KR20150091519A - 다계열 분화능 세포 생성 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일반적으로 다계열 분화능 (multilineage potential)을 나타내는 세포를 생성시키는 방법 및 그 방법에 의하여 생성된 세포에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 CD14+ 단핵세포 (mononuclear cell)로부터 포유류 줄기세포를 생성시키는 시험관 내 (in vitro) 방법 및 그 방법에 의하여 생성된 세포에 관한 것이다. 이러한 발견은 현재 광범위한 다양한 임상적 세팅 및 연구 세팅에 사용하기 위한, 줄기세포와 같은 다계열 분화능 세포군을 확실하고 효율적으로 생성시키는 수단을 설계하는데 기여한다. 이들 용도는, 그 중에서도, 대상 다계열 분화능 세포들의 시험관 내 또는 생체 내 (in vivo)의 유도 분화 (directed differentiation) 및 본 발명의 상기 다계열 분화능 세포들 또는 보다 온전히 분화된 그로부터 유도된 세포군들의 투여를 통하여 다양한 질환들의 치료 또는 예방 처치하는 것을 포함한다. 또한, 치료적 효과 및/또는 이들 세포들이 노출될 수 있는 잠재적인 치료법 또는 배양법의 독성을 시험하기 위한 시험관 내 기반 스크리닝 시스템의 설계도 용이하다.
Description
본 발명은 일반적으로 다계열 분화능 (multilineage potential)을 나타내는 세포를 생성시키는 방법 및 그 방법에 의하여 생성된 세포에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 CD14+ 단핵세포 (mononuclear cell)로부터 포유류 줄기세포를 생성시키는 시험관 내 (in vitro) 방법 및 그 방법에 의하여 생성된 세포에 관한 것이다. 이러한 발견은 현재 광범위한 다양한 임상적 세팅 및 연구 세팅에 사용하기 위한, 줄기세포와 같은 다계열 분화능 세포군을 확실하고 효율적으로 생성시키는 수단을 설계하는데 기여한다. 이들 용도는, 그 중에서도, 대상 다계열 분화능 세포들의 시험관 내 또는 생체 내 (in vivo)의 유도 분화 (directed differentiation) 및 본 발명의 상기 다계열 분화능 세포들 또는 보다 온전히 분화된 그로부터 유도된 세포군들의 투여를 통하여 다양한 질환들의 치료 또는 예방 처치하는 것을 포함한다. 또한, 치료적 효과 및/또는 이들 세포들이 노출될 수 있는 분화능 처리 또는 배양법의 독성을 시험하기 위한 시험관 내 기반 스크리닝 시스템의 설계도 용이하다.
본 명세서에서 저자에 의해 언급된 공개문헌들의 서지적 상세는 본 기재의 말미에 알파벳 순으로 모아져 있다.
본 명세서 중 임의의 선행 문헌 (또는 그로부터 유래하는 정보) 또는 공지된 임의의 사실에 대한 언급은 그 선행 문헌 (또는 그로부터 유래하는 정보) 또는 공지된 임의의 사실이 본 명세서가 관련된 분야에서 일반적인 상식의 일부를 형성한다는 승인 또는 좌우간의 제시가 아니며, 그렇게 받아들여져서는 아니된다.
포유 동물의 줄기세포 및 전구세포 (progenitor cell)의 동정, 단리 및 생성은 상당한 관심의 대상이다. "줄기세포" 및 "전구세포"에 대한 언급은 일반적으로 임의의 세포 유형 (생식 세포 포함)을 생성할 수 있는 전능성 세포 및 보다 제한된 범위의 성숙한 세포 계열을 생성할 수 있는 다능성 세포 양자 모두를 포함하는 광범위한 세포 유형들을 포함하는 것으로 이해된다. 일부 전구세포 (precursor cell) 유형은 여전히 더욱 분화되고 특정 세포 계열의 세포들을 생성할 수 있는 전구체에 해당한다. 이러한 능력은 완전한 기관 및 조직 발생에 필요한 모든 세포 분화 및 특화의 기초로서 작용한다.
이러한 발생적 경로의 선택된 측면인 시험관 내 생식의 관점에서, 줄기세포의 단리 및 배양에 그 초점이 있다. 예컨대, 배야줄기세포 (embryonic stem cell, ES cell)는 배반포의 내부 세포 매스 유래 세포들을 배양하고 빈번히 해리 및 계대배양을 반복함으로써 구축할 수 있다. 적절한 조건 하에서, 시험관 내 배양은 정상적인 핵형 및 그 줄기세포의 전능성 양자 모두를 보유하면서 유지될 수 있다. 특정 계열을 따라 줄기세포의 분화를 촉진하는 관점에서도 유의미한 진전이 있어 왔다. ES 세포가 인간으로부터 단리되었지만, 연구 및 치료법에서 그들의 이용은 윤리적 고려에 의하여 제한된다.
성인의 조직은 또한 자기 복제가 가능하고 비가역적 최종 분화를 겪는 딸 세포를 제공하는 것이 가능한 줄기세포군을 함유한다 (Science, 287, 1442-1446, 2000). 가장 잘 특징화된 것은 조혈 줄기세포와 그 자손이지만, 줄기세포는 간엽세포, 신경세포 및 조혈세포 등 대부분의 조직에서 확인된 바 있다 (Science, 284, 143-147, 1999; Science, 287, 1433-1438, 2000; J. Hepatol., 29, 676-682, 1998). 중간엽 줄기세포는 중간엽 조직, 예컨대 뼈, 연골, 지방, 근육 및 골수 기질로의 분화 가능성을 갖는 골수 내 부착성 섬유아세포-유사 세포로 확인되었다 (Science, 284, 143-147, 1999). 중간엽 줄기세포와 유사한 형태적 특징 및 표현형적 특징을 갖고, 그와 유사한 분화 가능성을 갖는 중간엽 전구세포들이 제대혈 (Br. J. Haematol., 109, 235-242, 2000), 태아의 말초 혈액 (Blood, 98, 2396- 2402, 2001) 및 성인의 말초 혈액 내에 (Arthritis Res., 2, 477-488, 2000) 매우 낮은 빈도로 존재함이 보고되었다.
이를 위하여, 분화는 항상 궁극적으로 그 기능이 명확히 정의되어 있고 수명이 제한되어 있는 최종 분화된 체세포의 표현형을 얻기 위한 많은 유전자들의 조절을 통하여 줄기세포의 선형의 진행 형태를 취한다고 가정되어 왔다. 이들 세포의 예로는 적혈구, 파골세포, 췌장 세포 및 혈소판을 들 수 있다. 줄기세포는 스스로 분열하고, 재생하며 특정 체세포 계열로 진행되는 (비대칭 분할) 딸 세포를 생성하는 것으로 여겨진다. 또한, 적절한 환경적 조건하에서는 줄기세포는 대칭적으로 분할하여 배가된 줄기세포 풀을 형성할 수 있다.
그럼에도 불구하고, 줄기세포를 효율적이고 믿을만 하게 분리하는 것, 그 유지 및 특히 증식은 계속해서 밝히기 어렵다는 사실이 남아있다. 따라서, 줄기세포의 분리, 유지 및 분화를 효율적이고 재현가능하게 가능하게 하는 새로운 수단을 개발할 필요가 계속하여 남아있다.
본 발명에 이르기까지의 연구에 있어서, 줄기세포 증식이 반드시 비대칭적 줄기세포 분열에 의하여 일어나야 하며 줄기세포 재생 및 최종 분화까지 특정 계보를 따르는 딸 세포의 선형적인 분화 양자 모두를 제공하는 것은 아님이 결정되었다. 오히려, 증식은 성숙된 세포가 다계열 가능성을 갖는 세포로 전이함에 따라 달성될 수 있다. 이러한 발견은 이제 다계열 분화능을 나타내는 세포를 믿을만 하고 효율적으로 생성시키기 위한 수단의 개발을 가능하게 함으로써, 그로 인하여 임상 및 연구용으로 줄기세포군 및/또는 그로부터의 체세포 분화가 이용 가능해지는 가치있는 메커니즘을 제공하여 준다.
발명의 요약
문맥이 특별하게 언급하지 않는 한 본 명세서 및 이어지는 청구항 전반에 걸쳐서, 단어 "포함하다 (comprise)" 및 "포함하다 (comprises)" 및 "포함하는 (comprising)" 같은 변이형들은 지시된 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 함유를 내포하는 것으로 이해될 것이지만, 다른 어떤 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 다른 어떤 그룹의 배제를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "로부터 유래된 (derived from)"은 특정 정수 또는 정수들의 그룹이 명시된 종들로부터 유래하지만 반드시 상기 명시된 소스로부터 직접적으로 얻어지는 것일 필요는 없다는 것을 지시하는 것으로 받아들여질 것이다. 추가적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "하나 (a)", "및 (and)" 및 "그 (the)"의 단수 형태들은 문맥이 특별히 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상들을 포함한다.
다르게 특정되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 측면은 포유류 다계열 분화능 세포를 생성시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계를 포함하고:
(i) CD14+ 단핵세포 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(ii) 대략 5%-85%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(iii) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵 세포가 다계열 분화능을 나타내는 세포로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지된다.
또 다른 측면에 있어서, 포유류의 다계열 분화능 세포를 생성시키는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계를 포함하고:
(i) CD14+ 단핵구세포 (monocyte cell) 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(ii) 대략 5%-85%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(iii) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵구세포가 다계열 분화능을 나타내는 세포로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지된다.
또 하나의 다른 측면에 있어서, 포유류의 다계열 분화능 세포를 생성시키는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계를 포함하고:
(i) CD14+ 말초 혈액 유래 단핵구세포 (monocyte cell) 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(ii) 대략 5%-85%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(iii) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵구세포가 다계열 분화능을 나타내는 세포로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지된다.
그러므로, 또 하나의 다른 측면에 있어서, 본 발명은 포유류의 다계열 분화능 세포를 생성시키는 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계를 포함하고:
(i) CD14+ 단핵구세포 (monocyte cell) 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(ii) 대략 5%-85%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(iii) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵구세포가 다계열 분화능을 나타내는 세포로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지되고, 다계열 분화능 세포는 조혈세포 분화능 및/또는 중간엽세포 분화능을 나타낸다.
또 하나의 다른 측면에 있어서, 다계열 분화능 인간 세포를 생성시키는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계를 포함하고:
(i) CD14+ 인간 말초 혈액 단핵구세포 (monocyte cell) 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(ii) 대략 5%-85%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(iii) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵구세포가 다계열 분화능을 나타내는 세포로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지된다.
또 하나의 다른 측면에 있어서, 포유류 MLPC-유래 세포 생성을 촉진시키는 방법이 제공되는데, 상기 방법은:
(i) 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계:
(a) CD14+ 단핵세포 (mononuclear cell) 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(b) 대략 5%-85%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(c) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵세포가 MLPC로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지되고; 필요에 따라
(ii) 상기 단계 (i)의 MLPC를 자극을 접하게 하여 상기 MLPC를 MLPC-유래 표현형으로의 분화를 이끌어내는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 포유류 MLPC-유래 세포 생성을 촉진시키는 방법이 제공되는데, 상기 방법은:
(i) 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계:
(a) CD14+ 단핵세포 (mononuclear cell) 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(b) 대략 5%-85%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(c) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵세포가 MLPC로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지되고; 필요에 따라
(ii) 상기 단계 (i)의 MLPC를 자극을 접하게 하여 상기 MLPC를 조혈 또는 중간엽 표현형으로의 분화를 이끌어내는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유류의 질환을 치료적으로 및/또는 예방적으로 처리하는 방법에 관한 것인데, 상기 방법은, 상기 포유류에게 본 발명의 방법에 따라 생성된 유효 숫자의 MLPC, 또는 부분적으로 또는 완전히 분화된 MLPC-유래 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 포유류의 이상 조혈 또는 중간엽 기능으로 특징화되는 질환을 치료적으로 및/또는 예방적으로 처리하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 상기 포유류에게
(i) 본 발명의 방법에 따라 생성된 유효 숫자의 조혈 줄기세포, 또는 부분적으로 또는 완전히 분화된 조혈 줄기세포-유래 세포; 또는
(ii) 본 발명의 방법에 따라 생성된 유효 숫자의 중간엽 줄기세포, 또는 부분적으로 또는 완전히 분화된 중간엽 줄기세포-유래 세포
를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 포유류의 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어, 본 발명의 방법에 따라 생성된 MLPC군 또는 MLPC-유래 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 방법에 따라 생성된 MLPC군 또는 MLPC-유래 세포에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은, MLPC 또는 MLPC-유래 세포의 표현형 상태 또는 기능적 상태에 대한 처리 또는 배양법의 효과를 평가하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 앞서 기재된 방법에 따라 생성된 상기 MLPC 또는 MLPC-유래 세포에 상기 처리법을 가하는 단계 및 변형된 기능적 상태 또는 표현형적 상태를 스크리닝하는 단계를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 방법에 따라 1 일간 37℃의 CO2 배양기에서 배양된 세포 배양체 세포 시료의 유세포 분석이다. PBMC를 밀폐된 백에서 배양하고 착생 세포를 제1일에 수확하였다. M2 영역은 이소형-매치된 대조군 항체-FITC (대조군-FITC)로 염색된 표면 표지자군 오버레이 영역이다. 가로축은 발현 세기를 의미한다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 3 일간 37℃의 CO2 배양기에서 배양된 세포 배양체 세포 시료의 유세포 분석이다. PBMC를 밀폐된 백에서 배양하고 착생 세포를 제3일에 수확하였다. M2 영역은 이소형-매치된 대조군 항체-FITC (대조군-FITC)로 염색된 표면 표지자군 오버레이 영역이다. 가로축은 발현 세기를 의미한다.
도 3은 본 발명의 방법에 따라 6 일간 37℃의 CO2 배양기에서 배양된 세포 배양체 세포 시료의 유세포 분석이다. PBMC를 밀폐된 백에서 배양하고 착생 세포를 제6일에 수확하였다. M2 영역은 이소형-매치된 대조군 항체-FITC (대조군-FITC)로 염색된 표면 표지자군 오버레이 영역이다. 가로축은 발현 세기를 의미한다.
