JP6995410B2 - 新規ケトース3-エピメラーゼ - Google Patents
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Description
希少糖の生産技術の研究、生理作用、化学的性質に関する研究が進行中であり、現在までに特異的な生理作用が次々と解明されているが、それらの医薬、農薬、機能性食品等としての実用化に際しては、その大量生産を可能にする希少糖に特異的に反応する酵素の開発が必須である。
cichorii)ST-24株由来のD-ケトース3-エピメラーゼが開示されており、この酵素を利用することによりD-フラクトースからD-アルロースが製造できることが記載されている。しかしながら、この酵素は別名D-タガトース3-エピメラーゼとも呼ばれるように、D-タガトースの3位のエピ化活性が最も高く、D-フラクトースへの作用は比較的弱い。
その結果、数多く単離した菌株の中に新規なケトース3-エピメラーゼを産生するアルスロバクター(Arthrobacter)属に属する微生物を見出した。このアルスロバクター属微生物であるアルスロバクター ヒスチジノロボランス(Arthrobacter histidinolovorans) Y586-1株は、活性が高く、かつ高耐熱性の新規なケトース3-エピメラーゼを産生する。
(1)アルスロバクター(Arthrobacter)属に属する微生物由来のケトース3-エピメラーゼであって、SDS-PAGEで測定した分子質量が36kDaであり、下記(A)および(B)の基質特異性を有するケトース3-エピメラーゼ。
(A)D-またはL-ケトースの3位をエピマー化し、対応するD-またはL-ケトースを生成する活性を有する。
(B)D-またはL-ケトヘキソースの中ではD-アルロースに対する3位のエピ化活性が最も高い。
(2)下記(C)および(D)の理化学的性質を有する、上記(1)に記載のケトース3-エピメラーゼ。
(C)反応至適pHは6~8である。
(D)反応至適温度は60℃である。
上記の反応至適温度は精製酵素の60℃である。実施例には精製酵素と粗酵素の2種類の実験が存在し、粗酵素の反応至適温度は70℃を示した(図1参照)。粗酵素では70℃で、精製した酵素は60℃を示しているが、粗酵素状態の方が、周りのタンパク質等の影響で耐熱性が上がる例は良くある現象である。組換え変異体については、例えば段落0047に耐熱性が野生型ケトース3-エピメラーゼよりも高い変異体が数多く得られる点でも優れていると記載のように、粗酵素ということで理解できる。
(3)基質特異性が、D-アルロース、D-タガトース、L-タガトース、D-フラクトース、L-アルロースの順である、上記(1)または(2)に記載のケトース3-エピメラーゼ。
(4)アルスロバクター属に属する微生物がアルスロバクター ヒスチジノロボランス(
Arthrobacter histidinolovorans)である、上記(1)ないし(3)のいずれかに記載のケトース3-エピメラーゼ。
(5)アルスロバクター属に属する微生物が特許微生物寄託センターに受託番号NITE BP-02813として寄託されているアルスロバクター ヒスチジノロボランス Y586-1株である、上記(1)ないし(4)のいずれかに記載のケトース3-エピメラーゼ。
(6)以下の(a)または(b)に記載のタンパク質。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、下記(A)および(B)のケトース3-エピメラーゼ活性を有し、かつ反応温度70℃と50℃におけるケトース3-エピメラーゼ活性の比(T70/T50)が1.55以上であるタンパク質。
(A)D-またはL-ケトースの3位をエピマー化し、対応するD-またはL-ケトースを生成する活性を有する。
(B)D-またはL-ケトヘキソースの中ではD-アルロースに対する3位のエピ化活性が最も高い。
(7)以下の(a)または(b)に記載のタンパク質。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、下記(A)および(B)のケトース3-エピメラーゼ活性を有し、かつ60℃で1時間保温後の残存活性が31%以上であるタンパク質。
(A)D-またはL-ケトースの3位をエピマー化し、対応するD-またはL-ケトースを生成する活性を有する。
(B)D-またはL-ケトヘキソースの中ではD-アルロースに対する3位のエピ化活性が最も高い。
(8)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸置換変異体からなるタンパク質であって、配列番号1で表されるアミノ酸配列のH56、T59、A60、P77、L94、L97、D101、A109、A128、V129、V132、S144、S167、P172、E199、A200、K202、S218から選ばれる少なくとも1つの部位のアミノ酸置換を有し、下記(A)および(B)のケトース3-エピメラーゼ活性を有し、かつ配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質より、反応温度70℃と50℃におけるケトース3-エピメラーゼ活性の比(T70/T50)が高いか、または60℃で1時間保温後の残存活性が高い変異体からなるタンパク質。
(A)D-またはL-ケトースの3位をエピマー化し、対応するD-またはL-ケトースを生成する活性を有する。
(B)D-またはL-ケトヘキソースの中ではD-アルロースに対する3位のエピ化活性が最も高い。
(9)上記(6)ないし(8)のいずれかに記載のタンパク質をコードするDNA。
(10)配列番号2で表される塩基配列若しくはその相補的配列からなるDNA。
(11)下記(a)~(c)のいずれかに記載のDNAであることを特徴とする上記(9)に記載のDNA。
