JP7066206B2 - マイクロ流体デバイス - Google Patents

Description

本実施形態は、一般にマイクロ流体デバイスに関し、より詳細には細胞を培養し監視するように構成されたマイクロ流体デバイスに関する。

単一細胞生物学における最近の発展により、同系細胞は遺伝子発現において大きな違いを示し、かつ同一条件下で増殖したときにふるまいに大きな違いを示し得ることが明らかになった。新しいデバイスはしたがって、経時的に表現型における細胞間の違いを特徴づける必要がある。このようなデバイスは、単一細胞を培養し監視する際に有効なツールであるために、ある特定の基準を満たす必要がある。例えばこれらのデバイスは、ロードの直後に表現型特性を監視できるように、細胞をロードしやすくなくてはならない。さらに、多くの異なる個々の細胞は、細胞間の違いを特徴づけるために並行して増殖される必要がある。デバイスは、例えば系列に依存する動態を監視するために、一定のよく制御された増殖条件下で長期間細胞を培養できるように設計されるべきである。もしデバイスが、新しい培養媒体または検査薬に応答する動的変化を監視するために培養条件を変えられるならばさらに好ましい。例えば、同系細胞上で異なる培養媒体を並行して試験する、または異なる細胞株上の媒体変化への応答を並行して監視するのに有利である可能性がある。

マイクロ流体デバイスの所望の適用は、細菌細胞がマイクロ流体デバイスにロードされた直後に一連の抗生物質または他の検査薬に対する細菌試料の表現型応答を速やかに並行して監視することである。このような適用では、例えば、分析速度を増すために、細菌または血液細胞と混合された細菌を含む尿試料をマイクロ流体デバイスに直接ロードできることが有利であるに違いない。

別の所望の適用は、抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ）と組み合わせることができ、これは表現型特性を最初に監視し次いで遺伝子型特性を決定することにより細胞試料中の遺伝的多様性を調査するであろう。

「Ｍｏｔｈｅｒ Ｍａｃｈｉｎｅ」の名称である従来技術のマイクロ流体デバイスは、ＷａｎｇらによりＣｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０年、２０、１０９９～１１０３ページに開示されている。このＭｏｔｈｅｒ Ｍａｃｈｉｎｅは、多くの異なる細胞チャネル内の細胞を並行して監視できる。しかし、この従来のマイクロ流体デバイスはいくつかの欠点を有する。例えば細胞のロードが複雑で、マイクロ流体デバイス内の培養条件を迅速に変更することが困難である。

したがって従来技術のマイクロ流体デバイスの欠点の一部またはすべてを克服する改良されたマイクロ流体デバイスが必要とされている。

改良されたマイクロ流体デバイスを提供することが実施形態の一目的である。

この目的および他の目的は本明細書に開示されたような実施形態によって満たされる。

実施形態の一態様は、単層で細胞を収容する寸法を有する、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルを撮像し有するための透明の基板を備える、マイクロ流体デバイスに関する。複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルのそれぞれの第１の端部は、第１の流体ポートと流体連結する第１の端部、および第２の流体ポートと流体連結する第２の端部を有する、流れ入力チャネルと流体連結する。複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルのそれぞれの第２の端部は、流れ出力チャネルと流体連結する第２の端部を有する、それぞれの第１の洗浄チャネルの第１の端部と流体連結する。流れ出力チャネルは、第３の流体ポートと流体連結する。第１の洗浄チャネルは、小さ過ぎて細胞を収容できない寸法を有する。

実施形態の別の態様は、上記に従ってマイクロ流体デバイスをロードする方法に関する。方法は、細胞および培養媒体をマイクロ流体デバイスの第１の流体ポートおよび第２の流体ポートの一方の中に入力して、マイクロ流体デバイスの流れ入力チャネルを通って複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルの中に細胞および培養媒体が流れるようにさせることを含む。複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルのそれぞれの第１の端部は、第１の流体ポートと流体連結する第１の端部、および第２の流体ポートと流体連結する第２の端部を有する、流れ入力チャネルと流体連結する。方法はまた、第１の流体ポートおよび第２の流体ポートの他方を通って過剰な細胞を出力すること、および第１の流体ポートおよび第２の流体ポートの他方を通りかつ流体出力チャネルと流体連結する第３のポートを通って培養媒体を出力することを含む。複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルのそれぞれの第２の端部は、流れ出力チャネルと流体連結する第２の端部を有する、それぞれの第１の洗浄チャネルの第１の端部と流体連結する。第１の洗浄チャネルは、小さ過ぎて細胞を収容できない寸法を有する。

実施形態のさらなる態様は、抗生物質感受性試験のための方法に関する。方法は、上記に従ってマイクロ流体デバイスの複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内に細菌細胞をロードすることを含む。方法は、また複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルの異なる空間的に画定され分離された細胞チャネル内の細菌細胞を、異なる抗生物質および／または異なる濃度の抗生物質に曝すことを含む。方法は、それぞれの表現型特性、好ましくは複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内の細菌細胞のそれぞれの増殖率、それぞれの核様体圧縮度、それぞれの代謝活性度およびそれぞれの膜統合度の少なくとも１つに基づいて、細菌細胞の抗生物質感受性を決定することをさらに含む。

実施形態のさらに別の態様は、細胞をｉｎ ｓｉｔｕで遺伝子型決定するための方法に関する。方法は、上記に従ってマイクロ流体デバイスの複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内に細胞をロードすることを含む。また方法は、細胞を複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内に定着させること、および複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内の細胞をｉｎ ｓｉｔｕで遺伝子型決定することを含む。

実施形態のさらなる態様は、細胞の表現型特徴づけのための方法に関する。方法は、上記に従ってマイクロ流体デバイスの複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内に細胞をロードすることを含む。方法は、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内で細胞を増殖すること、および複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内の細胞の表現型特徴をリアルタイムで監視することも含む。

実施形態のマイクロ流体デバイスは、細胞を容易にロードし、一定条件下または可変条件下で細胞を培養できる。マイクロ流体デバイスは、培養条件、または化学物質、試薬もしくは他の溶剤の添加を迅速に切り替えることができる。

実施形態は、そのさらなる目的および利点とともに、添付図面と合わせて以下の説明を参照することにより最も良く理解できる。

一実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す図である。 Ａ－Ａ線に沿った図１に示されるマイクロ流体デバイスの断面図である。 別の実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す図である。 Ａ－Ａ線に沿った図３に示されるマイクロ流体デバイスの断面図である。 さらなる実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す図である。 さらに別の実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す図である。 図６に示されるマイクロ流体デバイスのロードおよび作動を示す図である。 マイクロ流体デバイス内の細胞および参照チャネルの概略拡大図である。 マイクロ流体デバイス中にチャネル識別子を備える細胞チャネルの概略拡大図である。 さらなる実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す図である。 図１０に示されるマイクロ流体デバイスの箱Ａ内の一部の概略拡大図である。 図１１に示されるマイクロ流体デバイスの箱Ｂ内の一部の概略拡大図である。 一実施形態によるマイクロ流体デバイスを鋳造するための鋳型の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）画像である。 一実施形態によるマイクロ流体デバイス内で増殖する大腸菌細胞の位相差画像である。 一実施形態によるマイクロ流体デバイス内で増殖する、クロラムフェニコール感受性（ＭＩＣ≒４μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール耐性（ＭＩＣ＞１２μｇ／ｍｌ）の大腸菌株の位相差画像である。 一実施形態によるマイクロ流体デバイスにロードする方法を示す流れ図である。 １２０μｇ／ｍｌに時間＝０分で曝される際の、１つのエリスロマイシン耐性および２つのエリスロマイシン感受性の大腸菌株に対する平均増殖率の応答を示す図である。 時間＝０分で（１）薬品なし（「ｘ」で記されている）、（２）エリスロマイシン（１２０μｇ／ｍｌ、菱形で記されている）または（３）シプロフロキサシン（１０μｇ／ｍｌ、円形で記されている）に曝される際の、シプロフロキサシン耐性の大腸菌株に対する平均増殖率の応答を示す図である。

図面全体を通して、同じ参照番号は類似または対応する要素に使用される。

本実施形態は、一般にマイクロ流体デバイスに関し、より詳細には細胞を培養し監視するように構成されたマイクロ流体デバイスに関する。

実施形態のマイクロ流体デバイスは、一定条件下または可変条件下で長期の細胞培養を促進する。マイクロ流体デバイスは、細胞を容易にロードし、増殖条件を迅速に切り替え、生物剤または化学剤を追加または交換できる。

実施形態のマイクロ流体デバイスは、単一細胞の培養および実験に使用できる。このような適用では、個々の細胞は、入力試料内の他の細胞から分離して保持される。例えば、マイクロ流体デバイスを使用して、複数の細胞株ライブラリ内のそれぞれの細胞株の細胞を他の細胞株の細胞から分離して保持し培養できる。それゆえ各細胞株は、マイクロ流体デバイス内でそれぞれの空間的に画定され分離された細胞チャネルを有し、その中で細胞を増殖し研究できる。

実施形態の一態様はマイクロ流体デバイス（培養装置とも呼ばれる）に関する。マイクロ流体デバイスは、単層で細胞を収容する寸法を有する、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルを撮像し有するための透明な基板を備える。複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルのそれぞれの第１の端部は、流れ入力チャネル（流れチャネルとも呼ばれる）と流体連結する。流れ入力チャネルは、第１の流体ポート（流体源とも呼ばれる）と流体連結する第１の端部、および第２の流体ポート（流体シンクとも呼ばれる）と流体連結する第２の端部を有する。複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルのそれぞれの第２の端部は、流れ出力チャネル（シンクチャネルとも呼ばれる）と流体連結する第２の端部を有する、それぞれの第１の洗浄チャネルの第１の端部と流体連結する。流れ出力チャネルは、第３の流体ポート（洗浄シンクとも呼ばれる）と流体連結する。第１の洗浄チャネルは、小さ過ぎて細胞を収容できない寸法を有する。

次にマイクロ流体デバイスの様々な実装の実施形態について、図面を参照してさらに説明する。

一実施形態では、マイクロ流体デバイス１（図１参照）は、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル２０を撮像し有するための透明な基板１０を備える。細胞チャネル２０は、単層で細胞が収まる寸法を有する。細胞チャネル２０のそれぞれの第１の端部２２は、第１の端部３２内の第１の流体ポート３１および第２の端部３４内の第２の流体ポート３３を有する、流れ入力チャネル３０と流体連結する。第１の洗浄チャネル４０は好ましくは存在し、細胞チャネル２０のそれぞれの第２の端部２４から流れ出力チャネル５０に延在する。それゆえ第１の洗浄チャネル４０は、細胞チャネル２０の第２の端部２４と流体連結する第１の端部４２、および流れ出力チャネル５０と流体連結する第２の反対側の端部４４を有する。流れ出力チャネル５０は、第３の流体ポート５１と流体連結する。

