JP7064251B2 - 生体試料の加温方法、生体試料の加温容器、及び生体試料を加温するためのキット - Google Patents
生体試料の加温方法、生体試料の加温容器、及び生体試料を加温するためのキット Download PDFInfo
- Publication number
- JP7064251B2 JP7064251B2 JP2020527702A JP2020527702A JP7064251B2 JP 7064251 B2 JP7064251 B2 JP 7064251B2 JP 2020527702 A JP2020527702 A JP 2020527702A JP 2020527702 A JP2020527702 A JP 2020527702A JP 7064251 B2 JP7064251 B2 JP 7064251B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- biological sample
- heat medium
- storage container
- container
- heating
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
- C12M45/20—Heating; Cooling
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
- C12M41/18—Heat exchange systems, e.g. heat jackets or outer envelopes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0236—Mechanical aspects
- A01N1/0242—Apparatuses, i.e. devices used in the process of preservation of living parts, such as pumps, refrigeration devices or any other devices featuring moving parts and/or temperature controlling components
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0278—Physical preservation processes
- A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
- C12M45/22—Means for packing or storing viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Thermal Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
本発明の一態様に係る加温方法は、生体試料の加温方法であって、熱媒体が収容された熱媒体収容容器に、生体試料が収容された生体試料収容容器を収容する収容工程と、前記熱媒体が前記熱媒体収容容器の外に漏れないように前記熱媒体収容容器の前記熱媒体の入れ口を閉鎖する閉鎖工程と、前記熱媒体の入れ口が閉鎖した前記熱媒体収容容器内の前記熱媒体を運動させる運動工程と、を含む。
収容工程において、熱媒体が収容された熱媒体収容容器に、生体試料が収容された生体試料収容容器を収容する。本明細書において「容器AにBを収容する」は、(場合1)容器Aの内部に空間を有している容器Aの、当該空間にBを入れること、又は(場合2)容器Aの外表面と接するBを、容器Aによって包むことを意味する。(場合2)は、容器Aが変形可能な材質によって作製されていることを、さらに意味している。以下では、収容工程を、(場合1)を例に詳述する。
熱媒体収容容器は、内部に熱媒体を収容するものであり、熱媒体の入れ口となる開口部を有している。熱媒体収容容器の一例について図1を参照して説明する。図1は、本発明の一態様に係る加温方法で用いる加温容器を示す模式図である。加温容器1は、熱媒体収容容器2を有している。熱媒体収容容器2には、熱媒体4を注入するための開口部3が設けられている。また、熱媒体収容容器2には生体試料が収容された生体試料収容容器5が収容されている。図1は、後述する閉鎖工程において開口部3を蓋6により閉鎖した状態を例として示している。
上述の通り、熱媒体収容容器の一態様は、その外表面に生体試料収容容器を収容する(場合2)。(場合2)では、より正確には、熱媒体収容容器は生体試料収容容器を包む。したがって、(場合2)の熱媒体収容容器は、柔軟な材質によって作製されている容器である。
ここで、生体試料と熱媒体との熱交換により、熱媒体にどの程度の温度変化が生じるのかに基づいて、下記のとおり、熱媒体の量、熱媒体収容容器の容量をオーダーエスティメーションすることができる。このようなオーダーエスティメーションの結果に基づき、熱媒体の種類、量、温度、熱媒体収容容器の容積等を設計してもよい。
生体試料は固体であるため、その比熱は、氷の比熱(2.1kJ K^-1kg^-1)に近似すると考えられる。従って、当該過程においては、
(熱エネルギー)=(質量)×(比熱)×(温度変化)・・・(式1)
に従って、生体試料は熱媒体から
Q1[kJ]=0.001×2.1×80=0.168・・・(式2)
の熱を受け取ることになる。この結果、熱媒体は、Q1[kJ]の熱を奪われることとなり、
