JP7014469B2 - ３次元流路構造体およびこれを用いたナノ粒子の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、３次元流路構造体およびこれを用いたナノ粒子の製造方法に関する。
本発明は、３次元流路構造体およびこれを用いたナノ粒子の製造方法に関する。
脂質ナノ粒子やポリマーミセルなどの、自己組織化分子を粒子構成成分として含むナノ粒子は、ドラッグデリバリーシステム（DDS）のためのナノキャリアとして最も実用化が進んでおり、すでに臨床応用されている。最近になって、ナノキャリアの粒径によってがん組織への薬剤の送達効率が異なることが明らかになった。そこで、ナノ粒子の粒径を精密に制御するために、マイクロ流体デバイスを用いた粒径制御法が開発されている[非特許文献2-4]。
さらに本発明者らは、作製ないし加工が容易であり、かつ粒子径制御性が高いマイクロ流体デバイス及びそれを用いたナノ粒子の製造方法を開発した[非特許文献1及び特許文献1]。非特許文献１及び特許文献１に記載のナノ粒子の製造方法では、マイクロ流路中で脂質ナノ粒子を作る際の原料である脂質/アルコール溶液を緩衝液などによって迅速に希釈することで、精密な粒径制御を可能としている。
特許文献１：ＷＯ２０１８／１９０４２３
特許文献２：特開２００９－５０５９５７号公報
特許文献３：特表２０１３－５１００９６号公報
特許文献２：特開２００９－５０５９５７号公報
特許文献３：特表２０１３－５１００９６号公報
非特許文献１：“Development of the iLiNP Device: Fine Tuning the Lipid Nanoparticle Size within 10 nm for Drug Delivery”, N. Kimura, M. Maeki, Y. Sato, T. Note, A. Ishida, H. Tani, H. Harashima, and M. Tokeshi, ACS Omega, 3, 5044, (2018).
非特許文献２：“Understanding the Formation Mechanism of Lipid Nanoparticles in Microfluidic Devices with Chaotic Micromixers”, M. Maeki, Y. Fujishima, Y. Sato, T. Yasui, N. Kaji, A. Ishida, H. Tani, Y. Baba, H. Harashima, and M. Tokeshi, PLOS ONE, 12, e0187962, (2017).
非特許文献３：“Bottom-Up Design and Synthesis of Limit Size Lipid Nanoparticle Systems with Aqueous and Triglyceride Cores Using Millisecond Microfluidic Mixing”, I. V. Zhigaltsev, N. Belliveau, I. Hafez, A. K. K. Leung, C. Hansen, and P. R. Cullis, Langmuir, 38, 3633, (2012).
非特許文献４：“Rapid Discovery of Protein siRNA-Containing Lipid Nanoparticles Enabled by Controlled Microfluidic Formation”, D. Chen, K. T. Love, Y. Chen, A. A. Eltoukhy, C. Kastrup, G. Sahay, A. Jeon, Y. Dong, K. A. Whitehead, and D. G. Anderson, Journal of the American Chemical Society, 134, 6948, (2012).
非特許文献２：“Understanding the Formation Mechanism of Lipid Nanoparticles in Microfluidic Devices with Chaotic Micromixers”, M. Maeki, Y. Fujishima, Y. Sato, T. Yasui, N. Kaji, A. Ishida, H. Tani, Y. Baba, H. Harashima, and M. Tokeshi, PLOS ONE, 12, e0187962, (2017).
非特許文献３：“Bottom-Up Design and Synthesis of Limit Size Lipid Nanoparticle Systems with Aqueous and Triglyceride Cores Using Millisecond Microfluidic Mixing”, I. V. Zhigaltsev, N. Belliveau, I. Hafez, A. K. K. Leung, C. Hansen, and P. R. Cullis, Langmuir, 38, 3633, (2012).
非特許文献４：“Rapid Discovery of Protein siRNA-Containing Lipid Nanoparticles Enabled by Controlled Microfluidic Formation”, D. Chen, K. T. Love, Y. Chen, A. A. Eltoukhy, C. Kastrup, G. Sahay, A. Jeon, Y. Dong, K. A. Whitehead, and D. G. Anderson, Journal of the American Chemical Society, 134, 6948, (2012).
自己組織化分子ナノ粒子に封入される生理活性物質の一例として核酸が挙げられる。特許文献１～３及び非特許文献１には、核酸をカチオン性の脂質ナノ粒子に封入させることを開示している。核酸はアニオン性であるため、反対の電荷を有するカチオン性の脂質ナノ粒子への封入は比較的容易である。しかし、カチオン性の脂質は、血中でタンパク質に吸着することがあり、かつ細胞毒性の問題がある。カチオン性脂質以外に中性脂質及びアニオン性脂質があるが、中性脂質は電荷を有さず、核酸を吸引する能力はなく、アニオン性脂質はアニオン性である核酸と同じ電荷を有し、電荷的には反発することから、脂質ナノ粒子への封入は、アニオン性脂質の場合に比べて格段に難しかった。この点は脂質以外の自己組織化分子についても同様である。またここでは核酸を例として挙げたが他のアニオン性分子(低分子、中分子、高分子)を封入しようとする場合でも同様である。
本発明は、中性自己組織化分子及びアニオン性自己組織化分子を用いる場合であっても、高い封入率でアニオン性分子（以降、核酸を中心に説明するがこれに限定されない）を封入した自己組織化分子ナノ粒子を調製でき、かつ自己組織化分子ナノ粒子の粒径も精密に制御することが可能な自己組織化分子ナノ粒子の製造方法及び製造に用いる流路構造体を提供することを目的とする。
本発明は以下の通りである。
［１］
自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子（以下、自己組織化分子粒子と呼ぶ）を形成するための流路構造体であって、
前記流路構造体は、基体及びその内部に設けた流路構造を有し、
流路構造は、その上流側において、互いに独立した、第１の流動体を導入する第１導入路と、第２の流動体を導入する第２導入路との少なくとも２つの導入路を有し、かつ前記導入路は合流部位において合流し、
流路構造は、前記合流部位の下流側に向かって少なくとも１つの三次元的に屈曲した希釈流路を有し、
前記三次元的に屈曲した希釈流路は、これより上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をＸ方向とし、Ｘ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をＹ方向とし、Ｘ方向及びＹ方向とそれぞれ垂直に交差する希釈流路の深さ方向をＺ方向とし、少なくともその一部の希釈流路内において、Ｙ方向に突出した２以上のＹ構造子及びＺ方向に突出した１以上のＺ構造子をそれぞれ独立に有し、かつ前記Ｙ構造子の隣接する少なくとも２つはＹ方向に交互に突出する、流路構造体。
［２］
