JP7057746B2 - Low glutamate tomatoes - Google Patents
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Description
本発明は、果実中のグルタミン酸含有量が低減したトマト植物（ソラナム・リコペルシカム）に関する。 The present invention relates to a tomato plant (Solanum lycopersicum) having a reduced glutamic acid content in fruits.
トマト果実はグルタミン酸を含有しており、グルタミン酸は一般的にうま味に寄与することが知られている。うま味は、調味料等の加工食品ではその価値を高める効果がある一方で、飲料やデザート類、また生の状態で食べる際には、甘味をマスキングする等のネガティブな味覚である。そのため、グルタミン酸含有量が低減したトマト果実の需要がある。 Tomato fruits contain glutamic acid, and it is generally known that glutamic acid contributes to umami. Umami has the effect of increasing its value in processed foods such as seasonings, but it is a negative taste such as masking sweetness when eaten in beverages, desserts, or in the raw state. Therefore, there is a demand for tomato fruits with reduced glutamic acid content.
これまでに、トマト果実中のグルタミン酸含有量を積極的に低減させる技術については特に知られていなかったが、トマト等の植物体においてＧＡＢＡを高含有させるため、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）をコードするポリヌクレオチドを用いて該酵素活性を増強させた、形質転換植物が開示されている（特許文献１）。また、人為的にグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の発現を抑制した形質転換体を作出ところ、葉や未熟果では変化が見られなかったが、熟した果実ではグルタミン酸含有量が低下することも報告されている（非特許文献１）。 Until now, a technique for positively reducing the glutamic acid content in tomato fruits has not been particularly known, but glutamic acid decarboxylase (GAD) is encoded in order to increase the GABA content in plants such as tomatoes. A transformed plant in which the enzyme activity is enhanced by using a polynucleotide is disclosed (Patent Document 1). In addition, when a transformant that artificially suppressed the expression of glutamate dehydrogenase (GDH) was produced, no change was observed in leaves and immature fruits, but it was also reported that the glutamate content decreased in ripe fruits. (Non-Patent Document 1).
本発明は、その果実のグルタミン酸含有量が低減したソラナム・リコペルシカム及びその製造方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide Soranum lycopercicam having a reduced glutamic acid content in its fruit and a method for producing the same.
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究の末、ソラナム・ハブロカイテス（Solanum habrochaites）ＬＡ１７７７系統の第４染色体上の特定の遺伝子領域に、果実中のグルタミン酸含有量を低減させる原因遺伝子が存在することを見出した。そして、該原因遺伝子を第４染色体上にホモ接合型で含むソラナム・リコペルシカム（Solanum lycopersicum）の果実においては、該原因遺伝子を含まない又はヘテロ接合型で含むソラナム・リコペルシカムの果実に比べて、グルタミン酸含有量が有意に少ないことに想到し、本発明を完成させた。 After diligent research to solve the above problems, the present inventors have found a causative gene that reduces the glutamate content in fruits in a specific gene region on chromosome 4 of the Solanum habrochaites LA1777 strain. Found to exist. And, in the fruit of Solanum lycopersicum containing the causative gene in a homozygous form on chromosome 4, glutamate is compared with the fruit of Solanum lycopersicum containing the causative gene in a heterozygous form. The present invention was completed by arriving at the fact that the content was significantly low.
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ソラナム・リコペルシカムであって、
第４染色体上にグルタミン酸代謝関連遺伝子をホモ接合型で含み、
前記グルタミン代謝関連遺伝子は、ソラナム・ハブロカイテス（Solanum habrochaites）ＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ～６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に含まれるものである、ソラナム・リコペルシカム。
［２］前記グルタミン代謝関連遺伝子が、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ～６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれるものである、[１]に記載のソラナム・リコペルシカム。
［３］ソラナム・リコペルシカムであって、
配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号２１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲによって、第４染色体上にホモ接合型で存在するグルタミン酸代謝関連遺伝子を含む遺伝子領域が検出される、ソラナム・リコペルシカム。
［４］配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲによって、第４染色体上にホモ接合型で存在するグルタミン酸代謝関連遺伝子が検出される、［３］に記載のソラナム・リコペルシカム。
［５］その果実のグルタミン酸含有量が、野生型又は非改変系統のソラナム・リコペルシカムと比較して低い、［１］～［４］のいずれかに記載のソラナム・リコペルシカム。
［６］ソラナム・リコペルシカムの製造方法であって、
第４染色体上にグルタミン酸代謝関連遺伝子を含む第一の親品種と、任意の第二の親品種とを交配してＦ１世代を得る工程、
得られたＦ１世代又はその後代において、第４染色体上に前記グルタミン酸代謝関連遺伝子をホモ接合型で含むソラナム・リコペルシカムを選抜する工程、を含み、
前記グルタミン代謝関連遺伝子は、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ～６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に含まれるものである、製造方法。
［７］前記選抜工程は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号２１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより行われる、［６］に記載の製造方法。
［８］前記グルタミン代謝関連遺伝子が、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ～６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれるものである、［６］に記載の製造方法。
［９］前記選抜工程は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基
配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより行われる、［８］に記載の製造方法。
［１０］製造されるソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸含有量が、野生型又は非改変系統のソラナム・リコペルシカムと比較して低い、［６］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］ソラナム・リコペルシカムを鑑別する方法であって、
ソラナム・リコペルシカムの第４染色体上のグルタミン酸代謝関連遺伝子を含む遺伝子領域を検出する工程を含み、
前記検出工程は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号２１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより行われる、方法。
［１２］前記検出工程が、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより行われる、［１１］に記載の方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] Solanam lycopersicum,
It contains a homozygous gene related to glutamate metabolism on chromosome 4,
The glutamine metabolism-related gene is contained in the gene region of 60,709,841bp to 61,170,581bp on the fourth chromosome of the Solanum habrochaites LA1777 strain, Solanum lycopercicum.