(温度変化)=(熱エネルギー)/((質量)×(比熱))・・・(式3)
に従って、温度変化を起こすと考えられる。熱媒体は液体であるため、その比熱は、水の比熱(4.2kJ K^-1kg^-1)に近似すると考えられる。したがって、
ΔT1[K]=(-0.168)/(0.04×4.2)=-1.0・・・(式4)
の温度変化が熱媒体に生じる。
生体試料が固体から液体に変化する過程では、融解熱に相当する熱エネルギーを熱媒体から得る必要があり、必要な熱エネルギーは、
(熱エネルギー)=(質量)×(融解熱)・・・(式5)
により算出される。融解熱は、氷の融解熱(335kJ kg^-1)に近似すると考えられるため、この過程において、生体試料は熱媒体から
Q2[kJ]=(0.001)×(335)=0.335・・・(式6)
の熱を受け取ることになる。したがって熱媒体は、Q2の熱を奪われることになる。この結果、熱媒体は、上記式4と同様に、
ΔT2[K]=(-0.335)/(0.04×4.2)=-1.99・・・(式7)の温度変化が熱媒体に生じる。
熱量保存の法則に従えば、温度T、質量M、比熱Cの流体と、温度T’、質量M’、比熱C’の流体とを接触させた場合の平衡温度T∞は、相変化が起きないと仮定した場合、
T∞=(M×C×T+M’×C’×T’)/(M×C+M’×C’)・・・(式8)
により求められる。ここで、生体試料と熱媒体とが同一の比熱を有すると近似できるため、絶対零度をT0[℃]と表記すると0℃=-T0[K]となり、上記式8は以下のように簡略化することができる。
=(M×(T[℃]+T0[K])+M’×(T’[℃]+T0[K]))/(M+M’)
=(M×T[℃]+M’×T’[℃])/(M+M’)+T0[K]・・・(式8’)
したがって、さらに生体試料の過程iiiにおける初期温度が0℃であれば、
T∞[℃]=(M×T[℃]+M’×T’[℃])/(M+M’)
=(M[g]×T[℃])/(M[g]+M’[g])・・・(式8’’)となり、この過程の平衡温度は、
T∞[℃]=(21×40+0×1)/(40+1)=20.5・・・(式8’’’)となる。したがって、この過程において、熱媒体の温度変化ΔT3は、
ΔT3[K]=20.5-21=-0.5・・・(式9)
となる。また、この過程において、生体試料は、式1と同様に、
Q3[kJ]=0.001×4.2×20.5=0.086・・・(式10)
の熱を熱媒体から受け取ることになり、すなわち熱媒体はQ3[kJ]の熱を奪われることになる。この程度の温度変化であれば、熱の変化も微小であるため、外部環境との熱交換も発生し得る実使用時には無視できる温度変化である。
閉鎖工程において、収容工程後、熱媒体が熱媒体収容容器の外に漏れないように熱媒体収容容器の熱媒体の入れ口を閉鎖することが好ましい。例えば、熱媒体収容容器の熱媒体の入れ口を蓋で覆うことによって閉鎖することができる。熱媒体収容容器の熱媒体の入れ口を閉鎖することで、位置規定部等が、熱媒体の熱媒体収容容器からの流出を封止する機能を備えない(例えば後述の図5参照)形態や、そもそも位置規定部を備えない(例えば図1参照)形態においても、後述する運動工程において熱媒体収容容器ごと運動させた際にも熱媒体の入れ口から熱媒体及び生体試料収容容器が飛び出さず、作業者及び作業場の汚染を防ぐことができる。
運動工程において、熱媒体の入れ口が閉鎖した前記熱媒体収容容器ごと運動させることが好ましい。運動工程においては、熱媒体収容容器内で熱媒体が対流し、熱媒体収容容器内を熱媒体が循環するように、生体試料収容容器を装着した状態で熱媒体収容容器ごと運動させる。これにより、熱媒体と生体試料との(生体試料収容容器を介した)熱交換がより効率よく行なわれ、生体試料をより短時間で加温することができる。
本発明の他の一態様に係る加温容器は、生体試料の加温容器であって、生体試料が収容される生体試料収容容器を収容し、かつ熱媒体が内部に収容される、熱媒体収容容器と、当該熱媒体収容容器に設けられた、前記生体試料収容容器の位置を規定するための位置規定部とを備えている。
具体例1の熱媒体収容容器は、例えば、柔軟な材料によって作製されている袋である。熱媒体は、当該袋の内部に封入されている。生体試料収容容器は、任意の位置で折りたたまれた袋に挟まれる(袋の外表面に接した状態で、当該袋に収容される)。袋には予め熱媒体が充填されており、かつ袋の入れ口は生体試料収容容器と接する前に予め閉鎖されている。つまり、袋は、その内部に生体試料収容容器を収容せずに、入れ口を閉鎖することによって作製される。ビニールやポリ袋をフイルム等の原材料からから袋状の構造加工する工程や、ものを詰めた袋を閉じる工程等で汎用的に使われる手法で作製可能であるため作製や熱媒体の充填が容易である。
袋の他の例として、当該袋の外表面に窪みが形成されている袋が挙げられる。当該窪みは、当該袋の外表面に設けられている開口部、当該袋の内部に向かって伸びている中空部、および当該開口部の反対側で当該中空部を閉じている底部を有している。つまり、当該窪みは、生体試料収容容器を収容し得る形状である。柔軟な材料によって作製されている袋に窪みを設けることは、極めて容易である。したがって、具体例1の袋及び具体例2の袋は、窪みの有無を除いて、同じ利点を有している。
図3の1030は、加温容器20に生体試料収容容器21を収容する前の状態を示しており、図3の1031は、加温容器20に生体試料収容容器21を収容した後の状態を示している。図3の1030に示すように、熱媒体収容容器23には熱媒体25が収容されており、生体試料収容容器21には生体試料24が収容されている。生体試料収容容器21の開口部上には、生体試料収容容器21の熱媒体収容容器23内での位置を固定する固定部22が設けられている。