Ｙ構造子は、突出長が流路幅の±１０～９０％の範囲（但し、一方の流路内面からの突出長を＋とし、一方の流路内面に対向する位置にある流路内面からの突出長を－とする）であり、Ｘ方向の長さが、流路幅の１０％～１０００％の範囲であり、隣り合う２つのＹ構造子の対向する位置にある面の間隔が流路幅の１０％～１０００％の範囲である、［１］に記載の流路構造体。
［３］
Ｚ構造子は、突出長が流路高さの±１０～９０％の範囲（但し、一方の流路内面からの突出長を＋とし、一方の流路内面に対向する位置にある流路内面からの突出長を－とする）であり、Ｘ方向の長さが、流路幅の１０％～１０００％の範囲であり、Ｚ構造子が２以上の場合は隣り合う２つのＺ構造子の対向する位置にある面の間隔が流路幅の１０％以上である、［１］または［２］に記載の流路構造体。
［４］
前記導入路の合流部位から最初のＹ構造子及び／又は最初のＺ構造子までの希釈流路の長さｘ、幅ｙ及び高さｚは、ｘ：ｙが１～１００：１の範囲、ｚ：ｙが０．１～５：１の範囲である、［１］～［３］のいずれかに記載の流路構造体。
［５］
前記導入路の合流部位から最初の構造子は、Ｙ構造子、Ｚ構造子又はＹ構造子及びＺ構造子である、［１］～［４］のいずれかに記載の流路構造体。
［６］
前記導入路の合流部位から最初の構造子がＹ構造子（以下、第１Ｙ構造子と呼び、下流のＹ構造子を順次第ｍＹ構造子、ｍは２以上の整数、と呼ぶ）及びＺ構造子（以下、第１Ｚ構造子と呼び、下流のＺ構造子を順次第ｎＹ構造子、ｎは２以上の整数、と呼ぶ）であり、
第１Ｙ構造子のＸ方向の長さと第１Ｚ構造子のＸ方向の長さが同一であり、
第１Ｚ構造子と第２Ｚ構造子との間隔が、第１Ｙ構造子と第２Ｙ構造子との間隔に等しい、［１］～［５］のいずれかに記載の流路構造体。
［７］
第２Ｚ構造子及び第２Ｙ構造子より下流のＺ構造子の設置位置とＹ構造子の設置位置は、［６］に記載の位置関係と同様の関係を有する、［６］に記載の流路構造体。
［８］
前記導入路の合流部位から最初の構造子がＹ構造子であり、
前記導入路の合流部位から最初のＺ構造子である第１Ｚ構造子の上流側面は、第２Ｙ構造子の上流側面と同じ位置にあり、
第１Ｚ構造子のＸ方向の長さは、第２Ｙ構造子のＸ方向の長さと同一であり、
第１Ｚ構造子と第２Ｚ構造子との間隔が、第２Ｙ構造子と第４Ｙ構造子との間隔に等しい、［１］～［５］のいずれかに記載の流路構造体。
［９］
第２Ｚ構造子及び第４Ｙ構造子より下流のＺ構造子の設置位置とＹ構造子の設置位置は、［８］に記載の位置関係と同様の関係を有する、［８］に記載の流路構造体。
［１０］
前記導入路の合流部位から最初の構造子がＹ構造子及びＺ構造子であり、
前記導入路の合流部位から１番目のＺ構造子である第１Ｚ構造子の上流側面は、第１Ｙ構造子の上流側面と同じ位置にあり、
第１Ｚ構造子のＸ方向の長さは、第１Ｙ構造子のＸ方向の長さと同一であり、
第１Ｚ構造子と第２Ｚ構造子との間隔が、第１Ｙ構造子と第３Ｙ構造子との間隔に等しい、［１］～［５］のいずれかに記載の流路構造体。
［１１］
第２Ｚ構造子及び第４Ｙ構造子より下流のＺ構造子の設置位置とＹ構造子の設置位置は、［１０］に記載の位置関係と同様の関係を有する、［１０］に記載の流路構造体。
［１２］
構Ｙ造子及びＺ構造子の数は、構造子Ｙが３～１００個の範囲であり、構造子Ｚが２～１００個の範囲である［１］～［１１］のいずれかに記載の流路構造体。
［１３］
前記導入路の合流部位から最初のＹ構造子及び／又は最初のＺ構造子までの希釈流路の長さｘは２０～１０００μｍの範囲であり、幅ｙは２０～１０００μｍの範囲であり、かつ高さｚは２０～１０００μｍの範囲である［１］～［１２］のいずれかに記載の流路構造体。
［１４］
前記第１導入路及び前記第２導入路は、前記合流部位において流路方向（Ｘ方向）に対してそれぞれ独立に１０～９０°の角度で交差する、［１］～［１３］のいずれかに記載の流路構造体。
［１５］
前記第１導入路は複数の流路からなる、および／または前記第２導入路は複数の流路からなる、［１］～［１４］のいずれかに記載の流路構造体。
［１６］
自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体を流路構造体に供給して、被封入物質を封入した自己組織化分子粒子を形成することを含む自己組織化分子粒子の製造方法であって、
前記自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体の少なくとも一方が被封入物質を含有し、
前記流路構造体が［１］～［１５］のいずれかに記載の流路構造体であり、
この流路構造体の第１導入路および第２導入路の一方より前記自己組織化分子含有溶液を導入し、他方の導入路より前記希釈媒体を導入して、希釈流路内で自己組織化分子含有溶液を希釈媒体で希釈して前記自己組織化分子粒子を得る、前記製造方法。
［１７］
前記自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体は、総流量が１μｌ／分～１００ｍｌ／分となるように流路構造体に導入させる、［１６］に記載の製造方法。
［１８］
前記自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体の総流量は、前記第１導入路と前記第２導入路との合流部位から最初の構造子の上流側端部までの間を、前記自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体が０．１秒以下の時間で通過するように、前記自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体の総流量を定め、並びに／又は前記流路構造体の第１導入路と第２導入路との合流部位から最初の構造子の上流側端部までの間隔を設定する、［１６］又は［１７］に記載の製造方法。
［１９］
前記自己組織化分子含有溶液が、中性脂質含有溶液、アニオン性脂質含有溶液、カチオン性脂質含有溶液及びポリマー含有溶液からなる群から選ばれる少なくとも１種である、［１６］～［１８］のいずれかに記載の製造方法。
［２０］
前記被封入物質は、核酸である［１６］～［１９］のいずれかに記載の製造方法。
［２１］
前記被封入物質を封入した自己組織化分子粒子は、個数平均粒子径が２０～２００ｎｍの範囲である［１６］～［２０］のいずれかに記載の製造方法。
［１］
自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子（以下、自己組織化分子粒子と呼ぶ）を形成するための流路構造体であって、
前記流路構造体は、基体及びその内部に設けた流路構造を有し、
流路構造は、その上流側において、互いに独立した、第１の流動体を導入する第１導入路と、第２の流動体を導入する第２導入路との少なくとも２つの導入路を有し、かつ前記導入路は合流部位において合流し、
流路構造は、前記合流部位の下流側に向かって少なくとも１つの三次元的に屈曲した希釈流路を有し、
前記三次元的に屈曲した希釈流路は、これより上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をＸ方向とし、Ｘ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をＹ方向とし、Ｘ方向及びＹ方向とそれぞれ垂直に交差する希釈流路の深さ方向をＺ方向とし、少なくともその一部の希釈流路内において、Ｙ方向に突出した２以上のＹ構造子及びＺ方向に突出した１以上のＺ構造子をそれぞれ独立に有し、かつ前記Ｙ構造子の隣接する少なくとも２つはＹ方向に交互に突出する、流路構造体。
［２］
Ｙ構造子は、突出長が流路幅の±１０～９０％の範囲（但し、一方の流路内面からの突出長を＋とし、一方の流路内面に対向する位置にある流路内面からの突出長を－とする）であり、Ｘ方向の長さが、流路幅の１０％～１０００％の範囲であり、隣り合う２つのＹ構造子の対向する位置にある面の間隔が流路幅の１０％～１０００％の範囲である、［１］に記載の流路構造体。
［３］
Ｚ構造子は、突出長が流路高さの±１０～９０％の範囲（但し、一方の流路内面からの突出長を＋とし、一方の流路内面に対向する位置にある流路内面からの突出長を－とする）であり、Ｘ方向の長さが、流路幅の１０％～１０００％の範囲であり、Ｚ構造子が２以上の場合は隣り合う２つのＺ構造子の対向する位置にある面の間隔が流路幅の１０％以上である、［１］または［２］に記載の流路構造体。
［４］
前記導入路の合流部位から最初のＹ構造子及び／又は最初のＺ構造子までの希釈流路の長さｘ、幅ｙ及び高さｚは、ｘ：ｙが１～１００：１の範囲、ｚ：ｙが０．１～５：１の範囲である、［１］～［３］のいずれかに記載の流路構造体。
［５］
前記導入路の合流部位から最初の構造子は、Ｙ構造子、Ｚ構造子又はＹ構造子及びＺ構造子である、［１］～［４］のいずれかに記載の流路構造体。