基板１０は複数の細胞チャネル２０を有し、その中で細胞が培養される。細胞チャネル２０は、図１に示されるように、さらに図２に示されるように図１のＡ－Ａ線に沿って切断した断面図に示されるように平行に配置されてもよい。このような場合、細胞チャネル２０のそれぞれの第１の端部２２は、流れ入力チャネル３０と流体連結し、かつこの流れ入力チャネル３０から延在する。細胞チャネル２０の総数を増やすために、細胞チャネル２０は流れ入力チャネル３０の長手方向側部の両側から延在してもよく、それによって流れ入力チャネル３０の片側のみに細胞チャネル２０を有するのと比べて、細胞チャネル２０の数が実質的に２倍になる（図５参照）。

図５では、マイクロ流体デバイス１の基板１０は細胞チャネル２０の２組２Ａおよび２Ｂを有する。このような２Ａ、２Ｂの各組の細胞チャネル２０は、２つの端部３２、３４内に第１および第２の流体ポート３１、３３を備える、共通の流体入力チャネル３０に流体連結したそれらのそれぞれの第１の端部を有する。しかし各組２Ａ、２Ｂは、図５に示されるようにそれぞれの流れ出力チャネル５０Ａ、５０Ｂを有する。それゆえ第１の組２Ａ内の第１の洗浄チャネル４０の第２の端部は第１の流れ出力チャネル５０Ａと流体連結するのに対して、第２の組２Ｂ内の第１の洗浄チャネル４０の第２の端部は、第２の流れ出力チャネル５０Ｂと流体連結する。これらの２つの流れ出力チャネル５０Ａ、５０Ｂは、好ましくは共通の第３の出力ポート５１を共有する。

図５のマイクロ流体デバイス１は、図１に示されるように２組２Ａ、２Ｂを基本的に多重化したものである。これは、２組２Ａ、２Ｂの細胞チャネル２０および第１の洗浄チャネル４０が、その第１の端部３２内で第１の流体ポート３１に連結されその第２の端部３４内で第２の流体ポート３３に連結される、共通の流れ入力チャネル３０を共有することを意味する。各組２Ａ、２Ｂの細胞チャネル２０および第１の洗浄チャネル４０は、それぞれの流れ出力チャネル５０Ａ、５０Ｂで終了し、流れ出力チャネル５０Ａ、５０Ｂは相互連結され、共通の第３の流体ポート５１に連結される。

第１の組２Ａ（図の左側）内の細胞チャネル２０内に存在する細胞は、第２の組２Ｂ（図の右側）内の細胞チャネル２０内に存在する細胞と同じ培養媒体および試薬および化学的入力に第１の流体ポート３１で曝される。

また図６～図７および図１０に関連して本明細書にさらに説明されるように、細胞チャネル２０および流れ入力チャネル３０のより複雑な配置も基板１０内で可能である。重要な特徴は、各細胞チャネル２０が流れ入力チャネル３０と流体連結する端部２２を有すること、および細胞チャネル２０が分離されて、細胞が１つの細胞チャネル２０から逃れて別の細胞チャネル２０に入ることを防止することである。

細胞チャネル２０は、単層で細胞を収容する寸法である。これは、細胞チャネル２０の高さまたは直径が、監視される細胞の直径とほぼ同じであるかわずかに大きいように選択されることを意味する。例えば細胞チャネル２０は、細胞が細胞の直径に実質的に一致するチャネル側面を有する、図２に示されるような実質的に正方形の断面であってよい。別法として細胞チャネル２０は、細胞の直径と実質的に一致する直径を有する、円形またはＵ字形の断面を有してよい。また細胞を細胞チャネル２０内で、好ましくは単層で、生着可能に培養できる限り、他の断面構成も可能である。これは、細胞チャネル２０は細胞数個分の幅であってよいが、好ましくは細胞１個分のみの高さであり得ることを示唆する。この場合、細胞は、セル１個より幅が広くてもよいが好ましくは依然として単層である２Ｄ単層を形成する細胞チャネル２０内で増殖できる。

流れ入力チャネル３０は、好ましくは監視される細胞の直径より非常に大きい寸法を有する。これは、流れ入力チャネル３０に入るあらゆる細胞が、流れ入力チャネル３０を通って通常は第２の流体ポート３３に向かって流され、好ましくは連続した培養媒体の流れにより第１の流体ポート３１から流れチャネル３０を通って第２の流れポート３３に向かって流されることを意味する。したがって一実施形態では、流れ入力チャネル３０は、細胞が流れ入力チャネル３０を通って流れることができるように充分に大きい寸法を有する。

流れ入力チャネル３０および細胞チャネル２０の断面寸法の差をさらに活用して、マイクロ流体デバイス１に加えた生物試料内で細胞を互いから分離させることができる。例えば生物試料は、流体入力チャネル３０を通って流れる際に細胞が細胞チャネル２０に入ることができるように充分に小さいサイズを有する関心対象の細胞を含んでもよい。生物試料は、大き過ぎて細胞チャネル２０に入れないが依然として充分に小さいので流れ入力チャネル３０を通ることができる、より大きい細胞をさらに含んでもよい。生物試料が第１の入力ポート３１などを通ってマイクロ流体デバイス１に入力されると、サイズ分離が得られ、ここで大きい細胞は第１の流体ポート３１から第２の流体ポート３３へと向かう流れ入力チャネル３０内で細胞チャネル２０を通過する。しかし、より小さい標的細胞は細胞チャネル２０内で捕捉される。

加えてまたは別法として生物試料が、第１の洗浄チャネル４０に入るのに充分に小さいサイズを有する、非常に小さい細胞を含む場合、追加または別法のサイズ分離が得られる。したがって標的細胞は細胞チャネル２０に入るが、サイズが大き過ぎることに起因して第１の洗浄チャネル４０に入れないのに対して、非常に小さい細胞は細胞チャネル２０に入り、さらに第１の洗浄チャネル４０に入って流れ出力チャネル５０に流れる。これらの小さい細胞は次いで第３の流体ポート５１を通ってマイクロ流体デバイス１から出る。

したがって大きい細胞は決して細胞チャネル２０に入らないが、流れ入力チャネル３０を通って流され、第２の流れポート３３を通って出る。小さい細胞は細胞チャネル２０内にとどまらないが、むしろ細胞チャネル２０および第１の洗浄チャネル４０を通って流れ、さらに流れ出力チャネル５０および第３の流体ポート５１を通る。したがって適正なサイズおよび寸法の標的細胞のみが、細胞チャネル２０に入って捕捉される。

細胞チャネル２０および第１の洗浄チャネル４０の実際の寸法は、マイクロ流体デバイス１内で増殖され監視されるべき特定の型の細胞に基づいて選択され設計され得る。

概して細胞株ライブラリなどの細胞は、それぞれの細胞株の細胞などの細胞を各細胞チャネル２０内に加えることによって播種される。それによって細胞を細胞チャネル２０の長さに沿って単層で増殖できる。一実施形態では、それによって各細胞チャネル２０は単一の細胞株および遺伝子型の細胞を含有する。細胞チャネル２０内の細胞は、細胞チャネル２０が細胞１個分の幅である場合、糸に通した真珠のように見える。細胞チャネル２０がより幅広い場合、細胞は細胞チャネル２０内に２Ｄ層を形成する。

増殖して細胞チャネル２０の第１の端部２２を通過して軽減する細胞は、流れ入力チャネル３０に入り、それによって洗い流される。第２の、細胞チャネル２０の反対側の端部２４は第１の洗浄チャネル４０に連結され、第１の洗浄チャネル４０は、細胞が細胞チャネル２０の第２の端部２４から逃れて第１の洗浄チャネル４０に入るのを防止する寸法である。

一実施形態では、第１の洗浄チャネル４０はその全長に沿って、すなわち細胞チャネル２０の第２の端部２４に連結された第１の端部４２から流れ出力チャネル５０に連結された第２の端部４４まで、小さい寸法を有することができる。代替実施形態では、第１の洗浄チャネル４０は、細胞チャネル２０内に存在する細胞が増殖するかチャネル制限を通過して第１の洗浄チャネル４０内へと流れるには小さすぎるか狭すぎる寸法を有する、チャネル制限を備える。このチャネル制限は、次いで第１の洗浄チャネル４０の第１の端部４２に存在する。この実施形態では、第１の洗浄チャネル４０の残りの部分は、細胞チャネル２０と実質的に同じ寸法を有してもよい。したがってチャネル制限は細胞に対して有効なブロックまたは障害であるが、培養媒体およびあらゆる化学物質、試薬もしくは溶剤はチャネル障害を通過してさらに第１の洗浄チャネル４０および流れ出力チャネル５０内に流れることができる。

これらの例示的実施形態はどちらも、細胞チャネル２０内に存在する標的サイズの細胞が増殖するか細胞チャネル２０の第２の端部２４を通過して第１の洗浄チャネル４０内へと流れることを防止する所望の効果を実現する。

一実施形態では（図３参照）、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル２０の各細胞チャネル２０は、その長手方向側部２６、２８の少なくとも１つに沿って、流れ入力チャネル３０と流体連結する第１の端部６２および流れ出力チャネル５０と流体連結する第２の端部６４を有するそれぞれの第２の洗浄チャネル６０に隣接される。第２の洗浄チャネル６０は、小さ過ぎて細胞を収容できない寸法を有する。

この実施形態では、各細胞チャネル２０は、細胞チャネル２０と流体連結し、その長手方向側部２６、２８の１つに沿って配置される、少なくとも１つの第２の洗浄チャネル６０を有する。図３に示されるような実施形態は、各細胞チャネル２０の長手方向側部２６、２８の両方に沿って配置される第２の洗浄チャネル６０を有する。

一実施形態では、第１の洗浄チャネル４０および第２の洗浄チャネル６０は相互連結されてもよく、それによって図３に示されるように細胞チャネル２０の周囲に連続する洗浄層を形成する。したがって細胞チャネル２０の第２の端部２４から第２の洗浄チャネル６０の第２の端部６４までの第２の洗浄チャネル６０の一部は、第１の洗浄チャネル４０に隣接して相互連結されてもよい。

第２の洗浄チャネル６０（または洗浄層）の寸法、例えば深さまたは高さは、小さすぎて細胞を収容できない。これは、細胞チャネル２０内に存在する細胞は隣接した第２の洗浄チャネル６０に入ることができないが、細胞チャネル２０内に残ることを意味する。

図４は、Ａ－Ａ線に沿った図３のマイクロ流体デバイス１の断面図である。この図は、細胞チャネル２０に比べて第２の洗浄チャネル６０の深さが比較的浅いことを明確に示す。第２の洗浄チャネル６０は、正方形、長方形、円形、Ｕ字形などのあらゆる断面構成を有してもよい。