図4の1040は、加温容器30に生体試料収容容器31を格納する前の状態を示しており、図4の1041は、加温容器30に生体試料収容容器31を格納した後の状態を示している。図4の1040に示すように、熱媒体収容容器33には熱媒体35が収容されており、生体試料収容容器31には生体試料34が収容されている。加温容器30は、ドーナツ状の固定部36を備えた点において加温容器20と異なっている。
図5の1050は、加温容器40に生体試料収容容器41を格納する前の状態を示しており、図5の1051は、加温容器40に生体試料収容容器41を格納した後の状態を示している。図5の1050に示すように、熱媒体収容容器43には熱媒体45が収容されており、生体試料収容容器41には生体試料44が収容されて蓋42におり封止されている。加温容器40は、熱媒体収容容器43内に当接部材48を備えた点において加温容器20と異なっている。
図6の1060は、加温容器50に生体試料収容容器51を格納する前の状態を示しており、図6の1061は、加温容器50に生体試料収容容器51を格納した後の状態を示している。図6の1060に示すように、熱媒体収容容器53には熱媒体55が収容されており、生体試料収容容器51には生体試料54が収容されている。加温容器50は、カバー52を備えた点において加温容器20と異なっている。
図7の1070は、加温容器60に生体試料収容容器61を格納する前の状態を示しており、図7の1071は、加温容器60に生体試料収容容器61を格納した後の状態を示している。図7の1070に示すように、熱媒体収容容器63には熱媒体65が収容されており、生体試料収容容器61には生体試料64が収容されている。加温容器60は、位置規定部68を備えた点において加温容器20と異なっている。
本発明の一態様に係る生体試料を加温するためのキットは、熱媒体及び生体試料収容容器を収容するための熱媒体収容容器を備えている。前記熱媒体収容容器は、前記生体試料収容容器の位置を規定するための位置規定部を有しており、前記生体試料収容容器は生体試料を収容するためのものである。
本発明の好ましい一態様に係る生体試料を加温するためのキットは、熱媒体を収容するための加温容器と、生体試料を収容するためのものであり、前記加温容器に収容可能な生体試料収容容器と、を備えている。生体試料を加温するためのキットは、さらに、生体試料を洗浄するための洗浄液を備えていてもよく、また、生体試料を加温するためのキットは、洗浄した生体試料を保管する保管液を備えていてもよい。
本発明の一態様に係る加温方法における加温条件を模擬的な環境において評価した。説明の便宜上、本発明の加温方法を「Tube in Tube法」と称する。模擬的な環境として、細胞ではなく、1mLの凍結保存用溶液を凍結した凍結試料を生体試料として用いて、加温条件を評価した。凍結保存用溶液の組成は、90%(v/v)STK(登録商標)2(サイトカインフリー)+10%(v/v)DMSO(Wako 031-24051)である。加温容器として、位置規定部を有さない遠沈管を用いた。1mLの凍結保存用溶液を生体試料収容容器としての凍結ベッセル(クライオジェニックバイアル:WHEATON,Cat.W985865)中に収容し、-80℃のディープフリーザー下で凍結した。凍結ベッセルを、表1に示す温度及び量の熱媒体が収容された遠沈管(50mL 遠沈管:住友ベークライト株式会社Cat.MS-56501)に格納し、それぞれ表1に示す方法で熱媒体を循環させ、凍結ベッセル内の生体試料を加温して解凍した。
位置規定部を有する加温容器を用いて、本発明の一態様に係る加温方法を模擬的な環境において評価した。まず、位置規定部を有する加温容器を以下に示すように準備した。図10に熱媒体収容容器及び生体試料収容容器の一例を示す。図10に示すように、熱媒体収容容器となるチューブ91と、位置規定部を構成するための樹脂膜93と、蓋94と、生体試料収容容器として凍結ベッセル92を用いた。なお、チューブ91として、50mLの遠沈管を用いた。
in Tube法により生体試料を加温して解凍したところ、解凍時間にバラつきが生じた(170秒~220秒)。この解凍時間は、表1の条件4の解凍時間の1.1倍~1.4倍に相当し、解凍時間が長くなった。また、全体で1分間程度のバラつきがあること自体も問題であった。このように、解凍特性の再現性に課題があることが分かった。そこで、さらに検討を重ねた結果、樹脂膜93と凍結ベッセル92との間に空気層がある場合や、樹脂膜93にたるみがある場合に解凍時間が長くなることが分かった。
前十字靭帯再建術などで余剰となった滑膜組織が、適切な倫理審査を経て患者同意の下に、医療機関から提供された。提供された滑膜組織の湿重量を測定し、ゲンタマイシン(日医工)含有DMEM(SIGMA) 10mLが入った遠沈管に移し、洗浄した。さらに、新たなゲンタマイシン含有DMEM 10mLが入った遠沈管に移しもう一度、洗浄した後、容器上に取り出した。洗浄後の滑膜組織は滅菌済ハサミを使用して5mm以下の組織片となるよう、容器上で細切し、さらゲンタマイシン含有DMEMで懸濁し、続いて滑膜組織片を50mL遠沈管中に回収した。その後、室温、1500rpm、5分間、遠心分離を行い、上清を除去した。
増殖したMSCをPBS(Phosphate buffered saline、カルシウム及びマグネシウムフリー、PBS(-)、株式会社細胞科学研究所)で1回洗浄した後、細胞剥離剤TrypLE Select CTS(Thermo Fisher