［６］
前記導入路の合流部位から最初の構造子がＹ構造子（以下、第１Ｙ構造子と呼び、下流のＹ構造子を順次第ｍＹ構造子、ｍは２以上の整数、と呼ぶ）及びＺ構造子（以下、第１Ｚ構造子と呼び、下流のＺ構造子を順次第ｎＹ構造子、ｎは２以上の整数、と呼ぶ）であり、
第１Ｙ構造子のＸ方向の長さと第１Ｚ構造子のＸ方向の長さが同一であり、
第１Ｚ構造子と第２Ｚ構造子との間隔が、第１Ｙ構造子と第２Ｙ構造子との間隔に等しい、［１］～［５］のいずれかに記載の流路構造体。
［７］
第２Ｚ構造子及び第２Ｙ構造子より下流のＺ構造子の設置位置とＹ構造子の設置位置は、［６］に記載の位置関係と同様の関係を有する、［６］に記載の流路構造体。
［８］
前記導入路の合流部位から最初の構造子がＹ構造子であり、
前記導入路の合流部位から最初のＺ構造子である第１Ｚ構造子の上流側面は、第２Ｙ構造子の上流側面と同じ位置にあり、
第１Ｚ構造子のＸ方向の長さは、第２Ｙ構造子のＸ方向の長さと同一であり、
第１Ｚ構造子と第２Ｚ構造子との間隔が、第２Ｙ構造子と第４Ｙ構造子との間隔に等しい、［１］～［５］のいずれかに記載の流路構造体。
［９］
第２Ｚ構造子及び第４Ｙ構造子より下流のＺ構造子の設置位置とＹ構造子の設置位置は、［８］に記載の位置関係と同様の関係を有する、［８］に記載の流路構造体。
［１０］
前記導入路の合流部位から最初の構造子がＹ構造子及びＺ構造子であり、
前記導入路の合流部位から１番目のＺ構造子である第１Ｚ構造子の上流側面は、第１Ｙ構造子の上流側面と同じ位置にあり、
第１Ｚ構造子のＸ方向の長さは、第１Ｙ構造子のＸ方向の長さと同一であり、
第１Ｚ構造子と第２Ｚ構造子との間隔が、第１Ｙ構造子と第３Ｙ構造子との間隔に等しい、［１］～［５］のいずれかに記載の流路構造体。
［１１］
第２Ｚ構造子及び第４Ｙ構造子より下流のＺ構造子の設置位置とＹ構造子の設置位置は、［１０］に記載の位置関係と同様の関係を有する、［１０］に記載の流路構造体。
［１２］
構Ｙ造子及びＺ構造子の数は、構造子Ｙが３～１００個の範囲であり、構造子Ｚが２～１００個の範囲である［１］～［１１］のいずれかに記載の流路構造体。
［１３］
前記導入路の合流部位から最初のＹ構造子及び／又は最初のＺ構造子までの希釈流路の長さｘは２０～１０００μｍの範囲であり、幅ｙは２０～１０００μｍの範囲であり、かつ高さｚは２０～１０００μｍの範囲である［１］～［１２］のいずれかに記載の流路構造体。
［１４］
前記第１導入路及び前記第２導入路は、前記合流部位において流路方向（Ｘ方向）に対してそれぞれ独立に１０～９０°の角度で交差する、［１］～［１３］のいずれかに記載の流路構造体。
［１５］
前記第１導入路は複数の流路からなる、および／または前記第２導入路は複数の流路からなる、［１］～［１４］のいずれかに記載の流路構造体。
［１６］
自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体を流路構造体に供給して、被封入物質を封入した自己組織化分子粒子を形成することを含む自己組織化分子粒子の製造方法であって、
前記自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体の少なくとも一方が被封入物質を含有し、
前記流路構造体が［１］～［１５］のいずれかに記載の流路構造体であり、
この流路構造体の第１導入路および第２導入路の一方より前記自己組織化分子含有溶液を導入し、他方の導入路より前記希釈媒体を導入して、希釈流路内で自己組織化分子含有溶液を希釈媒体で希釈して前記自己組織化分子粒子を得る、前記製造方法。
［１７］
前記自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体は、総流量が１μｌ／分～１００ｍｌ／分となるように流路構造体に導入させる、［１６］に記載の製造方法。
［１８］
前記自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体の総流量は、前記第１導入路と前記第２導入路との合流部位から最初の構造子の上流側端部までの間を、前記自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体が０．１秒以下の時間で通過するように、前記自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体の総流量を定め、並びに／又は前記流路構造体の第１導入路と第２導入路との合流部位から最初の構造子の上流側端部までの間隔を設定する、［１６］又は［１７］に記載の製造方法。
［１９］
前記自己組織化分子含有溶液が、中性脂質含有溶液、アニオン性脂質含有溶液、カチオン性脂質含有溶液及びポリマー含有溶液からなる群から選ばれる少なくとも１種である、［１６］～［１８］のいずれかに記載の製造方法。
［２０］
前記被封入物質は、核酸である［１６］～［１９］のいずれかに記載の製造方法。
［２１］
前記被封入物質を封入した自己組織化分子粒子は、個数平均粒子径が２０～２００ｎｍの範囲である［１６］～［２０］のいずれかに記載の製造方法。
本発明によれば、アニオン性分子であっても高い封入率で封入した自己組織化分子ナノ粒子を調製でき、かつ自己組織化分子ナノ粒子の粒径も精密に制御することが可能な自己組織化分子ナノ粒子の製造方法、及びこの製造に用いる流路構造体を提供することができる。
(流路構造体)
本発明の流路構造体は、自己組織化分子粒子を形成するための流路構造体である。この流路構造体は、基体及びその内部に設けた流路構造を有する。流路構造は、その上流側において、互いに独立した、第１の流動体を導入する第１導入路と、第２の流動体を導入する第２導入路との少なくとも２つの導入路を有する。さらに、少なくとも２つの導入路は合流部位において合流し、流路構造は、前記合流部位の下流側に向かって少なくとも１つの三次元的に屈曲した希釈流路を有する。三次元的に屈曲した希釈流路は、少なくともその一部の希釈流路内において、流路内部のＹ方向に突出した２以上のＹ構造子及び流路内部のＺ方向に突出した１以上のＺ構造子をそれぞれ独立に有し、かつＹ構造子の隣接する少なくとも２つはＹ方向に交互に突出する。Ｙ構造子及びＺ構造子は、希釈流路の流路内部に向かって突出する。但し、三次元的に屈曲した部分より上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をＸ方向とし、Ｘ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をＹ方向とし、Ｘ方向及びＹ方向とそれぞれ垂直に交差する希釈流路の深さ方向をＺ方向とする。
本発明の流路構造体は、自己組織化分子粒子を形成するための流路構造体である。この流路構造体は、基体及びその内部に設けた流路構造を有する。流路構造は、その上流側において、互いに独立した、第１の流動体を導入する第１導入路と、第２の流動体を導入する第２導入路との少なくとも２つの導入路を有する。さらに、少なくとも２つの導入路は合流部位において合流し、流路構造は、前記合流部位の下流側に向かって少なくとも１つの三次元的に屈曲した希釈流路を有する。三次元的に屈曲した希釈流路は、少なくともその一部の希釈流路内において、流路内部のＹ方向に突出した２以上のＹ構造子及び流路内部のＺ方向に突出した１以上のＺ構造子をそれぞれ独立に有し、かつＹ構造子の隣接する少なくとも２つはＹ方向に交互に突出する。Ｙ構造子及びＺ構造子は、希釈流路の流路内部に向かって突出する。但し、三次元的に屈曲した部分より上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をＸ方向とし、Ｘ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をＹ方向とし、Ｘ方向及びＹ方向とそれぞれ垂直に交差する希釈流路の深さ方向をＺ方向とする。
本発明の流路構造体により形成される、自己組織化分子粒子については後述する。
本発明の流路構造体を図１に基づいて以下に詳細に説明する。
図１－１（ａ）に、本発明の流路構造体の流路構造1を示す。流路構造体は、図示されていないが、基体とこの基体内部に設けた流路構造からなり、基体は、樹脂等の硬質又は軟質の材料からなり、流路構造１の少なくとも一部は、基体内部に管状構造として形成される。管状構造の横断面の形状は特に制限はないが、矩形（例えば、正方形、長方形、菱形など）、多角形（例えば、三角形、五角形、六角形、八角形など）、円形（例えば、真円、楕円、長丸）、矩形、多角形及び円形のいずれかの組合せなどであることができる。また、流路構造の部位によらず横断面の形状が同一であってもよく、あるいは流路構造の部位によって横断面の形状が異なっても良い。図１－１、１－２、１－３、２、６、１３、２０、２９～３２には、基体内部に形成された流路構造のみを記載する。また、各図に記載の流路構造には、部位によって便宜上２種類の濃淡が形成されているが、構造の違いや隔壁の存在を示すものではなく、流路構造の内部は隔壁などない一体の中空である。
