007077263000029
Figure 0007077263000030
実施例１１：トラスツズマブ及びペルツズマブのための共通の軽鎖の生成
遺伝子合成
必要な場合、所望の遺伝子を、適切な鋳型を使用してＰＣＲによって生成するか、又は自動化遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、オリゴヌクレオチドプライマーを最も近いホモログからの配列に基づいて設計し、遺伝子を適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲによって単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを標準のクローニング／シークエンシングベクターにクローン化した。プラスミドＤＮＡを形質転換した細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニング遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中にサブクローニングできるように適切な制限部位を伴って設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含んでいた。配列番号１５５、１５６、及び１５７は例示的リーダーペプチドを与える。
抗原発現ベクターのクローニング
成熟チロシンキナーゼ型細胞表面受容体ＨＥＲ２（Ｈｅｒ２、ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０４６２６）のアミノ酸１から６２９をコードするＤＮＡ断片は、Ｎ末端リーダー配列を含有する哺乳動物レシピエントベクター中にフレームにクローニングされた。更に、コンストラクトは、Ｂｉｒ Ａビオチンリガーゼとの同時発現中に特定のビオチン化を可能にするＣ末端ａｖｉタグ、及び固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製に使用されるＨｉｓタグが含まれる（配列番号１及び２）。
抗原の発現はＭＰＳＶプロモーターによって一般的に駆動され、転写は、ＣＤＳの下流に位置する合成ポリＡシグナル配列によって終結される。発現カセットに加えて、各ベクターは、ＥＢＶ－ＥＢＮＡ発現細胞株における自律増殖のためのＥＢＶ ｏｒｉＰ配列を含む。
抗原及び抗体の産生及び精製
抗原及び抗体の両方は、ＥＢＶ由来のタンパク質ＥＢＮＡを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトされた。同時にコトランスフェクトしたビオチンリガーゼＢｉｒ Ａをコードするプラスミドは、インビボでのａｖｉタグ特異的ビオチン化を可能とした。タンパク質は、次いで、プロテインＡ、続いてゲルろ過をカラムを用いて精製された。
トラスツズマブ／ペルツズマブ共通の軽鎖の設計
トラスツズマブ及びペルツズマブのための共通の軽鎖（ＣＬＣ）の生成のために、個々の軽鎖（ＬＣ）を分析し、比較した。配列分析は、両方の可変ドメインが、同じ生殖系列配列に由来することを明らかにした。トラスツズマブの一般にＬＣＤＲ３が、具体的には残基Ｈ９１がＨｅｒ２の上トラスツズマブ特異的エピトープと特異的に相互作用することを考慮すると、トラスツズマブ／ペルツズマブのＣＬＣを作成する最初の試みは以下のようになされる：トラスツズマブの完全なＣＤＲ３領域又は残基Ｈ９１のみの何れかがペルツズマブのＬＣの対応する位置を置換した。その結果、ペルツズマブ由来ＬＣＤＲ１及び２をコードするがトラスツズマブ由来ＬＣＤＲ３のアミノ酸残基を保有するハイブリッドＬＣコンストラクトが作成された。得られたＣＬＣは、「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」（配列番号２５として記載されている可変ドメインのＤＮＡ配列）又は「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｙ９１Ｈ）ＬＣ」（配列番号２７）の何れかに命名され、トラスツズマブ又はペルツズマブＨＣの何れかと同時発現された。得られた４つの抗体（配列番号２２及び２６、「ペルツズマブＨＣ」ｘ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」；配列番号９２及び２６，「トラスツズマブＨＣ」ｘ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」；配列番号２２及び２８、「ペルツズマブＨＣ」ｘ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓｔ．Ｙ９１Ｈ）ＬＣ」；配列番号９２及び２８、「トラスツズマブＨＣ」ｘ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｙ９１Ｈ）ＬＣ」）として記載されている可変ドメインのタンパク質配列は、哺乳動物由来の細胞培養上清から精製され、Ｈｅｒ２に対する結合は、それぞれの親抗体（配列番号２２及び２４、「ペルツズマブＨＣ」ｘ「ペルツズマブＬＣ」；配列番号９２及び８２、「トラスツズマブＨＣ」ｘ「トラスツズマブＬＣ」）を用いてＳＰＲにより測定され、比較された。
ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサーを使用したＳＰＲによる親和性決定
新規抗体鎖の組合せの親和性（ＫＤ）は、２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて表面プラズモン共鳴により測定した。最初の工程で、ｈｕＩｇＧ（Ｆｃ特異的）を認識する抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ｉ２１３６、ポリクローナルヤギ抗体）の６５００ＲＵがアミンカップリングによってＧＬＭチップの全６チャンネル上に固定化された（酢酸ナトリウムｐＨ４、３０μｌ／分、３００秒）（垂直方向）。
各抗体を、ＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）で２μｇ／ｍｌに希釈し、その後、垂直方向において約４００応答単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成するために３０μｌ／分で６０秒間注入された。Ｈｅｒ２の注入：ワンショット動態測定のために、注入方向は水平方向に変更され、精製されたＨｅｒ２の３倍希釈系列（３００と３．７ｎＭの間の可変濃度範囲）は、１８０秒の会合時間及び６００秒の解離時間を用いて、別々のチャネル１－５に沿って１００μｌ／分で同時に注入された。緩衝液（ＰＢＳＴ）が、参照するために「インライン」ブランクを提供するため、第６チャネルに沿って注入された。再生は、１００μｌ／分で３０秒間、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５及び５０ｍＭのＮａＯＨの２つのパルスによって行った（水平方向）。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによるＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウエアの単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ－ｔｏ－ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出された。
予想されたように、両方の対照抗体であるトラスツズマブ及びペルツズマブは、低ナノモル又はサブ－ナノモル範囲での既知の親和性でＨｅｒ２を認識した。新たに設計された「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｙ９１Ｈ）ＬＣ」と組み合わせたペルツズマブＨＣの親和性はわずかに減少したが、トラスツズマブＨＣと組み合わせた同じ軽鎖は、いかなる検出可能な結合も得られなかった。これは、ペルツズマブＬＣにおける単一トラスツズマブ由来の点変異（Ｙ９１Ｈ）は、この鎖の組み合わせではＨｅｒ２に結合するには不十分であることを示している。これは、トラスツズマブＨＣと組み合わせると弱い結合をもたらしたが、ペルツズマブＨＣと共発現されると結合は減少したが明らかに目に見えた第二のＣＬＣ変異体「ペルツズマブＬＣ（Ｔｒａｓｔ．Ｌ３）」とは対照的である。動力学的及び熱力学的測定の概要が図１９及び表１８に与えられる。この知見に基づいて、ＣＬＣ「ペルツズマブＬＣ（Ｔｒａｓｔ。Ｌ３）」は、ペルツズマブＨＣと同時発現される場合、親和性に可能な限り小さく影響を与えつつ、トラスツズマブＨＣと組み合わせてＨｅｒ２結合を復元するために更に改変された。
Figure 0007077263000031
実施例１２：共通の軽鎖の親和性向上
付加的トラスツズマブ特異的ＬＣＤＲ残基のペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣへの導入及び特性評価
以前のＳＰＲ測定の結果に基づいて、ペルツズマブＨＣと組み合わせて設計されたＣＬＣ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓｔ．Ｌ３）ＬＣ」の結合は、減少したが依然として十分に検出可能な結合をもたらした。対照的に、トラスツズマブＨＣとのＣＬＣの共発現は、マイクロモル範囲で非常に弱い親和性をもたらし、親トラスツズマブ抗体と比較して有意に減少した。
更にＣＬＣの生成を更に進化させ、トラスツズマブＨＣとの組み合わせで結合を改善するために、ＬＣＤＲ１、２及び３並びにトラスツズマブに特異的であるフレームワーク３領域の付加的トラスツズマブ特異的アミノ酸が、以前に設計された「ペルツズマブ（Ｔｒａｓｔ．Ｌ３）ＬＣ」の配列に個別に導入された（配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、及び５１として列挙された可変ドメインのＤＮＡ配列）。得られたコンストラクト（配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、及び５２として列挙された可変ドメインのタンパク質配列）は、トラスツズマブＨＣ（配列番号９２）又はペルツズマブＨＣ（配列番号２２）とともに共発現され、哺乳動物由来の細胞培養上清から精製された。ＨＥＲ２に対する結合が測定され、それぞれの親抗体と比較された。