特定の実施形態では、第１および第２の洗浄チャネル４０、６０は、基板１０内で同じ深さを有する。

細胞チャネル２０は、流れ入力チャネル３０におけるその第１の端部２２からその第２の端部２４にわたり、好ましくは実質的に同じ深さを有する。この深さは、細胞が細胞チャネル２０内で単層であることができるように、好ましくは細胞の直径に一致する、またはわずかに大きい。細胞チャネル２０の第２の端部２４における深さは、細胞チャネル２０の第２の端部２４から流れ出力チャネル５０に延在する第１の洗浄チャネル４０に入る際に、より浅い。このより浅い深さは、好ましくは細胞の直径より小さく、細胞チャネル２０内に存在する細胞が第１の洗浄チャネル４０に入ることを防止する。

図３および図４に示されるような一実施形態では、基板１０は、その安定性を増すために、基板１０の全厚さを通して延在する構造または部分１５を好ましくは備える。図３および図４は、細胞チャネル２０の長手方向長さに沿っていくつかの第２の洗浄チャネル６０の間に提供される支柱の形態でのこのような構造１５を示す。これらの支柱１５は、洗浄層を支持し流体流れが可能な限り、あらゆる形状を有していてよい。支柱１５は、例えば長方形、星形、円形または三角形であり、規則的または不規則に配置されてよい。これらの構造１５は、図に示されるように分離された構造であり洗浄層全体を通して、すなわち第２の洗浄チャネル６０の間の流体流れを促進し得る。代替手法では、図に示される支柱の各カラムは、流れ入力チャネル３０と流れ出力チャネル５０との間で全長にわたり延在する単一構造を形成する。このような解決策はより安定した基板１０をもたらすであろうが、流体流れの効率が悪いという犠牲を払うことになる。

細胞チャネル２０ならびに第１および第２の洗浄チャネル４０、６０は、図２および図４に示さるたように好ましくは開チャネルである。これは、カバー板７０が好ましくは基板１０上に配置されて、細胞チャネル２０ならびに第１および第２の洗浄チャネル４０、６０に対する蓋を形成し、それらを封止することを意味する。カバー板７０はしたがって基板１０の主表面１２上に配置される。

次に本明細書でマイクロ流体デバイス１の作動について短く説明する。

細胞のロード中、培養媒体とともに細胞は第１の流体ポート３１または第２の流体ポート３３に入り、流れ入力チャネル３０の中に流れる。好ましい実施形態では、すべての流体ポート３１、３３、５１は開いており培養媒体および細胞が細胞チャネル２０の中に押し込まれるようにする。過剰な細胞、または大き過ぎて細胞チャネル２０内に適合できない細胞は、細胞チャネル２０および第２の洗浄チャネル６０（存在する場合）の深さが細胞を流れ出力チャネル５０に到達させ第３の流体ポート５１に到達させるには浅過ぎるので、第２の流体ポート３３または第１の流体ポート３１を通って洗い流される。培養媒体は、第２の流体ポート３３または第１の流体ポート３１および第３の流体ポート５１の両方からマイクロ流体デバイス１を出る。マイクロ流体デバイス１のサイズ選択容量を使用して、細胞チャネル２０に、例えば非常に大きい血液細胞から分離される細菌を播種できる。

マイクロ流体デバイス１の作動中、培養媒体は上に説明されたように第１の流体ポート３１に入る。第１の実施形態では、第２の流体ポート３３および第３の流体ポート５１は開いている。これは、培養媒体が第２の流体ポート３３だけでなく第３の流体ポート５１も通って出ることを意味する。これは、培養媒体、検査薬、および試薬が細胞チャネル２０内のすべての細胞に有効に到達することを意味する。過剰な細胞は流れ入力チャネル３０の中に流れ、さらに第２の流体ポート３３から流れ出るのに対して、媒体はすべての細胞の上を流れ、流れ出力チャネル５０に入り、第３の流体ポート５１から出て、すべての細胞に新鮮な培養媒体または試薬を供給し続ける。

第２の実施形態では、第３の流体ポート５１は閉じているので、培養媒体および過剰な細胞はどちらも第２の流体ポート３３を通って出る。これは、第１の実施形態に比べて細胞チャネル２０内の細胞の上を流れる細胞媒体の効率が概して低い実施形態である。

増殖ステップ、洗浄ステップ、および反応ステップにおいて、第３の流体ポート５１は好ましくは開いている。これは、培養媒体、洗浄流体または液体および反応試薬を含む溶液が第１の流体ポート３１に入り、流れ入力チャネル３０、細胞チャネル２０、および第１の洗浄チャネル４０（および任意の第２の洗浄チャネル６０）を通り、流れ出力チャネル５０および第３の流体ポート５１に向かって流れることを意味する。別の実施形態では、第２の流体ポート３３は増殖ステップ、および洗浄ステップ中に開いている。このような場合、培養媒体、洗浄流体または液体、および反応試薬を含む溶液は、第３の流体ポート５１または第２の流体ポート３３を通って出てもよい。

図６は、共通の第２の流体ポート３３および第３の流体ポート５１を共有するが、分離した、すなわち個々の第１の流体ポート３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ、３１Ｄを有する、細胞チャネル２０および第１の洗浄チャネル４０の複数の、すなわち少なくとも２つの、組２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄを有する、マイクロ流体デバイス１の実施形態を示す。これは、細胞チャネル２０の別の組２Ｂ、２Ｃ、２Ｄに存在する細胞と比べて、異なる培養媒体および／または試薬もしくは化学薬品を細胞チャネル２０の組２Ａの１つの中に存在する細胞に入力できることを意味する。

したがって一実施形態では、マイクロ流体デバイス１の基板１０は、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル２０の複数の組２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、複数の流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、ならびに複数の流れ出力チャネル５０Ａ、５０Ｂ、５０Ｃ、５０Ｄを有する。複数の組２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄの各組２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ内の複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル２０のそれぞれの第１の端部２２は、複数の流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄのそれぞれの流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄと流体連結する。複数の組２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄの各組２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ内の第１の洗浄チャネル４０のそれぞれの第２の端部４４は、複数の流れ出力チャネル５０Ａ、５０Ｂ、５０Ｃ、５０Ｄのそれぞれの流れ出力チャネル５０Ａ、５０Ｂ、５０Ｃ、５０Ｄと流体連結する。

複数の流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄの各流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄのそれぞれの第１の端部３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄは、それぞれの第１の流体ポート３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ、３１Ｄと流体連結する。それに応じて複数の流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄの各流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄのそれぞれの第２の端部３４Ａ、３４Ｂ、３４Ｃ、３４Ｄは、共通の第２の流体ポート３３と流体連結する。さらに、複数の流れ出力チャネル５０Ａ、５０Ｂ、５０Ｃ、５０Ｄの各流れ出力チャネル５０Ａ、５０Ｂ、５０Ｃ、５０Ｄは、共通の第３の流体ポート５１と流体連結する。

図６のマイクロ流体デバイス１は、細胞チャネル２０の複数の、すなわち少なくとも２つの、組２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄを有する例示的実施形態に過ぎないとみなされるべきである。これは、マイクロ流体デバイス１の変形がこのような組をＭ個もつ基板を有してよく、この場合Ｍは２以上の整数値であることを意味する。

図７は、図６のマイクロ流体デバイス１を使用する実施形態を概略的に示す。一実施形態では、ロード中、細胞および培養媒体は第２の流体ポート３３に入り、培養媒体は第３の流体ポート５１を通って、かつ異なる第１の流体ポート３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ、３１Ｄを通って流れ出る。過剰な細胞は第１の流体ポート３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ、３１Ｄを通って流れ出る。別の実施形態では、細胞は、個々の第１の流体ポート３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ、３１Ｄを通って入り、過剰な細胞は共通の第２の流体ポート３３を通って出て、培養媒体は共通の第２の流体ポート３３および共通の第３の流体ポート５１を通って出る。

マイクロ流体デバイス１の作動中、培養媒体は別個の第１の流体ポート３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ、３１Ｄに好ましくは入り、それによって異なる培養媒体を異なる組２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄの細胞チャネル２０および第１の洗浄チャネル４０に到達させることができる。過剰な細胞は共通の第２の流体ポート３３を通って洗い流され、培養媒体は共通の第３の流体ポート５１から、かつ共通の第２の流体ポート３３を通しても流れ出る。

同じ培養媒体が細胞チャネル２０のすべての組２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄに使用され、化学薬品、試薬または他の溶剤を異なる組２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄへ個々に追加する必要がない場合は、培養媒体の流れは代わりに共通の第２の流体ポート３３から共通の第３の流体ポート５１および別個の第１の流体ポート３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ、３１Ｄに向かってよい。

図１０は、図６および図７に関連して上に説明されたマイクロ流体デバイス１の変形を概略的に示す。この実施形態では、複数の流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃの各流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃのそれぞれの第１の端部３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃは、複数のそれぞれの第１の流体ポート３１Ａ、３１Ａ’、３１Ｂ、３１Ｂ’、３１Ｃ、３１Ｃ’と流体連結する。複数の流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃの各流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃのそれぞれの第２の端部３４Ａ、３４Ｂ、３４Ｃは、複数の共通の第２の流体ポート３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃと流体連結する。

これは、この実施形態では各流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃは、複数の別個の第１の流体ポート３１Ａ、３１Ａ’、３１Ｂ、３１Ｂ’、３１Ｃ、３１Ｃ’、および複数の共通の第２の流体ポート３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃと流体連結することを意味する。それによって複数の共通の第２の流体ポート３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃは細胞チャネルのすべての組２Ａ、２Ｂ、２Ｃによって共有されるのに対して、細胞チャネルのこのような各組２Ａ、２Ｂ、２Ｃは、その独自の群の複数の第１の流体ポート３１Ａ、３１Ａ’、３１Ｂ、３１Ｂ’、３１Ｃ、３１Ｃ’を有する。

細胞チャネルの組２Ａ、２Ｂ、２Ｃ毎に複数の第１の流体ポート３１Ａ、３１Ａ’、３１Ｂ、３１Ｂ’、３１Ｃ、３１Ｃ’および複数の共通の第２の流体ポート３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃの使用により、全く同一のマイクロ流体デバイス１を異なるモードで作動できる。

第１のこのような作動モードは、複数の特定の細胞株を使用することを含む。このような場合、異なる細胞株は、過剰な細胞の出口として共通の第２の流体ポート３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃの少なくとも１つを備える第１の流体ポート３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ（または３１Ａ’、３１Ｂ’、３１Ｃ’）内のマイクロ流体デバイス１にロードされるのに対して、培養媒体は、共通の第３の流体ポート５１および開いた共通の第２の流体ポート（複数可）３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃを通ってマイクロ流体デバイス１から出る。作動中、培養媒体およびあらゆる試薬、化学薬品または溶剤は、ロード中に細胞の老廃物に対して使用されなかった共通の第２の流体ポート３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃの少なくとも１つから流され、共通の第３の流体ポート５１および第１の流体ポート３１Ａ’、３１Ｂ’、３１Ｃ’（または３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ）を通ってマイクロ流体デバイス１を出ていく。