도 4는 본 발명의 방법에 따라 7 일간 37℃의 CO2 배양기에서 배양된 세포 배양체 세포 시료의 유세포 분석이다. PBMC를 밀폐된 백에서 배양하고 착생 세포를 제7일에 수확하였다. M2 영역은 이소형-매치된 대조군 항체-FITC (대조군-FITC)로 염색된 표면 표지자군 오버레이 영역이다. 가로축은 발현 세기를 의미한다.
도 5는 본 발명의 방법에 따라 1 일간 37℃의 CO2 배양기에서 배양된 세포 배양체 세포를 가시화한 전자현미경 사진이다. 세포는 생착 개시하였고 타원형 형태를 보인다.
도 6은 본 발명의 방법에 따라 2 일간 37℃의 CO2 배양기에서 배양된 세포 배양체 세포를 가시화한 전자현미경 사진이다. 세포는 스핀들 유사하고 섬유아세포 유사한 형태를 보이기 시작한다.
도 7은 본 발명의 방법에 따라 3 일간 37℃의 CO2 배양기에서 배양된 세포 배양체 세포를 가시화한 전자현미경 사진이다. 세포는 타원형 또는 스핀들 유사 형태를 보인다.
도 8은 본 발명의 방법에 따라 4 일간 37℃의 CO2 배양기에서 배양된 세포 배양체 세포를 가시화한 전자현미경 사진이다.
도 9는 본 발명의 방법에 따라 4 일간 37℃의 CO2 배양기에서 배양된 세포 배양체 세포를 가시화한 전자현미경 사진이다.
도 10은 본 발명의 방법에 따라 5 일간 37℃의 CO2 배양기에서 배양된 세포 배양체 세포를 가시화한 전자현미경 사진이다.
도 11은 본 발명의 방법에 따라 6 일간 37℃의 CO2 배양기에서 배양된 세포 배양체 세포를 가시화한 전자현미경 사진이다.
도 12는 CD14+ PBMC 유세포 분석을 보여준다.
도 13은 표로 만든 CD14+ PBMC 유세포 분석을 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 부분적으로, 성인 줄기세포 증식이 반드시 줄기세포 재생 및 특정 체세포 계열을 따르는 분화 양자 모두를 효과하기 위한 비대칭 줄기세포 분열의 발생에 기초하는 것은 아니라는 결정에 전제하고 있다. 특히, 다능성 줄기세포는 다계열 분화능 상태로 전이 유도되고 적절한 자극하에서 대칭적 분열 및 분화가 뒤따르게 되는, 보다 성숙한 CD14+ 단핵세포로부터 기원할 수 있다. 이러한 발견은 유의미한 중요성을 갖는데, 효율적으로 시험관 내 줄기세포 재생 및 증식을 유도하는 방법이 현실화되고 있지 못했다는 것이 이 기술 분야에서 특히 난점이었기 때문이다. 그러므로, 본 발명은 성숙 포유류 세포의, 다계열 분화능을 나타내는 줄기세포 표현형으로의 탈분화를 유도하는 것에 기초한, 고정적인 포유류 줄기세포의 시험관 내 생성 수단을 제공한다. 따라서, 이러한 발견의 생체 내 및 시험관 내 적용 가능성은 줄기세포군의 시험관 내 생성, 상기 표제 줄기세포의 시험관 내 또는 생체 내 유도 분화, 그에 기초한 치료적 또는 예방적 처리법 및 본 발명의 세포가 노출될 수 있는 분화능 처리 또는 배양법의 효율 및/또는 독성의 시험관 내 시험 등을 극히 광범위하게 포함하며 이에 국한되는 것이 아니다.
따라서, 본 발명의 한 가지 측면은 포유류 다계열 분화능 세포를 생성시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계를 포함하고:
(i) CD14+ 단핵세포 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(ii) 대략 5%-85%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(iii) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵 세포가 다계열 분화능을 나타내는 세포로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지된다.
CD14+ 단핵세포에 대한 언급은 세포 표면 분자 CD14를 발현하는 단핵세포에 대한 언급으로 이해되어야 한다. 본 발명을 어떤 하나의 이론이나 작용 모드에 국한시키지 않고, CD14는 박테리아의 리포폴리새커라이드를 감지하기 위한 공(共)수용체 (Toll 유사 수용체 TLR 4 및 MD-2와 함께)로 작용한다. CD14는 리포폴리새커라이드-결합 단백질의 존재하에서만 리포폴리새커라이드와 결합할 수 있다. 리포폴리새커라이드가 그 주요 리간드라고 여겨지지만, CD14는 또한 다른 병소-관련 분자 패턴들을 인식한다. CD14는 주로 대식세포 및 단핵구에 의하여 발현되고, 보다 적은 양으로 호중 과립구 (neutrophil granulocyte)에 의하여 발현된다. 또한, 이는 수지상 세포에 의하여도 발현된다. 용해성 형태인 sCD14는 간 및 단핵구로부터 분비되고 CD14를 발현하지 않는 다른 세포들에 대한 LPS-반응성을 제공하는 충분히 낮은 농도이다. 이를 위하여, "CD14"에 대한 언급은 모든 형태의 CD14 및 이 분자의 기능적 변이체 또는 다형성 형태에 관한 언급으로 이해되어야 하며, 예컨대 CD14 mRNA의 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)으로부터 결과할 수 있는 이소형을 포함한다. "CD14"에 대한 언급은 또한 세포 표면에 발현될 수 있는 모든 전구체, 전구단백질 또는 중간체를 포함하는 이 분자의 모든 형태에 관한 언급을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. "CD14"에 대한 언급은 또한 이량체, 다량체 또는 융합 단백질 어떤 형태로 존재하든지, 임의의 CD14 세포 표면 분자까지 활장되는 것으로 이해되어야 한다.
한 가지 구현예에 있어서, 상기 CD14 단핵세포는 단핵구세포이다.
이 구현예에 따르면, 포유류 다계열 분화능 세포를 생성시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계를 포함하고:
(i) CD14+ 단핵구세포 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(ii) 대략 5%-85%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(iii) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵구세포가 다계열 분화능을 나타내는 세포로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지된다.
여전히 본 발명을 어떠한 이론이나 작용 모드에 국한함이 없이, 단핵구세포는 일종의 백혈구이며 척추 동물, 예컨대 모든 포유류, 조류, 파충류 및 어류 등의 선천성 면역계의 일부이다. 단핵구세포는 면역 기능에 있어서 다양한 역할을 수행한다. 이러한 역할은 정상 상태에서 상주 대식세포 및 수지상 세포를 보충하는 것을 포함한다. 염증 신호에 반응하여, 단핵구세포는 빠르게 조직 내 감염 부위로 이동하여 대식세포 및 수지상 세포로 분화, 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 단핵구세포는 골수에 의하여 단핵모세포로 알려진 조혈 줄기세포 전구체로부터 생성된다. 이들은 1-3일 동안 혈류 내에서 순환하다가 통상 몸 전체의 조직 내로 이동한다. 단핵구세포는 혈중 백혈구의 3-8%를 구성한다. 대략 절반은 적비수의 빌로쓰 코드 (red pulp's Cords of Billroth) 내에 클러스터로 비장 내 예비 저장된다. 조직 내에서, 단핵구세포는 여러 해부학적 위치에서 다양한 유형의 대식세포로 성숙한다. 인간 혈중에는 적어도 3 가지 유형의 단핵구세포가 있다:
(a) 고전적인 단핵구세포는 CD14 세포 표면 수용체의 발현 수준이 높은 것으로 특징화됨 (CD14++ CD16- 단핵구세포)
(b) 비(非)고전적 단핵구세포는 CD14의 발현 수준이 낮고 CD16 수용체의 추가적인 공(共)발현을 보여줌 (CD14+CD16++ 단핵구세포)
(c) 중간적 단핵구세포는 CD14의 발현 수준이 높고 CD16의 발현 수준이 낮음을 보여줌 (CD14++CD16+ 단핵구세포).
고전적인 단핵구세포가 중간적 단핵구세포로 전개되고 그 후 비고전적 CD14+CD16++가 되는데 있어서 발생학적 관련이 있는 것으로 보인다. 그러므로, 상기 비고전적 단핵구세포는 보다 성숙된 버전을 나타낼 수 있다. 따라서, "단핵구세포"에 대한 언급은 그 분화의 발생 단계 또는 CD14의 발현 수준에 무관하게 임의의 CD14+ 단핵구세포 유형을 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 단핵구세포는 임의의 적절한 조직, 예컨대 말초 혈액 및 비장 등으로부터 기원할 수 있다.
한 가지 구현예에 있어서, 상기 단핵구세포는 말초 혈액으로부터 유래한다.
이 구현예에 따르면, 포유류 다계열 분화능 세포를 생성시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계를 포함하고:
(i) CD14+ 말초 혈액 유래 단핵구세포 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(ii) 대략 5%-85%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(iii) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵구세포가 다계열 분화능을 나타내는 세포로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지된다.
앞서 상술한 바와 같이, 성숙된 체세포, 구체적으로 단핵구세포가 다계열 분화능의 상태로 전이 유도될 수 있음이 알려졌다. 따라서, "다계열 분화능 (multilineage differentiation potential 또는 multilineage potential)"을 나타내는 세포에 관한 언급은 하나 이상의 체세포 분화 경로를 따라 발생하는 분화능을 나타내는 세포에 대한 언급으로 이해되어야 한다. 예컨대, 상기 세포는 다양한 체세포 유형을 생성시킬 수 있고, 이러한 세포를 보통 만능성 또는 다능성이라고 부른다. 이들 세포는 전능성 세포보다는 더 제한된 범위의 계열로의 분화를 나타내는데, 전능성 세포는 모든 체세포적 계열 및 그 배우자를 포함하는 선천적으로 가능한 임의의 분화 방향으로 발생할 수 있는 세포이다. 본 발명을 어떠한 하나의 이론 또는 작용 모드로 제한함이 없이, 줄기세포가 산후 조직으로부터 유래하는 한, 이를 또한 종종 "성인 줄기세포"라고 부른다. 고전적으로 "전구" 세포 또는 "전구체" 세포로 일컬어지는 많은 세포들 또한, 적절한 자극 조건하에서, 이들이 하나 이상의 체세포 계열의 세포를 발생시킬 수 있다는 것을 전제로 "다계열 분화능"의 정의 범위 내에 있을 수 있다. 본 발명의 방법에 의하여 생성되는 세포의 관점에서 "줄기세포"에 대한 언급이 본 명세서에서 이루어지는 한, 이것은 본 명세서에서 정의되는 바 다계열 분화능을 나타내는 세포에 대한 언급으로 이해되어야 한다.
본 발명의 한 가지 구현예에 있어서, CD14+ 단핵구세포는 조혈세포 계열 또는 중간엽세포 계열 중 하나를 따라 분화하는 분화능을 나타내는 다계열 분화능 표현형으로 전이 유도될 수 있음이 발겨혀졌다. 예컨대, 적절한 자극하에서, 표제의 다분화능 세포는 단핵 조혈세포 (예컨대 림프구 또는 단핵구세포), 다형핵 조혈세포 (예컨대, 호중구, 호염구 또는 호산구), 적혈구 또는 혈소판를 포함하는 조혈세포 계열로, 또는 중간엽세포 계열을 따라, 예컨대 결합 조직, 예컨대 뼈, 연골, 평활근, 힘줄, 인대, 기질, 골수, 진피 및 지방 등의 계열을 따라 하위 분화될 수 있다.
따라서, 본 발명의 양호한 구현예는 포유류의 다계열 분화능 세포를 생성시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계를 포함하고:
(i) CD14+ 단핵구세포 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(ii) 대략 5%-85%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(iii) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵구세포가 다계열 분화능을 나타내는 세포로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지되고, 다계열 분화능 세포는 조혈세포 및/또는 중간엽세포 분화능을 나타낸다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 다계열 분화능 세포는 CD14+, CD34+, CD105+, CD44+, CD45+, 및 CD24+이다.
또 하나의 다른 구현예에 있어서, 상기 다계열 분화능 세포는 CD14+, CD34+, CD105+, CD44+, CD45+, CD38+, CD31+ 및 CD59+이다.
더욱 좋기로는, 상기 조혈세포 분화능은 림프구, 단핵구세포, 호중구, 호염구, 호산구, 적혈구 또는 혈소판으로 분화하는 능력이고 상기 중간엽세포 분화능은 뼈, 연골, 평활근, 힘줄, 인대, 기질, 골수, 진피 또는 지방 세포로 분화하는 능력이다.
본 발명의 "포유류" 또는 "포유류의"라는 용어는 인간, 영장류, 가축 동물 (예컨대, 말, 소, 양, 돼지, 당나귀), 실험실 시험 동물 (예컨대, 마우스, 래트, 기니 피그), 반려 동물 (예컨대, 개, 고양이) 및 포획 야생 동물 (예컨대, 캥거루, 사슴, 여우)를 포함한다. 좋기로는, 상기 포유류는 인간 또는 실험실 시험 동물이다. 더욱 좋기로는, 상기 포유류는 인간이다.
CD14+ 단핵세포, 예컨대 단핵구세포의 다계열 분화능 세포로의 "전이"를 유도한다는 언급은 체세포적 표현형을 본 멍세서에서 정의하는 유형의 다계열 분화능 표현형으로 변화시키는데 필요한 유전학적, 형태학적 및/또는 기능적 변화를 유도한다는 것으로 이해되어야 한다.
CD14+ 단핵 세포의 다계열 분화능 세포로의 시험관 내 탈분화를 유도한다는 관점에서, 이것은 시험관 내 조직 배양의 소규모 또는 대규모의 바이어리액터 생산의 문맥 어느 것으로도 이루어질 수 있다.
앞서 상술된 바와 같이, CD14+ 단핵세포의 다계열 분화능 세포로의 전이가 상기 세포에 고유한 세포 배양법을 적용함으로써 시험관 내에서 이루어질 수 있다는 것이 밝혀졌다. 구체적으로, 단핵세포의 개시 시료는 특이적인 분율로 알부민 및 세포 배양 배지와 함께 배양된다. 이것이 본 발명 방법의 특별한 장점인데, 대부분의 세포 배양계와는 달리 본 발명 배양체의 구축은, 세포 수의 측정과 적절한 세포 농도의 조절을 수반하는 특정 세포 농도를 배양하는 것에 기초하지 않고 배양체를 그 부피 내의 실제 세포 수에 무관하게 부피 분율에 맞춰 설계하는 것에 기초하기 때문이다. 이는 여하간의 CD14+ 단핵세포 개시 부피가 이용 가능한지 또는 작업하기 편리한지 간에 그에 기반하여 본 발명의 방법을 매우 간이하고 규칙적이게 한다.
그러므로, 본 발명의 시험관 내 배양 시스템은 CD14+ 단핵세포 현탁물의 개시 부피에 맞춰 구축된다. "현탁물"이라는 언급은 비부착 세포의 시료에 대한 언급으로 이해되어야 한다. 이들 세포는 임의의 적절한 배지 내에, 예컨대 상기 세포를 살아있는 상태로 유지시킬 등장성 용액 (예컨대, PBS, 염용액, Hank 밸런스드 염용액 또는 기타 밸런스드 염용액 변주), 세포 배양 배지, 체액 (예컨대, 혈청) 또는 등등 내에 함유될 수 있다. 본 발명에 예시되는 바, 말초 혈액 단핵세포 시료는 표준 밀도 구배 원심분리를 이용하여 분리되어 그에 의하여 얻어진 세포군은 본 발명의 방법에 따라 배양되었다. 그러나, 표제의 세포는 다른 방법, 예컨대 양성 또는 음성 자기 비드 분리에 의하여 강화 또는 처치를 경험할 수 있는데, 이는 최종 CD14+ 단핵세포 현탁물을, 이용하는 방법의 성질에 따라 여러 가지 등장성 용액 중 임의의 하나에 함유될 수 있도록 한다. 수득되는 실제 세포 농도에 무관하게, 임의의 적절한 부피의 이러한 현탁물이 본 발명의 배양체를 구축하는데 사용될 수 있다. 이러한 부피는 사용하고자 하는 배양 시스템의 유형에 기초하여 선택될 것이다. 예컨대, 플라스크-기반 시스템, 백-기초 시스템 또는 롤러 보틀-기초 시스템에서 배양하고자 한다면, 약 1 리터 이하의 작은 부피가 세포 배양체의 총량을 형성하게 될 것이다. 그러나, 바이오리액터의 관점이라면, 훨씬 큰 부피의 세포 배양체가 동원됨으로써 더 큰 개시 부피가 이용될 수 있다. 이용될 특정 세포 배양 시스템의 관점에서 그 이용을 위한 적절한 최종 세포 배양 부피를 결정하는 것은 이 기술 분야의 숙련자에게는 잘 알려져 있다.
본 발명의 세포 배양체를 최초로 구축하는 관점에서, 배양될 상기 세포 배양체의 최종 부피는, CD14+ 단핵세포 현탁물 약 15% v/v을 약 15% v/v의 5%-85% 알부민 용액과 약 70% v/v의 세포 배양 배지와 함께 포함한다. 본 발명에서 상술되는 바, 이들 백분율 값에 대한 언급은 이들 특정 백분율로부터의 일부 편차는 허용되고 기능적으로 균등한 분율을 제공하는 한 대략적인 것이다. 매우 단순하고 통상적인 예시된 배양 시스템의 성질에 기초하여, 어느 정도로 상기 백분율 값의 일부 편차가 가능한지 결정하는 것은 이 기술 분야의 숙련자에게는 잘 알려져 있다. 예컨대, 약 10% 내지 20% v/v 단핵세포 현탁물 및 5%-85% 알부민 용액, 특히 11%-19%, 12%-18%, 13%-17% 또는 14%-16%가 유효할 수 있음이 예상된다. 표제의 알부민 용액에 관하여, 약 4% 내지 90%, 또는 5%-86% 또는 좋기로는 5%-7%의 용액이 균등하게 유효할 수 있다.
어떤 식으로든 본 발명을 제한함이 없이, 매우 광범위한 범위에 걸친 알부민 농도가 본 발명의 방법에서 유효함이 밝혀졌다. 따라서, 농도 범위 5%-85%, 5%-80%, 5%-75%, 5%-70%, 5%-65%, 5%-60%, 5%-50%, 5%-45%, 5%-40%, 5%-35%, 5%-30%, 5%-25%, 5%-20%, 5%-15%, 5%-10%가 사용될 수 있다. 한 가지 구현예에 있어서, 상기 농도는 5%-20%이다.
따라서, 본 발명의 한 가지 구현예는 포유류 다계열 분화능 세포를 생성시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계를 포함하고:
(i) CD14+ 단핵구세포 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(ii) 대략 5%-20%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(iii) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵구세포가 다계열 분화능을 나타내는 세포로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지된다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 알부민 농도는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%이다.
본 발명은 본 발명에 나타나 있는 바, 15% v/v 세포, 5%-20% v/v 알부민 또는 70% 세포 배양 배지라는 언급을 엄격히 고수하여 그에 한정되어서는 아니되며, 예컨대 본 발명의 기능성을 보유하고 이 기술 분야의 숙련자에 의하여 통상적이고 용이하게 시험될 수 있는 이들 백분율에 대한 그 수치 범위 변이를 포함한다.
앞서 상술된 바와 같이, 개시 세포 현탁물 내 CD14+ 단핵세포의 농도는 임의의 세포수일 수 있다. 그 세포수가 비교적 적든 비교적 많던 간에, 본 발명의 중요한 점은 오로지 그 개시 세포 현탁물이 그 현탁물 내 세포 농도와 무관하게 개시 세포 배양체의 총부피 중 15% v/v라는 것이다. 그럼에도 불구하고, 양호한 구현예에 있어서, 상기 개시 세포 농도에 하한이나 상한이 없음에도, 상기 세포수는 배양 중에 이들 단핵세포가 부착하기에 배양 컨테이너 내의 표면 면적이 불충분할 정도로 그 수가 너무 많지 않도록 제안된다. 상기 방법이 그럼에도 불구하고 다계열 분화능을 나타내는 세포를 생성하는데 성공하더라도, 상기 개시 세포 농도가 너무 높아서 이들 세포가 부착하기에 불충분한 표면이 마련될 정도이면, 부착하지 못한 세포들이 줄기세포로 탈분화되지 못하고 그로써 상기 방법이 효율적이나 최적으로 효율적이지는 않음을 간단히 알 수 있을 것이다. 따라서, 이에 관하여, 효율의 최대화라는 관점에서, 실시자는 상기 개시 세포 배양체의 일부를 형성하는 세포 농도가, 이용에 선택된 특정 조직 배양 컨테이너에, 존재하는 모든 세포들이 부착할 수 있는 환경에서 배양될 것을 보장하기를 바랄 수 있다. 예컨대, 배양 백 컨테이너를 사용하는 경우, 106 세포/ml 이하의 세포 농도가 적절하다.
사용되는 알부민 용액에 관하여, 6% 알부민 용액이 흔히 시판되지만, 다르게는 임의의 적절한 등장성 용액, 예컨대 염용액으로 이루어질 수 있다. "알부민"이라는 용어는 증류수 및 반포화된 황산암모늄 용액에 용해성이지만 완전히 포화된 황산암모늄 용액에서는 불용성인 구상 단백질의 군을 말하는 것으로 의도됨을 이해하여야 한다. 예컨대, 혈청의 주요 단백질인 혈청 알부민이 본 발명의 방법상 사용될 수 있다. 그러나, 락트알부민 또는 오브알부민과 같은 임의의 알부민 분자가 이용될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 임의의 합성 재조합 알부민 또는 알부민의 유도체형도 본 발명의 방법에서 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 이 기술 분야의 숙련자라면, 예컨대 본 발명의 개시 배양 부피 중 15% v/v 분율로 6% 알부민 용액을 사용함으로써, 0.9% 알부민이라는 유효 농도가 얻어진다는 것을 알 수 있을 것이다.
개시 배양체 부피의 나머지는 세포 배양 배지로 이루어지고, 이는 상기 개시 세포 배양체 부피의 70% v/v를 이룬다. "세포 배양 배지"라는 언급은 포유류 세포 성장을 뒷받침하도록 설계된 액체 또는 겔을 말하는 것으로, 특히 줄기세포 배양을 뒷받침할 배지를 말하는 것으로 이해되어야 한다. 이를 위하여, 임의의 적절한 세포 배양 배지가 사용될 수 있는데, 예컨대 세포 성장에 필요한 최소한의 영양분을 제공하는 최소 배지, 또는 포유류 세포의 생존 유지 및 성장을 촉진하는 추가적인 영양분을 함유할 수 있는 강화 배지를 들 수 있다. 사용에 적합한 배지의 예시로는 DMEM 및 RPMI를 들 수 있다. 또한, 세포 생존 유지 및 성장을 용이하게 하기 위하여 아미노산이나 당과 같은 선택된 추가 제제를 함유하는 보중 최소 배지도 사용될 수 있다. 상기 배지는 또한 기타 임의의 적절한 제제, 예컨대 항생제로 더 보충될 수 있다. 다른 예시에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 세포 생존 및 성장을 더 뒷받침하기 위하여 인슐린으로 보강된다. 70% v/v 세포 배양 배지에 대한 언급은, 그것이 염용액과 같은 등장성 용액이든 최소 배양 배지이든, 개시 CD14+ 단핵세포 또는 알부민이 현탁되는 용액의 성질에 의하여 영향받지 않는 독립형 요건으로 이해되어야 한다. 사실상, 본 발명의 배양 시스템에 도입되기 이전에, 단핵세포가 최초로 현탁되거나 알부민이 용해되는, 그 용액의 성질에 무관하게, 개시 세포 배양군의 총부피에 대한 백분율로서 70% v/v 세포 배양 배지 요건이 변치않고 유지된다는 것은 특별한 장점이다.
한 가지 구현예에 있어서, 상기 세포 배앙체는 추가적으로 10 mg/L 인슐린을 포함한다.
앞서 상술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 CD14+ 단핵세포군을, 그 단핵세포의 중간엽/조혈 줄기세포 표현형으로 탈분화 유도하기 위하여 세포 배양 배지 및 5%-85%의 알부민 용액과 함께 특정 분율로 배양한다는 것에 전제한다. 상기 CD14+ 단핵세포는 표제의 줄기세포 표현형이 달성되는 그러한 시간까지 시험관 내 배양된다. 한 가지 구현예에 있어서, 표제의 줄기세포를 생성하는데 3-8일의 배양 기간, 특히 4-7일이 적절하다는 것이 밝혀졌다. 필요한 정도의 탈분화가 이루어졌는지 아닌지를 결정하기 위하여 시험관 내 배양된 세포들을 표본화하는 것이 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 온도 및 CO2 비율 양자의 관점에서 그 조건하에서 세포를 배양하기 위한 가장 적절한 조건을 결정하는 것 역시 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있을 것이다. 본 발명을 어떠한 하나의 이론이나 작용 모드에 국한시킴 없이, 인간 CD14+ 단핵세포 배양시 4 내지 5일의 배양이 특히 적합하다는 것이 밝혀졌다. 또 다른 양호한 구현예에 있어서, 본 발명의 방법은 특히, 배양될 것이 인간 CD14+ 단핵세포인 경우라면, 상기 단핵세포의 세포 배양 컨테이너로의 부착을 용이하게 하기 위하여, 세포 배양 현탁물은 최초에 5% CO2/37℃에서 60-120 분간 배양되는 것이 효과적임이 밝혀졌다. 그 후, 배양은 수일간의 배양 기간에 걸쳐 우수한 세포 생존 및 성장을 유지하기에 적합해 보이는 조건하에서 진행될 수 있다. 이를 위하여, 적절한 세포 배양 조건을 구축하는 것이 통상적인 과정의 문제라는 것을 이 기술 분야의 숙련자는 인식할 것이다.
따라서, 한 가지 구현예에 있어서, 인간의 다계열 분화능 세포를 생성시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계를 포함하고:
(i) CD14+ 인간 말초 혈액 단핵구세포 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(ii) 대략 5%-85%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(iii) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵구세포가 다계열 분화능을 나타내는 세포로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지된다.
한 가지 구현예에 있어서, 상기 알부민 용액은 5%-20%, 좋기로는 5%-15%이다.
한 가지 구현예에 있어서, 상기 배양되는 세포는 10 mg/L의 인간 인슐린 또는 그의 기능적 단편 또는 균등물을 추가적으로 포함한다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 세포는 4 내지 7일간, 특히 4 내지 5일간 배양된다.
앞서 상술한 바와 같이, 본 발명은 단리된 CD14+ 단핵세포군에 대하여 시험관 내로 수행된다. 이를 위하여 표제의 세포가 개체 (예컨대, 처치의 대상이 될 수 있는 개체)로부터 신선하게 단리되거나 또는 이들은 비신선 원, 예컨대 배양체 (예컨대, 세포수가 증가 및/또는 세포가 배양되어 분화 신호 수용성인 것)로부터 또는 동결된 세포 스톡 (예컨대, 구축된 단핵구세포 세포주)로부터 기원할 수 있는데, 이는 개체 또는 다른 기원으로부터 보다 이른 때에 단리된 것이다. 또한, 표제의 세포는 다른 형태의 처리 또는 조작을 거친 것일 수 있는데, 예컨대 강화 또는 정제, 세포 주기의 변경 또는 세포주의 형성 등이지만 이에 국한되지는 않는다. 따라서, 표제의 세포는 1차 세포 또는 2차 세포일 수 있다. 1차 세포는 개체로부터 단리된 것이다. 2차 세포는, 그 단리 후, 예컨대 본 발명의 방법을 적용하기 전에 세포주를 준비하는 것 등 몇 가지 형태의 시험관 내 조작을 거친 것이다. 또한, 개시 CD14+ 단핵세포군은 비교적 순수한 것이거나 또는 이형 세포군, 예컨대 말초 혈액 세포군의 일부일 수 있음을 이해하여야 한다. 이는 추후 더 논의된다.
관련된 측면에 있어서, 본 발명의 방법은 또한 본 발명의 방법에 의하여 생성된 다계열 분화능 세포 (MLPC)의 보다 성숙한 표현현으로의 분화를 유도하도록 조정될 수 있음을 이해하여야 한다. 예컨대, 본 발명의 양호한 구현예적 문맥상, 조혈 줄기세포는 모든 혈액 세포 (예컨대, 적혈구, 혈소판, 림프구, 단핵구세포 및 과립구)를 제공하는 반면, 중간엽 줄기세포는 광범위한 결합 조직, 예컨대 뼈, 연골, 평활근, 힘줄, 인대, 기질, 골수, 진피 및 지방을 제공한다. 본 발명의 방법이 중간엽 분화능 및 조혈 분화능 양자를 모두 갖는 MLPC를 생산하는 한, 본 발명의 방법은, 시험관 내 또는 생체 내 어떤 식이든, 표제의 MLPC군을 상기 대상 계열을 따라 부분적 또는 완전한 분화를 유효하게 하기 위하여 필요한 특정한 자극에 도입할 추가적인 단계를 포함하도록 조정될 수 있다.
또한, 이러한 추가적인 유도 분화가 시험관 내에서 편리하게 수행될 수 있음에도, 생체 내에서도 이루어질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 이는 추후 보다 상세히 논의된다. 그러나, 특정한 인 시투 (in situ) 환경이 또한 특정 계열을 따르는 MLPC의 분화 유도에 필요한 범위의 신호를 편리하게 제공할 수 있다.
그러므로, "MLPC-유래 세포"라는 언급은 MLPC보다 더 분화되고 상기 MLPC로부터 온 세포 유형에 대한 언급으로 이해되어야 한다. 이들 세포는 MLPC가 제공한다고 알려져 있는 계열의 세포, 예컨대 조혈 줄기세포와 관련된 혈액 세포 및 중간엽 줄기세포와 관련된 결합 조직에 해당할 것이다. 표제의 MLPC-유래 세포는 특정 서브그룹의 세포 계열을 따라 비가역적으로 분화 진행된 더 분화된 전구체 세포, 예컨대 조혈 줄기세포 도는 중간엽 줄기세포일 수 있고, 또는 이는 특정 세포 계열의 부분적으로 또는 종국적으로 분화된 형태, 예컨대 적혈구, 림프구 또는 등등에 해당할 수도 있다. 그러므로, 본 발명의 이러한 측면의 관점에 포함되는 세포들은 발생상 임의의 후기-MLPC 분화 단계에 있을 수 있다. 앞서 상술한 바와 같이, 이러한 추가 분화는 구성상으로 발생하는 것일 수 있거나 하나 이상의 추가 신호를 필요로 하는 것일 수도 있다. 이러한 신호는 시험관 내, 예컨대 소규모의 시험관 내 조직 배양이나 대규모의 바이오리액터 생산의 맥락에서 제공되거나, 또는 생체 내 미세 환경에서, 예컨대 어떤 전구체 세포가 그 추가적인 분화를 위하여 적절한 조직 미세 환경에 이식되는 경우와 같은 미세 환경에서 제공될 수 있다.
따라서, 본 발명의 관련 측면에 있어서, 포유류 MLPC-유래 세포 생성을 촉진하는 방법이 제공되고, 상기 방법은
(i) 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계:
(a) CD14+ 단핵세포 (mononuclear cell) 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(b) 대략 5%-85%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(c) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵세포가 MLPC로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지되고; 필요에 따라
(ii) 상기 단계 (i)의 MLPC를 자극을 접하게 하여 상기 MLPC를 MLPC-유래 표현형으로의 분화를 이끌어내는 단계를 포함한다.
한 가지 구현예에 있어서, 상기 CD14+ 단핵세포는 단핵구세포, 더욱 좋기로는 말초 혈액 유래 단핵구세포이다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 알부민은 5%-20%이다.
또 다른 하나의 구현예에 있어서, 상기 MLPC는 조혈세포 분화능 및 중간엽세포 분화능 양자 모두를 나타낸다.
그러므로, 이러한 구현예에 따르면, 좋기로는 포유류 MLPC-유래 세포 생성을 촉진시키는 방법이 제공되는데, 상기 방법은
(i) 분율적으로 하기의 것들을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계:
(a) CD14+ 단핵세포 (mononuclear cell) 현탁물 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(b) 대략 5%-85%의 알부민 용액 15% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(c) 세포 배양 배지 70% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
여기서, 상기 세포 배양체는 상기 단핵세포가 MLPC로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지되고; 필요에 따라
(ii) 상기 단계 (i)의 MLPC를 자극을 접하게 하여 상기 MLPC를 조혈 또는 중간엽 표현형으로의 분화를 이끌어내는 단계를 포함한다.
더욱 좋기로는, 상기 조혈 줄기세포-유래 세포는 적혈구, 혈소판, 림프구, 단핵구세포, 호중구, 호염구 또는 호산구이다.
또 다른 양호한 구현예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포-유래 세포는 결합 조직, 예컨대 뼈, 연골, 평활근, 힘줄, 인대, 기질, 골수, 진피 또는 지방의 세포이다.
본 발명의 이러한 측면상, 조직 (예컨대, 근육 또는 피부 조직) 또는 세포 현탁물 (예컨대, 조혈세포 현탁물)과 같은 두 가지 세포 집합체가 생성될 수 있음을 이해하여야 한다.
앞서 상술한 바와 같이, 본 발명은 줄기세포가 CD14+ 단핵세포로부터 생성될 수 있다는 발견에 전제하고 있다. 이를 위하여, 이것이 개시 군집의 모든 CD14+ 세포의 전이를 유도하는 관점으로 또는 이들 성숙한 체세포의 개시 군집 중 서브군의 전이를 유도하는 관점으로 이루어질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 이것은, 예컨대 개시 세포군의 순도 및/또는 불균질성에 달린 것으로 보인다. 또한, 본 발명의 배양 시스템은 세포들로 이루어진 이종의 군을 생성하는 결과를 낳을 수 있다. 이는, 예컨대 개시 군집의 모든 세포들이 MLPC 표현형으로 전이하지 않거나, 모든 MLPC 세포가 그 후 더 성숙한 동종의 표현형으로 분화 유도되지 않는다면 일어날 수 있다. 이러한 경우, 개시 군집의 모든 세포가 반드시 MLPC 표현형으로 분화하거나 MLPC-유래 표현형으로 분화할 수 있는 것은 아니기 때문에, 그리고 얻어진 MLPC-유래 세포 결과물이 그 자체로 이종일 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은 원하는 표현형을 나타내는 세포를 동정하고 단리하기 위한 스크리닝 및 선별 단계에의 적용을 필요로 할 수 있다. 동정 방법은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 하기의 것들을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다:
(i) 세포 계열 특이적 구조의 검출
확인될 구조의 유형에 따라, 예컨대 광학 현미경, 형광 친화도 표지, 형광 현미경 또는 전자 현미경을 통하여 세포 계열 특이적 구조의 검출이 수행될 수 있다. 광학 현미경은 형태적 특징, 예컨대 림프구 대 다형핵 대 적혈구 핵 특성 또는 다핵성 골격근 세포 특징을 검출하는 데 사용될 수 있다. 다른 예시에 있어서, 약 10-30 μm 직경의, 미성숙 심장근육세포의 둥근형 또는 막대형 형태 특징을 갖는 단핵세포가 확인될 수 있다. 전자 현미경은 근절, X-밴드, Z-바디, 개재판, 갭 정션, 데스모좀과 같은 구조를 검출하는 데 사용될 수 있다. 형광 친화도 표지 및 형광 현미경은 문제의 구조에 특이적으로 결합하고, 형광체에 직접 또는 간접적으로 결합되는 분자, 흔히 항체인 분자를 형광 표지함으로써 세포 계열 특이적 구조를 검출하는 데 사용될 수 있다. 적절한 검출 및 컴퓨터 시스템을 이용하여 이러한 구조들에 대한 자동화된 정량이 수행될 수 있다.
(
ii
) 세포 계열 특이적 단백질의 검출
세포 표면 단백질 또는 세포 내 단백질과 같은 세포 계열 특이적 단백질의 검출은, 예컨대 형광 친화도 표지 및 형광 현미경을 통하여 편리하게 유효할 수 있다. 특이적 단백질은 전세포 및 조직 양자 모두에서 검출될 수 있다. 간단히, 형광으로 표지된 항체는 고정된 세포 상에 반응하여 특정 심장 표지자를 검출한다. 또는, 웨스턴 면역블롯팅 또는 혼성 마이크로 어레이 ("단백질 칩")과 같은 기법이 이용될 수 있다. 이러한 방법을 통하여 검출될 수 있는 단백질은 특정 군의 세포 특징인 임의의 단백질일 수 있다. 예컨대, 전구체 세포/전구 세포 유형의 부류는 하나 이상의 표면 분자의 발현 존부를 통하여 구별될 수 있다. 이와 관련하여, 이 방법은 하나 이상의 임의의 분자 발현에 기초한 양적 또는 음적 선별 단계를 통하여 세포 유형을 확인하는 데 사용될 수 있다. 더 성숙된 세포는 보통 문헌에 의하여 잘 알려진 다양한 특정 세포 표면 단백질 또는 세포 내 단백질의 발현으로 특징화될 수 있다. 예컨대, 모든 조혈 세포 유형의 분화 단계는 세포 표면 분자 발현 패턴의 관점에서 잘 정의되어 있다. 유사하게, 근육 세포 및 기타 중간엽-유래 세포 유형들 역시 발생의 다양한 분화 단계를 통하여 단백질 발현 프로파일이라는 관점에서 잘 보고되어 있다. 이를 위하여, 본 발명의 MLPC는 통상 CD14, CD34, CD105, CD44, CD45, CD38, CD31 및 CD59을 발현하고, 이들은 일반적으로 단핵구성 줄기세포, 중간엽 줄기세포 및 조혈 줄기세포의 특징적인 세포 표면 표지자이다.
(
iii
) 세포 계열 특이적
RNA
또는
DNA
의 검출
이 방법은 좋기로는 RT-PCR 또는 실시간 (qRT-PCR)을 이용하여 유효하다. 또는, 사용될 수 있는 기타 방법은 혼성 마이크로 어레이 ("RNA 칩) 또는 노던 블롯팅 또는 서던 블롯팅을 들 수 있다. RT-PCR은 기본적으로 임의의 단백질, 예컨대 상기 (ii)에서 상술된 단백질 또는 분비 단백질 또는 상기 (ii)에 기술된 방법론을 통하여 쉽게 검출될 수 없는 단백질을 코딩하는 특정 RNA를 검출하는 데 사용될 수 있다. 예컨대, B 세포 분화 초기에, 면역글로불린 유전자 재배열은 상기 재배열된 면역글로불린 분자의 세포 표면 발현 전에 DNA 수준에서 검출 가능하다.
(
iv
) 세포 계열 특이적인 기능적 활성의 검출
그 기능성이라는 관점에서 세포군의 분석이 일반적으로 상기 (i)-(iii)의 스크리닝 방법보다 덜 편리한 것으로 간주되긴 하지만, 경우에 따라서는 해당이 없을 수 있다. 예컨대, 심장 세포를 생성시키고자 한다면, 광학 현미경하에서 심장 특이적 기계적 수축을 간단히 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 방법을 적용함으로써 얻어지는 세포군을 특징화한다는 관점에서, 상술한 임의의 기법 1종 이상이 이용될 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명의 방법에 따라 배양하기 전에 CD14+ 단핵세포에 대한 성숙된 체세포군을 강화하거나 단리 또는 그들로부터 유래하는 MLPC 세포군을 강화한다는 관점에서, 다시금 다양한 공지의 기법들이 수행될 수 있다. 앞서 상술한 바와 같이, 항체 및 기타 세포 표면 결합 분자, 예컨대 렉틴과 같은 분자가 특히 특정 세포 계열 및/또는 분화 단계와 관련된 표지자들을 확인하는 데 유용하다. 항체는 고체 지지체에 부착되어 분리 가능할 수 있다. 그러나, 기타 세포 분리 기법으로는 물리적 특성 차이 (밀도 구배 원심분리 및 대향류 원심세정 (counter-flow centrifugal elutriation)) 및 생체 염색 특징 차이 (미토콘드리아-결합 염료 로다민 123 및 DNA-결합 염료 Hoechst 33342)에 기초한 것들을 들 수 있다.
분리 절차로는 항체 또는 렉틴-코팅된 자성 비드를 이용하는 자성 분리, 친화 크로마토그래피, 고체 기질에 부착된 항체를 이용하는 "패닝 (panning)" 또는 기타 임의의 편리한 기법을 들 수 있다. 특히 정밀한 분리를 제공하는 기타 기법으로는 형광 활성화 세포 분류를 들 수 있는데, 이 기법은 또한 순방향 대 측방향 광 산란에 의하여 식별 가능한 형태적 특징에 기초하여 세포 분리에 적용할 수 있는 것이다. 이들 기법을 양적 또는 음적 선별의 관점에서 적용할 수 있으나, 추가적인 음적 선별 기법으로 세포용해성, 세포사멸성 또는 달리는 독성 제제의 위치-지정 투여를 들 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 이는 그 지정된 전달을 용이하게 하기 위하여 이러한 제제를 모노클로날 항체에 커플링시킴으로써 가장 편리하게 달성될 수 있다. 또 다른 예시로, 항체로 옵소닌화 후 보체를 투여하여 동일한 결과를 달성할 수 있다.
이들 기법은 하나의 단계 또는 다단계 프로토콜로서 수행되어 원하는 수준의 정제 또는 강화를 달성할 수 있다.
본 발명의 세포 및 조직 증식 능력은 주어진 용도, 예컨대 손상된 조직을 보수하거나 치료적 처리법의 효과를 시험하기 위한 용도에 필수적일 수 있기 때문에, 적절한 수준의 증식 능력을 보이는 세포들을 스크리닝하는 것이 바람직할 수 있다. 세포의 증식 능력을 결정하는 것은 다수의 표준 기법들에 의하여 수행될 수 있다. 좋기로는, 증식의 측정은 3[H]-티미딘 또는 125I-요오도디옥시유리딘 흡수 시험을 통하여 유효하다. 또는, XTT와 같은 대사 염료를 이용한 비색 시험법 또는 직접적인 세포 계수를 이용하여 증식 능력을 확인할 수 있다. 또한, 증식 능력은 Ki-67과 같은 세포 주기 표지자의 발현을 통하여 평가될 수 있다.
앞서 상술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 시험관 내로 수행될 수 있다. 시험관 내 기술의 관점에서, 그러므로, 이제 통상적이고 믿을만하게 소규모 또는 대규모로 MLPC 또는 MLPC-유래 세포를 생산하는 수단이 제공되는 것이다. 예컨대, 조직 배양 플라스크 또는 백에서 유효할 수 있는 소규모 생산의 관점에서, 이는 특히 주어진 독립적이고 특이적인 조건상 세포군을 생성하는 데 적합할 수 있다. 대규모 생산의 관점에서, 본 발명의 방법은 대규모 수요를 충족시킬 실현 가능한 수단을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 대규모 생산을 달성하는 하나의 수단은 바이오리액터의 이용을 통하는 것이다.
바이오리액터는 생체 내 영양 농도 및 속도를 모방하는 제어된 농도 및 속도로 배지와 산소를 전달할 수 있는 배양 과정을 제공하도록 설계된다. 바이오리액터는 수년간 시판을 통하여 이용 가능하여 왔으며 다양한 유형의 배양 기술을 이용한다. 포유류 세포 배양에 사용되는 여러 가지 바이오리액터 중에서, 대부분은 단일한 세포 유형의 고밀도 배양 생산이 가능하도록 설계되었고 본 발명에서도 그러한 것을 이용한다. 이러한 고밀도 시스템의 통상적인 활용은 종국-산물로서 세포에 의하여 생성된 조건화된 배지를 생산하는 것이다. 예컨대, 이것은 모노클로날 항체의 하이브리도마 생산 및 바이러스 벡터 생산용 세포주를 패키징하는 경우이다. 그러나, 이들 활용은 본 발명에서와 같이 치료적 종국-산물이 수확된 세포 그 자체인 활용과는 다른 것이다.
일단 작동되면, 바이오리액터는 자동 조절되는 배지 흐름, 산소 전달 및 온도와 pH 제어를 제공하고, 일반적으로 많은 수의 세포 생산을 가능케 한다. 따라서, 바이오리액터는 노동력 절감 및 중간-공정 오염 가능성을 최소화하고, 가장 복잡한 바이오리액터는 최소한의 직접 노동력만을 필요로 하고 열린 공정 단계를 포함하는 셋업, 성장 선별 및 수확 과정을 가능하게 한다. 이러한 바이오리액터는 본 발명에서 고려되는 바와 같이 동종의 세포 혼합물 또는 집단화된 세포군을 이용하는 데 최적으로 설계된다. 본 발명에서 사용하기 위한 적절한 바이오리액터는 미국 특허 No. 5,763,194, No. 5,985,653 및 6,238,908, No. 5,512,480, No. 5,459,069, 5,763,266, 5,888,807 및 5,688,687에 개시된 것들을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
MLPC의 시험관 내 유도 분화가 필요한 경우와 같이, 임의의 큰 부피, 장기간의 세포 배양에 있어서, 몇 가지 기본적인 변수들이 제어될 필요가 있다. 배양체는 세포 생존 유지, 증식 및 분화 (아마도 몇 가지 개별적인 분화 배양 및 조건의 관점에서) 뿐 아니라 최종 세포 배양체 보존을 가능하게 하는 배지를 제공받아야 한다. 통상, 규칙적으로 배지를 바이오리액터 내에서 펌핑, 유입 및 교환함으로써 다양한 배지가 세포에 전달된다. 상기 교환 공정은 배양체로부터 부산물이 제거될 수 있도록 한다. 세포 또는 조직의 성장은 또한 산소원을 필요로 한다. 상이한 세포 유형은 상이한 산소 요건을 필요로 할 수 있다. 따라서, 세포에 산소를 제공하는 유연하고 조정 가능한 수단은 필요한 요소이다.
구체적인 배양체에 따라, 심지어 배양 챔버 내의 세포군 분포 및 배지 공급이 중요한 공정 제어가 될 수 있다. 이러한 제어는 종종 현탁물 배양 설계를 이용함으로써 달성되는데, 이는 세포 대 세포 상호작용이 중요치 않은 경우 유효한 것일 수 있다. 현탁물 배양 시스템의 예시로는 다양한 탱크 반응기 설계 및 가스-투과성 플라스틱 백을 들 수 있다. 3차원 구조로의 조립을 필요로 하지 않는 세포나, 기질 또는 공급층과 근접될 것을 요구하지 않는 세포 (예컨대, 대부분의 혈구세포 전구체 또는 성숙 혈구세포)의 경우, 이러한 현탁물 설계가 사용될 수 있다.
배양 과정 완료시 세포의 효율적인 수집은 효과적인 세포 배양 시스템의 중요한 특징이다. 산물로서 세포를 생산하기 위한 한 가지 접근법은 그 회수에 물리적인 장벽없이 세포를 제한된 공간에서 배양하는 것으로서, 그럼으로써 세포 산물의 간이한 분리가, 상기 목적을 위하여 설계된 시판되는 닫힌 계 세포 세척기 내에서 다루기 쉽고, 최종 수세에 적당한 농축된 세포 부피라는 결과를 낳는다. 최적으로는, 상기 시스템은, 보존제를 함유하거나 함유하지 않는 약학적 허용 담체, 또는 세포 저장 화합물의 첨가를 가능하게 할 것이며, 뿐만 아니라 적절한 멸균 패키징으로의 효율적인 수확을 제공할 것이다. 최적으로는, 상기 수확 및 패키징 공정은 배양 챔버의 유체 경로의 멸균 장벽을 무너뜨림이 없이 완성될 수 있다.
임의의 세포 배양 과정에서, 주요한 관심사는 멸균이다. 산물 세포가 환자에게 이식하기 위한 것인 경우 (종종 환자가 병중이거나 면역 무방비인 때), 미생물이 없을 것이 필수적이다.
본 발명의 개발은 이제 대상체를 치료적으로 또는 예방적으로 처치하기 위한 수단의 개발을 용이하게 하였다. 특히, 그리고 본 발명의 양호한 구현예의 문맥상, 부적절하고, 불충분하거나 비정상적인 조혈 또는 중간엽 세포 기능을 나타내는 환자를 치료하기 위한 수단이, 본 발명의 방법에 따라 생성되는 MLPC 또는 부분적으로 또는 완전히 분화된 MLPC-유래 세포 (예컨대 조혈세포 또는 중간엽세포 유래 세포)를 이들 대상체에게 투여하는 것에 기초하여 제공된다.
이 방법은 광범위한 질환, 예컨대 조혈성 장애, 순환기 장애, 뇌졸중, 심근 경색, 고혈압 골 장애, 유형 II 당뇨병, 불임, 손상되거나 형태적으로 비정상인 연골 또는 기타 조직, 탈장 보수, 지지 메쉬 및 생물학적 스캐폴드를 이용한 골반기저근 탈출증 수술, 기타 근골격계 장애를 위한 세포 치료 및 노화, 수술 또는 외상의 맥락상 손상된 지지 조직의 교체에 적용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
"비정상적 조혈 또는 중간엽 세포 기능"으로 특징화되는 질환에 대한 언급은 적어도 부분적으로는, 조혈 또는 중간엽 계열 세포의 기능 또는 발생의 관점에서 손상 또는 원치않거나 바람직하지 않은 결과에 기인한 임의의 질환을 말하는 것으로 이해되어야 한다. 이것은 동종 쪼는 이종의 세포군에 해당할 수 있다. "조혈 줄기세포", "조혈 줄기세포-유래 세포", "중간엽 줄기세포" 또는 "중간엽 줄기세포-유래 세포"에 대한 언급은 앞서 정의한 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 상기 손상은 정상적이지 않거나 다르게는 바람직하지 않은 임의의 세포 구조 또는 기능 특성, 예컨대 이들 세포의 생산이 불충분한 것을 말하는 것으로 이해되어야 한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 포유류에서 치료적으로 및/또는 예방적으로 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 방법에 따라 생성된, 유효한 숫자의 MLPC 또는 부분적으로 또는 완전히 분화된 MLPC-유래 세포를 상기 포유류에게 투여하는 단계를 포함한다.
더욱 특히, 포유류에서 비정상적 조혈 또는 중간엽 기능으로 특징화되는 질환을 치료적으로 및/또는 예방적으로 치료하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 상기 포유류에게
(i) 본 발명의 방법에 따라 생성된, 유효한 숫자의 조혈 줄기세포, 또는 부분적으로 또는 완전히 분화된 조혈 줄기세포-유래 세포; 또는
(ii) 본 발명의 방법에 따라 생성된, 유효한 숫자의 중간엽 줄기세포, 또는 부분적으로 또는 완전히 분화된 중간엽 줄기세포-유래 세포
를 투여하는 단계를 포함한다.
개체에게 유효한 숫자의 본 발명의 세포를 "투여하는 것"에 대한 언급은 상기 포유류에게 본 발명의 방법에 따라 생성된 생체 외 (ex vivo) 세포군을 도입하는 것을 말하는 것으로 이해되어야 한다. "투여", "제제"에 대한 언급은 상기 포유류에게, 생체 내로 도입된 MLPC에 작용하여 MLPC-유래 세포를 생성시킬 유효량의 1종 이상의 자극을 도입하는 것을 말하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 따르면, 표제의 MLPC 또는 MLPC-유래 세포는 좋기로는 생체 외에서 동정, 단리 및/또는 필요한 표현형으로 분화되어, 그들이 본래 수확되었던 개체 내로 되돌려 이식되는 자가 세포이다. 그러나, 그럼에도 불구하고 본 발명은, 상기 표제의 세포가 처리 대상인 개체와 동일한 조직 적합성 프로파일을 나타내는 경우라면, 임의의 다른 적절한 원으로부터 유래되는 세포의 사용에까지 확장됨을 이해하여야 한다. 따라서, 이러한 세포는 통상 외래 MHC 프로파일을 나타내는 세포 이식과 관련한 조직 적합성 문제를 야기하지 않는다는 점에서 자가 세포인 것이 효과적이다. 이러한 세포들이 "자가"의 정의 내에 들어가는 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, 특정 상황하에서, 상기 표제의 세포가 유전적으로 동이란 쌍둥이로부터 단리되는 것이 바람직하거나, 필요하거나 실시상 유의할 수 있다. 또한, 상기 세포는 우너하는 주요 조직적합성 프로파일을 나타내도록 조작되었을 수 있다. 이러한 세포를 사용하는 것은 조직 및 기관 이식의 관점에서 본질적으로 맞닥뜨리는 어려움을 극복하게 한다. 그러나, 자가 세포를 단리하거나 생성시키기 가능하지 않거나 용이하기 않은 경우, 동종의 줄기세포를 이용할 필요가 있을 수 있다. "동종의" 세포는 처치될 대상체와 동일한 종으로부터 단리된 것이지만 상이한 MHC 프로파일을 나타내는 세포이다. 치료법적 맥락에서 이러한 세포의 사용이 면역억제 처치의 이용을 필요로 하는 것 같지만, 이러한 문제는 그럼에도 불구하고 처치될 대상체의 그것과 유사성을 나타내는 MHC 프로파일을 보이는 세포, 예컨대 형제, 부모 또는 자녀 등 친족으로부터 단리/생성된 세포군을 이용함으로써 최소화될 수 있다. 또한, 본 발명은 이종 이식에까지 확장되는 것으로 이해되어야 한다. 즉, 본 발명의 방법에 따라 생성되고 환자에게 도입되는 세포는 처리될 대상체 종 외의 포유류 종으로부터 단리된다.
본 발명을 어떤 하나의 이론이나 작용 모드에 국한시킴이 없이, 비정상 세포군에 의하여 제공되지 못하는 기능의 심지어 부분적인 복구라 할지라도 많은 질환의 증상을 경감시키는 작용을 할 것이다. 따라서, "유효한 숫자"라는 언급은 적어도 부부적으로는 원하는 효과를 달성하거나, 치료될 특정 질환의 개시를 지연, 그 진행의 억제, 또는 상기 개시 또는 진행을 다같이 정지시키기 위하여 필요한 세포의 수를 의미한다. 물론, 이러한 양은 치료될 특정 질환, 그 질환의 중증도 및 연령, 신체적 조건, 체수, 체중, 생리학적 상태, 동시치료, 병력 및 문제의 장애와 관련된 변수들에 달려있다. 이 기술 분야의 숙련자라면 유효 투여량을 구성할 본 발명의 세포 및 조직의 숫자, 및 그 최적의 투여 모드를 과도한 실험없이 결정할 수 있을 것이고, 이러한 후자의 문제는 이하 더 논의된다. 이들 인자는 이 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고 일반적 실험을 넘어 설명될 것이 없다. 일반적으로, 최대한의 세포 수가 사용되는 것이 양호한데, 즉 건전한 의학적 판단에 따라 안전한 가장 많은 수가 사용된다. 그러나, 의학적 사유, 심리적 사유 또는 기타 임의의 사유로 적은 수의 세포가 투여될 수 있다는 것이 이 기술 분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다.
앞서 논의된 바와 같이, 본 발명의 방법이 그 범위 내에 본 발명에 정의되는 질환을 앓고 있는 개체에게 전이된 세포 또는 완전히 또는 부분적으로 분화된 세포를 도입하는 것을 포함한다고 하더라도, 상기 개체에게 도입된 모든 세포군이 관심 대상인 MLPC 또는 MLPC-유래 표현형을 획득한 경우인 것은 아닐 것이다. 예컨대, CD14+ 단핵구세포군이 MLPC로의 전이를 겪고 전체가 투여된 경우, 상기 필요한 표현형을 나타내는 세포로 전이되지 않은 세포군이 존재할 수 있다. 동일한 일이, MLPC-유래 세포군, 예컨대 특정 조혈세포 또는 중간엽세포군을 투여하는 맥락에서도 있을 수 있다. 그러므로, 본 발명은 해당 분율의 세포가 제공됨으로써 도입되어 전술한 바와 같이 "유효한 숫자"를 구성한다면 달성된다. 그러나, 특히 양호한 구현예에 있어서, 분화를 겪은 세포군은 성공적으로 분화된 세포의 동정, 그들의 단리 및 대상 개체로의 도입에 투입될 것이다. 이는, 예컨대 중간엽-유래 결합 조직이 발생 유도되는 경우 일어날 수 있는 MLPC-유래 세포 이종군을 선별하기 위한 수단을 제공하거나, 또는 적혈구 세포와 같은 투여용 특정 세포의 아군을 선별하기 위한 수단을 제공한다. 활용을 위하여 선택되는 방법의 유형은 치료될 질환의 성질에 의할 것이다. 그러나, 테라토마 형성과 같은 가능한 부작용을 피하기 위하여 일반적으로 순수한 세포군을 투여하는 것이 바람직할 것이 예상된다. 또는, 어떤 경우에는, MLPC군을 분화하게 하는 것이 가능한데, 전체로서 이 군이 필요한 기능적 활성을 나타내는 것으로 보인다면, 무관한 세포 유형의 사전 제거없이 전체로서 이 군을 대상 개체로 도입할 수 있다. 따라서, 이런 경우, "유효한 숫자"라는 언급은 도입에 필요한 세포 총수, 그에 따라 분화된 세포의 숫자가 충분하여 본 발명의 목적인 대상 질환의 치료라는 목적을 달성하는 활성 수준을 생성시키는 수를 말하는 것으로 이해되어야 한다.
앞서 상술한 대로, MLPC 전이는 시험관 내에서 수행된다. 이런 상황에 있어서, 대상 세포는 그 후 개체로의 도입을 필요로 한다. 예컨대, 세포 현탁물은 직접 주입에 의하여 도입되거나, 혈병 내로, 그로써 세포가 덩어리 내에 고정화되고 그럼으로써 이식을 용이하게 하는 방식으로 도입될 수 있다. 또한, 세포는 이식 전에 캡슐화될 수 있다. 캡슐화는 계속하여 증식할 수 있는 (즉, 불멸 특징을 나타내는) 세포의 확산을 방지하기 위하여 또는 조직 호환성 거부 문제를 최소화하기 위하여 유용한 기법이다. 그러나, 캡슐화의 유용성은 이식되는 세포가 제공하기로 요구되는 기능에 달려있을 것이다. 예컨대, 이식되는 세포가 본질적으로 용해성 인자 분비 목적으로 요구된다면, 캡슐화된 세포군은 이 목적을 달성할 것이다. 그러나, 이식되는 세포가 그들의 수축 특성이 요구되는 것이라면, 예컨대 그 세포는 존재하고 있는 근육의 조직 스캐폴드에 통합될 것이 요구될 것이다. 캡슐화된 세포는 이를 효율적으로 수행할 수 없을 것이다.
환자에게 투여되는 세포는 임의의 적절한 경로로 단일 투여량 또는 다회 투여량으로서 투여될 수 있다. 좋기로는, 가능한 경우, 단일 투여가 이용된다. 주입을 통한 투여는 필요한 보수의 유형에 따라 다양한 영역의 조직 또는 기관을 대상으로 할 수 있다.
본 발명의 이러한 측면에 따라, 환자에게 투여되는 세포가 임의의 적절한 형태, 예컨대 세포 현탁물로서 (예컨대, 혈구세포) 또는 조직 이식편 (예컨대, 결합 조직)의 형태를 취할 수 있음을 이해할 것이다. 단일 세포 현탁물을 생성시킨다는 관점에서, 분화 프로토콜은 세포 현탁의 유지를 돕도록 설계될 수 있다. 또는, 세포 집단 또는 조직 형태라면, 이들은 세포 현탁물 내로 분산될 수 있다. 세포 현탁물을 이용하는 관점에서, 환자에게 투여하기 위한 세포들의 특정 아군, 예컨대 특정 단핵 조혈세포를 선별해 내는 것이 또한 바람직할 수 있다. 조직을 환자에게 이식하는 것이 바람직한 경우라면, 이는 통상 외과적 이식을 필요로 할 것이다 (주사바늘이나 카테터를 통한 투여와는 반대로서). 또는, 이러한 조직의 단지 일부분만이 이식될 수 있다. 또 다른 예시에 있어서, 조작된 조직은 표준 조직 조작 기법을 통하여 생성될 수 있는데, 예컨대 본 발명의 세포 및 조직을 함유하게 설계된 형태를 갖는 조직 조작된 스캐폴드를 심고, 상기 심은 스캐폴드를 그 파종된 세포 및 조직에 의하여 스캐폴드의 콜로니화가 가능한 조건하에서 배양함으로써, 형태적 조직의 생성을 가능케 함으로써 생성될 수 있다. 형태화된 조직은 그 후 수혜자에게 투여되는데, 예컨대 표준 외과적 이식 기법에 의하여 투여된다. 적절한 스캐폴드는, 예컨대 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴 등의 세포외기질 성분을 포함하는, 예컨대 생체적합성, 생분해성 고분자 섬유 또는 폼을 이용하여 생성될 수 있다. 적절한 스캐폴드를 생성시키거나 수득하고, 이러한 스캐폴드를 배양 및 이러한 스캐폴드를 치료적으로 이식하기 위한 상세한 가이드라인은 문헌에 알려져 있다 (예컨대, 문헌 [Kim S.S. and Vacanti J.P., 1999. Semin Pediatr Surg . 8:119], [Osiris의 U.S. Pat. No. 6,387,369 ], [Therapeutics, Inc.], [Bell E.의 U.S. Pat. App. No. US20020094573A1]를 참조).
본 발명의 방법에 따르면, 기타 단백질성 또는 비단백질성 분자가 상기 표제의 세포의 도입과 함께 또는 그 전에 또는 그 이후에 공(共)투여될 수 있다. "공투여"는 동일한 제형에서 또는 상이한 제형에서 동일하거나 상이한 경로로 동시 투여, 또는 동일하거나 상이한 경로를 통한 순차적 투여를 의미한다. "순차" 투여는 이들 세포의 도입과 상기 단백질성 또는 비단백질성 분자의 투여 사이의, 또는 이들 세포의 기능적 활성의 개시와 상기 단백질성 또는 비단백질성 분자의 투여 사이의 초, 분, 시간 또는 일에 해당하는 시간차를 의미한다. 이러한 공투여가 필요할 수 있는 환경의 예시로는 다음을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다:
(i) 비-동계 (non-syngeneic) 세포나 조직을 대상체에게 투여하는 경우, 통상 상기 대상체에 의하여 이러한 세포나 조직에 대한 면역 거부가 발생한다. 이런 상황에 있어서, 좋기로는 이러한 투여 전에 개시하여 이러한 거부를 최소화하는 면역억제법으로 상기 환자를 처치하는 것이 또한 필요할 것이다. 동종이계 조직편 거부를 억제하기 위한 면역억제 프로토콜, 예컨대 시클로스포린 A, 면역억제 항체 등등이 상용되고 표준적인 실시예이다.
(ii) 치료될 질환의 성질에 따라, 이식된 세포가 통합되고 완전히 기능할 그러한 시간까지 질환의 증상을 경감시키기 위하여 환자에게 의약 투여 과정을 유지하여야 할 필요가 있을 수 있다. 또는, 질환이 치료되는 시점에, 손상의 재발을 방지하기 위하여 의약의 장기 사용을 개시하는 것이 필요할 수 있다. 예컨대, 대상이 되는 손상이 자가면역 질환에 의하여 야기된 경우 (예컨대, 류마티스 관절염의 맥락에서 발생한 경우), 연골을 대체하거나 보수하기 위하여 동계의 줄기세포가 사용된 경우에도 면역억제 약물의 지속적 사용이 필요할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법이 문제의 질환을 치료하기 위하여 분리 수행되거나, 대상 치료를 촉진하거나 증강하기 위하여 설계된 하나 이상의 추가 기법과 함께 수행될 수 있음이 이해되어야 한다. 이들 추가적인 기법은 앞서 상술한 대로 다른 단백질성 또는 비단백질성 분자의 공투여의 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유류의 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에, 본 발명의 방법에 따라 생성된 MLPC 또는 MLPC-유래 세포군을 사용하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 방법에 따라 생성된 MLPC 또는 MLPC-유래 세포에 관한 것이다.
좋기로는, 상기 MLPC는 조혈 또는 중간엽 줄기세포이다.
본 발명의 관련된 측면에 있어서, 치료 또는 예방을 경험하게 되는 대상체는 치료 또는 예방적 처치가 필요한 임의의 인간 또는 동물일 수 있다. 이에 관하여, 본 발명의 "치료" 및 "예방"에 대한 언급은 그 가장 넓은 문맥으로 간주된다. "치료"라는 용어는 반드시 포유류가 완전 회복까지 치료되는 것을 의미하지 않는다. 유사하게, "예방"은 대상체가 결국 질병 질환에 걸리지 않을 것을 반드시 의미하는 것은 아니다. 따라서, 치료 및 예방은 특정 질환 증상의 경감 또는 특정 질환의 발병 위험을 예방 또는 다르게는 그 발병 위험의 저감을 포함한다. "예방"이라는 용어는 특정 질환 개시의 중증도를 감소시키는 것으로 간주될 수 있다. "치료" 또한 이미 존재하는 질환의 중증도를 감소시키는 것일 수 있다.
시험관 내에서 MLPC 및 MLPC-유래 세포를 생성시키는 방법의 개발은 이제 기 존재하거나 잠재적인 치료법 또는 배양법의 효율 및 독성을 시험하기 위한 시험관 내 기반 스크리닝 시스템의 개발을 용이하게 한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, MLPC 또는 MLPC-유래 세포의 표현형적 또는 기능적 상태에 대한 치료법이나 배양법의 효과를 시험하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 앞서 정의된 방법에 따라 생성된 상기 MLPC 또는 MLPC-유래 세포를 상기 치료법으로 처리하는 단계 및 변경된 기능적 또는 표현형적 상태를 스크리닝하는 단계를 포함한다.
좋기로는, 상기 MLPC는 조혈 또는 중간엽 줄기세포이다.
"변경된"은 분석의 대상인 하나 이상의 기능적 또는 표현형적 변수들이 미처리 세포에 대하여 변화된 것을 의미한다. 이는, 문제의 치료법이 세포 기능을 개선하기 위하여 설계된 경우 바람직한 결과일 수 있다. 그러나, 상기 치료법이 해로운 결과와 연관된 경우, 이는 독성을 표시하는 것일 수 있고 그러므로 상기 치료법의 이용 부적합성을 표시하는 것일 수 있다. 현재는 개개인의 특정 약물에 대한 반응성의 관점에서 관찰되는 차이가 종종 그 개체의 고유한 유전적 구성과 연관된다는 것이 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 상기 문제의 개체로부터 유래되는 핵 물질을 이용하여 생성된 세포에 대하여 이미 존재하거나 새로운 치료법을 시험하는 가치있는 수단을 제공한다. 이는 그 약물을 생체 내 투여하기 전, 개체의 세포계에 대한 약물의 가능한 효과를 평가할 고유한 수단을 제공한다. 환자가 매우 좋지 않은 상태인 경우, 치료법에 의하여 야기될 수 있고, 원치 않는 결과를 야기하는 생리학적 스트레스를 회피하거나 또는 적어도 최소화할 수 있다.
따라서, 본 발명의 이러한 측면은 세포 기능을 표준화하기 위하여 설계되는 처치를 최적화하는 수단을 제공한다. 그러나, 상기 방법은 또한, 치료의 독성을 시험, 특히 화합물을 이용하는 치료의 독성을 평가하는데 사용될 수 있다. 따라서, 예컨대 어떤 화합물을 이용한 치료에 대한 반응에서 본 발명의 세포 및 조직 내 조혈 또는 중간엽 표현형과 관련된 특성 생성 실패는 이러한 화합물의 독성 평가에 사용될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 방법은 약물, 기타 치료법 또는 배양 조건을 스크리닝 및/또는 시험하는 데 사용될 수 있다. 표현형적 변화를 시험하는 관점에서, 본 발명의 이러한 측면은 대상 세포 및 조직의 유전자 발현 프로파일에 대한 변화를 모니터링하는 데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 이러한 측면에 따른 방법은, 예컨대 치료에 대한 반응에 있어서 유전자 발현 패턴 변화를 측정하는 데 이용될 수 있다.
좋기로는, 본 발명의 세포 또는 조직에 적용되는 처치는 어떤 화합물에의 노출이다. 좋기로는, 상기 화합물은 약물 또는 생리학적 이온이다. 또는, 상기 화합물은 성장 인자 또는 분화 인자일 수 있다. 이를 위하여, 그 약물을 투여하기 전, 세포군에 대한 이러한 부작용을 예측할 수 있는 방법이 이용 가능한 것은 매우 바람직하다.
본 발명을 하기 비제한적 실시예를 참조하여 더 설명한다.
실시예
1
MLPC
의 생성
표준 기법을 사용하여 건강한 성인 인간으로부터 정맥 혈액을 추출하고 밀도 구배 원심분리를 이용하여 말초 혈액 단핵세포 (PBMD)를 단리하였다.
CD14+ PBMC 시료를 FEP 혈액 백에 넣었다. CD14+ PBMC 시료와 동일한 부피의 6% 인간 혈청 알부민 용액을 첨가하였다.
줄기세포 배양에 적합한 세포 배양 배지를 첨가하였다. 최종 혼합물은 대략 15%의 CD14+ PBMC, 15%의 6% 인간 혈청 알부민 용액 및 70%의 세포 배양 배지로 구성되었다.
세포 성장을 촉진하기 위하여 임의 부피의 10 mg/L 인슐린을 첨가할 수 있다.
그 후, 세포 배양체를 37℃의 5% CO2 배양기에서 90 분간 배양하여 PBMC가 백 안쪽에 부착되도록 하였다. 부착 후, MLPC가 그 기간을 통하여 유도될 1 내지 7일간 배양하였다. 제7일에, 세포 배양체를 백으로부터 이탈시켜 0.9% 멸균된 일반 염용액으로 수세하였다. 결과물 MLPC이 자가 공여자에게 재도입되기 위하여 시험되고 이를 이용하였다.
실시예
2
MLPC
의 특징 분석
1.
MLPC
의 형태적 관찰
37℃의 CO2 배양기에서 배양 후 제1일, 제2일, 제3일, 제4일, 제5일, 제6일 및 제7일의 세포 배양체를 이용한 슬라이드를 준비하였다. MLPC의 생물학적 특징을 연구하기 위하여, 세포 배양 기간 동안 부착 세포 표현형을 도립 현미경으로 분석하였다 (도 1 내지 8).
2.
유세포
분석
MLPC 줄기세포 발현을 확인하기 위하여, 표면 표지자를 유세포 분석으로 분석하였다. 밀폐된 백 시스템으로부터 MLPC를 수확하고, PBS로 수세, 4℃, 1500 rpm에서 5 분간 원심분리하고, 세포 펠렛을 보관하였다. 세포 밀도를 튜브당 1 x 106로 조정하고, 100 마이크로리터의 PBS 완충액에 재현탁하여 1.5 mL 바이알에 옮겼다. MLPC를 4℃에서 20-30 분간 CD14-FITC, CD29-PE, C31-PE, CD34-PE, IgG-PE 이소형 대조군 (MACS, Germany), CD38-PE, CD45-PE, CD90-FITC, CD105-PE, (BD PharMingen, CA)를 포함하는 5-20 μl 플루오로크롬-표지된 항체와 반응시킨 후 4℃, 2000 rpm으로 5 분간 원심분리하였다. PBS 수세 단계 후 세포 펠렛을 모아, 4℃에서 30 분간 세포 펠렛에 고정 완충액 (eBioscience) 100 마이크로리터를 첨가하였다. 마지막으로, 고정된 MLPC 시료를 4℃, 2000 rpm으로 5 분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 펠렛을 PBS 완충액으로 재현탁하여 4℃에 보관하였다. CellQuest 소프트웨어를 이용하여 살아있는 세포를 확인하였고, 데이터를 로그 히스토그램으로 나타내었다.
3. 결과 분석
현미경 관찰 결과에 대하여, 도 1은 배양 백 안쪽에 부착된 CD14-양성 PBMC를 보여주며, 대부분은 90 분 배양 후 구형을 보인다. 제1일 내지 제2일에, 세포는 타원 형태가 된다 (도 2 내지 3). 그 후, 이들 부착 세포는 제3일 내지 제5일에 주로 스핀들 및 섬유아세포 유사 형태를 나타내며 동시에 확연한 꼬리를 보인다 (도 4 내지 6). 제6일과 제7일에, 세포는 타원 형태 표현형으로 돌아가지만 꼬리는 남아있다. 따라서, MLPC 생성이 완성된다 (도 7 내지 8).
유세포 분석에 대하여, 1일 배양 후, MLPC 시료를 분석하여 하기 프로파일 발현을 밝혔다: CD14+, CD34l 낮음, CD45+, CD29+, CD44+ (도 1).
3일 배양 후, MLPC 시료를 분석하여 하기 표현형 발현을 밝혔다: CD31+, CD38+, CD90-, CD105+ (도 2).
6일 배양 후, MLPC 시료를 분석하여 하기 표현형 발현을 밝혔다: CD14+, CD29+, CD34 낮음, CD44+, CD45+ (도 3).
7일 배양 후, MLPC 시료를 분석하여 하기 표현형 발현을 밝혔다: CD14+, CD34 낮음, CD44+, CD45+ (도 4).
실시예
3
CD14
+
다계열
분화능
세포의 단백질 발현
2
DE
및
MALDI
-
TOF
/
MS
/
MS
분석에 의한 단백질 발현
세포 추출물의 제조
4 내지 7일의 배양 후 CD14-양성인 4 명의 건강한 자원자들의 PBMCs-풀로부터 세포 단백질을 수집하였다. 간단히, 세포의 단백질 추출물은 우레아 용해 및 아세톤 정제에 의하여 얻어졌다.
각 그룹의 시료를 단백질 정량에 따라 균등하게 혼합하고 그 후 IPG 스트립 (18 cm, pH 3-11, 선형 (L); GE Healthcare, Amersham, USA)을 이용하여 2-DE를 수행하고, IPGphor IEF 시스템 및 Ettan DALTSix System (Amersham Biosciences, USA)을 이용하여 12.5 % 소듕 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 3회 반복하였다.
단백질 스폿 확인을 위하여 겔을 CyproRuby (GIBCO)로 염색하고 이미지 스캐너 (Amersham Biosciences, USA)로 스캔하였다. 겔-내 분해를 통하여 단백질을 수득하고; 겔 스폿을 50% 아세토니트릴 (ACN) 및 25% 50 mM NH4HCO3에서 탈색한 후, 100% ACN로 탈수하고 질소 가스 스트림에서 건조시켰다. 건조된 겔 조각을 25 mM NH4HCO3 및 트립신 (Promega, USA)으로 이루어지는 분해 용액 내에서 37℃에서 밤새 반응시켰다. 트립신 처리된 펩타이드 혼합물을 Zip tip C18 마이크로-컬럼 (Millipore, USA)으로 탈염하고 정제하였다. 정제된 펩타이드 혼합물을 질량 분광기 분석을 위하여 기질 α-시아노-4-하이드록시신남산 (CHCA)과 함께 혼합하였다. Bruker-Daltonic Autoflex TOF LIFT 질량 분광기를 이용하여 하기와 같은 변수 세팅으로 질량 분광 결과를 얻었다: 퍼플렉토미터 모드, 양이온, 플라잉 튜브 길이 2.7 m, 이온원 전압 가속 20,000 V, 및 반사 전압 23,000 V. 트립신 처리된 단편의 크기로부터 단백질을 확인하기 위하여 정보를 위한 MASCOT 서치 엔진과 함께 NCBI 데이터베이스에서 질량 분석 핑거프린팅을 이용하였다.
2DE 및 MALDI-TOF/MS/MS 분석에 의한 CD14+-PBMCs의 단백질 발현
1. MYL9
2. RASF6
3. SYMPK
4. ATPB
5. CALR
6. UBFL6
7. ACTB
8. TPM4
9. APOA1
10. TPA4A
11. SODM
웨스턴
블롯팅
분석에 의한 단백질 발현
세포 추출물의 제조
4 내지 7일의 배양 후 CD14-양성인 4 명의 건강한 자원자들의 PBMCs-풀로부터 세포 단백질을 수집하였다. 간단히, 세포의 단백질 추출물은 RIPA 용해 완충액 (Millipore, Temecula. CA 92590)에 의하여 얻어졌다. 추출된 현탁물을 얼음 상에서 20 분간 반응시킨 후 13000 g에서 5 분간 원심분리하였다. 상층액 (용해성 분획)을 수집하여 다양한 단백질 발현 검출에 사용하였다.
웨스턴 블롯 분석
다양한 단백질, 예컨대 콜라겐 타입 I, HLA 클래스-1, TAZ, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 3 (IGFBP3), 알칼리성 포스파타아제 및 퍼포린 [Abcam Inc. (Boston, USA)], CDX2, 피브로넥틴, 인터페론 감마-유도 단백질 10 (IP-10), 마크로파지-1 항원 (MAC-1), M 캐드헤린, MyoD (MYOD1), 핵 전사 인자 Y 서브유닛 알파 (NF-YA), 놋치 1, 페어드 박스-5 (PAX-5), P-당단백질, Wiskott-Aldrich 증후군 단백질 (WASP) [Epitomic Inc.], α-액티닌, Ca2+ /칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 (CaM 키나아제 IV), 세포 레티노산 결합 단백질 (CRABP II), GATA 결합 인자-4(GATA4), 저산소증-유도 인자-1α (HIF-1α), Achaete-scute 상동체 1 (MASH1), 미오제닌 및 Runt-연관 전사 인자 3 (Runx3) [Merck Millipore Headquarters (Billerica, MA, USA)], 아넥신 VI (G-10), 뉴로제닌 3 (E-8), 그란자임 B, 글루탐산 탈탄산효소 (GAD2, D5G2) 및 그래뉼리신 (F-9) [Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)]에 대한 항체를 상기 시판 제품으로부터 구입하였다.
세포 용해물의 상층액을 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석에 사용하였다. 각 세포 시료 100 μg이 Pierce 4-20% 트리스-글리신 겔 (Thermo SCIENTIFIC, Rockford USA)에 로딩되었다. 전기영동 후, 겔을 PVDF 멤브레인 (Millpore, Temecula. CA 92590) 상에 블롯팅하였다. PVDF 멤브레인을 Tris-완충 염용액 Tween-20 완충액 (10 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl) 내 5% 탈지유로 블로킹한 후 4℃에서 밤새 신선한 5% 탈지유 Tris-완충 염용액 Tween-20 완충액 내 다양한 1차 항체와 반응시켰다. 멤브레인을 수세하고 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-결합 2차 항체와 반응시켰다. Amersham-강화 화학발광 시스템을 이용하여 시각화하였다. 반응 밴드를 CCD 카메라 및 Multi Gauge 소프트웨어로 측정하였다.
웨스턴 블롯 분석에 의한 PBMC-CD14+의 단백질 발현
1.콜라겐 타입 I
2. HLA 클래스-1
3. TAZ
4. 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 3 (IGFBP3)
5. 알칼리성 포스파타아제
6. 퍼포린
7. CDX2
8. 피브로넥틴
9. 인터페론 감마-유도 단백질 10 (IP-10, CXCL-1)
10. 마크로파지-1 항원 (MAC-1)
11. M 캐드헤린
12. MyoD (MYOD1)
13. 핵 전사 인자 Y 서브유닛 알파 (NF-YA)
14. 놋치 1
15. 페어드 박스-5 (PAX-5)
16. P-당단백질
17. Wiskott-Aldrich 증후군 단백질 (WASP)
18. α-액티닌
19. Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 (CaM 키나아제 IV)
20. 세포 레티노산 결합 단백질 (CRABP II)
21. GATA 결합 인자-4 (GATA4)
22. 저산소증-유도 인자-1α (HIF-1α)
23. Achaete-scute 상동체 1 (MASH1)
24. 미오제닌
25. Runt-연관 전사 인자 3 (Runx3)
26. 아넥신 VI (G-10)
27. 뉴로제닌 3 (E-8)
28. 그란자임 B
29. 그래뉼리신 (F-9)
30. GAD2
유세포
분석에 의한 단백질 발현
밀폐된 백으로부터 CD14+-PBMCs를 수확하여 PBS (2% FBS 함유)로 수세, 4℃에서 5 분간 1500 rpm으로 원심분리하고, 세포 펠렛을 보관하였다. 유세포 분석을 위하여 세포 밀도를 분석당 2.5~3 x 106 세포로 조정하였다. 형광 표지 항체에 의하여 플루오로크롬-표지된 항체로 CD14+-PBMCs를 표지하고, 실험 과정은 표준 시행 지시를 따랐다. 마지막으로, 세포 펠렛을 고정 완충액 (BD) 100 마이크로리터에 넣고 4℃에서 20 분간 둔 후, 4℃에서 보관하고 유세포 분석까지 빛을 차단하였다 (Bacton Dickinson). CellQuest 소프트웨어를 이용하여 살아있는 세포를 확인하고, 데이터를 로그 히스토그램으로 나타내었다.
실시예
4
사례 연구 - 암
사례 연구: 35세 말기 흉선암 환자의 말초 혈액 수집을 통한 자가 줄기세포 치료
이 사례 연구는 4기 전이성 흉선 암 말기인 35세의 남성에 관한 것이다. 그는 실시예 1에 따라 제조된 자가 줄기세포를 3 회차 주사받았다.
도착시 그는 휠체어에 의존하였으며, 심각하게 빈혈 (anamic) 및 백혈구 감소증 (neutraperic) 상태였다. 그는 이전에 외과적 종양 절제, 화학 요법 (및 방사선 치료)를 받았다. 좌측 폐는 완전히 허탈 상태가 되었고 심전도 결과 심장 전이가 있었다.
그의 혈액 250 ml을 16 게이지 카테터를 이용하여 정맥 천자를 통해 2013년 4월 8일에 뽑았고, 그 후 줄기세포 자가 전환을 위하여 자가 줄기세포 기술 연구소로 보내졌다.
2013년 4월 13일에 환자 줄기세포 2.3 X 108가 재수혈되었다. 이 치료의 목적은 수회차의 화학요법 후 거의 존재치 않는 것처럼 고갈된 면역계를 강화하고 골수를 복원하기 위한 것이었다. 처치 후 어떠한 부작용도 나타나지 않았다.
충분한 골수 복원에, 두번째로 250 ml의 혈액을 2013년 4월 23일에 채취하여 2013년 4월 29일에 재수혈하였다. 이러한 자가 줄기세포 치료의 목적은 그의 밸혈구 세포 수를 증가시켜 충분한 양의 단핵구세포를 자가 줄기세포 전환용으로 수확할 수 있도록 하기 위함이다. 처치 후, 환자는 도움없이 걸을 수 있고, 식욕이 증가하고 에너지 수준이 증가하였다고 보고되었다.
3회차 및 최종 250 ml 혈액 추출이 2013년 5월 27에 있었고, 2013년 5월 1일에 3.6 X 108 줄기세포가 재수혈되었다. 이러한 치료의 목적은 그의 암을 특이적으로 표적하기 위한 것이다.
3회의 줄기세포 치료 후, 그의 헤모글로빈 수치는 정기적인 포장 적혈구 세포 수혈을 필요로 하지 않는 정도로 개선되었다. 전체적인 힘 및 활력은 그가 도움없이 걸을 수 있을 정도로 향상되었다. 산소 포화도는 줄기세포 치료 후 현저하게 증가됨을 알 수 있었다. 모든 병리적 파라미터들이 계속하여 개선되었고, 그의 타이완 주치의로부터의 치료 후 영상 보고는 심장과 대혈관 주위의 종양 퇴행을 보여준다. 악성 복수로부터의 복부 팽만이 치료 후 개선되었다. 이후, 신장 및 간 기능이 개선되면서 말초 부종 또한 감소하였다. 그는 계속하여 좋아지고 있다.
실시예
5
사례 연구 - 안면 회생
사례 연구: 안면 회생 및 재생 목적을 위한 70세 여성의 말초 혈액 수확을 통한 자가 줄기세포 치료
이 사례 연구는 2013년 5월 23일에 자가 줄기세포의 말초 주입을 시행받은 70세 여성에 대한 것이다.
말초 혈액 250 ml을 16 게이지 카테터를 이용한 정맥 천자를 통하여 채취하고 실시예 1의 방법을 행하였다.
2013년 5월 27일에 하기의 CD 표지자를 나타내는 1.5 × 108 개의 전환된 줄기세포를 2 시간에 걸쳐 상완 정맥 주사를 통해 주입하였다.
CD
표지자
· CD 38, CD 90 (조혈/림프 줄기세포)
· CD11b, CD31, CD44, CD105 (중간엽 줄기세포)
· CD7, CD59, CD84 (조혈 줄기세포)
· CD49d (신경 줄기세포)
· CD45 (조혈 전구세포)
· CD9, CD30
· CD7 (만능 줄기세포)
정맥 줄기세포 주입과 함께 안면 회생을 동시에 수행하였다. 선형의 레트로-그레이드 기법 (linear retro-grade technique)으로 얼굴의 전면에 진피 내 줄기세포 주입을 행하였다. 몇개 층의 줄기세포를 비순, 구강 주변, 안구 주변, 이마 미간에 채웠다. 대략 총 20-40 ml를 전체 안면 회생 과정에 사용하였다.
환자는 잘 퇴원하였다. 절차 직후, 환자는 최소한의 멍과 절차 후 24 시간 동안의 부종을 나타내었다.
환자를 6 주 간격으로 추척하였고 하기의 효과를 알 수 있었다:
· 피부 이완 개선
· 피부결 향상
· 색소 침착 감소
· 코-입술 주름 감소
· 미간 라인 감소
· 안구 주변 라인 개선
· 신규 콜라겐 형성
· 모공 크기 감소
· 주름 감소
실시예
6
재생 목적을 위한 68세 남성의 말초 혈액 수확을 통한 자가 줄기세포 이식
이 사례 연구는 재생 목적을 위하여 2013년 4월 25일에 자가 줄기세포 말초 주입을 시행받은 68세 남성에 관한 것이다. 줄기세포를 오로지 환자의 말초 혈액 수집으로만 수확하였고 실시예 1의 방법에 따라 처리하였다.
그의 현재 유의한 병력은 허혈성 심장 질환을 동반한 고혈압 제2형 당뇨병과, 최근의 L3/4 추간판 절제술을 동반한 일반화 오스테오패니아이다. 그의 과거 병력은 2004년 CVA 및 강력한 혈관 질환 가족력이 포함된다. 재생 기반 이식에 대한 환자의 주 목적은 자신의 건강 및 활력을 개선하기 위해서 뿐만 아니라 특히 오스테오패니아 후 수년간 그리고 현재 C-척추 및 요추까지 관여된 스테로이드 약물을 줄일 수 있도록 하는 것이었다.
이식 프로토콜에 따라 기저 혈액을 얻었고 특이점은 없었다. 2013년 4월 25일에 각 ml당 1.5 X 105, 총 1.56 X 107의 줄기세포를 함유하는 104.3 ml을 재주입하였다.
줄기세포는 하기의 표지자를 가지고 있었다:
CD 38, CD 90 (조혈/림프 줄기세포)
CD11b, CD31, CD44, CD105 (중간엽 줄기세포)
CD7, CD59, CD84 (조혈 줄기세포)
CD49d (신경 줄기세포)
CD45 (조혈 전구세포)
CD9, CD30
CD7 (만능 줄기세포)
합병증 없이 모든 관찰 결과 및 바이탈이 이식 내내 안정적이었고 환자는 잘 퇴원하였다. 프리젠테이션에서 환자는 유의한 제한된 RO Min 정기적으로 엔돈을 필요로 하는 C-척추에 대한 최소의 징후 및 증상을 보였다.
이식 후, 환자는 다음과 같은 유의한 개선을 보고하였다:
평안함 증가
및 피로 감소
움직임 범위 증가
통증 점수 감소
수면 패턴 향상
환자는 또한 10 mg로부터 현재 6 ㎎까지 프레드니손 투여를 줄일 수 있었다. 테이퍼 할 수 있었다. 그는 지금까지 이러한 복용량을 달성할 수 없었다. 그는 또한 마약성 진통제를 덜 필요로 하고 임상적으로 계속 개선되고 있다.
실시예
7
사례 연구
프레젠테이션에서 환자는 눈에 띄는 우측 편측-무시라는 결과를 낳은 과거 심각한 CVA 및 중증의 구음장애를 앓고 있었다. 이식 전에 그는 앉은 동안 눈에 띄게 몸통의 지지가 필요했고, 오른쪽 다리의 뻗음이 제한되었다. 모든 관찰 결과 및 바이탈 사인은 줄기세포 이식 전 후 모두에 안정적이었다.
환자는 실시예 1의 방법에 따라 제조된 세포로 이루어진 자가 줄기세포 이식을 거쳤다. 합병증은 없었고, 출석하였던 간호사와 함께 같은 날 그의 주거지로 돌아갔다. 그의 병리 상태는 미코플라즈마 배양 양성을 나타냈고, 임상적으로 좋았으며 양쪽 폐 기저는 깨끗하고 어떠한 열도 없었다. 산소 포화도는 모두 정상이었다.
예방용으로 Rulide 150 ㎎의 BD에 대한 약물 처방을 갖고 퇴원하여 계속하여 커버하였다.
줄기세포 요법 이후 환자에게서 관찰된 진행:
1. 4 분에 걸쳐 몸통을 지지하지 않고 의자에 균형을 잡고 앉아있을 수 있다. 이것은 요법 전에는 관찰되지 않았다.
2. 오른쪽 어깨 주위 근육의 톤이 개선되었다. 지금은 적극적으로 간헐적으로 오른쪽 어깨를 으쓱할 수 있고 이를 더 수평 유지할 수 있다.
3. 오른쪽 무릎 : 휠체어에 앉아있는 동안 오른쪽 무릎 뻗음에 대한 움직임이 관찰되었다. 이러한 움직임은 물리 치료사의 도움없이는 이전에는 불가능했다.
4. 왼손으로 핸드레일을 잡으면, 더욱 잘 제어하면서 휠체어로부터 스스로 서는 자세로 당길 수 있고 아주 적은 지지만으로 이러한 앉았다 서는 움직임을 3회만큼 반복할 수 있다.
5. 영어 및 그리스어 양자 모두에서 어느 정도 더 나은 발음으로써 말하기 역시 개선된 것으로 보인다.
6. 언어 치료사에 의해 개선된 분위기와 영향이 관찰되었다. 언어 치료사에 의해 무작위 일 단어 읽기 및 사진 명명 기술에 있어 미묘한 변화가 관찰되었다.
당업자는 본원에 기재된 발명이 구체적으로 기재된 것 외에 변이 및 변형 여지가 있음을 이해할 것이다. 본 발명은 모든 이러한 변이 및 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에서 언급되거나 표시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물들을, 각각 또는 통합하여 포함하고, 상기 단계 또는 특징 중 임의의 것 및 이들 중 2 이상의 모든 조합을 포함한다.
실시예
8
사례 연구
완전 무정자증인 45세 남성이고 2013년 6월에 줄기세포 요법에 제시된 남성 불임이다.
그는 자신의 불임을 설명할 어떠한 아동기 질병이나 사고가 없었으며, 단지 최근 2012년에 진단되었다.
그는 이전에 건강했고, 몇차례 IVF 시도를 하였으며 임신을 보조하기 위한 노력으로 수술을 겪었다.
FISH 연구를 통해 염색체 이상을 나타냈고, 매우 높은 이수성 비율 f 33%를보여주었다.
2012년 그의 최초 정자수는 0이었다.
줄기세포 요법 후 그는 1만 정자/ml, 주목할 만하게는 2만 정자/ml을 나타내었다. 첨부된 보고서로 알 수 있다.
2013년 7월의 결과에서는 염색체 이상 비율 역시 33%에서 21.9%로 떨어졌다.
현재는 성공적으로 정자를 생산하고 있기 때문에, 상기 줄기세포 요법은 이 환자로 하여금 적절한 IVF 요법이 가능하게 하였다.
그는 또한 줄기세포 요법 이후 모발 성장 및 에너지 수준이 현저히 증가하였다고 밝혔다.
Claims (25)
- 포유류 다계열 분화능 세포를 생성시키는 방법으로서, 상기 방법은 분율적으로:
(i) CD14+ 단핵세포 현탁물 10-20% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율;
(ii) 대략 5%-85%의 알부민 용액 10-20% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율; 및
(iii) 세포 배양 배지 60-80% v/v, 또는 그와 기능적으로 균등한 분율
을 포함하는 시험관 내 세포 배양체를 구축하는 단계를 포함하고, 상기 세포 배양체는 상기 단핵 세포가 다계열 분화능을 나타내는 세포로 전이 유도되기에 충분한 조건하에서 일정 시간 동안 유지되는 것인 방법. - 제1항에 있어서, 상기 10-20% v/v는 15% v/v이고, 상기 60-80% v/v는 70% v/v인 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CD14+ 단핵세포 현탁물은 CD14+ 단핵구세포 현탁물인 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 CD14+ 단핵구세포 현탁물은 말초 혈액으로부터 유래하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 다계열 분화능 세포는 조혈세포 분화능 및/또는 중간엽세포 분화능을 나타내는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 다계열 분화능 세포는 CD14+, CD34+, CD105+, CD44+ 및 CD45+인 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 다계열 분화능 세포는 추가적으로 CD14+, CD31+ 및 CD59+인 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 조혈세포 분화능은 림프구, 단핵구세포, 호중구, 호염구, 호산구, 적혈구 세포 또는 혈소판으로 분화하는 분화능인 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 중간엽세포 분화능은 뼈, 연골, 평활근, 힘줄, 인대, 기질, 골수, 진피 또는 지방 세포로 분화하는 분화능인 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 알부민 용액은 5%-85%, 5%-80%, 5%-75%, 5%-70%, 5%-65%, 5%-60%, 5%-50%, 5%-45%, 5%-40%, 5%-35%, 5%-30%, 5%-25%, 5%-20%, 5%-15%, 5%-10%의 농도인 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 알부민 농도는 5%-20%인 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 알부민 농도는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%인 것인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포 배양체는 추가적으로 인슐린 또는 그의 기능적 단편 또는 균등물을 10 mg/L 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포는 4-7일 동안 배양되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 다계열 분화능을 나타내는 세포 (MLPC)를 자극과 접하게 하여 상기 MLPC를 MLPC-유래 표현형으로 유도하는 추가 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 MLPC-유래 표현형은 조혈 또는 중간엽 표현형인 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 조혈 줄기세포-유래 세포는 적혈구 세포, 혈소판, 림프구, 단핵구세포, 호중구, 호염구 또는 호산구인 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포-유래 세포는 뼈, 연골, 평활근, 힘줄, 인대, 기질, 골수, 진피 또는 지방 세포와 같은 결합 조직 세포인 것인 방법.
- 포유류의 질환을 치료적으로 및/또는 예방적으로 처치하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 포유류에게 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법을 따라 생성된, 유효한 숫자의 MLPC, 또는 부분적으로 또는 완전히 분화된 MLPC-유래 세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 포유류의 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법을 따라 생성된 MLPC 또는 MLPC-유래 세포군의 용도.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 질환은 이상(異常) 조혈 기능 또는 이상 중간엽성 기능에 의하여 특징화되는 것인 방법 또는 용도.
- 제22항에 있어서, 상기 질환은 조혈성 장애, 순환기 장애, 뇌졸중, 심근 경색, 고혈압 골 장애, 유형 II 당뇨병, 손상되거나 형태적으로 비정상인 연골 또는 기타 조직, 탈장, 골반기저근 탈출증 수술, 근골격계 장애 또는 노화, 수술 또는 외상의 맥락상 손상된 지지 조직의 교체인 것인 방법 또는 용도.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법을 따라 생성된 MLPC 또는 MLPC-유래 세포군.
- MLPC 또는 MLPC-유래 세포의 표현형 상태 또는 기능적 상태에 대한 처치법 또는 배양법의 효과를 평가하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법을 따라 생성된 상기 MLPC 또는 MLPC-유래 세포에 상기 처치법을 가하는 단계 및 변형된 기능적 상태 또는 표현형적 상태를 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법.
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