[2] The solanum lycopercicum according to [1], wherein the glutamine metabolism-related gene is contained in the gene region of 60,709,841bp to 61,068,811bp of the fourth chromosome of the Solanum habrokaites LA1777 strain. ..
[3] Solanam lycopersicum,
Primer set containing DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 11 and DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 12, primer set containing DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 13 and DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: A primer set containing a DNA having a base sequence of 15 and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 16, a primer set containing a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 17 and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 18, and a primer set of SEQ ID NO: 19. A primer set containing a DNA having a base sequence and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 20, a primer set containing a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 21 and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 22, or a base of SEQ ID NO: 23. Solanam lycopelsicum, a gene region containing a glutamic acid metabolism-related gene present in a homozygous form on chromosome 4, is detected by PCR using a primer set containing a DNA having a sequence and a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 24. ..
[4] A primer set containing the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 11 and the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 12, the primer set containing the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 13 and the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 14. , A primer set containing the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 15 and the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 16, the primer set containing the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 17 and the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 18, or. PCR using a primer set containing a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 and a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20 detects a homozygous glutamic acid metabolism-related gene on chromosome 4 [3]. ] Soranum Rico Persicum described in.
[5] The solanum lycopercicum according to any one of [1] to [4], wherein the glutamic acid content of the fruit is lower than that of the wild-type or unmodified strain of solanum lycopercicum.
[6] A method for producing Solanam lycopersicum.
A step of mating a first parent cultivar containing a glutamic acid metabolism-related gene on chromosome 4 with an arbitrary second parent cultivar to obtain an F1 generation.
In the obtained F1 generation or its progeny, the step of selecting solanum lycopelsicum containing the glutamic acid metabolism-related gene in a homozygous form on chromosome 4 is included.
The production method, wherein the glutamine metabolism-related gene is contained in the gene region of 60,709,841bp to 61,170,581bp of the fourth chromosome of the Solanam habrokaites LA1777 strain.
[7] The selection step includes a primer set containing a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 11 and a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 12, a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 13, and a base sequence of SEQ ID NO: 14. A primer set containing DNA, a primer set containing a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 15 and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 16, a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 17, and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 18. Primer set containing, primer set containing DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 19 and DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 20, primer containing DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 21 and DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 22 The production method according to [6], which is carried out by PCR using a set or a primer set containing a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 23 and a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 24.
[8] The production method according to [6], wherein the glutamine metabolism-related gene is contained in the gene region of 60,709,841 bp to 61,068, 811 bp of chromosome 4 of the Solanam habrokaites LA1777 strain.
[9] The selection step includes a primer set containing a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 11 and a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 12, a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 13, and a base sequence of SEQ ID NO: 14. A primer set containing DNA, a primer set containing a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 15 and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 16, a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 17, and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 18. The production method according to [8], which is carried out by PCR using a primer set containing the primer set, or a primer set containing a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 19 and a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 20.
[10] The production method according to any one of [6] to [9], wherein the glutamic acid content of the produced Soranum lycopercicum fruit is lower than that of the wild-type or unmodified strain Soranum lycopercicum.
[11] A method for distinguishing Solanam lycopersicum,
Including the step of detecting a gene region containing a glutamic acid metabolism-related gene on chromosome 4 of Solanam lycopersicum, including the step of detecting the gene region.
The detection step includes a primer set containing a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 11 and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 12, a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 13, and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 14. Primer set, primer set containing DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 15 and DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 16, primer set containing DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 17 and DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 18. , A primer set containing the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 19 and the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 20, a primer set containing the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 21 and the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 22, or A method performed by PCR using a primer set containing a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 23 and a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 24.
[12] The detection step includes a primer set containing a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 11 and a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 12, a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 13, and a base sequence of SEQ ID NO: 14. A primer set containing DNA, a primer set containing a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 15 and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 16, a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 17, and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 18. The method according to [11], which is carried out by PCR using a primer set containing the primer set, or a primer set containing a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 19 and a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 20.
本発明によれば、その果実のグルタミン酸含有量が低減したソラナム・リコペルシカム及びその製造方法が提供される。グルタミン酸含有量が低減したトマト果実では、甘味のマスキングが抑制されるため、飲料やデザート等のトマト加工食品又は生食用トマトとして好適である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, Solanum lycopersicum having a reduced glutamic acid content in the fruit and a method for producing the same are provided. Tomato fruits with a reduced glutamic acid content are suitable as processed tomato foods such as beverages and desserts or tomatoes for raw consumption because masking of sweetness is suppressed.
本発明のソラナム・リコペルシカムは、第４染色体上に、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ～６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に含まれるグルタミン酸代謝関連遺伝子をホモ接合型で含む。前記グルタミン酸代謝関連遺伝子は、好ましくはソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ～６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれる。
本発明者らは、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統は、その果実におけるグルタミン酸含有量が小さいという形質を有することに着目し、第４染色体の上記遺伝子領域に１又は複数のグルタミン酸代謝関連遺伝子が存在し得ることに想到した。
The solanum lycopercicam of the present invention is homozygous for a glutamic acid metabolism-related gene contained in the gene region of 60,709,841bp to 61,170,581bp on the fourth chromosome of the Soranum habrokaites LA1777 strain on the fourth chromosome. include. The glutamic acid metabolism-related gene is preferably contained in the gene region of 60,709,841 bp to 61,068, 811 bp on chromosome 4 of the Solanam habrokaites LA1777 strain.
We note that the Soranum habrokaites LA1777 strain has the trait of low glutamate content in its fruits, and one or more glutamate metabolism-related genes may be present in the gene region of chromosome 4. I came up with that.