特定の好ましい実施形態では、ロード中に細胞および培養媒体入力ポートとして各第１の流体ポートの対３１Ａ、３１Ａ’、３１Ｂ、３１Ｂ’、３１Ｃ、３１Ｃ’の一方の第１の流体ポート３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃを使用し、作動中に培養媒体出力ポートとして各第１の流体ポートの対３１Ａ、３１Ａ’、３１Ｂ、３１Ｂ’、３１Ｃ、３１Ｃ’の他方の第１の流体ポート３１Ａ’、３１Ｂ’、３１Ｃ’を使用することが好ましい。それに応じて、ロード中に細胞および培養媒体出力ポートとして複数の共通の第２の流体ポート３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃの１つの共通の第２の流体ポート３３Ａを使用し、作動中に培養媒体および試薬、化学薬品または溶剤入力ポートとして別の共通の第２の流体ポート３３Ｃを使用することが好ましい。このような手法により、様々な流体ポートを汚染する危険性が低減し、特に培養媒体および培養媒体とともに作動中に使用される試薬、化学薬品または溶剤、ならびにロード中に追加された細胞を汚染する危険性が低減する。

第２の作動モードは、単一細胞株または細胞株ライブラリの使用を含む。このような場合、細胞株または細胞株ライブラリは、過剰な細胞および培養媒体のための出力ポートとしてそれぞれの第１の流体ポート３１Ａ’、３１Ｂ’、３１Ｃ’（または３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ）、および培養媒体のための出力ポートとして共通の第３の流体ポート５１を使用して、少なくとも１つ、好ましくは１つの共通の第２の流体ポート３３Ａを通ってロードされる。作動中に、異なる培養媒体および／または異なる試薬、化学薬品または溶剤を他方のそれぞれの第１の流体ポート３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ（または３１Ａ’、３１Ｂ’、３１Ｃ’）で入力できる。次いで共通の第２の流体ポート３３Ｂ、３３Ｃの少なくとも１つおよび共通の第３の流体ポート５１は、異なる培養媒体および／または異なる試薬、化学薬品または溶剤のための出力ポートとして使用される。

特定の実施形態では、複数の流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃの各流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃのそれぞれの第２の端部３４Ａ、３４Ｂ、３４Ｃは、それぞれの相互連結チャネル３６Ａ、３６Ｂ、３６Ｃを通って共通の第２の流体ポート（複数可）３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃと流体連結する。一実施形態では、各々の相互連結チャネル３６Ａ、３６Ｂ、３６Ｃは実質的に同じチャネル長を有する。

したがって一実施形態では、流れ入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃの各々の第２の端部３４Ａ、３４Ｂ、３４Ｃから共通の第２の流体ポート３３（図６参照）またはポート３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ（図１０参照）までのチャネル距離は、好ましくは細胞チャネルの各組の２Ａ、２Ｂ、２Ｃと同じ距離である。これは、相互連結チャネル３６Ａ、３６Ｂ、３６Ｃを使用して、図１０に示されるようにそれぞれの流体入力チャネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃと共通の第２の流体ポート（複数可）３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃとの間で基板１０上の物理的距離の差を補完することを意味する。このような同じ距離は、流れの上の圧力を細胞チャネルの各組２Ａ、２Ｂ、２Ｃで同じに保つ。

図１１は、箱Ａ内に存在する図１０に示されるマイクロ流体デバイスの部分の拡大を概略的に示す。それに応じて図１２は、箱Ｂ内に存在する図１１に示されるマイクロ流体デバイスの部分の拡大を概略的に示す。この図１２は、マイクロ流体デバイスの２つの任意だが好ましい特徴を示す。

第１に、各細胞チャネル２０は、それぞれのチャネル識別子１１を好ましくは有する。図１２は、様々な細胞チャネル２０に対するそれぞれのチャネル番号としてチャネル識別子１１を示す。例えば細胞チャネル２０は、１０，０００（または９，９９９）個の細胞チャネル２０をもつマイクロ流体デバイス１に対して００００（または０００１）から９９９９までの番号を付されてよい。数以外の識別記号をチャネル識別子１１として使用できる。

したがって一実施形態では（図９および図１２参照）、マイクロ流体デバイスの基板１０は、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル２０の各空間的に画定され分離された細胞チャネル２０に対するそれぞれのチャネル識別子１１を備える。それぞれのチャネル識別子１１は撮像によって可視化される。

すべての細胞チャネル２０がそれぞれのチャネル識別子１１を有する必要は必ずしもない。したがって一実施形態では、基板１０は、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル２０の少なくともＮ番目の空間的に画定され分離された細胞チャネル２０毎に、それぞれのチャネル識別子１１を備える。パラメータＮは、限定ではないが例示として１、２、５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００などの、１以上のあらゆる整数値を有してよい。

したがってチャネル識別子１１は、例えばマイクロ流体デバイス１の細胞チャネル２０内に存在する細胞の写真を撮る、または映像を録画する顕微鏡または撮像装置を使用して、好ましくは目で見ることができる。これは、所与の細胞チャネル２０内に存在する細胞をチャネル識別子１１によって識別できることを意味する。

第２に、マイクロ流体デバイスは、好ましくは参照チャネル２１を備える（図８および図１２参照）。例えば基板１０内の全てのｎ番目の細胞チャネル２０を、何らかの画定された整数値ｎに対する参照チャネル２１で置換できる。別法として第１および／または最後の細胞チャネル２０は、参照チャネル２１の形態であってよい。さらなる変形は、基板１０内の何らかの選択された細胞チャネルの位置（複数可）に１つまたは複数の参照チャネル２１を有することである。

参照チャネル２１は、細胞が参照チャネル２１の中に入り増殖するのを防止するように設計される。これは、非常に小さいので細胞が参照チャネル２１に入ることができない、参照チャネル２１の寸法を有することによって実現できる。別法として、チャネル制限は、参照チャネル２１の端部に、またはその付近に存在してよい。このようなチャネル制限はしたがって、細胞が参照チャネル２１に入ることを防止するが、依然として培養媒体およびあらゆる化学薬品、試薬または溶剤を参照チャネル２１に入らせ、参照チャネル２１を通って流れさせる。

参照チャネル２１を使用して、マイクロ流体デバイスおよびその中に存在する細胞を撮像する間になど、背景データ、制御データまたは参照データを獲得できる。例えば、特定の蛍光特性または吸収特性を有する化学薬品を細胞に加えて細胞の特定の特徴を決定または監視できる。このような場合、参照チャネル２１から獲得された蛍光または吸収の記録を、異なる細胞チャネル２０における蛍光または吸収を決定する際に背景参照または制御参照として使用できる。したがって参照チャネル２１を、背景除去目的に使用できる。別の例は、位相差顕微鏡を使用して細胞を監視する場合であり、この場合は参照チャネルの特徴の位相差画像を使用して非細胞背景を説明できる。

図８は、そのような参照チャネル２１の一実施形態を示す。この実施形態では、基板１０は、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル２０の２つの隣接した空間的に画定され分離された細胞チャネル２０の間に実質的に平行に配置される、少なくとも１つの参照チャネル２１を有する。少なくとも１つの参照チャネル２１のそれぞれの第１の端部２３は流れ入力チャネル３０と流体連結し、かつ細胞がそれぞれの第１の端部２３から少なくとも１つの参照チャネル２１に入ることを防止するように配置される細胞ブロック２７を備える。少なくとも１つの参照チャネル２１のそれぞれの第２の端部２５は、流れ出力チャネル５０と流体連結する第２の端部４４を有する、それぞれの第１の洗浄チャネル４０の第１の端部４２と流体連結する。

この実施形態では、参照チャネル２１は、延伸および寸法に関しては細胞チャネル２０と実質的に同じだが、１つの大きな違いがある。参照チャネル２１は、それらのそれぞれの第１の端部２３に細胞ブロック２７を備える。この細胞ブロック２７は、チャネル制限、または参照チャネル２１の残余部より小さい寸法を有するチャネル部の形態であってよい。チャネル制限またはより小さい寸法の部分は、そうでなければ細胞チャネル２０に入ることができる細胞に対して、小さ過ぎるまたは狭過ぎるように選択される。それゆえこれらの細胞は第１の端部２３から参照チャネル２１に入ることができない。参照チャネル２１の第２の端部２５は、細胞チャネル２０としてそれぞれの第１の洗浄チャネル４０に連結される。これは、細胞が第１の洗浄チャネル４０の選択された寸法または大きさに起因して、第２の端部２５から参照チャネル２１に入れないことを意味する。

図１２は、参照チャネル２１の別の実施形態を示す。この実施形態では、基板１０は、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル２０の２つの隣接した空間的に画定され分離された細胞チャネル２０の間に実質的に平行に配置される、少なくとも１つの参照チャネル２１を有する。少なくとも１つの参照チャネル２１のそれぞれの第１の端部２３は流れ入力チャネル３０Ａと流体連結し、かつ細胞がそれぞれの第１の端部２３から少なくとも１つの参照チャネル２１に入ることを防止するように配置されるチャネル制限２９を備える。少なくとも１つの参照チャネル２１のそれぞれの第２の端部２５は流れ出力チャネル５０Ａと流体連結し、かつ細胞がそれぞれの第２の端部２５から少なくとも１つの参照チャネル２１に入ることを防止するように配置されるチャネル制限２９を備える。

この実施形態では、各参照チャネル２１はしたがって、参照チャネル２１の各端部２３、２５の一方に、またはその付近に２つのチャネル制限２９を備える。参照チャネル２１の残余部の寸法はしたがって、細胞チャネル２０の寸法と実質的に同じであってよい。

上に説明された実施形態では、参照チャネル２１は、２つの隣接した細胞チャネル２０の間に配置されるように説明されている。他の実施形態では、参照チャネル２１は、それがその２つの長手方向側部の一方に沿った細胞チャネル２０を欠くように、細胞チャネル２０の１組の２Ａのいずれかの端部に存在してもよい。また互いに隣接して配置される２つの参照チャネル２１を有することも可能である。

しかし、例えば基板１０内の全てのｎ番目のチャネル位置に参照チャネル２１を有することによって、細胞チャネルの組２Ａにわたって一様に分配された参照チャネル２１を有することが概して好ましい。

図１３は、実施形態のマイクロ流体デバイスを鋳造するために使用できる鋳型のＳＥＭ画像である。図は、チャネル番号としてチャネル識別子を示し、参照チャネルおよび細胞チャネルと対応する第１の洗浄チャネルとの間の界面を画定するために使用されるチャネル制限を示す。