Scientific Inc.)で剥離、回収して洗浄培地(DMEM, Sigma)にて懸濁した後、遠心分離用のチューブに移し、室温で5分間、1500rpmにて遠心し、ペレットダウンした後に上清を除去した。
増殖したMSC(3継代目:P3)をPBS(-)で1回洗浄した後、細胞剥離剤TrypLE Select CTSで細胞をディッシュから剥離、回収してDMEMにて懸濁した後、遠心分離用のチューブに移し、室温で5分間1500rpmにて遠心分離し、ペレットダウンした。ペレットダウンされたシングルセル状態の細胞を再び洗浄培地にて懸濁し、トリパンブルー染色により細胞数をカウントした。
MSC(5継代目:P5)をPBS(-)で1回洗浄した後、細胞剥離剤TrypLE Select CTSで剥離、回収してDMEMにて懸濁した後、遠心分離用のチューブに移す。室温で5分間、1500rpmで遠心分離し、ペレットダウンし上清を除去した細胞をDMEMにて懸濁する。再び室温で5分間、1500rpmで遠心分離し、ペレットダウンし、上清を除去した細胞をDMEMにて懸濁した後、セルストレイナーを通し細胞を均一化する。さらに室温で5分間、1500rpmで遠心分離し、ペレットダウンし、上清を除去した細胞をSTK(登録商標)2により懸濁し、トリパンブルー染色により細胞数をカウントした。
登録商標)1の細胞塊を得た。
6well plate gMSC(登録商標)1をPBS(-)で2回洗浄した後、280U/ml コラゲナーゼ/50% TrypLE select溶液 1mL入った15mL遠沈管に移し、37℃で消化を行った。10分毎に10回転倒混和を行い、完全に塊が消えるまで消化し、トリパンブルー染色により総細胞数と生細胞数を測定した。280U/ml コラゲナーゼ/50% TrypLE select溶液の組成は以下の通り:コラゲナーゼ:Worthington biochemical corporation, Cat. LS004154 Lot :44D14883,TrypLE select: Thermo Fisher Scientific Inc., Cat.A12859-01 Lot:1905779,DMEM:Sigma, Cat. D6046, Lot: RNBG0276。
6well plate gMSC(登録商標)1をPBS(-)で2回洗浄した後、凍結保存用溶液1mLの入った2mL クライオバイアルに移し、-80℃で自然凍結を行った。凍結保存用溶液の組成は、90%(v/v)STK(登録商標)2(サイトカインフリー)+10%(v/v)DMSO(Wako 031-24051)である。
-80℃で1週間保存した後、フリーザーから凍結バイアルを取り出し、後述する加温実験に供した。加温による解凍後のgMSC(登録商標)1をDMEMにより洗浄し、280U/ml コラゲナーゼ/50% TrypLE select溶液により消化を行い、トリパンブルー染色により総細胞数と生細胞数を測定した。
上記2-5でシングルセル化されたgMSC(登録商標)1をDMEMで2回洗浄後、6well plateに5,000cells/cm2で再播種を行い、5日目の総細胞数及び生細胞数を測定した。
Tube in Tube法(非接触ではない)の効果を評価するために、同一方法で作製・凍結保存したgMSC(登録商標)1において、加温方法による細胞性能を比較した。本実施例においては加温方法として、「Tube in Tube法(以下の「解凍法B」参照)、37℃ウォーターバス法(以下の「解凍法A」参照)、及び37℃ヒートブロック法(以下の「解凍法C」参照)による解凍を行った。なお、37℃ヒートブロック法とは、ストレックス社製のヒートブロック装置(型番SY-1)を用い、37℃に設定して解凍する方法である。なお、gMSC(登録商標)1は3次元細胞塊であるため、細胞数を測定するためには上記2-5に記載のように細胞塊をシングルセルサスペンジョンにまで消化・分解する必要がある。このため、「凍結前の状態の細胞」を意味する対照群として、凍結操作を行わずに直ちに上記2-5に従って細胞数をカウントした群(以下の「非凍結群」参照)を別途用意した。実験の詳細を以下に示す。
上記2-1に基づいて樹立した3株(株が異なればドナーが異なる)のMSC(株1、株2、株3)を、上記2-2~2-4の方法に従ってgMSC(登録商標)1に加工した。各株由来のgMSC(登録商標)1を、それぞれ、非凍結群、解凍法A群、解凍法B群、解凍法C群の4群(したがって3株×4群の合計12群が存在する)に群わけした。それぞれの株において、サンプルサイズは、非凍結群(N=3)、解凍法A群(N=3)、解凍法B群(N=3)、解凍法C群(N=3)であった。
解凍法A~C群のgMSC(登録商標)1は、いずれも上記2-6に従って凍結保存した後、各群について以下の加温方法によって解凍した:
・解凍法A群:37℃のウォーターバスを用いて2.5分間解凍
・解凍法B群:Tube in Tube法により、22℃(室温)、約60rpmで3分間転倒混和を行い解凍
・解凍法C群:37℃に設定したヒートブロックで4.5分間解凍。
株1における解凍結果を図16に示し、株2における解凍結果を図17に示し、株3における解凍結果を図18に示した。図16~18に示す棒グラフの項目軸は、左から「非凍結群」、「解凍法A群」、「解凍法B群」、「解凍法C群」に対応している。また、それぞれの項目において、左側の白いバーは「gMSC(登録商標)1の一個(1drop)当たりの総細胞数」を示し、右側の黒いバーは「gMSC(登録商標)1の一個当たりの生細胞数」を示している。また、それぞれのバーにおけるエラーバーは、標準偏差を表している。