図１－１（ａ）に、本発明の流路構造体の流路構造1を示す。流路構造体は、図示されていないが、基体とこの基体内部に設けた流路構造からなり、基体は、樹脂等の硬質又は軟質の材料からなり、流路構造１の少なくとも一部は、基体内部に管状構造として形成される。管状構造の横断面の形状は特に制限はないが、矩形（例えば、正方形、長方形、菱形など）、多角形（例えば、三角形、五角形、六角形、八角形など）、円形（例えば、真円、楕円、長丸）、矩形、多角形及び円形のいずれかの組合せなどであることができる。また、流路構造の部位によらず横断面の形状が同一であってもよく、あるいは流路構造の部位によって横断面の形状が異なっても良い。図１－１、１－２、１－３、２、６、１３、２０、２９～３２には、基体内部に形成された流路構造のみを記載する。また、各図に記載の流路構造には、部位によって便宜上２種類の濃淡が形成されているが、構造の違いや隔壁の存在を示すものではなく、流路構造の内部は隔壁などない一体の中空である。
本発明の流路構造体の流路構造１は、その上流側において、互いに独立した、第１の流動体を導入する第１導入路１０と、第２の流動体を導入する第２導入路２０との少なくとも２つの導入路を有す。第１導入路１０と第２導入路２０は合流部位３０において合流する。さらに、合流部位３０の下流側に向かって少なくとも１つの三次元的に屈曲した希釈流路４０を有する。三次元的に屈曲した希釈流路４０は、少なくともその一部の希釈流路内において、Ｙ方向に突出した２以上のＹ構造子５０ａ、５０ｂ・・・及びＺ方向に突出した１以上のＺ構造子６０ａ、６０ｂ・・をそれぞれ独立に有する。図１－１～１－３においては、希釈流路４０の上流部の一部のＹ構造子及びＺ構造子のみを図示する。Ｙ構造子及びＺ構造子は、希釈流路内において流通する流体の流れ方向を変化させる邪魔板又はバッフル板として機能する。隣接する少なくとも２つのＹ構造子はＹ方向に交互に突出する構造を有する。これにより、希釈媒体による自己組織化分子含有溶液中の自己組織化分子の希釈とそれにより生じる粒子の形成が促進される。好ましくは、隣接するＹ構造子の３又はそれ以上、より好ましくは全部がＹ方向に交互に突出する構造を有する。本発明の流路構造体の流路構造においては、Ｙ構造子に加えて、少なくとも１のＺ構造子を設けることで、希釈媒体による自己組織化分子含有溶液中の自己組織化分子の希釈とそれにより生じる粒子の形成が、Ｙ構造子のみを有する場合に比べてさらに顕著に促進される。
図１－１（ａ）に記載の本発明の流路構造体の流路構造1では、複数のＹ構造子５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄ及びＺ構造子６０ａ、６０ｂ、６０ｃ、６０ｄが示されている。但し、Ｚ構造子６０ｂ及び６０ｄは、流路のかげになり、図中では見えていない。図１－２には、本発明の流路構造体の流路構造1をｘ－ｙ断面及びｘ－ｚ断面に分けて記載する。ｘ－ｚ断面の（Ｉ）は、上段及び下段の厚みがそれぞれ５０μｍである態様（実施例では基本形と呼ぶことがある。）であり、（ＩＩ）は上段及び下段の厚みがそれぞれ５０μｍであるが、ｘ－ｚ断面に示されるＺ構造子は６０ａ及び６０ｃであり、６０ｂは有さない態様、（ＩＩＩ）は上段及び下段の厚みが２０μｍ及び８０μｍである態様、（ＩＶ）は上段及び下段の厚みが８０μｍ及び２０μｍである態様の４つの態様を示す。図１－３には、本発明の流路構造体の流路構造1を、図１－１とは異なる角度からの斜視図として示し、かつ一部透視図とした。図１－３からは、Ｙ構造子５０ａとＺ構造子６０ａとの関係、Ｙ構造子５０ｂとＺ構造子６０ｂとの関係、及びＹ構造子５０ｃとＺ構造子６０ｃとの関係が分かる。尚、図１－１～１－３に示した態様では、２以上のＹ構造子及び２以上のＺ構造子がそれぞれ交互に配置されているが、本発明はこれに限定される意図ではなく、Ｙ構造子については、隣接する少なくとも２つのＹ構造子がＹ方向に交互に突出する構造を有すれば良く、Ｚ構造子は少なくとも１つ設けられていれば良い。
第１導入路１０は、最上流に第１の流動体を導入するための導入口１１を有し、第２導入路２０は、最上流に第２の流動体を導入するための導入口２１を有する。希釈流路４０は最下流に流路構造１で形成された自己組織化分子粒子を含む流体を排出するための排出口（図示せず）を有する。
図１－１（ｂ）に示すように、Ｙ構造子は、突出長が、例えば、流路幅の±１０～９０％の範囲であることができる。但し、一方の流路内面からの突出長を＋とし、一方の流路内面に対向する位置にある流路内面からの突出長を－とする。Ｙ構造子の突出長は、好ましくは流路幅の±２０～８０％の範囲、より好ましくは流路幅の±３０～７０％の範囲、さらに好ましくは流路幅の±４０～６０％の範囲である。Ｙ構造子のＸ方向の長さは、例えば、流路幅の１０％～１０００％の範囲であることができ、好ましくは流路幅の２０％～５００％の範囲、より好ましくは流路幅の３０％～３００％の範囲、さらに好ましくは流路幅の４０％～２００％の範囲、一層好ましくは流路幅の５０％～１５０％の範囲である。隣り合う２つのＹ構造子の対向する位置にある面の間隔は、例えば、流路幅の１０％～１０００％の範囲であることができ、好ましくは流路幅の２０％～５００％の範囲、より好ましくは流路幅の３０％～３００％の範囲、さらに好ましくは流路幅の４０％～２００％の範囲、一層好ましくは流路幅の５０％～１５０％の範囲である。
図１－１（ｂ）に示すように、Ｚ構造子は、突出長が例えば、流路高さの±１０～９０％の範囲であることができる。但し、一方の流路内面からの突出長を＋とし、一方の流路内面に対向する位置にある流路内面からの突出長を－とする。Ｚ構造子の突出長は、好ましくは流路高さの±２０～８０％の範囲、より好ましくは流路高さの±３０～７０％の範囲、さらに好ましくは流路高さの±４０～６０％の範囲である。図１－２のｘ－ｚ断面に（ＩＩＩ）上段及び下段の厚みが２０μｍ及び８０μｍである態様、（ＩＶ）上段及び下段の厚みが８０μｍ及び２０μｍである態様を例示する。Ｚ構造子のＸ方向の長さは、例えば、流路幅の１０％～１０００％の範囲であることができ、好ましくは流路幅の２０％～５００％の範囲、より好ましくは流路幅の３０％～３００％の範囲、さらに好ましくは流路幅の４０％～２００％の範囲、一層好ましくは流路幅の５０％～１５０％の範囲である。隣り合う２つのＺ構造子の対向する位置にある面の間隔は、例えば、流路幅の１０％～１０００％の範囲であることができ、好ましくは流路幅の１００％～５００％の範囲、より好ましくは流路幅の１５０％～４５０％の範囲、さらに好ましくは流路幅の２００％～４００％の範囲、一層好ましくは流路幅の２５０％～３５０％の範囲である。
導入路の合流部位から最初のＹ構造子５０ａ及び／又は最初のＺ構造子６０ａまでの希釈流路４０ａの長さｘ、幅ｙ及び高さｚ（図１－１（ａ）参照）は、例えば、ｘ：ｙが１～１００：１の範囲であり、ｚ：ｙが０．１～５：１の範囲であることができる。ｘ：ｙは好ましくは１～５０：１の範囲、より好ましくは１～２０：１の範囲、さらに好ましくは１～１０：１の範囲である。ｚ：ｙは好ましくは０．２～４：１の範囲、より好ましくは０．３～３：１の範囲、さらに好ましくは０．５～２：１の範囲である。
導入路の合流部位３０から最初の構造子は、Ｙ構造子、Ｚ構造子又はＹ構造子及びＺ構造子であることができ、好ましくはＹ構造子及びＺ構造子である。
好ましい態様の１つ（態様Ａ）としては、
導入路の合流部位３０から最初の構造子がＹ構造子及びＺ構造子であり、
最初のＹ構造子を第１Ｙ構造子と呼び、下流のＹ構造子を順次第ｍＹ構造子（ｍは２以上の整数）と呼び、最初のＺ構造子を第１Ｚ構造子と呼び、下流のＺ構造子を順次第ｎＹ構造子（ｎは２以上の整数）と呼ぶことにすると、
第１Ｙ構造子のＸ方向の長さと第１Ｚ構造子のＸ方向の長さは、同一であり、
第１Ｚ構造子と第２Ｚ構造子との間隔が、第１Ｙ構造子と第２Ｙ構造子との間隔に等しい、態様を挙げることができる。この態様においては、隣り合う１対のＹ構造子は対向する位置にあり、Ｙ構造子の高さ及びＺ構造子の高さは任意である。
導入路の合流部位３０から最初の構造子がＹ構造子及びＺ構造子であり、
最初のＹ構造子を第１Ｙ構造子と呼び、下流のＹ構造子を順次第ｍＹ構造子（ｍは２以上の整数）と呼び、最初のＺ構造子を第１Ｚ構造子と呼び、下流のＺ構造子を順次第ｎＹ構造子（ｎは２以上の整数）と呼ぶことにすると、
第１Ｙ構造子のＸ方向の長さと第１Ｚ構造子のＸ方向の長さは、同一であり、
第１Ｚ構造子と第２Ｚ構造子との間隔が、第１Ｙ構造子と第２Ｙ構造子との間隔に等しい、態様を挙げることができる。この態様においては、隣り合う１対のＹ構造子は対向する位置にあり、Ｙ構造子の高さ及びＺ構造子の高さは任意である。
さらに、この態様において、第２Ｚ構造子及び第２Ｙ構造子より下流のＺ構造子（例えば、第２Ｚ構造子と第３Ｚ構造子）の設置位置とＹ構造子（例えば、第２Ｙ構造子と第３Ｙ構造子）の設置位置は、上記第１Ｚ構造子と第２Ｚ構造子との間隔と第１Ｙ構造子と第２Ｙ構造子との間隔と、同様の関係を有する態様を挙げることができる。この態様は、図１－１～１－３に示した態様に相当する。即ち、第１Ｙ構造子、第２Ｙ構造子、第３Ｙ構造子、第４Ｙ構造子は、それぞれ図中の５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄに相当、第１Ｚ構造子、第２Ｚ構造子、第３Ｚ構造子、第４Ｚ構造子は、それぞれ図中の６０ａ、６０ｂ、６０ｃ、６０ｄに相当する。
態様の別の１つ（態様Ｂ）としては、
導入路の合流部位３０から最初の構造子がＹ構造子であり、
導入路の合流部位３０から最初のＺ構造子である第１Ｚ構造子の上流側面は、第２Ｙ構造子の上流側面と同じ位置にあり、
第１Ｚ構造子のＸ方向の長さは、第２Ｙ構造子のＸ方向の長さが同一であり、
第１Ｚ構造子と第２Ｚ構造子との間隔が、第２Ｙ構造子と第４Ｙ構造子との間隔に等しい、態様を挙げることができる。この態様においては、隣り合う１対のＹ構造子は対向する位置にあり、Ｙ構造子の高さ及びＺ構造子の高さは任意である。
導入路の合流部位３０から最初の構造子がＹ構造子であり、
導入路の合流部位３０から最初のＺ構造子である第１Ｚ構造子の上流側面は、第２Ｙ構造子の上流側面と同じ位置にあり、
第１Ｚ構造子のＸ方向の長さは、第２Ｙ構造子のＸ方向の長さが同一であり、
第１Ｚ構造子と第２Ｚ構造子との間隔が、第２Ｙ構造子と第４Ｙ構造子との間隔に等しい、態様を挙げることができる。この態様においては、隣り合う１対のＹ構造子は対向する位置にあり、Ｙ構造子の高さ及びＺ構造子の高さは任意である。
さらに、この態様において、第２Ｚ構造子及び第４Ｙ構造子より下流のＺ構造子の設置位置とＹ構造子の設置位置は、上記と同様の関係を有する態様を挙げることができる。この態様は、Ｙ構造子２個に対して、Ｚ構造子が１個配置される態様である。
別の態様の１つ（態様Ｃ）としては、
導入路の合流部位３０から最初の構造子がＹ構造子及びＺ構造子であり、
第１Ｚ構造子のＸ方向の長さは、第１Ｙ構造子のＸ方向の長さが同一であり、
第１Ｚ構造子と第２Ｚ構造子との間隔が、第１Ｙ構造子と第３Ｙ構造子との間隔に等しい、態様を挙げることができる。この態様においては、隣り合う１対のＹ構造子は対向する位置にあり、Ｙ構造子の高さ及びＺ構造子の高さは任意である。
導入路の合流部位３０から最初の構造子がＹ構造子及びＺ構造子であり、
第１Ｚ構造子のＸ方向の長さは、第１Ｙ構造子のＸ方向の長さが同一であり、
第１Ｚ構造子と第２Ｚ構造子との間隔が、第１Ｙ構造子と第３Ｙ構造子との間隔に等しい、態様を挙げることができる。この態様においては、隣り合う１対のＹ構造子は対向する位置にあり、Ｙ構造子の高さ及びＺ構造子の高さは任意である。
さらに、この態様において、
第２Ｚ構造子及び第３Ｙ構造子より下流のＺ構造子の設置位置とＹ構造子の設置位置は、上記と同様の関係を有する態様を挙げることができる。この態様は、導入路の合流部位３０から最初の構造子がＹ構造子及びＺ構造子であり、かつＹ構造子２個に対して、Ｚ構造子が１個配置される態様である。図１－２に、Ｙ構造子は、第１Ｙ構造子～第３Ｙ構造子に相当する５０ａ、５０ｂ及び５０ｃが配置されているのに対して、ｘ－ｚ断面の（ＩＩ）に示されるＺ構造子は第１Ｚ構造子及び第２Ｚ構造子に相当する６０ａ及び６０ｃであり、６０ｂは有さない。
第２Ｚ構造子及び第３Ｙ構造子より下流のＺ構造子の設置位置とＹ構造子の設置位置は、上記と同様の関係を有する態様を挙げることができる。この態様は、導入路の合流部位３０から最初の構造子がＹ構造子及びＺ構造子であり、かつＹ構造子２個に対して、Ｚ構造子が１個配置される態様である。図１－２に、Ｙ構造子は、第１Ｙ構造子～第３Ｙ構造子に相当する５０ａ、５０ｂ及び５０ｃが配置されているのに対して、ｘ－ｚ断面の（ＩＩ）に示されるＺ構造子は第１Ｚ構造子及び第２Ｚ構造子に相当する６０ａ及び６０ｃであり、６０ｂは有さない。
図１－４に上記態様Ａ、Ｂ、Ｃの概略説明図を示す。図中Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４は第１Ｙ構造子、第２Ｙ構造子、第３Ｙ構造子及び第４Ｙ構造子を意味し、Ｚ１、Ｚ２は、第１Ｚ構造子及び第２Ｚ構造子を示す。
Ｙ構造子の数は２以上であり、Ｚ構造子の数は１以上であること以外特に制限はないが、Ｙ構造子の数は好ましくは３以上であり、Ｚ構造子の数は好ましくは２以上である。より具体的には、Ｙ構造子の数は、例えば、３～１００個の範囲であることができ、好ましく５～５０の範囲、より好ましく５～２０の範囲、さらに好ましくは５～１０の範囲であることができる。Ｚ構造子の数は、例えば、２～１００個の範囲であることができ、好ましく５～５０の範囲、より好ましく５～２０の範囲、さらに好ましくは５～１０の範囲であることができる。構造子Ｙの数が５～１０の範囲であり、かつ構造子Ｚの数が５～１０の範囲であることが特に好ましい場合がある。
導入路の合流部位３０から最初のＹ構造子及び／又は最初のＺ構造子までの希釈流路４０ａの長さｘは、例えば、２０～１０００μｍの範囲であることができ、好ましくは５０～１０００μｍの範囲、より好ましくは１００～５００μｍの範囲である。導入路の合流部位３０から最初のＹ構造子及び／又は最初のＺ構造子までの希釈流路の幅ｙは、例えば、２０～１０００μｍの範囲であることができ、好ましくは５０～５００μｍの範囲、より好ましくは７０～４００μｍの範囲、さらに好ましくは８０～３００μｍの範囲である。導入路の合流部位３０から最初のＹ構造子及び／又は最初のＺ構造子までの希釈流路の高さｚは、例えば、２０～１０００μｍの範囲であることができ、好ましくは５０～５００μｍの範囲、より好ましくは７０～４００μｍの範囲、さらに好ましくは８０～３００μｍの範囲である。
第１導入路１０及び第２導入路２０は、合流部位３０において流路方向（Ｘ方向）の上流側への引き出し線に対してそれぞれ独立に１０～９０°の角度で交差することができる。この交差角度は、好ましくは２０～８０°の範囲、好ましくは３０～７０°の範囲、より好ましくは４０～６０°の範囲である。
第１導入路１０は２以上の複数の流路からなることができ、および／または第２導入路２０は複数の流路からなることができる。何れの導入路においても、複数の流路からなる場合、好ましくは２の複数の流路である。即ち、第１導入路１０及び第２導入路２０はそれぞれ独立に、その上流において、２以上の流路が合流して形成された導入路であることもできる。あるいは、第１導入路１０及び第２導入路２０に加えて、１以上の追加の導入路、例えば、第３の導入路又は第３の導入路及び第４の導入路を、合流部位３０において第１導入路１０及び第２導入路２０と合流するように設けることもできる。
第１導入路及び第２導入路のいずれか一方又は両方は、その上流側に位置する前処理用流路に接続されていることができる。前処理用流路は、例えば、自己組織化分子含有溶液の調製用の流路、あるいは希釈媒体の調製用の流路であることができる。前処理用流路は、例えば、本発明の流路構造体と同一の構造を有する流路構造体であることができる。但し、これに限定される意図ではなく、既存の流路構造体から適宜選択することもできる。
排出口は、その下流側に位置する後処理用流路に接続されていることができる。後処理用流路は、例えば、形成された自己組織化分子粒子を安定化する処理のための流路であることができる。後処理用流路は、例えば、本発明の流路構造体と同一の構造を有する流路構造体であることができる。但し、これに限定される意図ではなく、既存の流路構造体から適宜選択することもできる。
（自己組織化分子粒子の製造方法）
本発明は、自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体を流路構造体に供給して、被封入物質を封入した自己組織化分子粒子を形成することを含む自己組織化分子粒子の製造方法を包含する。被封入物質は、自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体の少なくとも一方に含有され、
この方法では、流路構造体が上記本発明の流路構造体であり、この流路構造体の第１導入路１０および第２導入路２０の一方より自己組織化分子含有溶液を流入し、他方の導入路より希釈媒体を導入して、希釈流路内で自己組織化分子含有溶液を希釈媒体で希釈して自己組織化分子粒子を得る。
本発明は、自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体を流路構造体に供給して、被封入物質を封入した自己組織化分子粒子を形成することを含む自己組織化分子粒子の製造方法を包含する。被封入物質は、自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体の少なくとも一方に含有され、
この方法では、流路構造体が上記本発明の流路構造体であり、この流路構造体の第１導入路１０および第２導入路２０の一方より自己組織化分子含有溶液を流入し、他方の導入路より希釈媒体を導入して、希釈流路内で自己組織化分子含有溶液を希釈媒体で希釈して自己組織化分子粒子を得る。
本発明の流路構造体及び本発明の製造方法で形成される、自己組織化分子粒子は、自己組織化分子粒子を粒子構成成分として含む粒子である。自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子は、自己組織化分子同士が会合し、かつ粒子を形成することで得られる粒子であり、粒子形成の際に系内に共存する被封入物質も粒子内に取り込むことができる。被封入物質が共存する条件下で形成される粒子の構成成分は、少なくとも自己組織化分子及び被封入物質である。
自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体は、例えば、総流量が１μｌ／分～１００ｍｌ／分となるように流路構造体に流入させることができる。但し、総流量は、この範囲に限定される意図ではなく、流路構造体の構造及び寸法、自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体の種類、所望の自己組織化分子粒子の粒子径や被封入物質の封入効率等を考慮して適宜決定できる。
自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体の総流量は、第１導入路と第２導入路との合流部位３０から最初の構造子の上流側端部までの間を、自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体が、例えば、０．１秒以下の時間で通過するように、自己組織化分子含有溶液及び希釈媒体の総流量を定め、並びに／又は流路構造体の第１導入路と第２導入路との合流部位３０から最初の構造子の上流側端部までの間隔を設定することが、所望の自己組織化分子粒子の粒子径や被封入物質の封入効率を得るという観点から好ましい。
自己組織化分子含有溶液は、例えば、中性脂質含有溶液、アニオン性脂質含有溶液、カチオン性脂質含有溶液及びポリマー含有溶液からなる群から選ばれるいずれかの溶液であることができるが、これらに限定される意図ではない。本発明における自己組織化分子は、自己組織化の機能を有し、前述のように、自己組織化分子同士が会合し、かつ粒子を形成することができる分子であればよい。自己組織化分子の一例である脂質としては、特に限定されるわけではないが、例えば、大豆レシチン、水添大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジルコリン類（例えば、卵由来のeggPC） 、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファスフィンゴミエリン類、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類、スフィンゴ脂質類、ステロール類等の天然由来脂質、および非天然由来脂質のほか、核酸送達用リポソームの構成成分として適するとされるカチオン性の非天然由来脂質であるＮ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチル塩化アンモニウム（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）およびＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、リポフェクチン（登録商標）、リポフェクタミン（登録商標）、トランスフェクタム（登録商標）、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン、DLin-KC2-DMA)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル 4-(ジメチルアミノ)ブタノアート（DLin-MC3-DMA）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ－Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ－Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）および２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- phosphocholine, POPC）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（1,2-Distearoyl-sn-glycero-3- phosphocholine, DSPC）などを用いることができる。上記2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン、DLin-KC2-DMA)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル 4-(ジメチルアミノ)ブタノアート（DLin-MC3-DMA）及びその類似体は、特開２０１３－２４５１９０号公報、特開２０１６－８４２９７号公報、特開２０１９－１５１５８９号公報に記載されている。
自己組織化分子の他の一例である両親媒性物質としては、特に限定されるわけではないが、両親媒性高分子化合物、例えばポリスチレン－ポリエチレンオキシドブロック共重合体、ポリエチレンオキシド－ポリプロピレンオキシドブロック共重合体、ポリ乳酸ポリエチレングリコール共重合体、ポリカプロラクトン－ポリエチレングリコール共重合体等のような両親媒性ブロック共重合体などが例示できる。
被封入物質は、特に限定されるものではないが、核酸、ペプチド、タンパク質、糖鎖などの生体高分子、金属イオン、低分子又は中分子有機化合物、有機金属錯体、金属粒子などの物質が挙げられ、また用途別の観点では抗癌剤、抗酸化剤、抗菌剤、抗炎症剤、ビタミン剤、人工血液（ヘモグロビン）、ワクチン、発毛剤、保湿剤、色素類、美白剤、顔料などといった薬剤、生理活性物質、化粧料等を例示できる。これらの被封入物質は、水溶性のものであれば、形成される粒子の水相中に包含させることができる。水に難溶性のものである場合は、自己組織化分子が形成する自己組織化膜の疎水性部分に包含されるか、もしくは自己組織化分子の疎水性部分と結合し凝集した凝集体として粒子内に包含させることができる。なお被封入物質を前処理工程にてあらかじめ水溶性又は難溶性にすること、又は凝集体とすることができ、当該前処理工程をその処理に適切な流路内で行うこともできる。前処理工程を流路内で行う場合は当該前処理工程を行う流路の排出口を本発明の流路構造体の第１又は第２導入路と接続することができる。
自己組織化分子を溶解して粒子溶液を調製するのに用いられる水混和性有機溶媒としては、特に限定されるわけではないが、例えば、アルコール類、エーテル類、エステル類、ケトン類、アセタール類などの水に混合可能な有機溶媒、特にエタノール、t-ブタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、及び2-ブトキシエタノール等のアルコール類、特に炭素数１～６のアルカノールを用いることが好ましい。また、両親媒性物質溶液を調製するのに用いられる水混和性有機溶媒としても同様のものが用いられ得るが、好ましい例としてはテトラヒドロフランなどのエーテル類、クロロホルム等が挙げられる。