図１４は、時間内に２つの異なる点で撮られた、実施形態によるマイクロ流体デバイス中で増殖する大腸菌細胞の位相差画像を示す。第１の洗浄チャネルと細胞チャネルとの間の界面でのチャネル制限の形態でなどの、より小さい寸法の第１の洗浄チャネルは、大腸菌細胞が図の左へと増殖する、すなわち第１の洗浄チャネルに入るのを有効に防止する。図の底部のチャネルは、空の参照チャネルである。参照チャネルの両端部における二重制限は、いかなる大腸菌細胞も参照チャネルに入るのを防止する。チャネル識別子は位相差画像で見ることができ、それによって個々の細胞チャネルおよびその中で増殖する大腸菌細胞を識別できる。

マイクロ流体デバイスの基板は、プラスチック材料など、任意の透明材料で作成されてよく、その中に細胞チャネル、第１の洗浄チャネル、第１の流体ポート、第２の流体ポート、流れ入力チャネル、流れ出力チャネル、および第３の流体ポートを構成する構造を画定できる。適切な材料の非限定例には、ＺＥＯＮ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌ．Ｐ．により市販される環状オレフィン重合体（ＣＯＰ）であるＺＥＯＮＥＸ（登録商標）およびＺＥＯＮＯＲ（登録商標）、ならびにＴｏｐａｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｓにより市販される環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）であるＴＯＰＡＳ（登録商標）が含まれる。これらの材料は、透過および背景蛍光の観点から優れた光学特徴を有する。またこれらの材料は、加熱されると良好な流れ特徴も有し、したがってマイクロ流体デバイスの基板の形成を可能にする小さい構造を複製できる。

基板に適切な材料の他の例には、ガラス、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）およびポリ（ｐ－フェニレンスルファイド）（ＰＰＳ）が含まれる。

図２および図４に示されるカバー板は、様々な材料で製造されてもよく、好ましくは撮像できるように透明である。非限定例にはガラスおよびプラスチック材料が含まれる。

作動時に、マイクロ流体デバイスは、流体マニホールドに好ましくは連結されてマイクロ流体デバイスおよび流体マニホールドを備える培養システムを形成する。流体マニホールドは、少なくとも１つのコンピュータで制御されるポンプを使用して、培養媒体およびあらゆる試薬、化学薬品または溶剤を細胞チャネルに分配するように構成される。流体マニホールドは、コンピュータで制御され予めプログラミングされたポンプを使用して、培養媒体の交換、試薬、化学薬品または溶剤の分配ができるように好ましくは構成される。特定の実施形態では、試薬、化学薬品または溶剤および細胞培養媒体を、実験の間中異なる温度で維持できる。

図１６は、一実施形態によるマイクロ流体デバイスにロードする方法を示す流れ図である。方法は、ステップＳ１において細胞および培養媒体をマイクロ流体デバイスの第１の流体ポートおよび第２の流体ポートの一方に入力して細胞および培養媒体をマイクロ流体デバイスの流れ入力チャネルを通って複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルの中に流すことができるようにすることを含む。複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルのそれぞれの第１の端部は、第１の流体ポートに流体連結する第１の端部および第２の流体ポートに流体連結する第２の端部を有する、流れ入力チャネルと流体連結する。次のステップＳ２は、第１の流体ポートおよび第２の流体ポートの他方を通って過剰な細胞を出力することを含み、ステップＳ３は、第１の流体ポートおよび第２の流体ポートの他方を通り、流れ出力チャネルと流体連結する第３のポートを通って培養媒体を出力することを含む。複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルのそれぞれの第２の端部は、流れ出力チャネルと流体連結する第２の端部を有する、それぞれの第１の洗浄チャネルの第１の端部と流体連結する。第１の洗浄チャネルは、小さ過ぎて細胞を収容できない寸法を有する。

ステップＳ２およびステップＳ３は、入力細胞および培養媒体がマイクロ流体デバイスおよびその様々なチャネルに入るのと同時に概して行われる。

実施形態のマイクロ流体デバイスは、様々な適用に使用できる。このような適用の一例は、抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ）である。例えば、図１０に示されるマイクロ流体デバイス１をこの目的に使用できる。このような場合、試料株を、例えば過剰な細胞および培養媒体のための出力ポートとして第１の流体ポート３１Ａ’、３１Ｂ’、３１Ｃ’を使用する共通の第２の流体ポート３３Ａ、および培養媒体のため、また細胞を細胞チャネルの中に吸引するための出力ポートとして共通の第３の流体ポート５１からロードできる。一例では、ロード中に培養媒体は共通の第２の流体ポート３３Ｃから共通の第２の流体ポート３３Ｂに流されて共通の第２の流体ポート３３Ｃが汚染するのを防止する。細胞をロードした後、培養媒体は、出力ポートとして第１の流体ポート３１Ａ’、３１Ｂ’、３１Ｃ’および共通の第３の流体ポート５１を使用して、共通の第２の流体ポート３３Ｃから好ましくは流れる。この段階で細胞チャネル内の細胞の増殖を、異なる細胞チャネル内の細胞を撮像しながら、０分～数日の間中監視できる。ＡＳＴ試験は、異なる抗生物質を、または同じ抗生物質を異なる濃度で細胞チャネルの異なる組の２Ａ、２Ｂ、２Ｃの中に、入力ポートとして第１の流体ポート３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃを使用する一方で、出力ポートとして共通の第２の流体ポート３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃおよび共通の第３の流体ポート５１を使用して流すことによって開始する。感受性は、異なる細胞チャネル内の抗生物質への表現型応答によって監視される。例えば、自動画像分析ルーチンを使用して位相差における長さ延伸を監視するだけで、平均増殖率および増殖率の細胞間の分布を決定できる。これらの測定は、数分以内に分単位の表現型変化を決定できるように、多くの細胞チャネル内の細胞にわたる平均を求めることができる。また表現型変化は、ＤＮＡの圧縮または膜構造もしくは完全性の変化などの、形態における変化であってもよい。いくつかの表現型変化は、蛍光チャネル内で観察できる４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）およびＳＹＴＯＸ（登録商標）蛍光染色などの検査薬の追加によって最もよく観察できる。

表現型ＡＳＴの後にｉｎ ｓｉｔｕで遺伝子型決定をする試験を実施できる。この試験では、重要な遺伝子、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ種の有無または量を、例えば蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、例えばループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）（ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を使用するｉｎ ｓｉｔｕ配列増幅もしくは等温増幅、または１つもしくは複数の特定の錠型プローブのハイブリダイゼーションおよびライゲーションに続くローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって決定する。

図１５は、ＡＳＴ試験中にマイクロ流体デバイスを撮った位相差画像であり、ここではクロラムフェニコール感受性（最小抑制濃度（ＭＩＣ）≒４μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール耐性（ＭＩＣ＞１２μｇ／ｍｌ）の大腸菌株が、図１０に対応するマイクロ流体デバイス内の異なる細胞チャネルでロードされた。細胞をロードした後、両方の株を６μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに曝した。１５分後に撮られた画像は、クロラムフェニコール感受性株がクロラムフェニコール耐性株よりはるかに増殖が少ないことを明確に示している。

図１７は、３つの異なる大腸菌株がエリスロマイシンに１２０μｇ／ｍｌで０分曝された際の平均増殖率を示し、ここでこの３つの株は図１０に対応するマイクロ流体デバイス１内の細胞チャネル２０のそれぞれの組２Ａ、２Ｂ、２Ｃにロードされる。「ｘ」で示される耐性株は２５６μｇ／ｍｌのＭＩＣを有するのに対して、円形および菱形で示される非耐性株は約１２μｇ／ｍｌのＭＩＣを有する。図は、耐性株が２０分未満で感受性株から区別できることを明確に示す。

図１８は、図１に対応するマイクロ流体デバイス１内の細胞チャネル２０のそれぞれの組２Ａ、２Ｂ、２Ｃにロードされたシプロフロキサシン（ＤＡ２０８５９ Ｅｃｏ ｇｙｒＡ１－Ｓ８３Ｌ ｇｙｒＡ２－Ｄ８７Ｎ ｐａｒＣ－Ｓ８０I ＭＩＣ約３０μｇ／ｍｌ）に耐性である大腸菌株に対する、位相差の低速度画像によって決定された際の、平均増殖率応答を示す。大腸菌株を（１）「ｘ」で記された薬品なし、（２）菱形で記されたエリスロマイシン１２０μｇ／ｍｌ、または（３）円形で記されたシプロフロキサシン１０μｇ／ｍｌに曝した。時点０分は処理の開始に対応する。株が影響を受ける薬品（エリスロマイシン）での処理に対応する曲線を、処理しない曲線から１０分未満で区別できる。株が影響を受ける薬品での処理に対応する曲線を、株が耐性のある薬品（シプロフロキサシン）に対応する曲線から１５分未満で区別できる。

したがって一実施形態は、抗生物質感受性試験のための方法に関する。方法は、細菌細胞を、実施形態によるマイクロ流体デバイスの複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内にロードすることを含む。また方法は、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルの異なる空間的に画定され分離された細胞チャネル内の細菌細胞を、異なる抗生物質および／または異なる濃度の抗生物質に曝すことも含む。方法は、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内の細菌細胞のそれぞれの表現型特徴に基づいて、細菌細胞の抗生物質感受性を決定することをさらに含む。

したがってそれぞれの表現型特徴は、細菌細胞に対して監視され決定され、この場合この表現型特徴は細菌細胞の抗生物質感受性を表す。好ましい実施形態では、表現型特徴は、好ましくは複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内の細菌細胞のそれぞれの増殖率、それぞれの核様体圧縮度、それぞれの代謝活性度およびそれぞれの膜統合度の少なくとも１つである。

実施形態のマイクロ流体デバイスは、細菌細胞、古細菌細胞、たとえば酵母細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞などの真核細胞を含むがこれに限定されない、様々な型の細胞を培養し監視するために使用できる。

実施形態のマイクロ流体デバイスは、細胞株ライブラリなどの細胞を特徴づけるために使用できる。特徴づけは、細胞株の少なくとも１つの表現型特徴を決定する形態、および／または細胞株の遺伝物質をｉｎ ｓｉｔｕで遺伝子型決定する形態であってよい。細胞株のライブラリの表現型特徴決定およびｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子型決定の一例は、同時係属の国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＥ２０１５／０５０２２７号に開示されている。特に、マイクロ流体デバイスは、監視された表現型特徴およびｉｎ ｓｉｔｕで決定された遺伝子型を高度に並行な方法で次いで連結させる。これは、監視された表現型特徴を細胞株の異なる遺伝子型に連結するために、異なる遺伝子型をもつ細胞株の膨大なライブラリをマイクロ流体デバイス内で並行して処理できることを意味する。