一般に、凍結・解凍直後の細胞は一時的に増殖能が低下することが知られている。そこで、上記の凍結・解凍を経たgMSC(登録商標)1から回収した細胞において、解凍直後の1継代の増殖能(立ち上がり)を比較した。具体的には、上記の凍結・解凍及び2-5に従ってシングルセルサスペンジョンにまで消化・分解した上記解凍法A~C群のそれぞれの細胞を、6wellプレート上に再播種し、一定期間単層培養した後の総細胞数及び生細胞数を比較した。
非接触Tube in Tube法の効果を評価するために、同一方法で作製・凍結保存したgMSC(登録商標)1に対する加温方法による細胞性能を比較した。本実施例においては、加温方法として、「非接触Tube in Tube法(以下の「解凍法D」参照)、37℃ウォーターバス法(以下の「解凍法A」参照)よる解凍をおこなった。
上記2-1に基づいて樹立した1株のMSCを、上記3-1と同様に、上記2-2~2-4の方法に従ってgMSC(登録商標)1に加工した。これらのgMSC(登録商標)1を、それぞれ、非凍結群、解凍法A群、解凍法D群の3群に群わけした。サンプルサイズは、非凍結群(N=3)、解凍法A群(N=3)、解凍法D群(N=3)であった。
解凍法A又はD群に割り当てたgMSC(登録商標)1は、いずれも上記2-6に従って凍結した後、各群について以下の加温方法によって解凍した:
・解凍法A群:37℃のウォーターバスを用いて2.5分間解凍
・解凍法D群:非接触Tube in Tube法により、22℃(室温)、約60rpmで3分間転倒混和を行い解凍。
図22は解凍後の総細胞数及び生細胞数を示している。図22の凡例は、図16~21と概ね同様であるが、プロットエリア中の二本の横線のうち、実線は解凍法D群の総細胞数(平均値)を示し、点線は解凍法D群の生細胞数(平均値)を示している。図22に示した結果から、非接触Tube in Tube法(解凍法D群)で解凍した場合、37℃ウォーターバス法(解凍法A群)と比較して、総細胞数及び生細胞数のいずれも同等、あるいはそれ以上であることが分かった。
一般に、凍結・解凍直後の細胞は一時的に増殖能が低下することが知られている。そこで、上記の凍結・解凍を経たgMSC(登録商標)1から回収した細胞を1継代培養した際の増殖能(立ち上がり)を比較した。具体的には、上記の凍結・解凍及び2-5に従ってシングルセルサスペンジョンにまで消化・分解した上記解凍法A群及びD群の細胞それぞれを、6wellプレート上に再播種し、一定期間単層培養した後の総細胞数及び生細胞数を比較した。
この項目では、gMSC(登録商標)1の代わりに、均質な細胞集団(ヒト皮膚線維芽細胞及びヒト脂肪由来MSC)を用いて、解凍法Dの有効性をさらに評価した結果を説明する。
適切な倫理審査を経て患者同意の下に、関係医療機関から提供された脂肪組織の湿重量を測定し、10μg/mLゲンタマイシン(日医工株式会社)を含有するDMEM(SIGMA、D6046)10mLが入った遠沈管に移し、洗浄した。さらに、新たなゲンタマイシン含有DMEM 10mLが入った遠沈管に移し、もう一度洗浄した後、容器上に取り出した。洗浄後の脂肪組織は滅菌済ハサミを使用して5mm以下の組織片となるよう、細切し、0.4%コラゲナーゼ溶液(Worthington Biochemical Corporation)により37℃で1.5時間、消化を行った後、100μmメッシュ(Greiner Bio-One International GmbH)でろ過し、新たな50mL遠沈管に回収した。遠心分離し、上清を除去し、細胞をSTK(登録商標)1(初代MSC樹立用無血清培地、株式会社DSファーマバイオメディカル)に懸濁した。細胞懸濁液の一部を0.4%トリパンブルー(Thermo Fisher Scientific Inc.)で染色し、生細胞数及び死細胞数をカウントした。5000cells/cm2(培養皿表面積)の播種密度に細胞懸濁液をSTK(登録商標)1で希釈し、150cm2dish(住友ベークライト株式会社)上に播種し、CO2濃度5%、37℃で14日間培養を行った(5日目、8日目、11日目に培地交換を実施した)。項目2-2および2-3の記載と同様の操作にてヒト脂肪由来MSC(A31、P4、以下「ADMSC」と記載する)を培養した。
前述のADMSCはSTK(登録商標)2培地で、株式会社ロンザジャパンから入手した、ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF、P14、以下「NHDF」と記載する)は10%FBSを含むDMEM培地で、それぞれCO2濃度5%、37℃で培養した。回収(剥離及び洗浄)後の細胞懸濁液を、1mLの細胞保存用溶液を入れた2mLクライオバイアルに移した。ADMSC用の細胞保存用溶液は、CELLBANKER2(日本全薬工業株式会社)であり、NHDF用の細胞保存用溶液は、CellBanker1(日本全薬工業株式会社)である。各細胞懸濁液を-80℃で凍結させ、凍結から1週間後に、解凍法Aによって解凍した細胞集団である解凍法A群(N=3)及び解凍法Dによって解凍した細胞集団である解凍法D群(N=3)を得た。「解凍法A」及び「解凍法D」の詳細は、項目3-1に記載の通りである。
図24は、解凍後の総細胞数及び生細胞数を、NHDF(上パネル)及びADMSC(下パネル)のそれぞれについて示している。図24に示す通り、解凍法D群は、解凍法A群と比べて、総細胞数及び生細胞数の低下をほとんど示さなかった。