希釈媒体としては、水、または基本的に水を主成分とする、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、クエン酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液等水溶液が、形成しようとする粒子の用途等に応じて適宜使用される。
本発明の方法で得られる被封入物質を封入した自己組織化分子粒子は、個数平均粒子径が、例えば、２０～２００ｎｍの範囲であることができる。但し、この範囲に限定される意図ではない。
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
実施例１
図１－１（ａ）及び（ｃ）に構造の一部の概略図を示し、以下の構造及び寸法を有する流路構造体を用いて作製した。
構造及び寸法
第一導入路と第二導入路との角度＝９０°
第一導入路と希釈流路（Ｘ方向の上流側への引き出し線）に対する角度＝４５°
第二導入路と希釈流路（Ｘ方向の上流側への引き出し線）に対する角度＝４５°
第一導入路と第二導入路の合流点から希釈流路の開始位置までの距離＝０．５ｍｍ
希釈流路の開始位置＝最初のＹ構造子及び最初のＺ構造子の上流側面
Ｙ構造子は、第一導入路側に設置
図１－１（ａ）及び（ｃ）に構造の一部の概略図を示し、以下の構造及び寸法を有する流路構造体を用いて作製した。
構造及び寸法
第一導入路と第二導入路との角度＝９０°
第一導入路と希釈流路（Ｘ方向の上流側への引き出し線）に対する角度＝４５°
第二導入路と希釈流路（Ｘ方向の上流側への引き出し線）に対する角度＝４５°
第一導入路と第二導入路の合流点から希釈流路の開始位置までの距離＝０．５ｍｍ
希釈流路の開始位置＝最初のＹ構造子及び最初のＺ構造子の上流側面
Ｙ構造子は、第一導入路側に設置
流路幅ｙ＝２００μｍ、
Ｙ構造子の高さ（Ｙ方向長さ）＝１５０μｍ、
Ｙ構造子の幅（Ｘ方向長さ）＝１００μｍ、
隣接するＹ構造子間の間隔＝１００μｍ、
Ｚ構造子の高さ（Ｚ方向長さ）＝５０μｍ、
Ｚ構造子の幅（Ｘ方向長さ）＝１００μｍ、
隣接するＺ構造子間の間隔＝３００μｍ、
Ｙ構造子の個数＝２０個
Ｚ構造子の個数＝１０個
Ｙ構造子の高さ（Ｙ方向長さ）＝１５０μｍ、
Ｙ構造子の幅（Ｘ方向長さ）＝１００μｍ、
隣接するＹ構造子間の間隔＝１００μｍ、
Ｚ構造子の高さ（Ｚ方向長さ）＝５０μｍ、
Ｚ構造子の幅（Ｘ方向長さ）＝１００μｍ、
隣接するＺ構造子間の間隔＝３００μｍ、
Ｙ構造子の個数＝２０個
Ｚ構造子の個数＝１０個
上記流路構造体の第一導入路から下記アニオン性脂質、中性脂質又はカチオン性脂質の原料溶液を、第二導入路から下記緩衝液で希釈して水溶液を調製した。総流量：500 μL/min、脂質原料溶液：緩衝液の流量比１：２とした。調製後に、PBSを外液として透析を行うことで水溶液中のアルコールを除去した。水溶液中の粒子へのsiRNA封入率をRobiGreenアッセイ（RNA定量試薬を用いた蛍光測定）により測定した結果（３Ｄ）を図３に示す。図３には、特許文献３に記載のカオティックミキサーを用いた場合（ＣＭ）及び特許文献１に記載の２Ｄ流路構造体を用いた場合（２Ｄ ｏｒ Ｂａｓｉｃ）の結果も併記する。さらに、調製・後処理後に水溶液中の粒子の粒度分布を、ゼータサイザーナノZS（マルバーン社）を用いて測定し、アニオン性脂質溶液を用いた場合を図４に示し、中性脂質溶液を用いた場合を図５に示す。図４及び５は、左側に粒度分布、右側にsiRNA封入率を示す。図４及び５には、３Ｄ、Ｂａｓｉｃ及びＣＭに加えてＢａｔｃｈの結果も表記する。各実験方法の概要は、図２に示す。
原料溶液
・脂質溶液：
アニオン性：10 mM DSPC/DOPS/Cholesterol (45/10/45 mol%)（溶媒：EtOH (80%v/v)+MeOH (20%v/v)）
中性：10 mM DSPC/Cholesterol (50/50 mol%)（溶媒：EtOH）
カチオン性： YSK05/Cholesterol/DMG-PEG2K (50/50/1 mol%)（溶媒：EtOH）
・緩衝液：10 mM Tris-HCl (pH8.0) + 13.4 mM CaCl2 + 70 μg/mL siFVII（アニオン性・中性脂質）
25 mM 酢酸緩衝液（pH 4.0）+ 70 μg/mL siFVII
・脂質溶液：
アニオン性：10 mM DSPC/DOPS/Cholesterol (45/10/45 mol%)（溶媒：EtOH (80%v/v)+MeOH (20%v/v)）
中性：10 mM DSPC/Cholesterol (50/50 mol%)（溶媒：EtOH）
カチオン性： YSK05/Cholesterol/DMG-PEG2K (50/50/1 mol%)（溶媒：EtOH）
・緩衝液：10 mM Tris-HCl (pH8.0) + 13.4 mM CaCl2 + 70 μg/mL siFVII（アニオン性・中性脂質）
25 mM 酢酸緩衝液（pH 4.0）+ 70 μg/mL siFVII
図３に示す結果は、本発明の３Ｄデバイスは、他の従来のデバイスよりも効率的にsiRNAを封入できることを示す。図４に示す結果は、アニオン性脂質溶液を用いた場合、３Ｄデバイスで作製された粒子はサイズ均一性が高く、siRNAを再現性良く封入できることを示す。図５に示す結果は、中性脂質溶液を用いた場合、３Ｄデバイスで作製された粒子はサイズ均一性が高く、siRNAを再現性良く封入できることを示す。
実施例２
実施例１と同様の流路構造体を作製した。
但し、図６に示すように、Ｚ構造子の高さ（Ｚ方向長さ）５０μｍ（基本形＝実施例１）を２０μｍ、４０μｍ、６０μｍ、又は８０μｍに変更した。実施例１と同様のアニオン性脂質溶液又は中性脂質溶液を用い、さらに用いた緩衝液、総流量及び流量比は実施例１と同様である。調製後に水溶液中の粒子へのsiRNA封入率及び粒子の粒度分布を実施例１と同様に測定した。アニオン性脂質溶液の場合、図７に平均粒径（個数平均粒径及びＺ平均粒径）、図８に個数平均粒度分布、図９にＺ平均粒度分布、図１０にsiRNA封入率の結果を示す。中性脂質溶液の場合、図１１に平均粒径（個数平均粒径及びＺ平均粒径）、図１２にsiRNA封入率の結果を示す。
実施例１と同様の流路構造体を作製した。
但し、図６に示すように、Ｚ構造子の高さ（Ｚ方向長さ）５０μｍ（基本形＝実施例１）を２０μｍ、４０μｍ、６０μｍ、又は８０μｍに変更した。実施例１と同様のアニオン性脂質溶液又は中性脂質溶液を用い、さらに用いた緩衝液、総流量及び流量比は実施例１と同様である。調製後に水溶液中の粒子へのsiRNA封入率及び粒子の粒度分布を実施例１と同様に測定した。アニオン性脂質溶液の場合、図７に平均粒径（個数平均粒径及びＺ平均粒径）、図８に個数平均粒度分布、図９にＺ平均粒度分布、図１０にsiRNA封入率の結果を示す。中性脂質溶液の場合、図１１に平均粒径（個数平均粒径及びＺ平均粒径）、図１２にsiRNA封入率の結果を示す。
図７～９の結果（アニオン性脂質溶液の場合）は、この条件では、流路構造体のＺ構造子の高さ（Ｚ方向長さ）は、粒径に大きく影響しないことを示す。図１０の結果は、Ｚ構造子の高さ（Ｚ方向長さ）が（基本形＝５０μｍ）より小さい２０μｍ及び４０μｍの場合（流路の断面積が大きい場合）の方が、siRNA封入率が高い傾向があった。図１１の結果（中性脂質溶液の場合）は、この条件では、流路構造体のＺ構造子の高さ（Ｚ方向長さ）は、粒径に大きく影響しないことを示す。図１２の結果は、この条件では、流路構造体のＺ構造子の高さ（Ｚ方向長さ）は、siRNA封入率にほとんど影響しないことを示す。
実施例３
実施例１と同様の流路構造体を作製した。
但し、図１３に示すように、基本形＝実施例１ではＹ構造子は第一導入路側（脂質溶液流入側）に設置していたが、これを第二導入路側（緩衝液流入側）に設置した逆設定型を作製した。
その上で、以下のバリエーションで実験を行った。
１－Ａ＝基本形流路構造体、第一導入路から脂質溶液流入
１－Ｂ＝基本形流路構造体、第二導入路から脂質溶液流入
２－Ａ＝逆設定型流路構造体、第一導入路から脂質溶液流入
２－Ｂ＝逆設定型流路構造体、第二導入路から脂質溶液流入
実施例１と同様の流路構造体を作製した。
但し、図１３に示すように、基本形＝実施例１ではＹ構造子は第一導入路側（脂質溶液流入側）に設置していたが、これを第二導入路側（緩衝液流入側）に設置した逆設定型を作製した。
その上で、以下のバリエーションで実験を行った。
１－Ａ＝基本形流路構造体、第一導入路から脂質溶液流入
１－Ｂ＝基本形流路構造体、第二導入路から脂質溶液流入
２－Ａ＝逆設定型流路構造体、第一導入路から脂質溶液流入
２－Ｂ＝逆設定型流路構造体、第二導入路から脂質溶液流入
実施例１と同様のアニオン性脂質溶液又は中性脂質溶液を用い、さらに用いた緩衝液、総流量及び流量比は実施例１と同様である。調製後に水溶液中の粒子へのsiRNA封入率及び粒子の粒度分布を実施例１と同様に測定した。アニオン性脂質溶液の場合、図１４に平均粒径（個数平均粒径及びＺ平均粒径）、図１５に個数平均粒度分布、図１６にＺ平均粒度分布、図１７にsiRNA封入率の結果を示す。中性脂質溶液の場合、図１８に平均粒径（個数平均粒径及びＺ平均粒径）、図１９にsiRNA封入率の結果を示す。
図１４～１６の結果（アニオン性脂質溶液の場合）は、この条件では、１－Ａの流路構造体で作製した粒子が粒径の均一性が高いことを示す。図１７の結果は、siRNA封入率は同程度であった。図１８の結果（中性脂質溶液の場合）は、この条件では、１－Ａと１－Ｂの流路構造体で作製した粒子は、粒径に大きな違いはないことを示す。図１９の結果は、この条件では、１－Ａと１－Ｂの流路構造体で作製した粒子のsiRNA封入率にほとんど影響しないことを示す。
実施例４
実施例１と同様の流路構造体を作製した。
但し、図２０に示すように、基本形＝実施例１ではＹ構造子の幅（Ｘ方向長さ）＝１００μｍであったが、これを７０μｍ又は５０μｍ変更した流路構造体を作製した。この変更に伴って、Ｚ構造子の幅（Ｘ方向長さ）も１００μｍ（基本形）を、７０μｍ又は５０μｍ変更し、隣接するＺ構造子間の間隔も３００μｍ（基本形）を２４０μｍ又は２００μｍとした。尚、隣接するＹ構造子間の間隔は１００μｍ（基本形）を維持している。
実施例１と同様の流路構造体を作製した。
但し、図２０に示すように、基本形＝実施例１ではＹ構造子の幅（Ｘ方向長さ）＝１００μｍであったが、これを７０μｍ又は５０μｍ変更した流路構造体を作製した。この変更に伴って、Ｚ構造子の幅（Ｘ方向長さ）も１００μｍ（基本形）を、７０μｍ又は５０μｍ変更し、隣接するＺ構造子間の間隔も３００μｍ（基本形）を２４０μｍ又は２００μｍとした。尚、隣接するＹ構造子間の間隔は１００μｍ（基本形）を維持している。
実施例１と同様のアニオン性脂質溶液又は中性脂質溶液を用い、さらに用いた緩衝液、総流量及び流量比は実施例１と同様である。調製後に水溶液中の粒子へのsiRNA封入率及び粒子の粒度分布を実施例１と同様に測定した。アニオン性脂質溶液の場合、図２１に平均粒径（個数平均粒径及びＺ平均粒径）、図２２に個数平均粒度分布、図２３にＺ平均粒度分布、図２４にsiRNA封入率の結果を示す。中性脂質溶液の場合、図２５に平均粒径（個数平均粒径及びＺ平均粒径）、図２６にsiRNA封入率の結果を示す。
図２１～２３の結果（アニオン性脂質溶液の場合）は、この条件では、流路構造体のＹ構造子の幅（Ｘ方向長さ）の違いは、粒子の粒径に影響ないことを示す。図２４の結果は、siRNA封入率は同程度であった。図２５の結果（中性脂質溶液の場合）は、この条件では、流路構造体のＹ構造子の幅（Ｘ方向長さ）の違いは、粒子の粒径に影響ないことを示す。図２６の結果は、この条件では、流路構造体のＹ構造子の幅（Ｘ方向長さ）の違いは、作製した粒子のsiRNA封入率にほとんど影響しないことを示す。
実施例５
pH応答性カチオン性脂質（YSK05）、コレステロール、PEG脂質、siRNAで構成されている脂質ナノ粒子を含む脂質粒子水溶液を実施例１で用いた３Ｄ流路構造体を用いて調製した。水溶液を用いてマウスを用いた粒子の性能評価を行った、その結果を図２７及び２８に示す。標的遺伝子をノックダウンすることに成功し、粒径によって送達効率が異なることを確認した。
pH応答性カチオン性脂質（YSK05）、コレステロール、PEG脂質、siRNAで構成されている脂質ナノ粒子を含む脂質粒子水溶液を実施例１で用いた３Ｄ流路構造体を用いて調製した。水溶液を用いてマウスを用いた粒子の性能評価を行った、その結果を図２７及び２８に示す。標的遺伝子をノックダウンすることに成功し、粒径によって送達効率が異なることを確認した。
参考例１（シミュレーション）
本発明に係る基本構造を有する３Ｄ流路構造体における脂質溶液の希釈状態をシミュレーションするため、脂質溶液の水混和性有機溶媒であるエタノールと、希釈媒体としての水とを、流量比１：３で総流量５００μｌ／分又は５０μｌ／分にて、流路構造体に流して、汎用性物理シミュレーションソフトCOMSOL Multiphysicsによりその流れをシミュレーションした。その結果を図２９～３２に２Ｄ流路構造体と対比して示す。
本発明に係る基本構造を有する３Ｄ流路構造体における脂質溶液の希釈状態をシミュレーションするため、脂質溶液の水混和性有機溶媒であるエタノールと、希釈媒体としての水とを、流量比１：３で総流量５００μｌ／分又は５０μｌ／分にて、流路構造体に流して、汎用性物理シミュレーションソフトCOMSOL Multiphysicsによりその流れをシミュレーションした。その結果を図２９～３２に２Ｄ流路構造体と対比して示す。
図２９及び３０は、総流量５００μｌ／分の場合の結果であり、３Ｄ流路構造体においては、２つめと３つめのＹ構造子の間でほぼ希釈が完了していることが分かる。一方、２Ｄ流路構造体の場合には、希釈の完了は４つめと５つめのＹ構造子の間であることが分かる。
図３１及び３２は、総流量５０μｌ／分の場合の結果であり、３Ｄ流路構造体においては、４つめと５つめのＹ構造子の間でほぼ希釈が完了していることが分かる。一方、２Ｄ流路構造体の場合には、希釈の完了は１０のＹ構造子では足りないことが分かる。
本発明は、siRNA等を脂質粒子等の自己組織化分子粒子に封入した粒子を調製する技術に関する分野において有用である。
Claims (9)
- 中性脂質及びアニオン性脂質からなる群から選ばれる少なくとも１種の脂質及び核酸を含有するナノ粒子の分散液であり、核酸の封入率が６０％以上である、粒子分散液(但し、脂質としてカチオン性脂質を含有する場合を除く)。
- 核酸の封入率が７０％以上である、請求項１に記載の粒子分散液。
- 核酸の封入率が８０％以上である、請求項１に記載の粒子分散液。
- ナノ粒子は、個数平均粒子径が２０～２００ｎｍの範囲である、請求項１～３のいずれか１項に記載の粒子分散液。
- 中性脂質が、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、スフィンゴ脂質類、ステロール類、大豆レシチン、水添大豆レシチン、または卵黄レシチンであり、
アニオン性脂質がホスファチジルセリン類、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジン酸類、ホスファチジルイノシトール類、糖脂質類、ガングリオシド類または長鎖アルキルリン酸塩類である、請求項１～４のいずれか１項に記載の粒子分散液。 - 脂質がアニオン性脂質である、請求項１～５のいずれか１項に記載の粒子分散液。
- 核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１～６のいずれか１項に記載の粒子分散液。
- 中性脂質及びアニオン性脂質からなる群から選ばれる少なくとも１種の脂質含有溶液及び希釈媒体を流路構造体に供給して、核酸の封入率が６０％以上である核酸封入ナノ粒子の分散液を形成することを含む、請求項１～７のいずれかに記載の粒子分散液の製造方法。
- 前記流路構造体は、基体及びその内部に設けた流路構造を有し、
流路構造は、その上流側において、互いに独立した、第１の流動体を導入する第１導入路と、第２の流動体を導入する第２導入路との少なくとも２つの導入路を有し、かつ前記導入路は合流部位において合流し、
流路構造は、前記合流部位の下流側に向かって少なくとも１つの三次元的に屈曲した希釈流路を有し、
前記三次元的に屈曲した希釈流路は、これより上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をＸ方向とし、Ｘ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をＹ方向とし、Ｘ方向及びＹ方向とそれぞれ垂直に交差する希釈流路の深さ方向をＺ方向とし、少なくともその一部の希釈流路内において、Ｙ方向に突出した２以上のＹ構造子及びＺ方向に突出した１以上のＺ構造子をそれぞれ独立に有し、かつ前記Ｙ構造子の隣接する少なくとも２つはＹ方向に交互に突出する、流路構造体であり、
前記脂質含有溶液及び希釈媒体の少なくとも一方が核酸を含有し、
流路構造体の第１導入路および第２導入路の一方より前記中性脂質及びアニオン性脂質からなる群から選ばれる少なくとも１種の脂質含有溶液を導入し、他方の導入路より前記希釈媒体を導入して、希釈流路内で脂質含有溶液を希釈媒体で希釈して前記粒子を得る、請求項８に記載の製造方法。
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