細胞株のライブラリは、遺伝子工学内の様々な技法に従って獲得できる。例えば、多重自動ゲノム工学（ＭＡＧＥ）（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を使用して、１日当たり数百万の異なる突然変異ゲノムを生成できる（Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年、４６０、８９４～８９８ページ）。細胞のライブラリを生成するために使用できる他の技法には、クラスター化し規則的にスペーサーが挿入される短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）（Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅｅ、２０１４年、３４３、８０～８４ページ、Ｋｏｉｋｅ－Ｙｕｓａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４年、３２、３０９～３１２ページ、Ｚｈｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１４年、５０９、４８７～４９１ページ）または大規模なＲＮＡ干渉（Ｂｅｒｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４年、４２８、４３１～４３７ページ）が含まれる。

次いでマイクロ流体デバイスは、ライブラリ内の各細胞株の細胞を他の細胞株または他の遺伝子型の細胞から分離して保持し培養できる。それゆえ各細胞株は、その中で細胞が増殖し研究され得るマイクロ流体デバイス内に、それぞれが空間的に画定され分離された細胞チャネルを有する。

マイクロ流体デバイス内の空間的に画定され分離された細胞チャネルで培養された細胞は、物理的および／または化学的刺激もしくは溶剤への細胞の応答を監視するために、様々な物理的および／または化学的刺激もしくは溶剤に洗い流されることなく好ましくは曝され得る。例えば、栄養物、薬品、抗生物質、遺伝子発現誘導因子または抑制体などの様々な化学検査薬を培養媒体に加え、それによって細胞を接触させることができる。様々な検査薬への異なる細胞株の細胞の応答の観点から、細胞株の表現型特徴を、例えば顕微鏡を使用して、次いで決定できる。それに応じて、温度、ｐＨ、圧力、流れ、気体、露光度または細胞が曝される機械的応力を変化させることができ、そのような変化する物理的条件に対する異なる細胞株の細胞の応答を、例えば顕微鏡を使用して決定できる。

細胞株は、それらの遺伝物質の少なくとも一部に異なる可変領域を有することによって表されるように、異なる遺伝子型を有する。可変領域は、細胞株のゲノム中に通常存在する。別法として可変領域は、プラスミドまたはベクトルなどの可動遺伝因子中に存在し、それゆえ必ずしも細胞のゲノム中に安定して組み込まれる必要はない。以下で、ゲノム中に存在する可変領域に関して実施形態を主に論じる。しかし本明細書に記載された可変領域およびさらなるＤＮＡ因子が代わりに細胞株のプラスミドまたは他の可動遺伝因子中に存在する、代替実施形態も可能である。可変領域またはその一部はまた、トランスポゾン、ウイルスまたはファージなどの不安定な遺伝因子中に存在する可能性もある。このようなコード化は、例えば細胞を固定する前にｄｓＤＮＡゲノムから可変領域の一部を特異的に削除または環状化することにより、ｉｎ ｓｉｔｕでの配列決定のために細胞を固定する前に可変配列を増幅する観点から、時として有利である。

また一実施形態では、方法は、マイクロ流体デバイス内で空間的に画定され分離された細胞チャネルで細胞株の細胞をランダムに播種することを含む。細胞をランダムに播種することは、各細胞チャネルが同じ遺伝子型の細胞、すなわち同じ細胞株の細胞のみを備えるように好ましくは実行される。

この実施形態の利点は、細胞の遺伝的同一性、すなわち遺伝子型が、マイクロ流体デバイス内に細胞を播種する前に決定され既知である必要がないことである。したがって、各細胞株の遺伝的同一性を知る必要があり方法全体を通して各遺伝子型の位置を継続的に監視するという観点から、播種する前に仕分けされた細胞ライブラリ内に細胞を保持する必要はない。これは、本実施形態が際立って対照的に、遺伝子型のいかなる認識もなしに表現型の特徴を並行してまず分析し、次いで遺伝子型を決定し、それらを表現型の特徴に連結させることを意味する。

ライブラリ内の各細胞株に対して決定される表現型特徴は、好ましくはライブラリ内の各遺伝子型に対応する表現型特徴である。したがってライブラリ内の細胞は、異なる遺伝子型、すなわち細胞株毎にそれぞれの遺伝子型を有する細胞である。遺伝子型における違いは、細胞が各々の遺伝子型に対応する異なる表現型特徴を有することを示唆する。

一実施形態では、細胞の表現型特徴は顕微鏡を使用して決定される。表現型を監視し決定するための顕微鏡は、従来技術に比べていくつかの利点を有する。例えば蛍光顕微鏡は、多くの世代にわたる細胞系列の広範なタイムラプス、単一分子検出感受性、および何らかの増殖条件の変更に対する経時的な応答を監視することが可能である。

顕微鏡を使用する実施形態により監視し決定できる表現型特徴の非限定だが具体的な例には、細胞形態、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはタンパク質などの様々な分子の空間的および／または時間的発現パターン、特定の代謝物のレベル、例えば異なる物理的もしくは化学的刺激もしくは溶剤の追加に応答する寿命または増殖率の変化、遺伝子発現レベルにおける細胞間の変動、胚発生、レポータータンパク質の輝度またはＲＮＡアプタマーなどが含まれる。

したがって細胞株の表現型特徴づけは、必要であれば長時間にわたって顕微鏡下で並行して実行できる。表現型特徴づけは、ライブラリ内の様々な細胞株の遺伝子型を知ることなくさらに実行できる。極めて対照的に、表現型特徴づけは、マイクロ流体デバイス内の各空間的に画定され分離された細胞チャネルのそれぞれの表現型特徴を代わりに決定する。例えば細胞株に対して決定される関連表現型特徴は、検査薬の添加後に、可変遺伝子調節領域またはコード配列を備える蛍光レポータータンパク質に対する標的遺伝子の遺伝子発現であると仮定する。このような場合、顕微鏡を使用してマイクロ流体デバイスを通して画像を撮ることができ、そこでそれぞれの遺伝子発現レベルを視覚的に決定できる。個々の遺伝子発現レベルを次いで定量化してマイクロ流体デバイス内の各細胞チャネルに対するそれぞれの値を得ることができる。したがって表現型特徴づけの決定の出力は、マイクロ流体デバイス内の各細胞チャネルに対する１つまたは複数のそれぞれの値のリストまたはマトリックスであり得る。各細胞チャネルが本明細書で先に説明したようにそれぞれのチャネル識別子に割り当てられる場合は、細胞チャネル内の細胞に対して測定された表現型特徴をその細胞チャネルに割り当てられたチャネル識別子と次に関連付けることができる。

一実施形態では、表現型特徴を決定することは、顕微鏡を使用してマイクロ流体デバイス内の細胞を培養中に各細胞株の表現型特徴を決定することを含む。実施形態で使用できる顕微鏡検査技法の例には、例えば明視野顕微鏡法、位相差顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、光シート顕微鏡法、またはあらゆる型の超解像度撮像技術、例えば誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）顕微鏡法、光活性化局在性顕微鏡法（ＰＡＬＭ）（ｐｈｏｔｏ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、走査型近接場光顕微鏡法（ＮＳＯＭ）（ｎｅａｒ－ｆｉｅｌｄ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、４Ｐｉ顕微鏡法、構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、基底状態抑制（ＧＳＤ）（ｇｒｏｕｎｄ ｓｔａｔｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）顕微鏡法、スペクトル精密距離顕微鏡法（ＳＰＤＭ）（ｓｐｅｃｔｒａｌ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、確率的光学再構築顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）などが含まれる。さらに、細胞間単一分子追跡法（ＳＰＴ）（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｎｇｌｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ）または蛍光相互作用分光法（ＦＣＳ）（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）も使用できる。顕微鏡分析は、固定の時間位置で、またはタイムラプス撮像を使用して行うことができる。

原子間力顕微鏡を使用する機械的特性の測定、指示染料または微小電極を使用する膜電位の測定、撮像質量分析法または特定のバイオセンサーアレイを使用する小分子分泌の測定などの、表現型の他の測定も可能である。培養デバイスに直接連結される近接場光アレイ検出器も可能である。

一旦細胞株の表現型特徴が決定されると、細胞はマイクロ流体デバイス内の細胞チャネル内に好ましくは定着される。細胞定着は、当技術分野に周知の技法に従って実行できる。例えば、ホルムアルデヒド、メタノール、またはエタノールを細胞定着に使用できる。非限定的例では、細胞は４％のホルムアルデヒドで約１５分間、または３％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒドでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて約３０分間定着される。

一実施形態では、定着された細胞はｉｎ ｓｉｔｕで遺伝子型決定する前に透過処理される。細胞透過化のために従来利用される様々な手順を、実施形態に従って使用できる。例えばＴｒｉｔｏｎ（トリトン）Ｘ－１００（０．２５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００など）または非イオン界面活性剤などの別の活性剤を使用できる。別法としてエタノール、例えば７０％のエタノールを細胞透過化に使用できる。さらなる例には塩酸、例えば０．１Ｍの塩酸が含まれ、細菌細胞壁を分解するためにペプシン、例えば０．０１％のペプシンなどのプロテアーゼまたはリゾチームと任意に組み合わせられる。

ｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子型決定は、マイクロ流体デバイス内の細胞チャネルにおける各細胞株の可変領域の少なくとも一部をｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子型決定することを含む。それゆえ必ずしも各細胞株の可変領域全体をｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子型決定する必要はない。それゆえ本明細書に使用される場合、ｉｎ ｓｉｔｕ配列決定は、可変領域の少なくとも一部または実際に可変領域全体をｉｎ ｓｉｔｕで配列決定することを含む。ｉｎ ｓｉｔｕ配列決定は、異なる細胞株間の可変領域内のあらゆるヌクレオチドの差異を示す情報を好ましくは出力し、この場合これらのヌクレオチドの差異は異なる表現型をもたらす。

一実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子型決定は、例えばＳｃｉｅｎｃｅ、２０１４年、３４３（６１７７）、１３６０～１３６３ページに説明されているように、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技法に基づく。つまり、ＦＩＳＳＥＱにおいて細胞内のｃＤＮＡの単位複製配列が、逆転写酵素および逆転写（ＲＴ）（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）中のアミノアリルデオキシウリジン５’－三リン酸塩（ｄＵＴＰ）の組み込みを使用して定着された細胞内に生成される。ｃＤＮＡは、４ｎｍのスペーサーを有するアミン反応性リンカーであるＢＳ（ＰＥＧ）９を使用して再定着される。ｃＤＮＡの断片が次いで環状化された後、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が行われる。ＢＡ（ＰＥＧ）９を次いで使用して、アミノアリルｄＵＴＰを含有するＲＣＡ単位複製配列を架橋する。ライゲーションによるＳＯＬｉＤシークエンシングを次いで使用してＲＣＡ単位複製配列内の関連配列を配列決定して、可変領域のヌクレオチド配列を得ることができる。