分取した残りの各細胞懸濁液に含まれている細胞の増殖能を評価した。各細胞懸濁液にDMEMを加え、細胞を洗浄した後に、細胞を遠心分離した。遠心分離されたNHDF(解凍法A群及び解凍法D群の両方)は、10%FBSを含むDMEM培地で再懸濁した。遠心分離されたADMSC(解凍法A群及び解凍法D群の両方)は、STK(登録商標)2培地で再懸濁した。解凍法A群及び解凍法D群の再懸濁したNHDF及びADMSCを、5×104細胞/ウェルで6ウェルプレートに播種した。NHDFを播種した6ウェルプレートを、5%CO2、37℃の培養条件に5日間おいた。ADMSCを播種した6ウェルプレートを、5%CO2、37℃の培養条件に7日間おいた。
2 熱媒体収容容器
3 開口部(入れ口)
4 熱媒体
5 生体試料収容容器
11 樹脂膜(位置規定部)
Claims (18)
- 熱媒体が収容された熱媒体収容容器に、生体試料が収容された生体試料収容容器を収容する収容工程と、
前記熱媒体が前記熱媒体収容容器の外に漏れないように前記熱媒体収容容器の前記熱媒体の入れ口を閉鎖する閉鎖工程と、
前記熱媒体の入れ口が閉鎖した前記熱媒体収容容器内の前記熱媒体を運動させる運動工程と、を含み、
前記閉鎖工程が、前記収容工程後に実施され、前記運動工程は、前記熱媒体収容容器を運動させることによって実施される、生体試料の加温方法。 - 前記運動工程は、前記熱媒体収容容器を手で把持して振ることにより行う、請求項1に記載の生体試料の加温方法。
- 熱媒体が収容された熱媒体収容容器に、生体試料が収容された生体試料収容容器を収容する収容工程と、
前記熱媒体が前記熱媒体収容容器の外に漏れないように前記熱媒体収容容器の前記熱媒体の入れ口を閉鎖する閉鎖工程と、
前記熱媒体の入れ口が閉鎖した前記熱媒体収容容器内の前記熱媒体を運動させる運動工程と、を含み、
前記運動工程は、前記熱媒体収容容器を手で把持して振ることにより行う、生体試料の加温方法。 - 前記運動工程を、前記熱媒体が20℃以上、40℃以下の状態で行う、請求項1から3のいずれか1項に記載の生体試料の加温方法。
- 前記運動工程を、前記熱媒体が20℃以上、27℃以下の状態で行う、請求項4に記載の生体試料の加温方法。
- 前記生体試料が、細胞、細胞塊、組織及び組織片からなる群より選ばれる少なくとも一つである、請求項1から5のいずれか1項に記載の生体試料の加温方法。
- 前記熱媒体が、水、等張液、及び抗菌剤を溶解した水から成る群より選ばれる少なくとも1種である、請求項1から6のいずれか1項に記載の生体試料の加温方法。
- 請求項1から7のいずれか1項に記載の生体試料の加温方法において用いる生体試料の加温容器であって、
生体試料が収容される生体試料収容容器を収容し、かつ熱媒体が内部に収容される、熱媒体収容容器と、
当該熱媒体収容容器に設けられた、前記生体試料収容容器の位置を規定するための位置規定部とを備え、
前記熱媒体収容容器は、前記熱媒体収容容器を運動させることによって、前記熱媒体を運動させるようになっている、生体試料の加温容器。 - 前記位置規定部は、当該熱媒体収容容器内に設けられている、請求項8に記載の生体試料の加温容器。
- 当該熱媒体収容容器は袋状であり、前記位置規定部は、当該熱媒体収容容器の外表面であり、袋状の前記熱媒体収容容器を折りたたんで前記生体試料収容容器を挟むことで、生体試料収容容器を収容し、かつ、位置を規定するものである、請求項8に記載の生体試料の加温容器。
- 前記位置規定部が樹脂膜である、請求項8に記載の生体試料の加温容器。
- 前記熱媒体収容容器は、一端が閉鎖され、他端が開口している筒状構造であり、開口している当該他端を閉鎖するための蓋をさらに備えた、請求項8又は11に記載の生体試料の加温容器。
- 前記筒状構造の長さ方向に垂直な断面の直径が5mm以上、200mm以下である、請求項12に記載の生体試料の加温容器。
- 内部に発熱体を有さない、請求項8から13のいずれか1項に記載の生体試料の加温容器。
- 請求項1から7のいずれか1項に記載の生体試料の加温方法において用いる生体試料を加温するためのキットであって、
熱媒体及び生体試料収容容器を収容するための熱媒体収容容器を備え、
前記熱媒体収容容器は、前記生体試料収容容器の位置を規定するための位置規定部を有しており、前記生体試料収容容器は生体試料を収容するためのものであり、
前記熱媒体収容容器は、前記熱媒体収容容器を運動させることによって、前記熱媒体を運動させるようになっている、生体試料を加温するためのキット。 - 前記生体試料収容容器には、低温保存された生体試料が予め収容されており、
前記生体試料の低温状態を維持するための保冷手段をさらに備えた、請求項15に記載の生体試料を加温するためのキット。 - 生体試料を洗浄するための洗浄液をさらに備えた、請求項15又は16に記載の生体試料を加温するためのキット。
- 前記生体試料収容容器には、生体試料が予め収容されており、
前記生体試料収容容器は、密封された容器内に滅菌されて収容されている、請求項15から17のいずれか1項に記載の生体試料を加温するためのキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018123502 | 2018-06-28 | ||
JP2018123502 | 2018-06-28 | ||