ＳＰＲによる「ペルツズマブ（Ｔｒａｓｔ．Ｌ３）ＬＣ」の変異体の親和性－決定
新規抗体鎖の組合せの親和性（ＫＤ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて表面プラズモン共鳴により測定され、前述のように実施された。動力学的及び熱力学的測定の概要が図１９に与えられる。
興味深いことに、ペルツズマブと組み合わせた場合「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」における付加的単一変異のいずれも有意には親和性に影響を与えず、その親和性は「ペルツズマブＨＣ」ｘ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」に匹敵した。しかし、トラスツズマブＨＣとの「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」変異体の組み合わせは、有意な差を生じた。一方、ＬＣＤＲ３領域におけるペルツズマブ配列への復帰変異（Ｐ９４Ｙ及びＴ９６Ｙ）（配列番号５０及び５２として記載される可変ドメインのタンパク質配列）は完全にＨｅｒ２への結合を破壊し、ペルツズマブ特異的変異の導入（配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、及び４８）は、「トラスツズマブＨＣ」×「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」の最初の組み合わせと比較して同等又は改善された親和性を生じた。特に、変異Ｉ３１Ｔ、Ｇ３２Ａ、Ｙ５３Ｆ、及びＧ６６Ｒの導入は、結合に最も有意な改善につながった。
「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」への最も重要なトラスツズマブ特異的残基の同時導入
上述の結合測定に基づいて、「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」への４つの最適なトラスツズマブ特異的変異の導入を組み合わせた。何れかの個々の変異を含む可変ドメインのタンパク質配列は配列番号３６、４０、４２、及び４８として記載される。「四重変異」を含む鎖は、「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」（配列番号５４）と命名した。
ＳＰＲによる「ペルツズマブ（Ｔｒａｓｔ．Ｌ３）（ＱＭ） ＬＣ」の親和性－決定
新規「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」を特性評価し、ペルツズマブＨＣ又はトラスツズマブＨＣの何れかと組み合わせた結合の親和性を決定するために、更にＳＰＲ実験を行った。新規抗体鎖の組合せの親和性（ＫＤ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて測定され、前述のように実施された。動力学的及び熱力学的測定の概要が図２０及び表２０に与えられる。
前に導入され特性評価された個々の変異と同様に、ペルツズマブＨＣ及び「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」を含む抗体の親和性は、「ペルツズマブＨＣ」ｘ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」の最初の鎖の組み合わせに比べて有意には低下しなかった。両方の鎖の組み合わせに対して、親和性は２６－３４ｎＭの範囲であった。興味深いことに、「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」との「トラスツズマブのＨＣ」の組み合わせは、Ｈｅｒ２に対する親和性の非常に強い改善につながる。更に、２００ｐＭのその親和性は、親抗体のトラスツズマブ（２．２ ｎＭ）の測定された親和性よりも更に優れている。
トラスツズマブＨＣとの「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」の組み合わせはＨｅｒ２への結合を完全に復元する（あるいは超える）ことを考慮し、及びペルツズマブＨＣとの組み合わせはＨｅｒ２への結合を減少させるが抑制しないことを考慮すると、両方のＨｅｒ２特異性のためのＣＬＣとして「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」を使用し、ペルツズマブＨＣの親和性成熟によってペルツズマブ特異的エピトープへの結合を復元することは明らかである。
Figure 0007077263000032
Figure 0007077263000033
実施例１３：ペルツズマブ重鎖の親和性成熟
ペルツズマブベースのＨ１／Ｈ３及びＨ２親和性成熟ライブラリーの作成
親和性成熟ペルツズマブ由来の重鎖の生成は、標準的なプロトコルを使用して、ファージディスプレイにより行った（Silacci et al, 2005）。
「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」と一緒に発現され、改善された親和性を有するペルツズマブ由来のＨＣの生成のために、ＣＤＲ１及び３又はＣＤＲ２において無作為化された成熟ライブラリーが作成された。ペルツズマブＨＣ（配列番号２２）及び「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」（配列番号５４）の配列がファージミドにクローン化され、無作為化のための鋳型として使用した。ＣＤＲ１及び３で無作為化されたペルツズマブＨＣ親和性成熟ライブラリーの生成のために、３つの断片は、「オーバーラップ・エクステンションによるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって組み立てられ、ファージベクターにクローニングされた。以下のプライマーの組み合わせがライブラリー断片を生成するために使用された：断片１（ＬＭＢ３（配列番号１４７）及びＡＭ＿ｏｍｎｉ＿Ｈ１＿ＴＮ－ｂａ（配列番号１４８）、断片２（ＲＪＨ１０８（ｏｍｎｉ＿３’Ｈ１＿ｆｏ）（配列番号１４９）及びＲＪＨ１０９（ｏｍｎｉ＿５’Ｈ３＿ｒｅ）（配列番号１５０）、及び断片３（ＡＭ＿ｏｍｎｉ＿Ｈ３＿ＴＮ＿ｆｏ（配列番号１５１）及びＲＪＨ９９（配列番号１５２）。完全長の無作為断片の十分な量を組み立てた後、それを同様に処理されたアクセプターファージミドベクターと一緒にＭｕｎＩ／ＮｈｅＩで消化した。Ｆａｂライブラリーインサートの６ｕｇが、ファージミドベクターの２４ｕｇと連結された。精製されたライゲーションは６０の形質転換のために使用され、６×１０ｅｘｐ９の形質転換体が得られた。ペルツズマブ親和性成熟ライブラリーを表示するファージミド粒子を救出し、選択のために使用されるためにＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製された。
ＣＤＲ２－無作為化ペルツズマブＨＣ親和性成熟ライブラリーの生成は同様に行われたが、わずか２つの断片が生成され、組み立てられ、前と同様に同じ制限酵素を用いてファージミドにクローニングされた。以下のプライマーの組み合わせがライブラリー断片を生成するために使用された：断片１（ＬＭＢ３（配列番号１４７）及びＲＪＨ１１０（ｏｍｎｉ＿５’Ｈ２＿ｂａ）（配列番号１５３）、及び断片２（ＡＭ＿ｏｍｎｉ＿ｈ２＿ＴＮ＿ｆｏ（配列番号１５４）及びＲＪＨ９９（配列番号１５２）。精製されたライゲーションは６０の形質転換のために使用され、４×１０ｅｘｐ９の形質転換体が得られた。ペルツズマブ親和性成熟ライブラリーを表示するファージミド粒子を救出し、選択のために使用されるためにＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製された。
Figure 0007077263000034
Figure 0007077263000035
Figure 0007077263000036
Figure 0007077263000037
親和性成熟ペルツズマブＨＣ－由来クローンの選択
ヒトＨｅｒ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する選択は、ＨＥＫ２９３で発現されたタンパク質を用いて行われた。抗原は、Ｎ末端のａｖｉタグを介してビオチンリガーゼＢｉｒ Ａの共発現により酵素的にビオチン化された。パニングラウンドは、以下のパターンに従って溶液中で行われた：１． １ｍｌの全容量で０．５時間１０ｎＭのビオチン化Ｈｅｒ２ ＥＣＤへ～１０１２ファージミド粒子の結合、２． １０分間、５．４×１０７ストレプトアビジン被覆磁気ビーズの添加によるビオチン化Ｈｅｒ２ ＥＣＤ及び特異的に結合したファージ粒子の捕獲、３． ５×１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×１ｍｌのＰＢＳを用いたビーズの洗浄、４． １０分間、１ｍｌの１００ｍＭのＴＥＡを添加することによるファージ粒子の溶出及び５００μｌの１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４を添加することによる中和、５． 指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ１細菌の再感染、６． ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染及び続いてその後の選択ラウンドに使用されるファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。選択は減少する濃度（２０ｘ１０－９Ｍから１ｘ１０－９Ｍ））を用いて３ラウンドにわたって実施された。ラウンド２及び３において、抗原：ファージ複合体の捕獲はストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラビジンプレートを用いて行った。また、ニュートラビジンプレートは２ｌのＰＢＳ中で３時間洗浄した。特異的結合剤は、ＥＬＩＳＡによって以下のように同定された：ウェルあたり３０ｎＭのビオチン化Ｈｅｒ２ ＥＣＤ１００μｌがニュートラビジンプレート上にコーティングされた。Ｆａｂを含む細菌の上清が添加され、結合するＦａｂが抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用して、Ｆｌａｇ・タグを介して検出された。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを、９６ウェルフォーマットで、可溶性Ｆａｂ断片として細菌に発現させ、上清はＰｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６を用いてＳＰＲ分析による動力学的スクリーニング実験に供された。
ＳＰＲによる親和性成熟されたペルツズマブＨＣ変異体の親和性－決定
新規ペルツズマブＨＣ変異体の親和性（ＫＤ）は、表面プラズモン共鳴によって測定された。第一工程において、ポリクローナル抗ヒトＦａｂ抗体の７０００ＲＵは、アミンカップリングによるＧＬＭチップの全６チャンネル上に固定化された（酢酸ナトリウムｐＨ４．５、３０μＬ／分、３００秒）（垂直方向）。
各抗体含有細菌上清をろ過し、ＰＢＳで３倍に希釈し、次に垂直方向に１００から４００の間の応答単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成するために３０μｌ／分で１８０秒間注入された。Ｈｅｒ２の注入：ワンショット動態測定のために、注入方向は水平方向に変更され、精製されたＨｅｒ２の２倍希釈系列（１００と６．２５ｎＭの間の可変濃度範囲）は、１８０秒の会合時間及び１０００秒の解離時間を用いて、別々のチャネル１－５に沿って１００μｌ／分で同時に注入された。緩衝液（ＰＢＳＴ）が、参照するために「インライン」ブランクを提供するため、第６チャネルに沿って注入された。再生は、１００μｌ／分で３０秒間、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５及び５０ｍＭのＮａＯＨの２つのパルスによって行った（水平方向）。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによるＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウエアの単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ－ｔｏ－ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出された。最も高い親和性定数を有するＦａｂを発現するクローンを同定し、対応するファージミドの重鎖を配列決定した。最もアフィン（ａｆｆｉｎｅ）ペルツズマブＨＣ変異体（配列番号６２、６６、６８、７０、７２、及び７４として記載される可変ドメインのタンパク質配列）の熱力学的測定は表２３及び図２１に要約される。
Figure 0007077263000038
実施例１４：トラスツズマブ／ペルツズマブ二重特異性抗体の特性評価
ＣＬＣを有するトラスツズマブ／ペルツズマブ二重特異性抗Ｈｅｒ抗体の生成
次の工程では、親和性成熟ペルツズマブＨＣ並びにトラスツズマブＨＣは「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」と命名されるＣＬＣと組み合わせて二重特異性抗体のフォーマットで発現された。ＣＬＣを有するこのような二重特異性抗体の生成のために、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化がノブ・イントゥ・ホール技術の適用によって達成された。ペルツズマブの親和性成熟クローンＥ１及びＧ２の可変ドメイン（配列番号６８及び７０として記載される可変ドメインのタンパク質配列）並びにクローン「Ｄ１由来」（Ｄ１－ｄｅｒ）配列（配列番号６４）が、ドメインＣＨ３に「ホール」変異を含むヒトＩｇＧ１ ＨＣにクローニングされた。ＣＬＣを有する二重特異性抗体の概略が図２２に示される。親和性成熟クローン「Ｄ１－ｄｅｒ」は、クローンＤ１（配列番号６２）のＣＤＲ１及び３変異を他の選択されたクローンに見いだされた付加的ＣＤＲ２変異と組み合わせる。トラスツズマブＨＣの可変ドメイン（配列番号９２）はドメインＣＨ３に「ノブ」変異を保有するヒトＩｇＧ１ ＨＣにクローニングされた。「ハーセプチン」コンストラクトと呼ばれる、得られたコンストラクトは共発現され、哺乳動物由来の細胞培養上清から精製された。３つ全ての二重特異性抗体の分析データの概要が図２３と表２４中のクローンに示される。
Figure 0007077263000039
Ｈｅｒ２ノックアウト抗原変異体の生成
Ｈｅｒ２上の両方のエピトープのそれぞれに対する、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ二重特異性抗体の結合を分析し特性評価するために、Ｈｅｒ２のノックアウト変異体が設計された。これらの変異体では、２つの特異的エピトープの何れかは、それぞれの抗体鎖と相互作用するアミノ酸の変異によって除去された。
発現及び精製のために、それぞれのＤＮＡ断片は、Ｎ末端リーダー配列及び溶解－及び精製タグとしての機能を果たすＣ末端ヒトＩｇＧ１ Ｆｃをコードする断片にインフレームで融合された。Ｆｃ断片のＣ末端のａｖｉタグはインビボでビオチン化させた。単量体型で抗原を発現するために、これらのＦｃ鎖は「ノブ」変異が含まれ（配列番号５及び６、Ｈｅｒ２ ＥＣＤ－Ｆｃ（ノブ）；配列番号７及び８、Ｈｅｒ２ ＥＣＤ（ペルツズマブＫＯ）－Ｆｃ（ノブ）；配列番号９及び１０、Ｈｅｒ２ ＥＣＤ（トラスツズマブＫＯ）－Ｆｃ（ノブ））、「Ｆｃ－ホール」カウンターパート（配列番号３及び４）と組み合わせて共発現させた。
ＳＰＲによるＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ二重特異性抗体の親和性－決定
ｈｅｒ２におけるそれらのエピトープの各々に対する新規二重特異性抗体の親和性（ＫＤ）は、２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてＳＰＲにより測定した。最初の工程で、ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）を認識するポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ｉ２１３６）の１１０００ＲＵがアミンカップリングによってＧＬＭチップの全６チャンネル上に固定化された（酢酸ナトリウムｐＨ４、３０μｌ／分、３００秒）（垂直方向）。
各抗体を、ＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）で２μｇ／ｍｌに希釈し、その後、垂直方向において約４００応答単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成するために３０μｌ／分で６０秒間注入された。Ｈｅｒ２の注入：ワンショット動態測定のために、注入方向は水平方向に変更され、精製された一価Ｈｅｒ２－Ｆｃタンパク質コンストラクトの２倍希釈系列（１００と６．２５ｎＭの間の可変濃度範囲）は、１８０秒の会合時間及び６００秒の解離時間を用いて、別々のチャネル１－５に沿って１００μｌ／分で同時に注入された。緩衝液（ＰＢＳＴ）が、参照するために「インライン」ブランクを提供するため、第６チャネルに沿って注入された。再生は、１００μｌ／分で３０秒間、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５及び５０ｍＭのＮａＯＨの２つのパルスによって行った（水平方向）。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによるＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウエアの単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ－ｔｏ－ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出された。
トラスツズマブ、ペルツズマブ並びに親和性成熟ペルツズマブＨＣ、トラスツズマブＨＣ、及びＣＬＣ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓｔ．Ｌ３）（ＱＭ）」を含む３つの二重特異的Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇコンストラクトを含む全ての抗体が両方のＨｅｒ２ノックアウト変異体への結合について試験された。予想されたように、トラスツズマブ及びペルツズマブの両方とも、それぞれのＨｅｒ２のエピトープに予想される親和性で結合する。それらに対応するノックアウト変異体への結合は消失された（図２４）。これらの結果は、Ｈｅｒ２のノックアウトエピトープ変異体の使用は、二重特異性抗体の結合を切断させ、両特異性の個々の親和性を分析することを可能とすることを示している。
各ハーセプチンクローン変異体の個々のＫＤ値の決定は、０．６から１．８ｎＭの予想される範囲内のトラスツズマブのエピトープに対する一定の結合親和性を明らかにした。これとは対照的に、ペルツズマブのエピトープへの結合は、親和性成熟ペルツズマブＨＣに依存する。３つのＨｅｒｃｅｐｔａｒｇクローン変異体のうち、クローン「Ｄ１－Ｄｅｒ」は最も高い親和性（０．１６ｎＭ）を有することが見出された。熱力学的データの概要を表２５に示す。要約すると、本実験では、我々が、ＣＬＣを有し、トラスツズマブ及びペルツズマブのエピトープに特異的な二重特異性抗体を生成することができたことを確認する。
Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇクローン変異体のＫＰＬ－４細胞への結合分析
ＫＰＬ－４細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。０．２Ｍｉｏ細胞を、９６ウェル丸底プレートに播種した。細胞をペレットにするために、プレートを４００×ｇで３分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を希釈した抗体４０μｌに再懸濁した。プレートは、抗体の結合を可能にするために４℃で３０分間インキュベートした。未結合抗体を除去するために、細胞を再び遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。抗体を検出するために、細胞を、希釈した二次ヤギ抗ヒトＦｃ特異的ＦＩＴＣ標識二次抗体１２μｌ中に再懸濁し（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９－０９６－０９８）、４℃で３０分間再びインキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液２００μｌに再懸濁し、蛍光をＢＤ ＣａｎｔｏＩＩを用いて測定した。結果を図２５に示す。
Figure 0007077263000040
Figure 0007077263000041
Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ結合変異体により媒介される増殖阻害
標的細胞を、回収し、洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＣＳ＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁し、５×１０３細胞／ウェルの濃度で播種した。それぞれの抗体希釈液を添加する前に、細胞を細胞インキュベーター中で４時間インキュベートした。プレートを穏やかに振盪し、細胞インキュベーター中で５日間インキュベートした。プレートを室温に平衡化され、新たに調製したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）基質１００μｌ／ウェルが各ウェルに添加された。発光はＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ３ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒで測定された。結果は、表２６及び図２６に示される。
Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇクローン媒介性抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
標的細胞を回収し、洗浄し、ＡＩＭＶ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させ、３×１０４細胞／ウェルの濃度で播種した。各抗体希釈液を細胞に三通りで添加し、エフェクター細胞（末梢血単核エフェクター細胞［ＰＢＭＣ］）の添加前に１０分間インキュベートした。エフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）細胞は、次いで、指示されたＥ：Ｔ比で３７℃で指示された時間インキュベートされた（全試料について三通り）。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出は、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。ＡＤＣＣは、以下の式を用いて計算された。
Figure 0007077263000042
抗体無しでエフェクター細胞と共にインキュベートした標的細胞に対応する自発的放出は、０％細胞毒性として定義され、最大放出（１％トリトンＸ－１００で溶解した標的細胞）は、１００％細胞毒性として定義された。三通りの各実験のＡＤＣＣの平均割合及び標準偏差が計算された。結果を図２７に示す。
Figure 0007077263000043
実施例１５：増殖アッセイ
１ｘ１０４ＢＴ－４７４細胞／ウェルが、９６ウェル平底プレート中のＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で培養された。２４時間後、増殖培地を除去し、指示された抗体の滴定量が１００μｌの最終容量に添加された（培地中で予備混合された）。
培養物中の生存細胞の数を決定するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙが、代謝活性細胞の指標として現在のＡＴＰレベルを定量することによって行われた。このように、培養の６日後に、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号＃Ｇ７５７１）を細胞に添加し、２分間振り、溶解物の７５μｌが、別の９６ウェル平底タイタープレートに移された（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号＃３９１７）。更に混合した後、発光はＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｒｅａｄｅｒを使用して、製造者の指示に従って評価された。
結果は、表２８及び図２８に示される。
増殖アッセイでは、二重特異性Ｈｅｒ２抗体は、ペルツズマブ若しくはトラスツズマブ単独又は組み合わせにおいてＢＴ－４７４細胞の増殖をより強力に阻害することが示された。以下の二重特異性Ｈｅｒ２抗体が試験された：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ ｗｔ”：配列番号６４、５４、９２、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ Ｇ２”：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
Figure 0007077263000044
実施例１６：Ｃ１ｑ ＦＡＣＳ結合アッセイ
３ｘ１０５のＢＴ－４７４細胞を氷上で指示抗体１０μｇ／ｍｌと共にインキュベートした。以下の二重特異性Ｈｅｒ２抗体が試験された：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ ｗｔ”：配列番号６４、５４、９２、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ Ｇ２”：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
３０分後、１０μｇ／ｍｌのＣ１ｑ（Ｓｉｇｍａ，Ｃ１７４０）を添加し、更に２０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、市販のＰＥ標識抗Ｃ１ｑ抗体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，ＣＬ７６１１ＰＥ－ＳＰ）を用いて対比染色した。更にインキュベーション（３０分間、氷）した後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩで分析した。
結果は、図２９及び表２９に示される。このＣ１ｑのアッセイは、ＢＴ－４７４細胞上における組換え補体因子Ｃ１ｑの異なるＨｅｒ抗体への結合を示している。これは、最高のＣ１ｑ結合は、トラスツズマブ及びペルツズマブの組み合わせ、続いて２つのＣＬＣ二重特異性Ｈｅｒ２抗体により処置して得られたことが示された。Ｃｒｏｓｓｍａｂによる処置はわずかに上昇したＣ１ｑ結合のみが得られた。
Figure 0007077263000045
実施例１７：仔ウサギ補体（ＢＲＣ）を用いたＬＤＨアッセイ
ＣＨＯ－Ｋ１ Ｎｘｒｅ１９細胞（ＩＬ１５ＲでトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１）が、９６ウェル平底細胞培養プレート（ＮＵＮＣ，１００μＬ／ウェル）上に１０，０００細胞／ウェルで播種され、一晩培養された。ＩＬ１５－Ｆｃ融合ポリペプチドがを添加され（５倍最終濃度の２５μＬ／ウェル）、１時間インキュベートされた。その後、仔ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、カタログ番号ＣＬ３４４１）の１バイアルをＡｑｕａ ｂｉｄｅｓｔの１ｍＬで再構成した。補体溶液は培地で希釈され、２５μＬがウェルに添加された。４時間後、プレートを２００ｇで遠心分離し、１００μＬ／ウェルが別の９６ウェル平底プレートに移された。その後、ＬＤＨ反応混合物の１００μＬ（細胞傷害性検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した。３７℃で２０分のインキュベーション時間後、光学密度（ＯＤ）がＴｅｃａｎ Ｓｕｎｒｉｓｅリーダーで４９２／６９０ｎｍで測定された。
Figure 0007077263000046
ＢＲＣは、低バックグラウンド毒性を有し、用量依存性補体毒性を示すことが分かる。
実施例１８：ＢＴ－４７４細胞におけるＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）活性化（ＬＤＨ放出）。
１ｘ１０４細胞／ウェルが、１５０μｌ中、３７℃で３０分間、指示された抗体の１０μｇ／ｍｌと共にインキュベートされた。以下の二重特異性Ｈｅｒ２抗体が試験された：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ ｗｔ”：配列番号６４、５４、９２、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ Ｇ２”：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
その後、５０μｌの仔ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、カタログ番号ＣＬ３４４１、バッチ番号６３１２）が添加され、更に２時間インキュベートされた。次いで、ｓ／ｎは移され、５０μｌのＬＤＨの反応ミックス（Ｒｏｃｈｅ）と混合され、１５分間の更なるインキュベーション後、吸光度（Ｅｘ）はＴｅｃａｎ Ｓｕｎｒｉｓｅリーダーで４９０／６２０ｎｍで分析された。ＢＴ－４７４細胞に対する特異的抗体依存性毒性（ｎ＝４の平均＋／－ＳＤ）は以下のように計算された：
（Ｅｘ．試料－Ｅｘ．自発的溶解／Ｅｘ．最大溶解－自発的溶解）×１００．
結果を図３０に示す。
このＣＤＣアッセイは、仔ウサギ補体の存在下で、異なる抗Ｈｅｒ２抗体（フォーマット、組み合わせ）の処置の際の瀕死／死細胞のマーカーとしてのＬＤＨの放出を示す。
ここでは、トラスツズマブ及びペルツズマブの組み合わせは、ＣＤＣの有意な誘導をもたらしたが、親抗体単独ではもたらさなかった。驚くべきことに、両方のＣＬＣ Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ変異体はより優れたＣＤＣ作用を誘発したが、一方Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ Ｃｒｏｓｓｍａｂ処置は親抗体の組み合わせよりも効果の弱いＣＤＣ反応をもたらしている。
実施例１９：ＢＴ－４７４細胞のＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）媒介性死滅（ＡＣＥＡ）
１×１０４４のＢＴ－４７４細胞／ウェルが９６ウェルのＥ－プレート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）に播種され、Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ装置中で一晩増殖された。増殖培地は除去され、細胞は、無血清ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ）で一回洗浄された。５０μｌ／ウェルのＡＩＭ－Ｖ培地及びＡＩＭ－Ｖ中の５０μｌの抗体（３倍の最終濃度）が添加され、２０分間インキュベートされた。５０μｌの仔ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）が添加され、ＣｅｌｌＩｎｄｅｘ（ＣＩ；細胞の生存率についての代表として）が５分毎に測定された（曲線を参照）。以下の二重特異性Ｈｅｒ２抗体が試験された：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ ｗｔ”：配列番号６４、５４、９２、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒ Ｇ２”：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
特異的ＣＤＣは下記式により算出され、ここで正規化された細胞指数である：
Figure 0007077263000047
２つの代表時点において（反応開始後１時間及び２時間後）、特異的溶解（＝ＣＤＣ誘導細胞死）が算出され、図に示される（ｎ＝４の平均＋／ＳＥＭ）。
結果は、図３１及び表３１に示される。このＣＤＣアッセイは、仔ウサギ補体の存在下で、異なる抗Ｈｅｒ２抗体（フォーマット、組み合わせ）による処置の際の瀕死／死細胞のマーカーとしての細胞指数の変化を示す。ここでは、トラスツズマブ及びペルツズマブの組み合わせは、ＣＤＣの有意な誘導をもたらしたが、親抗体単独ではもたらさなかった。驚くべきことに、両方のＣＬＣ Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ変異体はより優れたＣＤＣ作用を誘発したが、一方Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ Ｃｒｏｓｓｍａｂ処置は親抗体の組み合わせよりも効果の弱いＣＤＣ反応をもたらしている。
Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ Ｄ１－ｄｅｒの優位性の一つの可能な理由は、トラスツズマブのエピトープに対するわずかに高い親和性並びにペルツズマブのエピトープに対する有意に高い親和性であり得る（表２５も参照）。
Figure 0007077263000048
実施例２０：マウス異種移植研究
細胞株ＫＰＬ４
このヒト乳がん細胞株は、炎症性皮膚転移を有する乳がん患者の悪性胸水から樹立されている。細胞は、Ｊ．Ｋｕｒｅｂａｙａｓｈｉ教授によって提供された（Ｋａｗａｓａｋｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｋｕｒａｓｈｉｋｉ，Ｊａｐａｎ）。腫瘍細胞は、５％ＣＯ２で水飽和大気中、３７℃で１０％ウシ胎児血清グルタミン（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び２ｍＭのＬ－グルタミン（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＤＭＥＭ培地（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で常套的に培養された。培養継代は、トリプシン／ＥＤＴＡ １×（ＰＡＮ）を用いて行われ、２回／週、分割された。細胞継代Ｐ６がインビトロ研究に使用された。
マウス
雌ＳＣＩＤベージュ（Ｃ．Ｂ．－１７）マウス；年齢１０－１２週；体重１８～２０ｇ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）；体重＞２０ｇは、国際ガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って１２時間明／１２時間暗黒の日々のサイクルによる特定病原体を含まない条件下で維持された。到着後、動物は、新しい環境に慣れるため、及び観察のために、１週間動物施設の検疫部で収容された。継続的な健康管理が定期的に実施された。ダイエット食品（Ａｌｌｔｒｏｍｉｎ）及び水は自由に与えられた。実験的研究は、地方自治体によりレビューされ承認された。
腫瘍細胞の注入
注入の日に、腫瘍細胞は培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＴｒｉＦｌａｓｋ）から回収され（トリプシン－ＥＤＴＡ）、び５０ｍｌの培地に移され、１回洗浄され、ＰＢＳに再懸濁された。ＰＢＳによる更なる洗浄工程及びろ過（セルストレイナー；Ｆａｌｃｏｎφ１００μｍ）の後に、最終の細胞力価を１．５ｘ１０８／ｍｌに調整された。腫瘍細胞懸濁液は、細胞凝集を避けるため移送ピペットを用いて慎重に混合された。麻酔は、プレインキュベーションチャンバー（プレクシグラス）、個々のマウスの鼻マスク（シリコン）及び可燃性又は爆発性でない麻酔化合物イソフルラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ－Ｕｐｊｏｈｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて小動物用のＳｔｅｐｈｅｎｓ吸入器を使用して閉鎖循環系で実行された。注入の２日前に、ＳＣＩＤベージュマウスの外被は剃毛され、ＫＰＬ－４細胞（３×１０ｅ６細胞）は、各麻酔マウスの右の最後から２番目の鼠径部乳腺脂肪体に２０μｌの容量で（Ｈａｍｉｌｔｏｎマイクロシリンジ及び３０Ｇｘ１／２”針を使用して）同所注入された。細胞懸濁液が、乳頭下の皮膚を介して注入された。
モニタリング
動物は、副作用の臨床症状の検出のために毎日管理された。モニタリングのため、実験を通して、動物の体重を毎週２回記録し、週２回腫瘍体積をキャリパーで測定した。腫瘍体積は、ＮＣＩプロトコルに従って算出された（腫瘍重量＝１／２ａｂ２、「ａ」及び「ｂ」は、それぞれ腫瘍の長径、短径である）。終了基準はクリティカルな腫瘍塊（上限１．７ｇ又は＞１．５ｃｍ）、ベースラインから２０％以上の体重減少、動物の腫瘍潰瘍又は悪い全身状態であった。動物に対する研究の除外基準が説明され、対応する「Ｔｉｅｒｖｅｒｓｕｃｈｓａｎｚｅｉｇｅ」で承認される。
処置
マウスは８０ｍｍ３の腫瘍体積について無作為化され、続いて腹腔内の１０ｍｌ／ｋｇの量で週一回処置された。併用治療のために、ハーセプチンが最初に与えられ、その２４時間後にパージェタが与えられた。
以下の二重特異性Ｈｅｒ２抗体が試験された：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ ＣＬＣ－Ｄ１－ｄｅｒ：配列番号６４、５４、９２。結果を図３２に示す。
Figure 0007077263000049
Figure 0007077263000050
Figure 0007077263000051
Figure 0007077263000052
Figure 0007077263000053
Figure 0007077263000054
Figure 0007077263000055
Figure 0007077263000056
Figure 0007077263000057
Figure 0007077263000058
Figure 0007077263000059
Figure 0007077263000060
Figure 0007077263000061
Figure 0007077263000062
Figure 0007077263000063
Figure 0007077263000064
Figure 0007077263000065
Figure 0007077263000066
Figure 0007077263000067
Figure 0007077263000068
Figure 0007077263000069

Claims (9)

  1. ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的に結合可能な第一Ｆａｂ分子及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合可能な第二Ｆａｂ分子を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記二重特異性抗体が、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶの両方に対して一価であり、第一Ｆａｂ分子の可変軽鎖の配列が、第二Ｆａｂ分子の可変軽鎖の配列と同一であり、第一及び第二Ｆａｂ分子の可変軽鎖が配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、前記二重特異性抗体が、
    ａ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖、配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一重鎖、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二重鎖；
    ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖、配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一重鎖、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二重鎖；
    ｃ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖、配列番号６８のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一重鎖、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二重鎖；
    ｄ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖、配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一重鎖、及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二重鎖；
    ｅ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖、配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一重鎖、及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二重鎖；又は
    ｆ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖、配列番号６８のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一重鎖、及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二重鎖
    を含み、
    前記第二重鎖が、ＣＤＲに安定性を付与し、標的に対する結合を付与するアミノ酸配列中の少なくとも一の修飾を有し、前記少なくとも一の修飾が、Ｄ９８Ｅ、Ｄ９８Ｎ、Ｄ９８Ｔ、Ｇ９９Ａ及びＧ９９Ｓからなる群から選択される、二重特異性抗体。
  2. 請求項１に記載の二重特異性抗体を含む薬学的組成物。
  3. がんの治療のための請求項１に記載の二重特異性抗体。
  4. 医薬としての使用のための請求項１に記載の二重特異性抗体。
  5. 請求項１に記載の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド。
  6. 請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  7. 請求項６に記載の発現ベクターを含む原核又は真核宿主細胞。
  8. 抗体が産生されるように請求項７に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法。
  9. 個体においてがんを治療するための医薬であって、請求項１に記載の二重特異性抗体を含む、医薬。
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Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
KR20220162801A (ko) 2008-04-11 2022-12-08 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
WO2012116926A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding proteins
BR112013020338A2 (pt) 2011-02-28 2016-10-18 Hoffmann La Roche proteína de ligação de antígeno monovalente, composição farmacêutica, uso da proteína de ligação de antígeno monovalente, método para o tratamento de um paciente com necessidade de terapia, método para a preparação de uma proteína de ligação de antígeno monovalente, ácido nucleico, vetor e célula hospedeira
EP3733714A1 (en) * 2019-04-30 2020-11-04 Universität Zürich Her2-binding tetrameric polypeptides
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
BR112016006929A2 (pt) * 2013-10-11 2017-09-19 Hoffmann La Roche Anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de preparação de anticorpo, de tratamento de pacientes e de geração de um anticorpo, composição farmacêutica e uso do anticorpo
US10947319B2 (en) 2013-11-27 2021-03-16 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting HER2
CN112062853B (zh) * 2013-12-20 2024-01-09 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性her2抗体及使用方法
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
HUE050831T2 (hu) 2014-11-17 2021-01-28 Regeneron Pharma Daganatkezelési módszerek a CD3XCD20 bispecifikus antitest használatával
CN105820251B (zh) * 2015-01-08 2019-10-15 江苏康宁杰瑞生物制药有限公司 具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物
AU2016242866B2 (en) 2015-03-30 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to FC gamma receptors
WO2016205531A2 (en) * 2015-06-17 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-her2 antibodies and methods of use
EP3353212B1 (en) * 2015-09-23 2021-11-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Optimized anti-cd3 bispecific antibodies and uses thereof
CN106554419A (zh) * 2015-09-28 2017-04-05 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 重组抗her2双特异性抗体、其制备方法和应用
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US11326182B2 (en) 2016-04-29 2022-05-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
CN107446045A (zh) * 2016-07-22 2017-12-08 北京天广实生物技术股份有限公司 一种抗her2的抗体、其药物组合物及用途
US10377833B2 (en) 2016-07-22 2019-08-13 Beijing Mabworks Biotech Co., Ltd. Bispecific anti-HER2 antibody
WO2018114728A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with a bispecific anti-ang2/vegf antibody and a bispecific anti-her2 antibody
WO2018139623A1 (en) * 2017-01-30 2018-08-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-sclerostin antibodies and methods of use
WO2018148445A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Adimab, Llc Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
CN108395480A (zh) * 2017-02-08 2018-08-14 广州百尼夫生物科技有限公司 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、carher2-nkt细胞及其制备方法和应用
KR20240060739A (ko) 2017-02-20 2024-05-08 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Her2, nkg2d 및 cd16에 결합하는 단백질
CN110520442A (zh) * 2017-03-17 2019-11-29 本康生物制药（深圳）有限公司 多特异性抗体、抗体偶联物和相关的药物组合物及应用
US11325982B2 (en) 2017-04-09 2022-05-10 Xuanzhu Biopharmaceutical Co., Ltd. Biparatopic and multiparatopic antibodies with common light chain and method of use
EP3645048A4 (en) * 2017-06-25 2021-06-16 Systimmune, Inc. MULTISPECIFIC ANTIBODIES AND THE METHOD OF MANUFACTURING AND USING THEREOF
WO2019028125A1 (en) * 2017-08-01 2019-02-07 Ab Studio Inc. BISPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2019051308A1 (en) * 2017-09-07 2019-03-14 Dragonfly Therapeutics, Inc. NKG2D, CD16 BINDING PROTEINS AND ANTIGEN ASSOCIATED WITH A TUMOR
CA3237846A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the nkg2d receptor
MA51793A (fr) 2018-02-08 2020-12-16 Hoffmann La Roche Molécules bispécifiques de liaison à l'antigène et procédés d'utilisation
IL277049B2 (en) 2018-03-13 2024-02-01 Zymeworks Bc Inc Conjugates of biparatopic anti-HER2 antibody and drug and methods of use
CA3090232A1 (en) 2018-03-13 2019-09-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with targeted 4-1bb (cd137) agonists
PE20210652A1 (es) * 2018-04-13 2021-03-26 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno dirigidas a her2 que comprenden 4-1bbl
AU2019331024A1 (en) 2018-08-31 2021-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dosing strategy that mitigates cytokine release syndrome for CD3/C20 bispecific antibodies
BR112021005670A2 (pt) * 2018-10-08 2021-06-22 Universität Zürich polipeptídeos tetraméricos de ligação a her2
WO2020156555A1 (zh) 2019-02-03 2020-08-06 苏州康聚生物科技有限公司 抗her2的双特异性抗体及其应用
EP3952996A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antigen binding molecules comprising lipocalin muteins
CA3166619A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 Julian Andreev Bispecific antigen binding molecules that bind her2, and methods of use thereof
EP4126968A4 (en) * 2020-03-27 2024-03-27 Jiangsu Alphamab Biopharmaceuticals Co Ltd EFFECTIVE DOSE FOR HER2 BISPECIFIC ANTIBODY
US20230242647A1 (en) * 2020-05-01 2023-08-03 Novartis Ag Engineered immunoglobulins
US20220017637A1 (en) 2020-06-23 2022-01-20 Hoffmann-La Roche Inc. Agonistic cd28 antigen binding molecules targeting her2
CN114057882B (zh) * 2020-07-31 2023-01-06 山东博安生物技术股份有限公司 多价多特异性抗体
CA3188508A1 (en) * 2020-08-13 2022-02-17 Xiquan Zhang Antibody drug conjugate
US20220153869A1 (en) * 2020-11-16 2022-05-19 Tavotek Biotherapeutics (Hong Kong) Limited Shielded and homing bispecific antibody that simultaneously inhibits angiogenic pathway targets and her2 family proteins and uses thereof
CN114539413A (zh) * 2020-11-25 2022-05-27 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合her2的多价双特异性抗体、其制备方法和用途
KR20230157385A (ko) * 2021-03-08 2023-11-16 진콴텀 헬스케어 (쑤저우) 씨오., 엘티디. 항 her2 항체 면역 작용제 접합체 및 이의 적용
WO2023280092A1 (zh) * 2021-07-05 2023-01-12 江苏康宁杰瑞生物制药有限公司 抗体药物偶联物及其应用
CN113817065B (zh) * 2021-09-06 2023-04-18 深圳市乐土生物医药有限公司 一种抗her2的多肽及其用途
TW202340240A (zh) * 2021-11-17 2023-10-16 大陸商江蘇先聲藥業有限公司 多特異性抗體及其藥物用途
WO2024028731A1 (en) * 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Transferrin receptor binding proteins for treating brain tumors
WO2024028732A1 (en) * 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Cd98 binding constructs for treating brain tumors
WO2024061224A1 (zh) * 2022-09-20 2024-03-28 普米斯生物技术(珠海)有限公司 抗her2抗体及其用途
WO2024104933A1 (en) * 2022-11-15 2024-05-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules
CN116514998B (zh) * 2023-05-12 2023-09-15 再少年(北京)生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001523971A (ja) 1997-05-02 2001-11-27 ジェネンテック，インコーポレーテッド ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法
WO2011084496A1 (en) 2009-12-16 2011-07-14 Abbott Biotherapeutics Corp. Anti-her2 antibodies and their uses
WO2012085113A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Roche Diagnostics Gmbh Binding agent
WO2012143523A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecifc antibodies against her2
JP2013512927A (ja) 2009-12-04 2013-04-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性抗体、抗体アナログ、組成物、及び方法
US20130266564A1 (en) 2010-12-06 2013-10-10 National Research Council Of Canada ANTIBODIES SELECTIVE FOR CELLS PRESENTING ErbB2 AT HIGH DENSITY
JP6510532B2 (ja) 2013-12-20 2019-05-08 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性ｈｅｒ２抗体及び使用方法

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US6733752B1 (en) 1994-03-30 2004-05-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Prevention of tumors with monoclonal antibodies against neu
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
US7125843B2 (en) 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
AU2003217912A1 (en) * 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
US7332585B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
CA2481515C (en) 2002-04-10 2013-10-01 Genentech, Inc. Anti-her2 antibody variants
US7709610B2 (en) * 2003-05-08 2010-05-04 Facet Biotech Corporation Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
US20060003412A1 (en) * 2003-12-08 2006-01-05 Xencor, Inc. Protein engineering with analogous contact environments
JP2008507520A (ja) 2004-07-22 2008-03-13 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｈｅｒ２抗体組成物
GB0624500D0 (en) * 2006-12-07 2007-01-17 Istituto Superiore Di Sanito A novel passive vaccine for candida infections
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
KR101431319B1 (ko) 2009-05-27 2014-08-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 삼중특이성 또는 사중특이성 항체
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
WO2011019827A2 (en) * 2009-08-11 2011-02-17 Academia Sinica Phage displaying system expressing single chain antibody
EP2482212A4 (en) 2009-09-25 2014-02-26 Sh Nat Eng Res Ct Nanotech Co METHOD FOR DETECTING HIGH AFFAIR PROTEINS WITH COMPUTER BASED DESIGN
SI2330131T1 (sl) * 2009-12-07 2015-02-27 Fundacio Privada Institucio Catalana De Recerca I Estudis Avancants Protitelesa proti HER2 skrajšani varianti CTF-611
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
JP6082344B2 (ja) * 2010-05-27 2017-02-15 ゲンマブ エー／エス Ｈｅｒ２エピトープに対するモノクローナル抗体
EP2655413B1 (en) 2010-12-23 2019-01-16 F.Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
CA2832389A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
MX349095B (es) 2011-08-23 2017-07-11 Roche Glycart Ag Moleculas biespecificas de union a antigeno.
EP2906596B1 (en) * 2012-10-12 2023-12-27 Arizona Board of Regents on behalf of Arizona State University Antibody based reagents that specifically recognize toxic oligomeric forms of tau
DK3083689T3 (da) 2013-12-17 2020-08-03 Genentech Inc Anti-CD3-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse
US9629801B2 (en) * 2014-01-10 2017-04-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Blood-brain barrier targeting antibodies
CA2874083C (en) * 2014-12-05 2024-01-02 Universite Laval Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
CN105820251B (zh) 2015-01-08 2019-10-15 江苏康宁杰瑞生物制药有限公司 具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001523971A (ja) 1997-05-02 2001-11-27 ジェネンテック，インコーポレーテッド ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法
JP2013512927A (ja) 2009-12-04 2013-04-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性抗体、抗体アナログ、組成物、及び方法
WO2011084496A1 (en) 2009-12-16 2011-07-14 Abbott Biotherapeutics Corp. Anti-her2 antibodies and their uses
US20130266564A1 (en) 2010-12-06 2013-10-10 National Research Council Of Canada ANTIBODIES SELECTIVE FOR CELLS PRESENTING ErbB2 AT HIGH DENSITY
WO2012085113A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Roche Diagnostics Gmbh Binding agent
WO2012143523A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecifc antibodies against her2
JP6510532B2 (ja) 2013-12-20 2019-05-08 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性ｈｅｒ２抗体及び使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cancer Res.，2013年，Vol. 6471-6483

Also Published As

Publication number Publication date
EP3083696A1 (en) 2016-10-26
JP2017501706A (ja) 2017-01-19
EP3327038A3 (en) 2018-06-13
WO2015091738A1 (en) 2015-06-25
US10584178B2 (en) 2020-03-10
US20170029529A1 (en) 2017-02-02
MX2016008098A (es) 2017-01-11
RU2016129517A (ru) 2018-01-25
CA2925677A1 (en) 2015-06-25
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