一実施形態では、可変領域をｉｎ ｓｉｔｕで遺伝子型決定することは、マイクロ流体デバイス内の細胞チャネル内の可変領域または少なくともその一部のライゲーションによってｉｎ ｓｉｔｕ配列決定することを好ましくは含む。ライゲーションによって配列決定することは、塩基対ミスマッチに対するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）リガーゼの感受性に依存する。概して、配列決定される可変領域は好ましくは、アンカープライマー結合配列として機能する公知の配列が少なくとも１つの端部上に隣接する、一本鎖ＤＮＡ配列の形態である。公知の配列に相補的であるアンカープライマーは、公知の配列に結合される。

通常８～９塩基長のプローブオリゴヌクレチドの混合プールが次いで、配列決定される位置に従って、取り入れられ、通常蛍光染料で標識される。これらの標識されたオリゴヌクレチドはアンカープライマーに隣接した可変領域にハイブリダイズし、ＤＮＡリガーゼは、そのヌクレオチド配列が未知の可変領域に一致する場合、オリゴヌクレチドをアンカープライマーに優先的に接合する。分子によって生成された蛍光に基づいて、可変領域のこの位置における塩基の識別を推測できる。

オリゴヌクレチドプローブはまた切断可能な連鎖で構成されてもよく、標識を識別後にこれを切断できる。これは標識を取り除き、かつライゲーションされたプローブの端部上に５’－リン酸を再生し、それによってライゲーションの新しいラウンドが可能になる。ライゲーションおよび切断のこの循環を数回繰り返してより長い配列を読むことができる。この技法は可変領域ですべての第Ｑ塩基を配列決定し、この場合Ｑは切断後に残されるプローブの長さである。可変領域内の抜かされた位置を配列決定するために、アンカープライマーおよびライゲーションされたオリゴヌクレチドは可変領域を取り去られてもよく、ライゲーションによる配列決定の別のラウンドが、１塩基以上短いアンカープライマーで開始される。

別の技法は、標識がプローブ内の異なる位置に対応する単一ライゲーションのラウンドを繰り返すことであり、続いてアンカープライマーおよびライゲーションされたプローブを取り去る。

ライゲーションによる配列決定は、標識によってブロックされるオリゴヌクレチドプローブの端部に依存して、いずれかの方向（５’－３’または３’－５’）に進み得る。

一実施形態では、配列決定される配列は好ましくは、可変領域から獲得したＲＮＡ転写物の逆転写によって獲得されるｃＤＮＡ配列である。この実施形態では、可変領域は、アンカープライマーが結合する少なくとも１つの公知の配列が隣接する。

ライゲーションによる配列決定は、マイクロ流体デバイス内の細胞チャネル中の可変領域または少なくともその一部のライゲーションによりｉｎ ｓｉｔｕで配列決定を実現するために、定着された細胞上で実行できる。例えばＳｃｉｅｎｃｅ ２０１４年、３４３、１３６０～１３６３ページ、およびＮａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ２０１３年、１０、８５７～８６０ページを参照されたい。これらの教示はライゲーションによるｉｎ ｓｉｔｕで配列決定を実行することに関して、参照により本明細書に組み込まれる。

つまり一変形では、可変領域またはバーコードから獲得したＲＮＡは、逆転写によりｃＤＮＡに複製され、続いてＲＮａｓｅを使用してｍＲＮＡ鎖を分解する。第１の実施形態では、鋳型プローブは、ライゲーションによる配列決定のために標的にされる塩基上でプローブ端部の間に空隙を有してｃＤＮＡに結合する。この空隙はＤＮＡ重合およびＤＮＡライゲーションによって充填されて、ＤＮＡ環を生み出す。第２の実施形態では、ｃＤＮＡ環化はｓｓＤＮＡライゲーションのみによって実行される。第３の実施形態では、可変配列の少なくとも一部および隣接するＤＮＡを含むｄｓＤＮＡは、例えば制限酵素またはトランスポーゼースにより周辺ＤＮＡから切除される。次いで切除されたｄｓＤＮＡはエンドヌクレアーゼによりｓｓＤＮＡへと消化されて、自己ハイブリダイズおよびライゲーションして環状ＤＮＡを形成し得る。

一変形では、配列決定される可変領域は、染色体要素または可動遺伝因子のいずれかのｄｓＤＮＡから直接増幅される。この場合ｄｓＤＮＡは可変領域に近接した制限酵素で切断され、ｄｓＤＮＡはエクソヌクレアーゼにより一本鎖にされる。このｓｓＤＮＡを、ｃＤＮＡに対し通常働くが、ＲＮＡを発現する必要がない方法によって増幅できる。この方法は、可変領域付近のＤＮＡ領域を設計するための制限を緩和する。例えば、可変領域をギャップフィル鋳型反応によって充填できる。

ギャップフィルの代替として、比較的長い可変領域（１０～２５ｂｐ）を使用し、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレチドの組を可変領域にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレチドの結合エネルギーは、特定のオリゴヌクレチドのみが選択されたハイブリダイゼーションおよびライゲーション温度で結合するように選択される。例えばライブラリが、４^１５～１０^９の変異物が可能であるはずである、１５ｐｂの可変領域でコードされる４０００の変異物を含む場合、クロスハイブリダイズするプローブがないように４０００の変異を採取できる。オリゴヌクレオチドおよび鋳型プローブのハイブリダイゼーション後に、プローブは増幅できる環へとライゲーションされる。

いずれの場合も、形成されたＤＮＡ環は、ライゲーションにより配列決定に供されるローリングサークル産物（ＲＣＰ）（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔ）を生成する、ターゲット－プライムドローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（ｔａｒｇｅｔ－ｐｒｉｍｅｄ ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって増幅される。アンカープライマーが標的配列の隣にハイブリダイズされた後、オリゴヌクレオチドプローブをライゲーションする。一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、８個のランダム位置（Ｎ）および１個の固定位置（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）を備える、９マーの４個のライブラリからなる。各ライブラリは４つの蛍光染料の１つで標識される。固定位置で最もよく一致するオリゴヌクレオチドプローブが、その蛍光標識とともにライゲーションによって組み込まれる。試料は撮像され、各ＲＣＰは一致した塩基に対応する色を表示する。オリゴヌクレオチドプローブが洗い流された後、隣接した塩基に対してオリゴヌクレオチドプローブを増幅する。所望の数の塩基が読み取られるまで、ライゲーション、洗浄、撮像、および除去のステップが反復される。

別の実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子型決定は、マイクロ流体デバイス内の細胞チャネルにおける可変領域またはその少なくとも一部の合成によりｉｎ ｓｉｔｕ配列決定することを含む。

例えば、さらなる重合をブロックする停止剤を含有する、４つの型の改変ｄＮＴＰが加えられる。停止剤はまた、カメラによって検出できる蛍光標識も含有する。組み込まれていないヌクレオチドは洗い流され、蛍光的に標識されたヌクレオチドの画像が撮られる。停止剤とともに蛍光標識がＤＮＡから化学的に除去され、配列決定の次の循環が可能になる。

ｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子型決定の結果は、好ましくは各細胞株に対する可変領域または少なくともその一部のヌクレオチド配列である。各ヌクレオチド配列は、マイクロ流体デバイス内のそれぞれの細胞チャネルに、例えばチャネル識別子を使用することによってさらに連結される。これは、遺伝子型決定が、ライゲーションまたは合成によるｉｎ ｓｉｔｕ配列決定などの、ｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子型決定として実行されるので可能である。ｉｎ ｓｉｔｕはここでは、遺伝子型決定が、その場でまたは適所で、すなわちマイクロ流体デバイス内の細胞チャネルにおいて実行されることを示唆する。

先に説明された表現型決定の出力は、チャネル識別子によって識別された各細胞チャネルに対して決定された表現型特徴（複数可）を一覧にしたリストまたはマトリックスの形態でなどの、マイクロ流体デバイス内の各細胞チャネルに対するそれぞれの決定された表現型特徴であった。ｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子型決定の出力は、マイクロ流体デバイス内の各細胞チャネルにおいて可変領域に対して決定されるヌクレオチド配列である。この出力はまた、チャネル識別子によって識別された各細胞チャネルに対して決定されたヌクレオチド配列を一覧にしたリストまたはマトリックスの形態であってもよい。

各々の表現型特徴を次いで、マイクロ流体デバイス内の細胞チャネルに基づいて各々の遺伝子型と連結または関連付けることができる。例えば、細胞チャネル番号Ｐにおける細胞株の細胞に対して決定された表現型特徴は、この細胞株の細胞の遺伝子型の結果であり、この遺伝子型は、細胞チャネル番号Ｐに対して決定されたヌクレオチド配列から獲得される。それゆえ表現型と遺伝子型の連結は、単にマイクロ流体デバイス内の各細胞チャネルに対して決定された表現型特徴と遺伝子型を一致させることによって実現できる。

上に説明された適用では、実施形態のマイクロ流体デバイスは、細胞株ライブラリの組み合わされた表現型およびｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子型の決定のために使用される。マイクロ流体デバイスは、別法として単に表現型決定または単にｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子型の決定のために使用されてもよい。それゆえ、マイクロ流体デバイスにロードされた細胞の表現型およびｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子型の決定の両方を実行する必要はない。

実施形態の一態様はしたがって、細胞をｉｎ ｓｉｔｕで遺伝子型決定するための方法に関する。方法は、実施形態によるマイクロ流体デバイスの複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルに細胞をロードすることを含む。方法はまた、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネルに細胞を定着させることも含む。方法は、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内の細胞をｉｎ ｓｉｔｕで遺伝子型決定することをさらに含む。

実施形態の別の態様は、細胞の表現型の特徴づけのための方法に関する。方法は、実施形態によるマイクロ流体デバイスの複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内に細胞をロードすることを含む。方法はまた、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内で細胞を増殖または培養することも含む。方法は、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内の細胞の表現型特徴をリアルタイムで監視することをさらに含む。

実施形態のさらなる態様は、細胞株の遺伝物質の少なくとも一部に異なる可変領域を有する、複数の細胞株のライブラリを特徴づける方法に関する。方法は、実施形態によるマイクロ流体デバイスの複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内にライブラリの細胞株の細胞をロードすることを含む。方法はまた、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内の細胞株の細胞を増殖または培養することも含む。方法は、マイクロ流体デバイス内の各細胞株の表現型特徴を、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル内の細胞株の細胞のそれぞれの表現型特徴を好ましくはリアルタイムで監視することによって決定することをさらに含む。加えて方法は、マイクロ流体デバイス内に空間的に画定され分離された細胞チャネル内の細胞株の細胞を定着させることを含む。方法は、マイクロ流体デバイス内に空間的に画定され分離された細胞チャネル内の各細胞株の可変領域をｉｎ ｓｉｔｕで遺伝子型決定することをさらに含む。最後に方法は、マイクロ流体デバイス内に空間的に画定され分離された細胞チャネルに基づいて、好ましくはマイクロ流体デバイスの基板内に空間的に画定され分離された細胞チャネルのそれぞれのチャネル識別子またはそれぞれの位置に基づいて、各々の表現型特徴を各々の遺伝子型に連結させることを含む。