PCT/JP2019/025962 WO2020004655A1 (ja) | 2018-06-28 | 2019-06-28 | 生体試料の加温方法、生体試料の加温容器、及び生体試料を加温するためのキット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2020004655A1 JPWO2020004655A1 (ja) | 2021-07-01 |
JP7064251B2 true JP7064251B2 (ja) | 2022-05-10 |
Family
ID=68985442
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020527702A Active JP7064251B2 (ja) | 2018-06-28 | 2019-06-28 | 生体試料の加温方法、生体試料の加温容器、及び生体試料を加温するためのキット |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210261902A1 (ja) |
JP (1) | JP7064251B2 (ja) |
AU (1) | AU2019293831B2 (ja) |
WO (1) | WO2020004655A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI750907B (zh) * | 2020-11-19 | 2021-12-21 | 廣普生物科技股份有限公司 | 微量管組件及微量管操作系統 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013116068A (ja) | 2011-12-02 | 2013-06-13 | Hamamatsu Photonics Kk | 解凍器 |
JP2015536137A (ja) | 2012-10-31 | 2015-12-21 | プルリステム リミテッド | 生物由来材料を解凍するための方法および装置 |
JP2017538447A (ja) | 2014-12-04 | 2017-12-28 | アシンプトート リミテッド | 解凍方法および装置 |
JP2018512274A (ja) | 2015-03-27 | 2018-05-17 | リチャージャブル バッテリー コーポレイション | 生体試料を温めるための自己加熱装置 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH056795Y2 (ja) * | 1985-10-09 | 1993-02-22 | ||
JP3070134B2 (ja) * | 1991-04-26 | 2000-07-24 | 株式会社島津製作所 | インキュベーション装置 |
JPH09121839A (ja) * | 1995-10-27 | 1997-05-13 | Sanyo Electric Co Ltd | 培養庫 |
JP2009148221A (ja) * | 2007-12-21 | 2009-07-09 | National Agriculture & Food Research Organization | 生殖細胞凍結保存容器及び生殖細胞凍結保存方法 |
US20140251584A1 (en) * | 2013-03-11 | 2014-09-11 | Air Bath Technologies, LLC | System For Precision Temperature Control of Thermal Bead Baths |
-
2019
- 2019-06-28 WO PCT/JP2019/025962 patent/WO2020004655A1/ja active Application Filing
- 2019-06-28 US US17/254,108 patent/US20210261902A1/en active Pending
- 2019-06-28 AU AU2019293831A patent/AU2019293831B2/en active Active
- 2019-06-28 JP JP2020527702A patent/JP7064251B2/ja active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013116068A (ja) | 2011-12-02 | 2013-06-13 | Hamamatsu Photonics Kk | 解凍器 |
JP2015536137A (ja) | 2012-10-31 | 2015-12-21 | プルリステム リミテッド | 生物由来材料を解凍するための方法および装置 |
JP2017538447A (ja) | 2014-12-04 | 2017-12-28 | アシンプトート リミテッド | 解凍方法および装置 |
JP2018512274A (ja) | 2015-03-27 | 2018-05-17 | リチャージャブル バッテリー コーポレイション | 生体試料を温めるための自己加熱装置 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPWO2020004655A1 (ja) | 2021-07-01 |
AU2019293831B2 (en) | 2021-12-02 |
AU2019293831A1 (en) | 2021-01-21 |
WO2020004655A1 (ja) | 2020-01-02 |