本明細書において「グルタミン酸代謝関連遺伝子」とは、果実中のグルタミン酸含有量の増減の直接的な又は間接的な原因となる遺伝子をいい、グルタミン酸生合成に関与する遺伝子、グルタミン酸分解に関与する遺伝子等であると考えられる。ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統が上記形質を示すことから、該系統の第４染色体上の上記領域に
含まれるグルタミン酸代謝関連遺伝子では、ソラナム・リコペルシカムの野生型遺伝子と比較して、グルタミン酸生合成促進に関与する遺伝子の活性を欠失又は減弱化する変異、グルタミン酸生合成抑制に関与する遺伝子の活性を増強する変異、グルタミン酸分解促進に関与する遺伝子の活性を増強する変異、グルタミン酸分解促進に関与する遺伝子の活性を欠失又は減弱化する変異等が生じているものと推測される。
以降、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の上記遺伝子領域に含まれる、果実中のグルタミン酸含有量を低減させる原因となるグルタミン酸代謝関連遺伝子を、「ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子」とも記す。
As used herein, the term "glutamic acid metabolism-related gene" refers to a gene that directly or indirectly causes an increase or decrease in the content of glutamate in a fruit, a gene involved in glutamate biosynthesis, and a gene involved in glutamate degradation. And so on. Since the Soranum habrokaites LA1777 strain exhibits the above traits, the glutamic acid metabolism-related gene contained in the above region on the fourth chromosome of the strain is involved in the promotion of glutamic acid biosynthesis as compared with the wild-type gene of solanum lycopelsicum. Mutations that delete or attenuate the activity of genes involved in, mutations that enhance the activity of genes involved in suppressing glutamate biosynthesis, mutations that enhance the activity of genes involved in promoting glutamate degradation, mutations that enhance the activity of genes involved in promoting glutamate degradation It is presumed that a mutation or the like that deletes or attenuates the activity has occurred.
Hereinafter, the glutamic acid metabolism-related gene contained in the above gene region of the 4th chromosome of the Solanum habrokaites LA1777 strain, which is a cause of reducing the glutamic acid content in the fruit, is also referred to as "causative gene derived from Soranum habrokaites LA1777".
なお、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ～６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に、既知のグルタミン代謝関連酵素であるグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）は座上していないことは、本発明者らにより確認されている。 Glutamate decarboxylase (GAD) and glutamic acid dehydrogenase (GDH), which are known glutamate metabolism-related enzymes, are present in the gene regions of 60,709,841bp to 61,170,581bp on the 4th chromosome of the Soranum habrokaites LA1777 strain. It has been confirmed by the present inventors that they are not sitting up.
本発明のソラナム・リコペルシカムにおいて、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子は、ホモ接合型で第４染色体上に含まれる。ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の上記形質は劣勢形質であると考えられることから、ヘテロ接合型ではグルタミン酸含有量が低減した果実が得られない。 In Solanum lycopersicum of the present invention, the causative gene derived from Solanum habrokaites LA1777 is homozygous and is contained on chromosome 4. Since the above trait derived from Solanam habrokaites LA1777 is considered to be an inferior trait, it is not possible to obtain a fruit with a reduced glutamic acid content in the heterozygous type.
また、本発明のソラナム・リコペルシカムにおいて、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子は、前記形質が損なわれない限りにおいて、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７の該遺伝子の塩基配列と９０％以上の同一性を有するものであってもよく、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってもよい。 Further, in the solanum lycopersicum of the present invention, the causative gene derived from solanum habrokaites LA1777 has 90% or more identity with the base sequence of the gene of solanum habrokaites LA1777 as long as the above-mentioned trait is not impaired. It may be present, more preferably 95% or more, and even more preferably 98% or more.
また、本発明のソラナム・リコペルシカムは、第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子を含み、前記形質が損なわれない限りにおいて、第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ～６１,１７０,５８１ｂｐの、又は同６０,７０９,８４１ｂｐ～６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域の一部または全部を含んでもよい。 Further, the solanum lycopercicam of the present invention contains the causative gene derived from solanum habrokaites LA1777 on the fourth chromosome, and as long as the above-mentioned trait is not impaired, the fourth chromosome of the solanum habrokaites LA1777 strain is contained on the fourth chromosome. It may contain a part or all of the gene region of 60,709,841bp to 61,170,581bp, or 60,709,841bp to 61,068,811bp.
本発明のソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸含有量は、野生型又は非改変系統のソラナム・リコペルシカムと比較して低いという特徴を有し、好ましくは野生型又は非改変系統のソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸含有量の５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下である。なお、「非改変」とは第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子をホモ接合で座上させる改変を行っていないことをいう。また、ここでいう果実は赤く熟した状態の果実をいう。
果実中のグルタミン酸含有量は、常法により測定することができ、例えば、後述の実施例のように破砕により得た果汁に対してバイオケミストリーアナライザー（２９００型、ＹＳＩ社製）等を用いて測定することができる。この方法で測定する場合、第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子をホモ接合で有しないソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸濃度は２００ｍｇ％程度であるところ、本発明のソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸濃度は好ましくは１００ｍｇ％以下、より好ましくは６０ｍｇ％以下、さらに好ましくは４０ｍｇ％以下である。
The glutamic acid content of the fruit of the solanum lycopelsicum of the present invention is characterized by being lower than that of the wild-type or unmodified strain of solanum lycopelsicum, preferably the fruit of the wild-type or unmodified strain of solanum lycopelsicum. The glutamic acid content is 50% or less, more preferably 30% or less, still more preferably 20% or less. In addition, "unmodified" means that the causative gene derived from Solanam habrokaites LA1777 is not modified to be homozygously located on chromosome 4. In addition, the fruit here means a fruit in a red and ripe state.
The glutamic acid content in the fruit can be measured by a conventional method. For example, the fruit juice obtained by crushing as in the examples described later is measured using a biochemistry analyzer (type 2900, manufactured by YSI) or the like. can do. When measured by this method, the glutamic acid concentration of the fruit of Soranum lycopersicum which does not have the causative gene derived from Soranum habrokaites LA1777 on the fourth chromosome by homozygosity is about 200 mg%, whereas the fruit of Soranum lycopersicum of the present invention is measured. The glutamic acid concentration of Glutamic acid is preferably 100 mg% or less, more preferably 60 mg% or less, still more preferably 40 mg% or less.
また、本発明のソラナム・リコペルシカムの果実においては、糖質含有量にグルタミン酸含有量が低減する形質の発現が影響しない。 Further, in the fruit of Solanam lycopersicum of the present invention, the expression of the trait that reduces the glutamic acid content does not affect the sugar content.
本発明のソラナム・リコペルシカムは、遺伝子工学的手法により製造することができる
。遺伝子工学的手法としては、例えば公知のゲノム編集技術が挙げられ、具体的にはＣＲＩＳＰＲ法、ＺＦＮ法、ＴＡＬＥＮ法等によって、ソラナム・リコペルシカムのゲノムが前記原因遺伝子を含むように操作することが挙げられる。また、その他に、以下の製造方法によっても取得することができる。
まず、第一の親品種として第４染色体上に、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ～６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に含まれるグルタミン酸代謝関連遺伝子、好ましくは同６０,７０９,８４１ｂｐ～６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれるグルタミン酸代謝関連遺伝子を含む第一の親品種を用意する。かかる第一の親品種としては、ソラナム・リコペルシカムを好ましく用いることができ、また、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統でもよいし、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統と他の栽培種との交配種でもよい。
第二の親品種としては、任意のものを用意すればよく、好ましくはソラナム・リコペルシカムを用いる。また、第二の親品種は、前記遺伝子又は遺伝子領域を含まないものであってよい。
The Solanam lycopersicum of the present invention can be produced by a genetic engineering method. Examples of the genetic engineering method include known genome editing techniques. Specifically, the genome of Solanam lycopercicum is manipulated to contain the causative gene by the CRISPR method, ZFN method, TALEN method, or the like. Will be. In addition, it can also be obtained by the following manufacturing method.
First, as the first parent cultivar, a glutamic acid metabolism-related gene contained in the gene region of 60,709,841bp to 61,170,581bp of the 4th chromosome of the Solanam habrokaites LA1777 strain, preferably 60 on the 4th chromosome. , 709,841bp to 61,068,811bp, the first parent cultivar containing the glutamic acid metabolism-related gene contained in the gene region is prepared. As the first parent cultivar, Solanum lycopersicum can be preferably used, and Solanum habrokaites LA1777 strain may be used, or Solanum habrokaites LA1777 strain may be a hybrid of other cultivars.
As the second parent variety, any one may be prepared, and Solanam lycopercicum is preferably used. Further, the second parent cultivar may be one that does not contain the gene or the gene region.
そして、第一の親品種と第二の親品種とを交配してＦ１世代を得る工程、得られたＦ１世代又はその後代において、第４染色体上に、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ～６１,１７０,５８１ｂｐの遺伝子領域に含まれるグルタミン酸代謝関連遺伝子、好ましくは同６０,７０９,８４１ｂｐ～６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれるグルタミン酸代謝関連遺伝子をホモ接合型で含むソラナム・リコペルシカムを選抜する工程、を行うことにより、果実のグルタミン酸含有量が低減したソラナム・リコペルシカムを製造することができる。得られたＦ１世代の後代は、Ｆ１世代を自殖させてＦ２世代を得る工程、Ｆ１世代と第一の親品種又は第二の親品種とを戻し交配（バッククロス）する工程、又はＦ１世代と任意のソラナム・リコペルシカムとを交配する工程等によって取得することができる。また、本製造方法において、これらの後代を得る工程及び選抜する工程は複数回繰り返してもよい。 Then, in the step of crossing the first parent cultivar and the second parent cultivar to obtain the F1 generation, in the obtained F1 generation or its progeny, on the fourth chromosome, on the fourth chromosome of the Soranum habrokaites LA1777 strain. A homozygous type of a glutamic acid metabolism-related gene contained in the gene region of 60,709,841bp to 61,170,581bp, preferably a glutamic acid metabolism-related gene contained in the gene region of 60,709,841bp to 61,068,811bp. By carrying out the step of selecting the solanum lycopercicam contained in the above, it is possible to produce the solanum lycopercicam having a reduced glutamic acid content in the fruit. The obtained progeny of the F1 generation is a step of self-fertilizing the F1 generation to obtain the F2 generation, a step of returning the F1 generation to the first parent cultivar or the second parent cultivar (backcrossing), or the F1 generation. It can be obtained by a process of mating with any Soranum lycopersicum. Further, in the present production method, the steps of obtaining these progeny and the step of selecting them may be repeated a plurality of times.
所望のソラナム・リコペルシカムを選抜する工程は、第４染色体上のソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統由来の原因遺伝子を含む遺伝子領域を、任意のマーカーで検出することにより行うことができる。
例えば、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０，７４８，３２０ｂｐのマーカーを検出する。配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０，８０９，１２６ｂｐのマーカーを検出する。配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０，８１８，３９４ｂｐのマーカーを検出する。配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０，８２７，００１ｂｐのマーカーを検出する。配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０，８８６，１２２ｂｐのマーカーを検出する。配列番号２１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６１，０６８，８１１ｂｐのマーカーを検出する。配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６１，１２５，３８２ｂｐのマーカーを検出する。
The step of selecting a desired Solanum lycopercicum can be performed by detecting a gene region containing a causative gene derived from the Solanum habrokaites LA1777 strain on chromosome 4 with an arbitrary marker.
For example, the marker of 60,748,320 bp of chromosome 4 of the Soranum habrokaites LA1777 strain is detected by PCR using a primer set containing a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 11 and a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 12. .. The markers 60, 809, 126 bp of chromosome 4 of the Soranum habrokaites LA1777 strain are detected by PCR using a primer set containing the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 and the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14. The markers 60, 818, 394 bp of chromosome 4 of the Soranum habrokaites LA1777 strain are detected by PCR using a primer set containing the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16. The markers 60,827,001bp on chromosome 4 of the Soranum habrokaites LA1777 strain are detected by PCR using a primer set containing the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 and the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18. Markers of 60,886,122 bp on chromosome 4 of the Soranum habrokaites LA1777 strain are detected by PCR using a primer set containing the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 and the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20. The marker of 61,068, 811 bp of chromosome 4 of the Soranum habrokaites LA1777 strain is detected by PCR using a primer set containing the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 and the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22. The markers 61, 125, 382 bp of chromosome 4 of the Soranum habrokaites LA1777 strain are detected by PCR using a primer set containing the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 and the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24.
好ましい態様では、前記選抜する工程は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号２１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲを行うことで行われる。そして、前記プライマーセットにより検出されるマーカーが、第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子及び／又はこれを含む遺伝子領域がホモ接合で存在することを示すソラナム・リコペルシカムを選択する。 In a preferred embodiment, the selection step includes a primer set containing the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 11 and the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 12, the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 13, and the base sequence of SEQ ID NO: 14. It has a primer set containing a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 15, a primer set containing a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 15 and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 16, a DNA having a base sequence of column No. 17, and a base sequence of SEQ ID NO: 18. A primer set containing DNA, a primer set containing a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 19 and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 20, a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 21 and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 22 It is carried out by performing PCR using a primer set containing the primer set, or a primer set containing the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 23 and the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 24. Then, the marker detected by the primer set selects solanum lycopercicam, which indicates that the causative gene derived from Solanum habrokaites LA1777 and / or the gene region containing the causative gene is homozygously present on chromosome 4.
より好ましい態様では、前記選抜する工程は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、又は配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを用いるＰＣＲを行うことで行われる。そして、前記プライマーセットにより検出されるマーカーが、第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子及び／又はこれを含む遺伝子領域がホモ接合で存在することを示すソラナム・リコペルシカムを選択する。 In a more preferred embodiment, the selection step includes a primer set containing the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 11 and the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 12, the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 13, and the base of SEQ ID NO: 14. A primer set containing a DNA having a sequence, a primer set containing a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 15 and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 16, a DNA having a base sequence of sequence No. 17, and a base sequence of SEQ ID NO: 18. This is performed by performing PCR using a primer set containing the DNA having the same, or a primer set containing the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 19 and the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 20. Then, the marker detected by the primer set selects solanum lycopercicam, which indicates that the causative gene derived from Solanum habrokaites LA1777 and / or the gene region containing the causative gene is homozygously present on chromosome 4.
前記選抜する工程において、選択されるソラナム・リコペルシカムにおいて検出される、第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７由来の原因遺伝子がホモ接合で存在することを示すマーカーは、１つでもよく、２つ以上でもよい。
好ましくは、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の、６０，７４８，３２０ｂｐのマーカー、６０，８０９，１２６ｂｐのマーカー、６０，８１８，３９４ｂｐのマーカー、６０，８２７，００１ｂｐのマーカー、６０，８８６，１２２ｂｐのマーカー、６１，０６８，８１１ｂｐのマーカー、及び６１，１２５，３８２ｂｐのマーカー、からなる群から選択される１以上のマーカーが検出される。
好ましくは、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の、６０，７４８，３２０ｂｐのマーカー、６０，８０９，１２６ｂｐのマーカー、６０，８１８，３９４ｂｐのマーカー、６０，８２７，００１ｂｐのマーカー、及び６０，８８６，１２２ｂｐのマーカーからなる群から選択される１以上のマーカーが検出される。
In the selection step, one marker or two or more markers indicating that the causative gene derived from Solanum habrokaites LA1777 is homozygously present on chromosome 4 detected in the selected Solanum lycopersicum may be present. But it may be.
Preferably, a marker of 60,748,320 bp, a marker of 60,809,126 bp, a marker of 60,818,394 bp, a marker of 60,827,001 bp, 60,886, on chromosome 4 of the Soranum habrokaites LA1777 strain. One or more markers selected from the group consisting of 122 bp markers, 61,068, 811 bp markers, and 61, 125, 382 bp markers are detected.
Preferably, a marker of 60,748,320 bp, a marker of 60,809,126 bp, a marker of 60,818,394 bp, a marker of 60,827,001 bp, and a marker of 60,886 of the 4th chromosome of the Soranum habrokaites LA1777 strain. , 122 bp One or more markers selected from the group consisting of markers are detected.
マーカーの検出により、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統由来の原因遺伝子及び／又はこれを含む遺伝子領域が、第４染色体上にホモ接合型で存在することが示された場合、かかるソラナム・リコペルシカムはグルタミン酸含有量が低減した果実を産生する系統であると判断される。 If marker detection indicates that the causative gene from the Soranum habrokaites LA1777 strain and / or the gene region containing it is homozygous on chromosome 4, such solanum lycopelsicum has a glutamic acid content. Is judged to be a strain that produces reduced fruit.
別の観点では、本発明のソラナム・リコペルシカムは、上記いずれかのプライマーセットを用いるＰＣＲにより、第４染色体上にソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統由来の原因遺伝子及び／又はこれを含む遺伝子領域がホモ接合型で存在することが検出されるソラナム・リコペルシカムであるともいえる。 In another aspect, the solanum lycopercicam of the present invention is homozygous for the causative gene derived from the solanum habrokaites LA1777 strain and / or the gene region containing the same on chromosome 4 by PCR using any of the above primer sets. It can also be said that it is a solanum lycopercicum that is detected to be present in.
また、本発明の別の態様としては、上記いずれかのプライマーセットを用いるＰＣＲを
行うことにより、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統由来の原因遺伝子及び／又はこれを含む遺伝子領域を検出する工程を含む、ソラナム・リコペルシカムを鑑別する方法である。この鑑別方法において、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統由来の原因遺伝子及び／又はこれを含む遺伝子領域が、第４染色体上にホモ接合型で存在することが示された場合、かかるソラナム・リコペルシカムはグルタミン酸含有量が低減した果実を産生する系統であると鑑別される。
Further, as another aspect of the present invention, a step of detecting a causative gene derived from the Soranum habrokaites LA1777 strain and / or a gene region containing the causative gene by performing PCR using any of the above primer sets is included.・ It is a method to distinguish the primer. In this differential method, if the causative gene from the Soranum habrokaites LA1777 strain and / or the gene region containing it is shown to be homozygous on chromosome 4, such solanum lycopelsicum has a glutamic acid content. Is differentiated as a strain that produces reduced fruit.
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
＜材料＞
用いたソラナム・リコペルシカムの系統を表１に示す。ＴＡ１４５９及びＴＡ１５６２は、ＵＣ ＤＡＶＩＳ Ｃ.Ｍ. Ｒｉｃｋ Ｔｏｍａｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＴＧＲＣ http://tgrc.ucdavis.edu）から入手したものであり、野生種ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統と栽培種ソラナム・リコペルシカムＥ６２０３とのイントログレッションラインである。これと、カゴメ株式会社内の圃場で育成された６系統（ＰＫ４７６、ＰＫ９８５、ＰＫ７５０、ＰＫ９９３、ＰＫ８９３、ＰＫ７３６）及びカゴメ株式会社にて収集した１系統（ＴＫ５５３９）からなる群のいずれか１系統とを交雑して、Ｆ１系統（Ｋｃ１４－９７９、Ｋｃ１４－９８０、Ｋｃ１４－９８１、Ｋｃ１４－９８２、Ｋｃ１４－９８３、Ｋｃ１４－９８４、Ｋｃ１４－９８５）を得た。さらに前記Ｆ１系統の自殖により、Ｆ２系統（Ｋｃ１４－９７９－１、Ｋｃ１４－９８０－１、Ｋｃ１４－９８１－１、Ｋｃ１４－９８２－１、Ｋｃ１４－９８３－１、Ｋｃ１４－９８４－１、Ｋｃ１４－９８５－１）を得た。
これらのソラナム・リコペルシカム植物体は、２０１５年～２０１６年に、カゴメ株式会社内の圃場にて、育成・栽培を行った。
<Material>
The strains of Solanum lycopercicum used are shown in Table 1. TA1459 and TA1562 were obtained from UC DAVIS C.M.Rick Tomato Genetics Resource Center (TGRC http://tgrc.ucdavis.edu), and were obtained from the wild Soranum habrokaites LA1777 strain and the cultivated Soranum lycopercicum E6. This is the introduction line of. This and one of the group consisting of 6 lines (PK476, PK985, PK750, PK993, PK893, PK736) cultivated in the field in Kagome Co., Ltd. and 1 line (TK5539) collected by Kagome Co., Ltd. F1 lines (Kc14-979, Kc14-980, Kc14-981, Kc14-982, Kc14-983, Kc14-984, Kc14-985) were obtained by crossing. Furthermore, by self-fertilization of the F1 line, the F2 line (Kc14-979-1, Kc14-980-1, Kc14-981-1, Kc14-982-1, Kc14-983-1, Kc14-984-1, Kc14- 985-1) was obtained.
These Solanam lycopersicum plants were cultivated and cultivated in the fields in Kagome Co., Ltd. from 2015 to 2016.
＜方法＞
（１）ＤＮＡマーカーの作成
公知のデータベース（Ｓｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ https://solgenomics.net/）で公開されている、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統とソラナム・リコペルシカムの塩基配列情報に基づいて、野生種ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統と栽培種ソラナム・リコペルシカムとの間で多型が検出可能なＤＮＡマーカーを作成した。作成したＤＮＡマーカーの配列情報とアニーリング温度を表２に示す。公知のデータベースで公開されている塩基配列情報のマップは、バージョンＳＬ２．５０を用いた。
<Method>
(1) Preparation of DNA marker Based on the nucleotide sequence information of Soranum habrokaites LA1777 and Soranum lycopercicum published in a known database (Sol Genomics Network https://solgenomics.net/), the wild species Soranum. A DNA marker was created in which polymorphisms could be detected between the Habrokaites LA1777 strain and the cultivated species Solanam lycopersicum. Table 2 shows the sequence information and annealing temperature of the prepared DNA markers. Version SL2.50 was used as the map of the base sequence information published in the known database.
（２）ＤＮＡマーカー検定
ソラナム・リコペルシカムの各系統から抽出したＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物についてキャピラリー電気泳動装置（ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置ＭＣＥ－２０２、島津社製）で電気泳動を行うことにより、ＤＮＡマーカー検定を行った。ＰＣＲの反応条件は以下に示す。キャピラリー電気泳動は、前記装置の所定のプロトコルに従った。各ＤＮＡマーカーのバンドパターンを表３に示す。
＜ＰＣＲ反応液組成＞
テンプレートＤＮＡ 0.5μL
２×ＰＣＲバッファー（ＴＯＹＯＢＯ社製） 12.5μＬ
ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ２ｍＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製） 5μＬ
フォワードプライマー 1μＬ
リバースプライマー 1μＬ
KOD FX（ＴＯＹＯＢＯ社製） 0.25μＬ
超純水 4.75μＬ
(2) DNA marker test PCR was performed using DNA extracted from each strain of Soranum lycopelsicum as a template, and the PCR product was subjected to a capillary electrophoresis device (microchip electrophoresis device for DNA / RNA analysis MCE-202, manufactured by Shimadzu Corporation). DNA marker assay was performed by performing electrophoresis in. The reaction conditions for PCR are shown below. Capillary electrophoresis followed the prescribed protocol of the device. The band pattern of each DNA marker is shown in Table 3.
<PCR reaction solution composition>
Template DNA 0.5 μL
2 x PCR buffer (manufactured by TOYOBO) 12.5 μL
dNTP Mix 2 mM (manufactured by TOYOBO) 5 μL
Forward primer 1 μL
Reverse primer 1 μL
KOD FX (manufactured by TOYOBO) 0.25 μL
Ultrapure water 4.75 μL
（３）グルタミン酸濃度の測定
各系統において、赤く熟した果実を３回にわたって収穫し、それぞれにおいてグルタミン酸濃度を測定し、平均値を算出した。収穫した果実をミキサーで１分間破砕してビン容器に充填し、沸騰湯浴中で３０分間加熱し、ろ紙（定量濾紙Ｎｏ．５Ａ、ADVANTEC社製）でろ過したろ液を、測定サンプルとして用いた。グルタミン酸濃度は、バイオケミストリーアナライザー（２９００型、ＹＳＩ社製）を用いて測定した。グルタミン酸濃度の単位である「ｍｇ％」とは、果実１００ｇあたり何ｍｇのグルタミン酸を含むかを表したものである。
(3) Measurement of glutamic acid concentration In each strain, red ripe fruits were harvested three times, the glutamic acid concentration was measured in each, and the average value was calculated. The harvested fruit is crushed with a mixer for 1 minute, filled in a bottle container, heated in a boiling water bath for 30 minutes, and filtered with filter paper (quantitative filter paper No. 5A, manufactured by ADVANTEC), and the filtrate is used as a measurement sample. board. The glutamic acid concentration was measured using a biochemistry analyzer (type 2900, manufactured by YSI). The unit of glutamic acid concentration, "mg%", indicates how many mg of glutamic acid is contained in 100 g of fruit.
（４）糖度（ＲＩ）の測定
グルタミン酸濃度の測定と同様の方法で調製した測定サンプルについて、デジタル屈折計ＲＸ５０００ｉ（ＡＴＡＧＯ社製）を用いて糖度を測定した。測定時の品温は、２０℃とした。
(4) Measurement of sugar content (RI) The sugar content was measured using a digital refractometer RX5000i (manufactured by ATAGO) with respect to the measurement sample prepared by the same method as the measurement of the glutamate concentration. The product temperature at the time of measurement was 20 ° C.
＜結果＞
（１）イントログレッションラインの解析
イントログレッションラインＴＡ１４５９及びＴＡ１５６２はいずれも、第４染色体上に野生種ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統由来のＤＮＡ配列を有している。これら２系統の解析を行ったところ、バックグラウンドであるソラナム・リコペルシカムＥ６２０３に比べ、有意に果実中のグルタミン酸含量が低減していることがわかった（表４）。このことから、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体上には、果実中のグルタミン酸濃度を低減させる原因遺伝子が存在することが示唆された。
<Result>
(1) Analysis of Introgression Line Both Introgression Lines TA1459 and TA1562 have a DNA sequence derived from the wild species Solanam Habrokaites LA1777 on chromosome 4. Analysis of these two strains revealed that the glutamic acid content in the fruit was significantly reduced compared to the background Solanum lycopercicum E6203 (Table 4). This suggests that the causative gene that reduces the glutamate concentration in the fruit exists on the 4th chromosome of the Solanam habrokaites LA1777 strain.
（２）Ｆ１系統の解析
全てのＦ１系統において、果実中のグルタミン酸濃度の低減が見られなかった（表４）。このことから、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統に由来する、果実中のグルタミン酸濃度を低減させる遺伝形質は、劣性形質であると考えられた。そのため、該遺伝形質を発現させるためには、原因遺伝子領域をホモ接合で保有させる必要があると考えられる。
(2) Analysis of F1 strains No reduction in glutamic acid concentration in fruits was observed in all F1 strains (Table 4). From this, it was considered that the genetic trait derived from the Solanam habrokaites LA1777 strain, which reduces the concentration of glutamic acid in the fruit, is a recessive trait. Therefore, in order to express the genetic trait, it is considered necessary to homozygate the causative gene region.
（３）Ｆ２系統の解析
Ｆ２系統において、マーカー検定を行ったところ、マーカーＮｏ．１６、マーカーＮｏ．１９及びマーカーＮｏ．２３がＬＡ１７７７型ホモになっている個体において、グルタミン酸濃度が低減していることがわかった（表５）。このことから、野生種ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統由来の本遺伝形質は、どんなバックグランドの品種に導入してもグルタミン酸含量を低減させることが明らかとなった。またグルタミン酸含量をＲＩで割った値を系統間・遺伝子型間で比較するとグルタミン酸含量と同様のパターンを示すことから、グルタミン酸含量の低減に伴うＲＩへの影響は小さいものと考えられる。
さらに、マーカーＮｏ．１６、とマーカーＮｏ．２３に間にＤＮＡマーカーを複数作成し、これらを用いてＫｃ１４－９８５－１に対してマーカー検定を行った結果、マーカーＮｏ．３４からマーカーＮｏ．３３までの間がＬＡ１７７７型ホモになっている個体にお
いて、グルタミン酸濃度が低減していることが明らかとなった（表５）。
(3) Analysis of F2 system When a marker test was performed on the F2 system, the marker No. 16. Marker No. 19 and marker No. It was found that the glutamate concentration was reduced in the individual in which 23 was homozygous for LA1777 type (Table 5). From this, it was clarified that this genetic trait derived from the wild species Solanam Habrokaites LA1777 reduces the glutamate content when introduced into any background cultivar. Moreover, when the value obtained by dividing the glutamic acid content by RI is compared between strains and genotypes, the same pattern as the glutamic acid content is shown, and it is considered that the influence on RI due to the decrease in the glutamic acid content is small.
Furthermore, the marker No. 16, and marker No. As a result of creating a plurality of DNA markers between 23 and performing a marker test on Kc14-9851 using these, the marker No. From 34, marker No. It was clarified that the glutamate concentration was reduced in the individuals having LA1777 type homozygous up to 33 (Table 5).
（４）Ｆ３系統の解析
Ｆ２系統を自殖して、Ｆ３系統を得た。用いた系統を表６に示す。Ｆ３系統において、マーカー検定を行った結果、マーカーＮｏ．３４からマーカーＮｏ．２６までの間がＬＡ１７７７型ホモになっている個体において、グルタミン酸濃度が低下していることが明らかとなった（表７）。
(4) Analysis of F3 line The F2 line was self-propagated to obtain the F3 line. The strains used are shown in Table 6. As a result of performing a marker test in the F3 system, the marker No. From 34, marker No. It was clarified that the glutamate concentration was decreased in the individuals having LA1777 type homozygous up to 26 (Table 7).
本発明によれば、その果実のグルタミン酸含有量が低減したソラナム・リコペルシカム及びその製造方法が提供される。グルタミン酸含有量が低減したトマト果実では、甘味のマスキングが抑制されるため、飲料やデザート等のトマト加工食品又は生食用トマトとして好適であり、産業上有用である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, Solanum lycopersicum having a reduced glutamic acid content in the fruit and a method for producing the same are provided. Since tomato fruits having a reduced glutamic acid content suppress sweetness masking, they are suitable as processed tomato foods such as beverages and desserts or tomatoes for raw consumption, and are industrially useful.
Claims (7)
第４染色体上にグルタミン酸代謝関連遺伝子をホモ接合型で含み、
前記グルタミン酸代謝関連遺伝子は、ソラナム・ハブロカイテス（Solanum habrochaites）ＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ～６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれるものであり、少なくとも前記染色体の６０，８２７，００１ｂｐ～６０，８８６，１２２ｂｐの遺伝子領域を含むものである、ソラナム・リコペルシカム。 Solanum lycopersicum,
It contains a homozygous gene related to glutamate metabolism on chromosome 4,
The glutamic acid metabolism-related gene is contained in the gene region of 60,709,841 bp to 61,068, 811 bp of chromosome 4 of the Solanum habrochaites LA1777 strain, and is contained in at least 60 of the chromosome. , 827,001 bp-60,886,122 bp , Solanum lycopercicum.
配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、並びに配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットから選択される一又は二以上であり、少なくとも配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを含むプライマーセットを用いるＰＣＲによって、第４染色体上にホモ接合型で存在するグルタミン酸代謝関連遺伝子が検出される、ソラナム・リコペルシカム。 Solanam Rico Persicum,
Primer set containing DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 11 and DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 12, primer set containing DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 13 and DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: A primer set containing a DNA having a base sequence of 15 and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 16, a primer set containing a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 17 and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 18, and a primer set containing a base sequence of SEQ ID NO: 19. One or more selected from a primer set containing a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 20 and a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 20, and having at least the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 17 and the base sequence of SEQ ID NO: 18. Soranum lycopelsicum, in which a glutamic acid metabolism-related gene present in a homozygous form on chromosome 4 is detected by PCR using a primer set containing a primer set containing DNA .
第４染色体上にグルタミン酸代謝関連遺伝子を含む第一の親品種と、任意の第二の親品種とを交配してＦ１世代を得る工程、
得られたＦ１世代又はその後代において、第４染色体上に前記グルタミン酸代謝関連遺伝子をホモ接合型で含むソラナム・リコペルシカムを選抜する工程、を含み、
前記グルタミン酸代謝関連遺伝子は、ソラナム・ハブロカイテスＬＡ１７７７系統の第４染色体の６０,７０９,８４１ｂｐ～６１，０６８，８１１ｂｐの遺伝子領域に含まれる
ものであり、少なくとも前記染色体の６０，８２７，００１ｂｐ～６０，８８６，１２２ｂｐの遺伝子領域を含むものである、製造方法。 It is a manufacturing method of Solanam lycopersicum.
A step of mating a first parent cultivar containing a glutamic acid metabolism-related gene on chromosome 4 with an arbitrary second parent cultivar to obtain an F1 generation.
In the obtained F1 generation or its progeny, the step of selecting solanum lycopelsicum containing the glutamic acid metabolism-related gene in a homozygous form on chromosome 4 is included.
The glutamic acid metabolism-related gene is contained in the gene region of 60,709,841 bp to 61,068, 811 bp of the fourth chromosome of the Solanam habrokaites LA1777 strain, and is at least 60,827,001 bp of the chromosome. A production method comprising a gene region of ~ 60,886,122 bp .
ソラナム・リコペルシカムの第４染色体上のグルタミン酸代謝関連遺伝子を含む遺伝子領域を検出する工程を含み、
前記検出工程は、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセット、並びに配列番号１９の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２０の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットから選択される一又は二以上であり、少なくとも配列番号１７の塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号１８の塩基配列を有するＤＮＡを含むプライマーセットを含むプライマーセットを用いるＰＣＲにより行われる、方法。 A method for discriminating that the glutamic acid content of fruits in Solanum lycopercicum is lower than that of wild-type or unmodified strains of Solanum lycopercicum .
Including the step of detecting a gene region containing a glutamic acid metabolism-related gene on chromosome 4 of Solanam lycopersicum, including the step of detecting the gene region.
The detection step includes a primer set containing a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 11 and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 12, a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 13, and a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 14. Primer set, primer set containing DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 15 and DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 16, primer set containing DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 17 and DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 18. , And one or more selected from a primer set containing the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 19 and the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 20, and the DNA having at least the base sequence of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18. A method performed by PCR using a primer set containing a primer set containing a DNA having the base sequence of .
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