上に説明された実施形態は、本発明のいくつかの説明用例として理解されるべきである。様々な修正、組合せ、および変更が本発明の範囲から逸脱することなく、実施形態になされてもよいことが当業者には理解されよう。特に異なる実施形態における異なる部分の解決策は、技術的に可能な他の構成内で組み合わされることが可能である。しかし本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。

Claims (11)

1. 抗生物質感受性試験のための方法であって、前記方法は、
   細胞チャネル（２０）、流れ入力チャネル（３０；３０Ａ、３０Ｂ）及び流れ出力チャネル（５０； ５０Ａ、５０Ｂ）の少なくとも１つの組（２Ａ、２Ｂ）を有する基板（１０）を含むマイクロ流体デバイス（１）の細胞チャネル（２０）内に細菌細胞をロードすることであって、ここで前記流れ入力チャネル（３０；３０Ａ、３０Ｂ）は、細胞チャネル（２０）を介して流れ出力チャネル（５０； ５０Ａ、５０Ｂ）と流体連結されており、細胞チャネル（２０）は、細胞チャネル（２０）に入る細菌細胞がチャネル制限を通過して流れ出力チャネル（５０； ５０Ａ、５０Ｂ）に到達するのを防止するためのそれぞれのチャネル制限を含む、前記マイクロ流体デバイス（１）の細胞チャネル（２０）内に細菌細胞をロードすることと、
   細胞チャネル（２０）内の細菌細胞を抗生物質に曝すことと、
   細胞チャネル（２０）内の細菌細胞のそれぞれの表現型特徴に基づいて細菌細胞の抗生物質感受性を決定することと、を含み、
   前記流れ入力チャネル（３０；３０Ａ、３０Ｂ）は、第１の入力流体ポート（３１；３１Ａ、３１Ａ’、３１Ｂ、３１Ｂ’）と流体連結する第１の端部（３２；３２Ａ、３２Ｂ）と、第２の入力流体ポート（３３；３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ）と流体連結する第２の端部（３４；３４Ａ、３４Ｂ）とを有し、前記流れ出力チャネル（５０；５０Ａ、５０Ｂ）は、出力流体ポート（５１）と流体連結されており、前記細菌細胞は、前記第１の入力流体ポート（３１；３１Ａ、３１Ａ’、３１Ｂ、３１Ｂ’）又は前記第２の入力流体ポート（３３；３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ）にロードされ、
   前記表現型特徴は、前記細胞チャネル（２０）内の細菌細胞における、増殖率、核様体圧縮度、代謝活性度および膜統合度からなる群から選択される１種以上である、
   抗生物質感受性試験のための方法。
2. 基板（１０）は、細胞チャネル（２０）の第１の組（２Ａ）および細胞チャネル（２０）の第２の組（２Ｂ）を有し、
   前記細菌細胞を抗生物質に曝すことは、第１の組（２Ａ）の細胞チャネル（２０）内の細菌細胞を第１の濃度の抗生物質に曝し、第２の組（２Ｂ）の細胞チャネル（２０）内の細菌細胞を、第１の濃度とは異なる第２の濃度の抗生物質又はゼロ濃度の抗生物質に曝すことを含み、
   前記抗生物質感受性を決定することは、第１の組（２Ａ）の細胞チャネル（２０）内の細菌細胞の表現型特徴と、第２の組（２Ｂ）の細胞チャネル（２０）内の細菌細胞の表現型特徴との比較に基づいて細菌細胞の抗生物質感受性を決定することを含む、
   請求項１に記載の方法。
3. 前記基板（１０）は、複数の空間的に画定され分離された細胞チャネル（２０）の少なくとも１つの組（２Ａ、２Ｂ）を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記細菌細胞をロードすることは、細菌細胞をマイクロ流体デバイス（１）の細胞チャネル（２０）にロードして、細胞チャネル（２０）内の細菌細胞を捕捉することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記細胞チャネル（２０）は、前記流れ入力チャネル（３０；３０Ａ、３０Ｂ）と流体連結するそれぞれの第１の端部（２２）と、流れ出力チャネル（５０；５０Ａ、５０Ｂ）と流体連結するそれぞれの第２の端部（２４）とを含み、
   前記細胞チャネル（２０）は、それぞれの第２の端部（２４）に配置されたチャネル制限を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記細菌細胞をロードすることは、マイクロ流体デバイス（１）の細胞チャネル（２０）の第１の組（２Ａ）及び細胞チャネル（２０）の第２の組（２Ｂ）内に細菌細胞をロードすることを含み、ここで前記マイクロ流体デバイス（１）は、
   細胞チャネル（２０）の前記第１の組（２Ａ）と、細胞チャネル（２０）の前記第２の組（２Ｂ）を有する基板（１０）と、
   第１の入力流体ポート（３１Ａ、３１Ａ’）と流体連結する第１の端部（３２Ａ）と、第２の入力流体ポート（３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ）と流体連結する第２の端部（３４Ａ）とを有する第１の流れ入力チャネル（３０Ａ）と、
   出力流体ポート（５１）と流体連結されている第１の流れ出力チャネル（５０Ａ）と、
   第３の入力流体ポート（３１Ｂ、３１Ｂ’）と流体連結する第１の端部（３２Ｂ）と、第４の入力流体ポート（３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ）と流体連結する第２の端部（３４Ｂ）とを有する第２の流れ入力チャネル（３０Ｂ）と、
   出力流体ポート（５１）と流体連結されている第２の流れ出力チャネル（５０Ｂ）と、
   を含み、
   前記第１の流れ入力チャネル（３０Ａ）は、前記第１の組（２Ａ）の細胞チャネル（２０）を介して前記第１の流れ出力チャネル（５０Ａ）と流体連結されており、
   前記第２の流れ入力チャネル（３０Ｂ）は、前記第２の組（２Ｂ）の細胞チャネル（２０）を介して前記第２の流れ出力チャネル（５０Ｂ）と流体連結されており、
   前記細菌細胞は、前記第１の入力流体ポート（３１Ａ、３１Ａ’）及び前記第３の入力流体ポート（３１Ｂ、３１Ｂ’）にロードされ、
   前記細菌細胞を抗生物質に曝すことは、
   前記第１の組（２Ａ）の細胞チャネル（２０）内の細菌細胞を、抗生物質を含む培養媒体に曝すことと、
   前記第２の組（２Ｂ）の細胞チャネル（２０）内の細菌細胞を、抗生物質を欠いている培養媒体に曝すことと、を含み、
   前記抗生物質感受性を決定することは、前記第１の組（２Ａ）の細胞チャネル（２０）内の細菌細胞の表現型特徴と、前記第２の組（２Ｂ）の細胞チャネル（２０）内の細菌細胞の表現型特徴との比較に基づいて、細菌細胞の抗生物質感受性を決定することを含む、
   請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記第１の流れ入力チャネル（３０Ａ）の第２の端部（３４Ａ）は、共通の入力ポート（３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ）に流体連結されており、
   前記第２の流れ入力チャネル（３０Ｂ）の第２の端部（３４Ｂ）は、共通の入力ポート（３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ）に流体連結されており、
   前記細菌細胞をロードすることは、共通の入力ポート（３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ）に細菌細胞をロードすることを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記第１の組（２Ａ）の細胞チャネル（２０）内の細菌細胞を、抗生物質を含む培養媒体に曝すことは、第１の入力ポート（３１Ａ、３１Ａ’）に抗生物質を含む培養媒体を加え、前記第１の組（２Ａ）の細胞チャネル（２０）内の細菌細胞を、抗生物質を含む培養媒体に曝すことを含み、
   前記第２の組（２Ｂ）の細胞チャネル（２０）内の細菌細胞を、抗生物質を欠いている培養媒体に曝すことは、第３の入力ポート（３１Ｂ、３１Ｂ'）に抗生物質を欠いている培養媒体を加え、前記第２の組（２Ｂ）の細胞チャネル（２０）内の細菌細胞を、抗生物質を欠いている培養媒体に曝すことを含む、
   請求項６又は７に記載の方法。
9. 前記抗生物質感受性を決定することは、
   前記第１の組（２Ａ）の細胞チャネル（２０）内の細菌細胞の第１の平均増殖率を決定することと、
   前記第２の組（２Ｂ）の細胞チャネル（２０）内の細菌細胞の第２の平均増殖率を決定することと、
   前記第１の平均増殖率と前記第２の平均増殖率との比較に基づいて抗生物質感受性を決定することとを含む、
   請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 細胞チャネル（２０）内の細菌細胞を定着させることと、
    ＤＮＡ配列及び／またはＲＮＡ配列の有無および量の少なくとも１つ以上を決定するために、細胞チャネル（２０）内の細菌細胞をｉｎ ｓｉｔｕで遺伝子型決定することとを更に含む、
    請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 細胞チャネル（２０）、流れ入力チャネル（３０；３０Ａ、３０Ｂ）及び流れ出力チャネル（５０； ５０Ａ、５０Ｂ）の少なくとも1つの組（２Ａ、２Ｂ）を有する基板（１０）を含むマイクロ流体デバイス（１）の細胞チャネル（２０）内に細菌細胞をロードすることであって、ここで前記流れ入力チャネル（３０；３０Ａ、３０Ｂ）は、細胞チャネル（２０）を介して流れ出力チャネル（５０； ５０Ａ、５０Ｂ）と流体連結されており、細胞チャネル（２０）は、細胞チャネル（２０）に入る細菌細胞がチャネル制限を通過して流れ出力チャネル（５０； ５０Ａ、５０Ｂ）に到達するのを防止するためのそれぞれのチャネル制限を含む、前記マイクロ流体デバイス（１）の細胞チャネル（２０）内に細菌細胞をロードすることと、
    細胞チャネル（２０）内の細胞を増殖させることと、
    細胞チャネル（２０）内の細胞の表現型特徴をリアルタイムで監視することとを含み、
    前記流れ入力チャネル（３０；３０Ａ、３０Ｂ）は、第１の入力流体ポート（３１；３１Ａ、３１Ａ’、３１Ｂ、３１Ｂ’）と流体連結する第１の端部（３２；３２Ａ、３２Ｂ）と、第２の入力流体ポート（３３；３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ）と流体連結する第２の端部（３４；３４Ａ、３４Ｂ）とを有し、前記流れ出力チャネル（５０；５０Ａ、５０Ｂ）は、出力流体ポート（５１）と流体連結されており、前記細菌細胞は、前記第１の入力流体ポート（３１；３１Ａ、３１Ａ’、３１Ｂ、３１Ｂ’）又は前記第２の入力流体ポート（３３；３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ）にロードされ、
    前記表現型特徴は、前記細胞チャネル（２０）内の細菌細胞における、増殖率、核様体圧縮度、代謝活性度および膜統合度からなる群から選択される１種以上である、
    細胞の表現型特徴づけのための方法。

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