US20210261902A1 (en) | 2021-08-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Meneghel et al. | Cryopreservation as a key element in the successful delivery of cell-based therapies—a review | |
Thirumala et al. | Clinical grade adult stem cell banking | |
Massie et al. | GMP cryopreservation of large volumes of cells for regenerative medicine: active control of the freezing process | |
US7232681B2 (en) | Personal cell sampling kit | |
WO2018023829A1 (zh) | 一种脐带、脐血、胎盘采集用套装 | |
JP7064251B2 (ja) | 生体試料の加温方法、生体試料の加温容器、及び生体試料を加温するためのキット | |
US20070190518A1 (en) | Hypothermic tooth transport system | |
US20150313211A1 (en) | A Method of Vitrification | |
WO2009076469A1 (en) | Amniopunch and uses thereof | |
CN205774560U (zh) | 一种细胞转运储存箱 | |
RU2624214C1 (ru) | Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток | |
CN210929356U (zh) | 一种封闭式卵巢组织冷冻装置 | |
Yao et al. | Hydrogel microencapsulation enhances cryopreservation of red blood cells with trehalose | |
Sandell et al. | Mammalian cell culture | |
Morris et al. | Cryopreservation of murine embryos, human spermatozoa and embryonic stem cells using a liquid nitrogen-free, controlled rate freezer | |
Fuller et al. | Cryopreservation of mammalian embryos | |
US20160015024A1 (en) | Method for Preparing Adipose Tissue | |
CN112538416A (zh) | 快速分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒及使用方法 | |
Elmoazzen et al. | Cord blood clinical processing, cryopreservation, and storage | |
Gook | Chapter 12 human ovarian tissue slow freezing | |
Rosell-Valle et al. | Evaluation of the effectiveness of a new cryopreservation system based on a two-compartment vial for the cryopreservation of cell therapy products | |
Todorov et al. | Three live births after human embryo vitrification with the use of aluminum oxide as an intermediate cooling agent: a case report | |
JP2012034667A (ja) | 細胞類の凍結装置 | |
CN207462352U (zh) | 一种用于体温计的消毒存储盒 | |
CN205470694U (zh) | 一种用于兽医临床样品采集的多功能采样箱 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20201211 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210120 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211214 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220210 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220405 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220415 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7064251 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |