JP2023096518A - Tomato with high content of aspartic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、例えば果実のアスパラギン酸含有量が増加したトマト(ソラナム・リコペルシカム(Solanum lycopersicum))に関する。 The present invention relates to eg tomatoes (Solanum lycopersicum) with increased aspartic acid content in the fruit.
アスパラギン酸は、ヒト生体内での機能として毒素となるアンモニアの排出促進やアミノ酸の糖新生への利用による疲労回復の促進といった機能が一般的に知られている。そのため、アスパラギン酸を高含量で含むトマト果実の需要がある。 Aspartic acid is generally known to have functions in the human body such as promotion of excretion of toxic ammonia and promotion of recovery from fatigue by utilizing amino acids for gluconeogenesis. Therefore, there is a demand for tomato fruits with a high content of aspartic acid.
一方、トマトのアスパラギン酸の含有量は71mg/100gFW程度である(出展：食品成分データベース(文科省))。野生種のトマトSolanum chmielewskii （ソラナム・キミエルスキー）LA1318系統は、栽培種やその他野生種と比較して著しくアスパラギン酸含量が高いものの、果重や着果性が悪く、食味も極めて悪い。また、遺伝子組換えによってアスパラギン酸高含有トマトを作出した報告(非特許文献１)はあるものの、野生種であるソラナム・キミエルスキーLA1318系統を素材としてアスパラギン酸を増加させたトマトについての報告はない。 On the other hand, the content of aspartic acid in tomatoes is about 71mg/100gFW (Source: Food Composition Database (Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology)). Wild tomato Solanum chmielewskii LA1318 line has a remarkably high aspartic acid content compared to cultivated varieties and other wild varieties, but its fruit weight and fruit setting are poor, and its taste is extremely poor. In addition, although there is a report that produced tomatoes with a high aspartic acid content by genetic recombination (Non-Patent Document 1), there is no report on tomatoes with increased aspartic acid using the wild Solanum Kimielski LA1318 strain as a material. do not have.
また、特許文献１及び２には、水耕栽培時に耐塩性付与剤を接触させることで、トマトの可食部に含まれるアミノ酸が増強された植物体及びその製造方法が開示されている。
Further,
特許文献３～５には、植物の可食部分における遊離アミノ酸を高度に蓄積するトランスジェニック植物及びその作出方法が開示されている。特許文献３～５は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GDH)遺伝子又はグルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)遺伝子に関連するものである。
本発明は、上述の実情に鑑み、果実のアスパラギン酸含有量が増加したトマト(ソラナム・リコペルシカム(Solanum lycopersicum))及びその製造方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a tomato (Solanum lycopersicum) with increased aspartic acid content in the fruit and a method for producing the same.
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体上の特定の遺伝子領域に、トマト果実中のアスパラギン酸含有量を増加させる原因遺伝子が存在することを見出した。そして、該原因遺伝子を第4染色体上にホモ接合型又はヘテロ接合型で含むソラナム・リコペルシカムの果実においては、該原因遺伝子を含まないソラナム・リコペルシカム(栽培種型)の果実に比べて、アスパラギン酸含有量が有意に高いことを見出し、本発明を完成するに至った。
As a result of intensive research to solve the above problems, it was found that a causative gene that increases the aspartic acid content in tomato fruits exists in a specific gene region on
すなわち、本発明は、以下を包含する。
［１］ソラナム・リコペルシカム(Solanum lycopersicum)であって、
第4染色体上にアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子を含み、
前記アスパラギン酸高含有形質原因遺伝子は、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,001,206bp～61,179,940bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域に含まれるものである、
前記ソラナム・リコペルシカム。
［２］前記アスパラギン酸高含有形質原因遺伝子が、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,483,830bp～60,557,813bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域に含まれるものである、［１］記載のソラナム・リコペルシカム。
［３］ソラナム・リコペルシカムであって、
配列番号５の塩基配列を有するDNA及び配列番号６の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、配列番号７の塩基配列を有するDNA及び配列番号８の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、配列番号１１の塩基配列を有するDNA及び配列番号１２の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、又は配列番号１５の塩基配列を有するDNA及び配列番号１６の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセットを用いるPCRによって、第4染色体上にホモ接合型又はヘテロ接合型で存在するアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子が検出される、
前記ソラナム・リコペルシカム。
［４］その果実のアスパラギン酸含有量が、栽培種型のソラナム・リコペルシカムと比較して高い、［１］～［３］のいずれか１記載のソラナム・リコペルシカム。
［５］その果実のグルタミン酸含有量が、栽培種型のソラナム・リコペルシカムと比較して低い、［４］記載のソラナム・リコペルシカム。
That is, the present invention includes the following.
[1] Solanum lycopersicum,
Containing an aspartic acid-rich trait-causing gene on
The aspartic acid-rich trait-causing gene is contained in the gene region of
Said Solanum lycopersicum.
[2] The gene of
[3] Solanum lycopersicum,
A primer set containing the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:5 and the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:6, a primer set containing the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:7 and the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: PCR using a primer set containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12, or a primer set containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 , an aspartic acid-rich trait-causing gene present in homozygous or heterozygous form on
Said Solanum lycopersicum.
[4] Solanum lycopersicum according to any one of [1] to [3], wherein the content of aspartic acid in its fruit is higher than that of cultivar-type Solanum lycopersicum.
[5] The Solanum lycopersicum according to [4], wherein the glutamic acid content of its fruits is low compared to the cultivar form of Solanum lycopersicum.
［６］ソラナム・リコペルシカムの製造方法であって、
第4染色体上にアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子を含む第一の親品種と、任意の第二の親品種とを交配してF1世代を得る工程、及び、
得られたF1世代又はその後代において、第4染色体上に前記アスパラギン酸高含有形質原因遺伝子をホモ接合型又はヘテロ接合型で含むソラナム・リコペルシカムを選抜する工程、
を含み、
前記アスパラギン酸高含有形質原因遺伝子は、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,001,206bp～61,179,940bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域に含まれるものである、
前記方法。
［７］前記アスパラギン酸高含有形質原因遺伝子が、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,483,830bp～60,557,813bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域に含まれるものである、［６］記載の方法。
［８］前記選抜工程は、配列番号５の塩基配列を有するDNA及び配列番号６の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、配列番号７の塩基配列を有するDNA及び配列番号８の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、配列番号１１の塩基配列を有するDNA及び配列番号１２の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、又は配列番号１５の塩基配列を有するDNA及び配列番号１６の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセットを用いるPCRによって、第4染色体上にホモ接合型又はヘテロ接合型で存在するアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子が検出されるPCRにより行われる、［６］又は［７］記載の方法。
［９］製造されるソラナム・リコペルシカムの果実のアスパラギン酸含有量が、栽培種型のソラナム・リコペルシカムと比較して高い、［６］～［８］のいずれか１記載の方法。
［１０］製造されるソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸含有量が、栽培種型のソラナム・リコペルシカムと比較して低い、［９］記載の方法。
［１１］ソラナム・リコペルシカムを鑑別する方法であって、
ソラナム・リコペルシカムの第4染色体上のアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子を含む遺伝子領域を検出する工程を含み、
前記検出工程は、配列番号５の塩基配列を有するDNA及び配列番号６の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、配列番号７の塩基配列を有するDNA及び配列番号８の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、配列番号１１の塩基配列を有するDNA及び配列番号１２の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、又は配列番号１５の塩基配列を有するDNA及び配列番号１６の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセットを用いるPCRによって、第4染色体上にホモ接合型又はヘテロ接合型で存在するアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子が検出されるPCRにより行われる、
前記方法。
[6] A method for producing Solanum lycopersicum, comprising:
A step of crossing a first parent cultivar containing an aspartic acid-rich trait-causing gene on
A step of selecting Solanum lycopersicum containing the trait-causing gene with high aspartic acid content on
including
The aspartic acid-rich trait-causing gene is contained in the gene region of
the aforementioned method.
[7] The gene of
[8] The selection step includes a primer set containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8. A primer set containing DNA, a primer set containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12, or DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 The method of [6] or [7], wherein the aspartic acid-rich trait-causing gene present in homozygous or heterozygous form on
[9] The method according to any one of [6] to [8], wherein the fruit of Solanum lycopersicum to be produced has a high aspartic acid content compared to cultivar-type Solanum lycopersicum.
[10] The method of [9], wherein the produced Solanum lycopersicum fruit has a low glutamic acid content compared to the cultivar type of Solanum lycopersicum.
[11] A method for identifying Solanum lycopersicum, comprising:
A step of detecting a gene region containing a trait-causing gene with high aspartic acid content on
The detection step includes a primer set containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8. A primer set, a primer set containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12, or a primer containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 PCR using the set detects an aspartic acid-rich trait-causing gene that is homozygous or heterozygous on
the aforementioned method.
本発明によれば、その果実のアスパラギン酸含有量が増加したソラナム・リコペルシカム及びその製造方法が提供される。通常のトマトでは果実中に71mg/100gFWのアスパラギン酸が含有されるのに対して、本発明に係るソラナム・リコペルシカムでは、果実中のアスパラギン酸含有量は190～380mg/100gFWである。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, Solanum lycopersicum with increased aspartic acid content in its fruit and a method for producing the same are provided. While ordinary tomatoes contain 71 mg/100 gFW of aspartic acid in the fruit, Solanum lycopersicum according to the present invention has an aspartic acid content of 190-380 mg/100 gFW in the fruit.
また、本発明に係るソラナム・リコペルシカムを用いて育成したトマト品種を用いることで、生鮮トマト、トマトジュース及びトマト加工品のアスパラギン酸量を増加できる。 In addition, by using the tomato variety grown using Solanum lycopersicum according to the present invention, the amount of aspartic acid in fresh tomatoes, tomato juices and processed tomato products can be increased.
さらに、本発明に係るソラナム・リコペルシカムによれば、アスパラギン酸量の増加によって生鮮トマト及びトマト加工品においてアンモニアの排出促進や疲労回復の促進効果が期待できる。 Furthermore, according to the Solanum lycopersicum according to the present invention, an increase in the amount of aspartic acid can be expected to promote ammonia discharge and fatigue recovery in fresh tomatoes and processed tomato products.
また、高アスパラギン酸遺伝資源ソラナム・キミエルスキーLA1318系統では生鮮トマト品種と比較し果重が著しく低下するが、本発明に係るソラナム・リコペルシカムを用いると、果重低下を抑えられ、且つ、果実の赤熟も起こるため生鮮用トマトとしても適する。 In addition, in the high aspartic acid genetic resource Solanum Kimielski LA1318 line, the fruit weight is significantly reduced compared to fresh tomato varieties. It is also suitable as a fresh tomato because red ripening also occurs.
さらに、本発明に係るソラナム・リコペルシカムによれば、アスパラギン酸含量の上昇と付随して生じるグルタミン酸含量の低下により後味として残る旨味を低減するとともに、甘味を向上し酸味を低減することができる。よって、本発明に係るソラナム・リコペルシカムは、飲料やデザート等のトマト加工食品のために、又は生食用トマトとして好適である。 Furthermore, according to the Solanum lycopersicum according to the present invention, the increase in aspartic acid content and the concomitant decrease in glutamic acid content can reduce the umami remaining as an aftertaste, improve sweetness, and reduce sourness. Therefore, Solanum lycopersicum according to the present invention is suitable for processed tomato foods such as beverages and desserts, or as fresh tomatoes.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るソラナム・リコペルシカムは、第4染色体上に、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,001,206bp～61,179,940bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域に含まれるアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子をホモ接合型又はヘテロ接合型で含む。当該アスパラギン酸高含有形質原因遺伝子である、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,001,206bp～61,179,940bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域は、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の上記遺伝子領域の塩基配列とソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の塩基配列とをアラインメントし、比較することで決定することができる。アスパラギン酸高含有形質原因遺伝子は、好ましくはソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,483,830bp～60,557,813bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域に含まれるものである。
The present invention will be described in detail below.
The Solanum lycopersicum according to the present invention is the 4th chromosome of the Solanum Kimielski LA1318 strain corresponding to the gene region of 60,001,206 bp to 61,179,940 bp of the 4th chromosome of Solanum lycopersicum (SL2.50) on the 4th chromosome. contains the aspartic acid-rich trait-causing gene contained in the gene region of the homozygous or heterozygous type. The gene region of
本発明者等は、ソラナム・キミエルスキー LA1318系統は、その果実におけるアスパラギン酸含有量が高いという形質を有することに着目し、第4染色体の上記遺伝子領域に1又は複数のアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子が存在し得ることに想到した。ソラナム・キミエルスキー LA1318系統は、米国TGRC(Tomato Genetics Resource Center)より入手できる(本明細書では、「TK3273」とも称される)。また、上記ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の遺伝子情報は、世界ナス科ネットワークのSol Genomics Networkより入手できる。
The present inventors focused on the fact that the Solanum Kimielski LA1318 line has a trait of high aspartic acid content in its fruit, and found that one or more aspartic acid-rich traits were added to the gene region of
ここで、「アスパラギン酸高含有形質原因遺伝子」とは、トマト果実中のアスパラギン酸高含有の直接的な又は間接的な原因となる遺伝子をいう。ソラナム・キミエルスキー LA1318系統が上記形質を示すことから、該系統の第4染色体上の上記領域に含まれるアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子では、ソラナム・リコペルシカムの栽培種型遺伝子と比較して、アスパラギン酸生合成促進に関与する遺伝子の活性を増強させる変異、アスパラギン酸生合成抑制に関与する遺伝子の活性を欠失又は減弱化する変異、アスパラギン酸分解促進に関与する遺伝子の活性を欠失又は減弱化する変異等が生じているものと推測される。
Here, the term "causative gene for high aspartic acid content" refers to a gene directly or indirectly responsible for high aspartic acid content in tomato fruit. Since the Solanum Kimielski LA1318 strain exhibits the above trait, the aspartic acid-rich trait-causing gene contained in the above region on
以下、ソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の上記遺伝子領域に含まれる、果実中のアスパラギン酸含有量を増加させる原因となるアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子を、「ソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子」と称する場合がある。
Hereinafter, the aspartic acid-rich trait-causing gene that causes an increase in the aspartic acid content in fruits contained in the above gene region of
なお、ソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の上記遺伝子領域に、既知のグルタミン代謝関連酵素であるグルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GDH)は座上していないことは、本発明者等により確認されている。
It should be noted that glutamate decarboxylase (GAD) and glutamate dehydrogenase (GDH), which are known glutamine metabolism-related enzymes, are not located in the above gene region of
本発明に係るソラナム・リコペルシカムにおいて、ソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子は、ホモ接合型又はヘテロ接合型で第4染色体上に含まれる。ソラナム・キミエルスキー LA1318系統の上記形質は共優性形質であると考えられることから、ヘテロ接合型でもアスパラギン酸含有量が増加した果実が得られる。
In Solanum lycopersicum according to the present invention, the causative gene derived from Solanum kimierski LA1318 is contained on
また、本発明に係るソラナム・リコペルシカムにおいて、ソラナム・キミエルスキーLA1318由来の原因遺伝子は、前記形質が損なわれない限りにおいて、ソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子の塩基配列と90％以上の同一性を有するものであってもよく、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の同一性を有するものであってもよい。 In addition, in the Solanum lycopersicum according to the present invention, the causative gene derived from Solanum kimielskii LA1318 is composed of the base sequence of the causative gene derived from Solanum kimielskii LA1318 and 90% or more, as long as the trait is not impaired. They may have identity, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more.
また、本発明に係るソラナム・リコペルシカムは、第4染色体上にソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子を含み、前記形質が損なわれない限りにおいて、第4染色体上に、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,001,206bp～61,179,940bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域又は同60,483,830bp～60,557,813bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域の一部又は全部を含んでもよい。
In addition, Solanum lycopersicum according to the present invention contains a causative gene derived from Solanum kimierski LA1318 on
本発明に係るソラナム・リコペルシカムの果実のアスパラギン酸含有量は、栽培種型のソラナム・リコペルシカムと比較して高いという特徴を有し、好ましくは栽培種型のソラナム・リコペルシカムの果実のアスパラギン酸含有量の20％以上、より好ましくは30％以上、さらに好ましくは50％以上である。なお、「栽培種型」とは、第4染色体上にソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子をホモ接合又はヘテロ接合で座上させる改変を行っていない、ソラナム・リコペルシカムのことをいう。また、ここでいう果実は、赤く熟した状態の果実をいう。
The aspartic acid content of the fruit of Solanum lycopersicum according to the present invention is characterized by being higher than that of the cultivar-type Solanum lycopersicum, preferably the aspartic acid content of the cultivar-type Solanum lycopersicum fruit. 20% or more, more preferably 30% or more, and still more preferably 50% or more. The term "cultivar type" refers to Solanum lycopersicum that has not been modified to locate the causative gene derived from Solanum Kimielski LA1318 on
果実中のアスパラギン酸含有量は、常法により測定することができ、例えば、破砕により得た果汁に対してバイオケミストリーアナライザー(2900型、YSI社製)等を用いて測定することができる。この方法で測定する場合、例えば、第4染色体上にソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子をホモ接合又はヘテロ接合で有しないソラナム・リコペルシカムの果実のアスパラギン酸濃度は30mg％程度であるところ、本発明に係るソラナム・リコペルシカムの果実のアスパラギン酸濃度は好ましくは60mg％以上、より好ましくは100mg％以上、さらに好ましくは200mg％以上である。
The aspartic acid content in the fruit can be measured by a conventional method, for example, the fruit juice obtained by crushing can be measured using a biochemistry analyzer (model 2900, manufactured by YSI) or the like. When measured by this method, for example, the aspartic acid concentration of the fruit of Solanum lycopersicum, which does not have a homozygous or heterozygous causative gene derived from Solanum kimierski LA1318 on
また、本発明に係るソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸含有量は、栽培種型のソラナム・リコペルシカムと比較して低いという特徴を有し、好ましくは栽培種型のソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸含有量の50％以下、より好ましくは30％以下、さらに好ましくは20％以下である。 In addition, the glutamic acid content of the fruit of Solanum lycopersicum according to the present invention is characterized in that it is lower than that of the cultivar-type Solanum lycopersicum, and preferably the glutamic acid content of the cultivar-type Solanum lycopersicum fruit. 50% or less, more preferably 30% or less, still more preferably 20% or less.
果実中のグルタミン酸含有量は、上述の果実中のアスパラギン酸含有量の測定と同様の方法により測定することができる。例えば、第4染色体上にソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子をホモ接合又はヘテロ接合で有しないソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸濃度は200mg％程度であるところ、本発明に係るソラナム・リコペルシカムの果実のグルタミン酸濃度は好ましくは150mg％以下、より好ましくは100mg％以下、さらに好ましくは50mg％以下である。
The glutamic acid content in fruit can be measured by the same method as for measuring the aspartic acid content in fruit described above. For example, the glutamic acid concentration of the fruit of Solanum lycopersicum, which does not have a homozygous or heterozygous causative gene derived from Solanum Kimielski LA1318 on
さらに、本発明に係るソラナム・リコペルシカムの果実中のグルタミン酸濃度(含有量)に対するアスパラギン酸濃度(含有量)の比(Asp/Glu比)は、例えば1～2、好ましくは2～5、特に好ましくは5～10である。 Furthermore, the ratio of aspartic acid concentration (content) to glutamic acid concentration (content) in the fruit of Solanum lycopersicum according to the present invention (Asp/Glu ratio) is, for example, 1 to 2, preferably 2 to 5, and particularly preferably. is between 5 and 10.
また、本発明に係るソラナム・リコペルシカムの果実においては、糖質含有量にアスパラギン酸含有量が増加する形質及び/又はグルタミン酸含有量が低下する形質の発現が影響しない。 In addition, in the Solanum lycopersicum fruit according to the present invention, expression of the trait of increasing aspartic acid content and/or the trait of decreasing glutamic acid content does not affect the carbohydrate content.
本発明に係るソラナム・リコペルシカムは、遺伝子工学的手法により製造することができる。遺伝子工学的手法としては、例えば公知のゲノム編集技術が挙げられ、具体的にはCRISPR法、ZFN法、TALEN法等によって、ソラナム・リコペルシカムのゲノムがソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子を含むように操作することが挙げられる。また、その他に、以下の製造方法によっても取得することができる。 Solanum lycopersicum according to the present invention can be produced by genetic engineering techniques. Genetic engineering techniques include, for example, known genome editing techniques. Specifically, the genome of Solanum lycopersicum contains the causative gene derived from Solanum kimierski LA1318 by CRISPR method, ZFN method, TALEN method, and the like. It can be operated as follows. In addition, it can also be obtained by the following manufacturing method.
具体的には、まず、第一の親品種として、第4染色体上に、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,001,206bp～61,179,940bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域に含まれるアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子、好ましくは同60,483,830bp～60,557,813bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域に含まれるアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子を含む第一の親品種を用意する。当該第一の親品種としては、ソラナム・リコペルシカムを好ましく用いることができ、また、ソラナム・キミエルスキー LA1318系統でもよいし、ソラナム・キミエルスキー LA1318系統と他の栽培種との交配種でもよい。
Specifically, first, as the first parent variety, Solanum Kimielski LA1318 on
第二の親品種としては、任意のものを用意すればよく、好ましくはソラナム・リコペルシカムを用いる。また、第二の親品種は、ソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子又は当該原因遺伝子を含む上述の遺伝子領域を含まないものであってよい。 Any cultivar may be prepared as the second parent cultivar, and Solanum lycopersicum is preferably used. In addition, the second parent variety may not contain the causative gene derived from Solanum Kimielski LA1318 or the aforementioned gene region containing the causative gene.
そして、第一の親品種と第二の親品種とを交配してF1世代を得る工程、得られたF1世代又はその後代において、第4染色体上に、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,001,206bp～61,179,940bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域に含まれるアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子、好ましくは同60,483,830bp～60,557,813bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域に含まれるアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子をホモ接合型又はヘテロ接合型で含むソラナム・リコペルシカムを選抜する工程、を行うことにより、果実のアスパラギン酸含有量が増加したソラナム・リコペルシカムを製造することができる。また、製造されたソラナム・リコペルシカムは、果実のグルタミン酸含有量が低下している。得られたF1世代の後代は、F1世代を自殖させてF2世代を得る工程、F1世代と第一の親品種又は第二の親品種とを戻し交配(バッククロス)する工程、又はF1世代と任意のソラナム・リコペルシカムとを交配する工程等によって取得することができる。また、本製造方法において、これらの後代を得る工程及び選抜する工程は複数回繰り返してもよい。
Then, in the step of crossing the first parent breed and the second parent breed to obtain the F1 generation, in the obtained F1 generation or its progeny, on the 4th chromosome, Solanum lycopersicum (SL2.50) Aspartic acid-rich trait-causing gene contained in the gene region of
所望のソラナム・リコペルシカムを選抜する工程は、第4染色体上のソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子を含む遺伝子領域を、任意のマーカーで検出することにより行うことができる。
The step of selecting the desired Solanum lycopersicum can be performed by detecting the gene region containing the causative gene derived from Solanum kimierski LA1318 on
例えば、配列番号５の塩基配列を有するDNA及び配列番号６の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット(それぞれ、以下の実施例におけるプライマー名称：04g074490のフォワードプライマー及びリバースプライマーに相当する)を用いるPCRにより、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,483,986bpに対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体のマーカーを検出する。配列番号７の塩基配列を有するDNA及び配列番号８の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット(それぞれ、以下の実施例におけるプライマー名称：04g074530のフォワードプライマー及びリバースプライマーに相当する)を用いるPCRにより、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,520,092bpに対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体のマーカーを検出する。配列番号１１の塩基配列を有するDNA及び配列番号１２の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット(それぞれ、以下の実施例におけるプライマー名称：04g074610のフォワードプライマー及びリバースプライマーに相当する)を用いるPCRにより、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,557,703bpに対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体のマーカーを検出する。配列番号１５の塩基配列を有するDNA及び配列番号１６の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット(それぞれ、以下の実施例におけるプライマー名称：04g074900のフォワードプライマー及びリバースプライマーに相当する)を用いるPCRにより、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,818,232bpに対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体のマーカーを検出する。
For example, PCR using a primer set containing a DNA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and a DNA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 (corresponding to the forward primer and reverse primer of 04g074490 in the following examples, respectively) detects a marker on
好ましい態様では、前記選抜工程は、配列番号５の塩基配列を有するDNA及び配列番号６の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、配列番号７の塩基配列を有するDNA及び配列番号８の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、配列番号１１の塩基配列を有するDNA及び配列番号１２の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、又は配列番号１５の塩基配列を有するDNA及び配列番号１６の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセットを用いるPCRによって、第4染色体上にホモ接合型又はヘテロ接合型で存在するアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子が検出されるPCRにより行われる。そして、前記プライマーセットにより検出されるマーカーが、第4染色体上にソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子及び/又はこれを含む遺伝子領域がホモ接合又はヘテロ接合で存在することを示すソラナム・リコペルシカムを選択する。
In a preferred embodiment, the selection step includes a primer set containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:5 and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:6, DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:7 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO:8. A primer set containing DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 11 and a primer set containing DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 12, or DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 15 and the base sequence of SEQ ID NO: 16 The aspartic acid-rich trait-causing gene present in homozygous or heterozygous form on
なお、上記の各プライマーの配列番号で示される塩基配列において、1又は数個(例えば、1～10個、1～5個、1～3個、好ましくは1又は2個)の塩基が欠失、置換、挿入又は付加した塩基配列を有し、且つそれぞれのプライマー機能を有するプライマー(ソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子及び/又はこれを含む遺伝子領域の所定の位置にアニーリング(ハイブリダイズ)し、起点となって伸長反応を誘導するプライマー)を代替的に含むことができる。 In addition, one or several (eg, 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, preferably 1 or 2) bases are deleted in the base sequences shown by the SEQ ID NOs of the above primers. , a primer having a substituted, inserted or added nucleotide sequence and having each primer function (causal gene derived from Solanum Kimielski LA1318 and / or annealing (hybridizing) at a predetermined position of the gene region containing the same and a primer that serves as a starting point for inducing an extension reaction) can alternatively be included.
前記選抜工程において、選択されるソラナム・リコペルシカムにおいて検出される、第4染色体上にソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子がホモ接合又はヘテロ接合で存在することを示すマーカーは、1つでもよく、2つ以上でもよい。
In the selection step, there may be one marker that is detected in Solanum lycopersicum to be selected and indicates that the causative gene derived from Solanum kimierski LA1318 is present on
好ましくは、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の、60,483,986bpに対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体のマーカー、60,520,092bpに対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体のマーカー、60,557,703bpに対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体のマーカー及び60,818,232bpに対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体のマーカーから成る群より選択される1以上のマーカーが検出される。
Preferably, a marker of
マーカーの検出により、ソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子及び/又はこれを含む遺伝子領域が、第4染色体上にホモ接合型又はヘテロ接合型で存在することが示された場合、当該ソラナム・リコペルシカムはアスパラギン酸含有量が増加した果実を産生する系統であると判断される。
If the marker detection indicates that the causative gene derived from Solanum Kimielski LA1318 and/or the gene region containing it is present on
別の観点では、本発明に係るソラナム・リコペルシカムは、上記いずれかのプライマーセットを用いるPCRにより、第4染色体上にソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子及び/又はこれを含む遺伝子領域がホモ接合型又はヘテロ接合型で存在することが検出されるソラナム・リコペルシカムであるともいえる。
In another aspect, the Solanum lycopersicum according to the present invention has a causative gene derived from Solanum Kimielski LA1318 and/or a gene region containing the same on
また、本発明の別の態様としては、上記いずれかのプライマーセットを用いるPCRを行うことにより、ソラナム・リコペルシカムの第4染色体上のソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子及び/又はこれを含む遺伝子領域を検出する工程を含む、ソラナム・リコペルシカムを鑑別する方法である。この鑑別方法において、ソラナム・キミエルスキー LA1318由来の原因遺伝子及び/又はこれを含む遺伝子領域が、第4染色体上にホモ接合型又はヘテロ接合型で存在することが示された場合、当該ソラナム・リコペルシカムはアスパラギン酸含有量が増加した果実を産生する系統であると鑑別される。
In another aspect of the present invention, a causative gene derived from Solanum kimierski LA1318 on
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail below using examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
〔実施例１〕ソラナム・リコペルシカムにおけるアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子の座上領域絞り込み
１．材料と方法
2017年上期に、ソラナム・リコペルシカムにおいてアスパラギン酸高含有形質が個体間で分離しているKc15-165-3 (17J11)とKc15-165-4 (17J12)をカゴメ保有の圃場にて各25株ずつ栽培した。Kc15-165-3及びKc15-165-4はTK3273と加工用品種（TK5352）を交配して作製した戻し交配系統（BC4F3世代）である。各個体から葉と完熟果をサンプリングした。サンプリングした完熟果はミキサーで1分間破砕し、サンプル瓶に詰めて30分間煮沸したものをアスパラギン酸分析に供試した。
[Example 1] Narrowing down loci of trait-causing genes with high aspartic acid content in
In the first half of 2017, 25 strains each of Kc15-165-3 (17J11) and Kc15-165-4 (17J12), which have high aspartic acid content in Solanum lycopersicum, were isolated in a field owned by Kagome. cultivated. Kc15-165-3 and Kc15-165-4 are backcross lines (BC4F3 generation) produced by crossing TK3273 and a processing variety (TK5352). Leaves and ripe fruits were sampled from each plant. The sampled ripe fruits were crushed with a mixer for 1 minute, packed in a sample bottle, boiled for 30 minutes, and subjected to aspartic acid analysis.
2系統、各25株、合計50株の中からアスパラギン酸含量の高い10個体（アスパラギン酸高含有バルク）、低い10個体（アスパラギン酸低含有バルク）、中程度の10個体（アスパラギン酸中含量バルク）を選定し、バルク毎にサンプリングした葉を混合してバルクシーケンス（全ゲノム配列解析）を実施した。ゲノム配列データを用いてアスパラギン酸高含有形質に関わる変異の探索を行った。 2 strains, 25 strains each, total of 50 strains, 10 individuals with high aspartic acid content (bulk with high aspartic acid content), 10 individuals with low aspartic acid content (bulk with low aspartic acid content), 10 individuals with medium content (bulk with medium aspartic acid content) ) were selected, and bulk sequencing (whole genome sequence analysis) was performed by mixing the leaves sampled for each bulk. We searched for mutations related to aspartic acid-rich traits using genome sequence data.
２．結果と考察
Kc15-165-3（17J11）、Kc15-165-4（17J12）の各個体におけるアスパラギン酸分析結果を表１に示す。本結果から、Asp/Gluが3以上だった10個体(Asp含有バルク「高」)をアスパラギン酸高含量バルクとして、Asp/Gluが1程度であった10個体(Asp含有バルク「中」)をアスパラギン酸中含量バルクとして、Asp/Gluが0.5程度であった10個体(Asp含有バルク「低」)をアスパラギン酸低含量バルクとしてそれぞれ選抜した。
2. Results and discussion
Table 1 shows the analysis results of aspartic acid in each individual of Kc15-165-3 (17J11) and Kc15-165-4 (17J12). From this result, 10 individuals with an Asp/Glu of 3 or more (Asp-containing bulk "high") were classified as aspartic acid-rich bulk, and 10 individuals with an Asp/Glu of about 1 (Asp-containing bulk "medium") Ten individuals whose Asp/Glu was about 0.5 (Asp-containing bulk "low") were selected as medium-aspartic acid-content bulk.
各バルクについて全ゲノム配列解析を行い、リファレンス配列との塩基配列の違い（以下、「多型」と記述）を抽出した。抽出した多型の中から遺伝子配列上に存在する多型を選抜し、さらにアミノ酸配列の変化を伴う多型を選抜した。なお、アスパラギン酸高含有形質は共優性であるため、アスパラギン酸高含有バルクの個体は原因の多型をホモで、中含有バルクの個体は多型をヘテロで持っており、低含有バルクの個体は通常と同じ塩基配列（多型なし）だと考えられた。そこで選抜した多型をバルク間で比較し、アスパラギン酸高含量バルクでホモ、中含量バルクでヘテロ、低含量バルクで多型なし（リファレンス配列と同じ配列）となるもののみを選抜した。その結果、選抜した多型は4番染色体の59～63Mbの領域に集中して存在していた（図１）。このことからアスパラギン酸高含有形質の原因遺伝子は本領域に座上していると考え、さらなるファインマッピングを試みることとした。 Whole-genome sequence analysis was performed on each bulk, and differences in the nucleotide sequence from the reference sequence (hereinafter referred to as "polymorphism") were extracted. Among the extracted polymorphisms, polymorphisms existing on the gene sequence were selected, and polymorphisms accompanied by changes in the amino acid sequence were further selected. In addition, since the aspartic acid-rich trait is codominant, individuals with high aspartic acid content are homozygous for the causative polymorphism, individuals with moderate content are heterozygous for the causative polymorphism, and individuals with low content bulk are heterozygous for the causative polymorphism. was considered to have the same nucleotide sequence as normal (no polymorphism). Therefore, the selected polymorphisms were compared between bulks, and only those that were homozygous in bulks with high aspartic acid content, heterozygous in bulks with medium content, and no polymorphisms in bulks with low content (the same sequence as the reference sequence) were selected. As a result, the selected polymorphisms were concentrated in the 59-63 Mb region of chromosome 4 (Fig. 1). Based on this, we assumed that the causative gene for the aspartic acid-rich trait resides in this region, and decided to attempt further fine mapping.
〔実施例２〕ファインマッピング
１．材料と方法
評価にはKc15-148-1を用いた。Kc15-148はTK3273戻し交配系統（14Z125-2）と生鮮用ミニペア品種（PK868）を交配して作製したF2系統であり、個体間でアスパラギン酸含量が分離することが予想された。そこでKc15-148-1の中から第4染色体59～63Mbの領域が野生種型（ホモ）・ヘテロ型・栽培種型の個体、及びこの領域内で遺伝子型が分離している個体を選定し、評価を行うこととした。
[Embodiment 2]
ファインマッピングに用いたプライマーセットを表２に示す。39個体のKc15-148-1からDNAを抽出した。抽出したDNAと表２に示すプライマーセットを用いてPCRを行い、増幅されたDNA断片をキャピラリー電気泳動装置（MCE-202/maltiNA, 島津製作所）を用いて検出した。PCRの条件を表３に示す。選抜した個体を栽培し、遺伝子型調査結果とアスパラギン酸及びグルタミン酸含量を比較することでアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子の座上領域の絞り込みを行った。 Table 2 shows the primer set used for fine mapping. DNA was extracted from 39 individuals of Kc15-148-1. PCR was performed using the extracted DNA and the primer set shown in Table 2, and the amplified DNA fragment was detected using a capillary electrophoresis device (MCE-202/maltiNA, Shimadzu Corporation). Table 3 shows the PCR conditions. By cultivating the selected individuals and comparing the results of genotyping with the contents of aspartic acid and glutamic acid, we narrowed down the locus region of the aspartic acid-rich trait causative gene.
KOD FXシステムを用いた簡易DNA抽出方法とマーカー検定
上述のDNA抽出及びマーカー検定は、以下の通り行った：
１）用意するもの
はさみ、瓶入りの70%エタノール、1.5mlチューブ又は96ウェルディープウェルプレート、破砕用アルミナビーズ（φ3mm又は4mm）、チューブ立て（1.5mlチューブ使用時）、ディープウェルプレート用マット（96ウェルディープウェルプレート使用時）、マジックペン、抽出バッファー（100mM Tris-HCl (pH9.5), 1M KCl, 10mM EDTA）、検定用苗。
２）抽出方法
(1)子葉の半分（小指の爪よりやや小さい程度）をはさみで切除し、1.5mlチューブ又は96ウェルディープウェルプレートに入れた；
(2)抽出バッファー100μLと破砕用ビーズを入れ、ふたを閉じた。96ウェルディープウェルプレート使用時はディープウェルプレート用マットをしっかりとかぶせた。1.5mlチューブ使用時：破砕用ビーズφ3mm。96ウェルディープウェルプレート使用時：破砕用ビーズφ4mm；
(3)1.5mlチューブ又は96ウェルディープウェルプレートをGeno Grinderにセットし、回転数1000rpmで1分間破砕した；
(4)0.5μLをPCR鋳型とした（最初にチューブに入れると乾燥するため、プレミックスを入れた後がよい）。
３）マーカー検定
(1)以下の組成で、プレミックス液を作製した：
（以下は50サンプル用、96サンプルの際は、以下を2本作成）
2X PCR Buffer for KOD FX 625μL
dNTP (2mM) 250μL
F Primer 50μL
R Primer 50μL
（プライマーが複数本の場合、滅菌水の量をプライマーの液量だけ減らす）
滅菌水 237.5μL
KOD FX 12.5μL；
(2)プレミックス液を24.5μlずつPCRチューブ（96穴プレート）に分注した；
(3)PCR鋳型を0.5μLずつPCRチューブ（96穴プレート）に分注した；
(4)以下のプログラムでPCRを実施した：
・94℃ 2min 1回
・98℃ 10sec, Tm℃ 30sec, 68℃ 1min 40回；
(5)アガロースゲル、あるいはキャピラリー電気泳動装置で結果を確認した。
Simplified DNA Extraction Method and Marker Assay Using KOD FX System The DNA extraction and marker assay described above were performed as follows:
1) Things to prepare Scissors, bottled 70% ethanol, 1.5ml tube or 96 well deep well plate, alumina beads for crushing (φ3mm or 4mm), tube stand (when using 1.5ml tube), mat for deep well plate ( When using a 96-well deep well plate), magic pen, extraction buffer (100mM Tris-HCl (pH9.5), 1M KCl, 10mM EDTA), seedlings for testing.
2) Extraction method
(1) Half of the cotyledons (slightly smaller than a little fingernail) were excised with scissors and placed in a 1.5 ml tube or 96-well deep well plate;
(2) 100 μL of extraction buffer and crushing beads were added and the lid was closed. When using a 96-well deep well plate, the plate was firmly covered with a deep well plate mat. When using a 1.5 ml tube: Crushing beads φ3 mm. When using a 96-well deep well plate: Crushing beads φ4 mm;
(3) A 1.5 ml tube or 96-well deep well plate was set in a Geno Grinder and crushed at 1000 rpm for 1 minute;
(4) 0.5 μL was used as a PCR template (preferably after adding the premix, as it will dry when put into the tube first).
3) Marker test
(1) A premixed liquid was prepared with the following composition:
(The following is for 50 samples, and for 96 samples, create 2 copies below)
2X PCR Buffer for KOD FX 625μL
dNTPs (2mM) 250μL
F Primer 50μL
R Primer 50μL
(If there are multiple primers, reduce the amount of sterilized water by the amount of primer.)
Sterilized water 237.5 μL
KOD FX 12.5 μL;
(2) 24.5 μl of the premix solution was dispensed into each PCR tube (96-well plate);
(3) 0.5 μL of the PCR template was dispensed into each PCR tube (96-well plate);
(4) PCR was performed with the following programs:
・94
(5) The results were confirmed by agarose gel or capillary electrophoresis.
２．結果と考察
Kc15-148-1の遺伝子型とアスパラギン酸含量を比較した結果を図２に示す。04g072670プライマーと04g079160プライマーでともに野生種型を示した個体（野生種型）はアスパラギン酸含量が高く、グルタミン酸含量が低かった（Asp/Glu=7.22）。また両プライマーでともにヘテロ型を示した個体（ヘテロ型）ではアスパラギン酸含量は比較的高かったものの、グルタミン酸含量も野生種型ホモの個体と比較して高かった（Asp/Glu=1.23）。さらに両プライマーでともに栽培種型を示した個体（栽培種型）ではアスパラギン酸含量が低く、グルタミン酸含量が高かった（Asp/Glu=0.15）。このことからアスパラギン酸高含有形質は本実施例で調査した04g072670プライマーと04g079160プライマーの間の領域に座上していると判断した。なお、両プライマーの検定結果がともに野生種型・ヘテロ型・栽培種型だったこれらの個体では本領域内で組換えが起こっていない（この領域が全て野生種型・ヘテロ型・栽培種型である）と推測した。
2. Results and discussion
FIG. 2 shows the results of comparing the genotype of Kc15-148-1 and the aspartic acid content. The individual showing wild type with both 04g072670 and 04g079160 primers (wild type) had a high aspartic acid content and a low glutamic acid content (Asp/Glu=7.22). In addition, although the aspartic acid content was relatively high in the individual showing heterozygous type with both primers (hetero type), the glutamic acid content was also higher than that of the wild-type homozygous individual (Asp/Glu=1.23). Furthermore, the individual that showed the cultivar type with both primers (cultivar type) had a low aspartic acid content and a high glutamic acid content (Asp/Glu=0.15). From this, it was determined that the aspartic acid-rich trait resides in the region between the 04g072670 primer and the 04g079160 primer examined in this example. In addition, recombination did not occur in this region in those individuals whose test results for both primers were wild type, heterozygous type, and cultivar type (this region is all wild type, heterozygous type, cultivar type is).
本領域内で遺伝子型が分離している個体を比較すると、04g074490プライマーから04g076240プライマーの領域が野生種型ホモの個体（分離A、B、C）はアスパラギン酸含量が高く（Asp/Glu >4.8）、栽培種型ホモの個体（分離I）はアスパラギン酸含量が低かった（Asp/Glu≒0.1）。またヘテロ型の個体（分離D、E、F、G、H）のAsp/Gluは約1.0だった。遺伝子型とアスパラギン酸含量がリンクしていたことから、アスパラギン酸高含有形質の原因遺伝子の座上領域は黒枠で示す60,001,206 ～ 61,863,326 bp（SL2.50）の領域に絞り込まれた。そこで他の系統においても本領域の遺伝子型がアスパラギン酸高含有形質とリンクしていることを確認するとともに、さらなる座上領域の絞り込みを試みることとした。 Comparing individuals whose genotypes are segregated within this region, the region from 04g074490 primer to 04g076240 primer is homozygous for the wild type (segregation A, B, C) has a high aspartic acid content (Asp/Glu >4.8 ), and the cultivar type homozygous individual (segregation I) had a low aspartic acid content (Asp/Glu≒0.1). Asp/Glu in heterozygous individuals (segregants D, E, F, G and H) was about 1.0. Since the genotype and aspartic acid content were linked, the locus region of the causative gene for the aspartic acid-rich trait was narrowed down to the region of 60,001,206 to 61,863,326 bp (SL2.50) indicated by the black frame. Therefore, we confirmed that the genotype of this region is linked to the aspartic acid-rich trait in other strains, and tried to further narrow down the locus region.
〔実施例３〕ファインマッピング２
１．材料と方法
評価にはKc14-1026-5-2 （15Z155-2）とKc15-148-1-1を用いた。Kc14-1026-5-2はTK3273と生鮮用ラウンド品種（PK515）を交配して作製した戻し交配系統（BC3F2）であり、個体間でアスパラギン酸含量が分離することが予想された。そこでKc14-1026-5-2の中から第4染色体の絞り込んだ領域内が野生種型（ホモ）・ヘテロ型・栽培種型の個体を選定し、評価を行うこととした。
[Example 3]
1. Materials and Methods Kc14-1026-5-2 (15Z155-2) and Kc15-148-1-1 were used for evaluation. Kc14-1026-5-2 is a backcross line (BC3F2) produced by crossing TK3273 and fresh round variety (PK515), and it was expected that the aspartic acid content would separate between individuals. Therefore, from Kc14-1026-5-2, it was decided to select and evaluate the wild-type (homozygous), heterozygous, and cultivar-type individuals in the narrowed region of
またさらなる領域の絞り込みを行うために、実施例２の評価で絞り込んだ領域の遺伝子型がヘテロ型だったKc15-148-1 分離Gの個体（図２参照）から採種した後代（Kc15-148-1-1）を用い、第4染色体の絞り込んだ領域内が野生種型・ヘテロ型・栽培種型の個体、及び領域内で遺伝子型が分離している個体を選定し、評価を行うこととした。マーカー選抜に用いたプライマーセット、DNA抽出方法、PCR条件、検出方法は実施例２と同様であった。
In addition, in order to further narrow down the region, the progeny (Kc15-148- 1-1), select and evaluate wild-type, heterozygous, and cultivated-type individuals in the narrowed region of
２．結果と考察
Kc14-1026-5-2及びKc15-148-1-1の遺伝子型とアスパラギン酸含量を比較した結果を図３に示す。Kc14-1026-5-2では絞り込んだ領域内に存在するAsp-F3/R3プライマーと04g074610プライマーを遺伝子型調査に用いた。両プライマーでともに野生種型ホモの個体（野生種型）はAsp含量が高く（Asp/Glu＝7.03）、栽培種型の個体（栽培種型）では含量が低かった（Asp/ Glu＝0.16）。またヘテロ型の個体ではAsp/Glu＝1.10であり、アスパラギン酸高含有形質は両プライマーセットでの多型検出結果と一致していた。
2. Results and discussion
FIG. 3 shows the results of comparing the genotypes of Kc14-1026-5-2 and Kc15-148-1-1 with the aspartic acid content. For Kc14-1026-5-2, Asp-F3/R3 primers and 04g074610 primers present in the narrowed region were used for genotyping. For both primers, the wild type homozygous individual (wild type) had a high Asp content (Asp/Glu = 7.03), and the cultivated type individual (cultivar type) had a low content (Asp/Glu = 0.16). . In heterozygous individuals, Asp/Glu was 1.10, and the aspartic acid-rich trait was consistent with the results of polymorphism detection with both primer sets.
Kc15-148-1-1では絞り込んだ領域内に存在する04g074740プライマー、04g074900プライマー、04g076240プライマーを遺伝子型調査に用いた。04g074740プライマーと04g074900プライマーでともに野生種型ホモの個体はAsp/Glu＝6.61、ヘテロ型の個体はAsp/Glu＝1.03、栽培種型の個体はAsp/ Glu＝0.13であり、アスパラギン酸高含有形質は本プライマーセットでの多型検出結果と一致していた。一方でこれらの個体において、04g076240プライマーで検定した遺伝子型は全て野生種型であった。本結果と図２の結果から、アスパラギン酸高含有形質の原因遺伝子は黒枠で示す60,001,206 ～ 61,179,940bp (SL2.50)の領域に座上していると判断した。 For Kc15-148-1-1, 04g074740 primers, 04g074900 primers, and 04g076240 primers present in the narrowed region were used for genotyping. For both 04g074740 and 04g074900 primers, wild-type homozygous individuals had Asp/Glu = 6.61, heterozygous individuals had Asp/Glu = 1.03, and cultivated-type individuals had Asp/Glu = 0.13. was consistent with the results of polymorphism detection with this primer set. On the other hand, in these individuals, all genotypes assayed with 04g076240 primers were wild type. Based on these results and the results in FIG. 2, it was determined that the causative gene for the aspartic acid-rich trait resides in the region of 60,001,206 to 61,179,940 bp (SL2.50) indicated by the black frame.
〔実施例４〕ソラナム・リコペルシカムにおけるアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子の座上領域絞り込み
１．材料と方法
アスパラギン酸高含有形質を持つ品種（保有品種）、Kc15-165-8（17J14-5)とアスパラギン酸高含有形質を持たない品種（非保有品種）、Kc17-332-1（18F250-B）を交配・自殖して得たF2世代、Kc18-121-1をファインマッピングに用いた。また対照にはKc15-165-8-5（17J14-5-1）とPK993を保有品種及び非保有品種として用いた。
[Example 4] Narrowing down loci of trait-causing genes with high aspartic acid content in
Kc18-121-1を50粒播種し、各個体から葉をサンプリングして、実施例２に記載のKOD FXシステムを用いた簡易DNA抽出方法とマーカー検定に従いDNAを抽出した。抽出したDNAと実施例２に記載の表２に示すNo.3、4、6プライマーを用いて、実施例２に記載の表３の条件に従いPCRを実施した。PCR結果から遺伝子型毎に定植・栽培を行った（表４）。 50 grains of Kc18-121-1 were seeded, leaves were sampled from each individual, and DNA was extracted according to the simple DNA extraction method using the KOD FX system described in Example 2 and the marker test. Using the extracted DNA and No. 3, 4 and 6 primers shown in Table 2 described in Example 2, PCR was performed according to the conditions in Table 3 described in Example 2. Based on the PCR results, planting and cultivation were performed for each genotype (Table 4).
２．評価方法
PK993以外の品種については各個体から、PK993については5株からバルクでそれぞれ完熟果をサンプリングし、クラッシュサンプルを作製した。洗浄した果実をミキサーで1分間破砕し、サンプル瓶に詰めて30分間煮沸したものをクラッシュサンプルとした。作製したサンプルを用いて分析要領に従ってRI、リコピン、グルタミン酸、アスパラギン酸高含有分析を実施した。
2. Evaluation method
Crush samples were prepared by sampling ripe fruits in bulk from each individual of the cultivars other than PK993 and from five strains of PK993. The washed fruit was crushed with a mixer for 1 minute, packed in a sample bottle and boiled for 30 minutes to obtain a crushed sample. RI, lycopene, glutamic acid, and aspartic acid content analysis was performed using the prepared sample according to the analysis procedure.
遺伝子型再確認のため各個体から葉をサンプリングし、実施例２に記載のKOD FXシステムを用いた簡易DNA抽出方法とマーカー検定に従って再びDNAを抽出した。抽出したDNAと実施例２に記載の表２に示すNo.3、4、6、8プライマーを用いて、実施例２に記載の表３の条件に従ってPCRを実施した。 Leaves were sampled from each individual for reconfirmation of the genotype, and DNA was extracted again according to the simple DNA extraction method using the KOD FX system described in Example 2 and the marker test. Using the extracted DNA and No. 3, 4, 6 and 8 primers shown in Table 2 described in Example 2, PCR was performed according to the conditions in Table 3 described in Example 2.
３．結果と考察
アスパラギン酸、グルタミン酸の含量及び遺伝子型の調査結果を表５に示す。F270、F271_A、F271_Bの個体は全てF270_CやF272の個体と比較してアスパラギン酸含量が高かった。このことから、F270、F271_A、F271_Bの個体で保有型の遺伝子型が共通しているNo.4プライマー付近（No.3プライマーからNo.6プライマーの領域、第4染色体60,483,830bp～60,557,813 bp (SL2.50））にアスパラギン酸高含有形質の原因遺伝子が座上していると考えた（図４）。本実施例の試験でKc15-165-8-5（F270）はアスパラギン酸高含有形質及びその他の栽培特性の固定が確認できたことから、採種した次世代種子（Kc15-165-8-5-1, 19F270-1）をPK1521とした。
3. Results and Discussion Table 5 shows the results of the investigation of the contents of aspartic acid and glutamic acid and the genotype. F270, F271_A and F271_B plants all had higher aspartic acid content than F270_C and F272 plants. From this, it was found that around the No. 4 primer (the region from the No. 3 primer to the No. 6 primer,
絞り込んだ領域には13個の遺伝子が存在した（表６）。そこで実施例３で原因遺伝子の座上領域を絞り込んだ際に取得したバルクシーケンスデータを用いて、13遺伝子上の多型を調査した。その結果、本形質を持つ個体に特異的な多型の無い遺伝子が1つ、多型はあるがアミノ酸置換を伴わない遺伝子が2つ存在した。これらの遺伝子を除いた10遺伝子の中に原因遺伝子が存在すると考えた。絞り込んだ10遺伝子とアスパラギン酸の関連についてはこれまでに報告されていないことから、原因遺伝子はアスパラギン酸の生合成又は代謝に関わる新規の遺伝子である可能性が高かった。 There were 13 genes in the narrowed region (Table 6). Therefore, using the bulk sequence data obtained when narrowing down the locus region of the causative gene in Example 3, polymorphisms on 13 genes were investigated. As a result, there was one gene without specific polymorphisms in individuals with this trait, and two genes with polymorphisms but no amino acid substitutions. We considered that the causative gene exists among the 10 genes other than these genes. Since the relationship between the narrowed down 10 genes and aspartic acid has not been reported so far, the causative gene was highly likely to be a novel gene involved in the biosynthesis or metabolism of aspartic acid.
なお、No.4プライマーでPCRを実施した際、非保有品種であるPK993（F272）は240bpのバンドが検出されたが、Kc18-121-1の非保有個体（F271_C）ではバンドが検出されなかった（図５中央）。そのため、Kc18-121-1の個体間においてはNo.4プライマーでは保有ホモ型とヘテロ型ともに同じバンドパターンとなり、遺伝子型を同定できなかった（F271_A、F271_B）。F270及びF271_Aについてはアスパラギン酸含量が高く、前後の遺伝子型からもNo.4の遺伝子型は保有型ホモと推測した（表５）。一方でF271_Bについては前後の遺伝子型が異なるため遺伝子型を判別することは難しいものの、アスパラギン酸含量がF270やF271_Aと同程度に高かったことから、原因遺伝子が座上していると推測されるNo.4プライマーは保有型ホモの可能性が高かった。 When PCR was performed with No.4 primer, a 240 bp band was detected in the non-carrying cultivar PK993 (F272), but no band was detected in the non-carrying individual of Kc18-121-1 (F271_C). (Fig. 5 center). Therefore, among Kc18-121-1 individuals, the same band pattern was obtained for both the possessed homozygous type and the heterozygous type with the No. 4 primer, and the genotype could not be identified (F271_A, F271_B). As for F270 and F271_A, the aspartic acid content was high, and from the genotypes before and after, the genotype of No. 4 was presumed to be a homozygous type (Table 5). On the other hand, although it is difficult to determine the genotype of F271_B because the genotypes before and after are different, it is presumed that the causative gene is located because the aspartic acid content was as high as that of F270 and F271_A. There was a high possibility that the No.4 primer was homozygous for the retained type.
また、No.3プライマーとNo.6プライマーでの検定においても非保有品種間でバンドサイズが異なった（図５）。このことから栽培種（非保有品種）ではNo.3、No.4、No.6プライマーの場所に複数のアリルが存在すると推測した。 In addition, the band sizes differed between the non-carrying cultivars in the tests with the No. 3 primer and the No. 6 primer (Fig. 5). From this, it was inferred that there are multiple alleles at the sites of No. 3, No. 4, and No. 6 primers in cultivars (non-retaining cultivars).
作製したNo.4プライマーを用いることで、ソラナム・キミエルスキー由来のアスパラギン酸高含有形質を持つ個体を選抜することが可能であったことから、DNAマーカーとして使用可能だと考えた。 By using the prepared No. 4 primer, it was possible to select Solanum kimierskii-derived individuals with a high content of aspartic acid, so we thought that it could be used as a DNA marker.
まとめ
アスパラギン酸高含有形質のファインマッピングを行い、加工用トマト品種でも利用可能なDNAマーカーの開発を試みた。その結果、原因遺伝子は第4染色体の60,483,830bpから60,557,813bp （SL2.50）の領域に座上していた。この領域の多型を検出するプライマーセット、04g074530-F/Rを用いることで、加工用品種においてもソラナム・キミエルスキー由来のアスパラギン酸高含有形質を持つ個体を選抜することが可能であった。本結果から04g074530-F/Rをアスパラギン酸高含マーカーとして育種利用していく。
Conclusion Fine mapping of traits with high aspartic acid content was performed, and attempts were made to develop DNA markers that can be used in tomato cultivars for processing. As a result, the causative gene was located in the region from 60,483,830bp to 60,557,813bp (SL2.50) of
Claims (11)
第4染色体上にアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子を含み、
前記アスパラギン酸高含有形質原因遺伝子は、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,001,206bp～61,179,940bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域に含まれるものである、
前記ソラナム・リコペルシカム。 Solanum lycopersicum,
Containing an aspartic acid-rich trait-causing gene on chromosome 4,
The aspartic acid-rich trait-causing gene is contained in the gene region of chromosome 4 of Solanum lycopersicum (SL2.50) corresponding to the gene region of 60,001,206 bp to 61,179,940 bp of chromosome 4 of Solanum lycopersicum (SL2.50). is something that can be
Said Solanum lycopersicum.
配列番号５の塩基配列を有するDNA及び配列番号６の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、配列番号７の塩基配列を有するDNA及び配列番号８の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、配列番号１１の塩基配列を有するDNA及び配列番号１２の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、又は配列番号１５の塩基配列を有するDNA及び配列番号１６の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセットを用いるPCRによって、第4染色体上にホモ接合型又はヘテロ接合型で存在するアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子が検出される、
前記ソラナム・リコペルシカム。 Solanum lycopersicum,
A primer set containing the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:5 and the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:6, a primer set containing the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:7 and the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: PCR using a primer set containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12, or a primer set containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 , an aspartic acid-rich trait-causing gene present in homozygous or heterozygous form on chromosome 4 is detected,
Said Solanum lycopersicum.
第4染色体上にアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子を含む第一の親品種と、任意の第二の親品種とを交配してF1世代を得る工程、及び、
得られたF1世代又はその後代において、第4染色体上に前記アスパラギン酸高含有形質原因遺伝子をホモ接合型又はヘテロ接合型で含むソラナム・リコペルシカムを選抜する工程、
を含み、
前記アスパラギン酸高含有形質原因遺伝子は、ソラナム・リコペルシカム(SL2.50)の第4染色体の60,001,206bp～61,179,940bpの遺伝子領域に対応するソラナム・キミエルスキー LA1318系統の第4染色体の遺伝子領域に含まれるものである、
前記方法。 A method for producing Solanum lycopersicum, comprising:
A step of crossing a first parent cultivar containing an aspartic acid-rich trait-causing gene on chromosome 4 with an arbitrary second parent cultivar to obtain an F1 generation;
A step of selecting Solanum lycopersicum containing the trait-causing gene with high aspartic acid content on chromosome 4 in the obtained F1 generation or its progeny in a homozygous or heterozygous manner;
including
The aspartic acid-rich trait-causing gene is contained in the gene region of chromosome 4 of Solanum lycopersicum (SL2.50) corresponding to the gene region of 60,001,206 bp to 61,179,940 bp of chromosome 4 of Solanum lycopersicum (SL2.50). is something that can be
the aforementioned method.
ソラナム・リコペルシカムの第4染色体上のアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子を含む遺伝子領域を検出する工程を含み、
前記検出工程は、配列番号５の塩基配列を有するDNA及び配列番号６の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、配列番号７の塩基配列を有するDNA及び配列番号８の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、配列番号１１の塩基配列を有するDNA及び配列番号１２の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセット、又は配列番号１５の塩基配列を有するDNA及び配列番号１６の塩基配列を有するDNAを含むプライマーセットを用いるPCRによって、第4染色体上にホモ接合型又はヘテロ接合型で存在するアスパラギン酸高含有形質原因遺伝子が検出されるPCRにより行われる、
前記方法。
A method for identifying Solanum lycopersicum, comprising:
A step of detecting a gene region containing a trait-causing gene with high aspartic acid content on chromosome 4 of Solanum lycopersicum,
The detection step includes a primer set containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8. A primer set, a primer set containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12, or a primer containing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 PCR using the set detects an aspartic acid-rich trait-causing gene that is homozygous or heterozygous on chromosome 4,
the aforementioned method.
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