(a)配列番号2で表される塩基配列若しくはその相補的配列の一部若しくは全部を含む配列からなるDNA、
(b)配列番号2で表される塩基配列からなるDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、および
(c)配列番号2で表される塩基配列からなるDNAと70%以上の配列同一性を有するDNA。
(12)上記(9)ないし(11)のいずれかに記載のDNAを含有する組換えベクター。
(13)(12)に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換宿主細胞。
(14)上記(1)ないし(3)のいずれかに記載のケトース3-エピメラーゼを生産する、特許微生物寄託センターに受託番号NITE BP-02813として寄託されているアルスロバクター ヒスチジノロボランス Y586-1株。
(15)上記(1)ないし(5)のいずれかに記載のケトース3-エピメラーゼが担体に固定化されていることを特徴とする固定化酵素。
(16)上記(1)ないし(5)のいずれかに記載のケトース3-エピメラーゼを生産するアルスロバクター属微生物の、菌体破砕物中に存在するケトース3-エピメラーゼ粗酵素が担体に固定化されていることを特徴とする固定化酵素。
(17)前記担体が、イオン交換樹脂、有機高分子担体、および/または無機担体である、上記(15)または(16)に記載の固定化酵素
(18)上記(6)ないし(8)のいずれかに記載のタンパク質が、担体に固定化されていることを特徴とする固定化タンパク質。
(19)前記担体が、イオン交換樹脂、有機高分子担体、および/または無機担体である、上記(18)に記載の固定化タンパク質。
(19)上記(1)ないし(5)のいずれかに記載のケトース3-エピメラーゼを生産するアルスロバクター属微生物を培地中で培養し、微生物菌体中に当該ケトース3-エピメラーゼを蓄積させ、これを採取するケトース3-エピメラーゼの製造方法。
(20)前記培地がD-アルロースを添加した無機塩培地である、上記(19)に記載のケトース3-エピメラーゼの製造方法。
(21)上記(13)に記載の形質転換宿主細胞を培地で培養し、培養物からケトース3-エピメラーゼ活性を有するタンパク質を採取するケトース3-エピメラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
(22)D-またはL-ケトースから選ばれる1種以上を含有する溶液に、上記(1)ないし(5)のいずれかに記載のケトース3-エピメラーゼ、上記(6)ないし(8)のいずれかに記載のタンパク質、上記(15)ないし(17)のいずれかに記載の固定化酵素、または、上記(18)または(19)に記載の固定化タンパク質を作用させて、該ケトースの3位をエピマー化し、対応するケトースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするケトースの製造方法。
また、酵素の至適温度が70℃と高く、しかも80℃においても、至適温度での70℃での活性を100とした相対活性が59.4と約60%あり、高耐熱性である。しかも、60℃で1時間保温処理した後の残存活性も49.4%という熱耐性を有することから、至適温度の70℃での反応において、より多量の生産物を得ることができる。この酵素のもつ優れた耐熱性は、酵素のアミノ酸置換変異体の作成により、さらに高めることができるという特性がある。
アルスロバクター属の微生物由来の本酵素を食品産業で用いる利点として、菌の安全性が挙げられる。
アルスロバクター属の微生物は、α-アミラーゼ、イソマルトデキストラナーゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、グルカナーゼ、α-グルコシルトランスフェラーゼ、フルクトシルトランスフェラーゼなどの酵素起源微生物として、また、トレハロースやビタミンK(メナキノン)生産菌として、日本の食品添加物リストに収載されている安全な微生物である。
本発明でケトースとはペントースなども含む広義でのケトースを意味し、ケトヘキソースと記載する場合は、ケトース構造を有する六炭糖のケトヘキソースを意味する。具体的には、フラクトース、アルロース、タガトースおよびソルボースであり、D-またはL-ケトースとは、これらのD-体およびL-体を意味する。
したがって、本発明のケトース3-エピメラーゼは、D-またはL-ケトースの3位をエピマー化し、対応するD-またはL-ケトースを生成する活性を有し、具体的には、D-またはL-フラクトースとD-またはL-アルロース間の相互変換、および、D-またはL-タガトースとD-またはL-ソルボース間の相互変換を触媒することができる。さらに、他の全てのケトースにも作用することができる。
Y586-1株は、16SrRNA遺伝子の塩基配列について、BLASTサーチ(日本DNAデータバンク)により既知の菌種との相同性検索を行った結果、塩基配列に対して相同性98%以上であった菌株名から、当初、アルスロバクター プロトフォルミエ(
Arthrobacter protophormiae)と同定された。その後、日本食品分析センターの同定では、アルスロバクター ヒスチジノロボランス(
Arthrobacter histidinolovorans)と判定されたため、Y586-1株の全ゲノムの配列検索を行った結果、アルスロバクター ヒスチジノロボランスであると確定した。
そのため、受託番号NITE BP-02813の菌株の名称変更を独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに届け出て、2019年10月4日に承認された。
逆反応であるD-アルロースからD-フラクトースへエピ化する酵素活性についても同様の条件で測定する。ケトースの変換反応は、通常、次の条件で行なわれる。基質濃度は1~60%(w/v)、望ましくは、約5~50%(w/v)、反応温度は10~70℃、望ましくは、約30~60℃、反応pHは5~10、望ましくは、約7~10、反応時間は適宜選択できるが、バッチ反応の場合には、通常5~50時間の範囲が選ばれる。
酵素が精製されたことを確認するために、SDS-PAGE(ゲル濃度12.5%)にかけて、単一なバンドが得られることと分子質量を確認する。
その例としては、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそれと相同なアミノ酸配列を有し、同等なケトース3-エピメラーゼ活性を維持するタンパク質が挙げられる。
相同なアミノ酸配列とは、例えば、配列番号1のアミノ酸配列と70%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは76、77、78、79または80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらにより好ましくは86、87、88、89、90、91、92、93または94%以上、より一層好ましくは95%、96%、97%、98%以上のアミノ酸配列の同一性を有することを指す。
本発明にかかるDNAは、公知の技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術やPCR技術などを組み合わせて単離することができる。
また、本発明にかかるDNAには、配列番号2で表される塩基配列を含むDNA、当該DNAおよび当該DNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAならびに当該DNAおよび当該DNAの相補鎖と70%以上の配列同一性を有するDNAも含まれる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的に、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的な実験条件である。通常、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度は高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。核酸同士のハイブリッドの形成は、相補鎖がその融点よりやや低い環境において再アニールする能力に依存する。より具体的に述べると、ストリンジェントな条件としては、上記DNAを単離することができる条件として、当業者によって選択される条件であれば特に限定はされず、例えば、洗浄段階において、42℃~70℃、好ましくは42℃~65℃の温度条件の下、25mM~450mM、好ましくは25mM~500mMのナトリウム濃度の条件が好ましい。このような条件としては、例えば、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、0.1%SDS中、42℃で洗浄する条件などが挙げられる。さらに、温度を上げる等、より高いストリンジェントな条件にすることにより、相同性の高いDNAを得ることができる。ストリンジェントな条件(緊縮条件)は、最終的に5×SSC、0.2%SDS溶液を用いて、45℃(非常に低い緊縮)、50℃(低い緊縮)、55℃(中位の高い緊縮)、60℃(中くらいに高い緊縮)、65℃(高い緊縮)及び70℃(非常に高い緊縮)で、それぞれ15分間、3度の洗浄を意味する。
また、相同な塩基配列とは、「70%以上の配列同一性を有するDNA」であり、配列番号2の塩基配列と70%以上の配列同一性を有するDNAであれば、何%であってもよく、例えば、と70%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは76、77、78、79または80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらにより好ましくは86、87、88、89、90、91、92、93または94%以上、より一層好ましくは95%、96%、97%、98%以上の塩基配列の同一性を有することを指す。
すなわち、ケトース3-エピメラーゼの固定化に使用される固定化用担体については、当該酵素の固定化が可能であることを限度として、特に制限されないが、例えば、イオン交換樹脂、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、アクリル、キトサン、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子担体;セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、セラミックス等の無機担体が挙げられる。また、微生物を固定化酵素として使用する場合は、4級化ピリジン化合物(例えば電気化学工業株式会社製の商品名DAC)やアルギン酸塩を固定化用担体として使用することができる。これらの固定化用担体は、1種単独で使用してもよく、また2種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの固定化用担体の中でも、固定化によるケトース3-エピメラーゼの活性維持、安価で圧損失が少なく取り扱いが容易等の観点から、好ましくはイオン交換樹脂、例えば塩基性陰イオン交換樹脂としては、強塩基性陰イオン交換樹脂あるいは弱塩基性陰交換樹脂のいずれでも用いることができ、たとえば、強塩基性陰イオン交換樹脂としては、HPA25L(三菱ケミカル社製)、IRA904CL(オルガノ社製)等が挙げられ、弱塩基性陰イオン交換樹脂としてはWA30(三菱ケミカル社製)、FPA54、FPA95(オルガノ社製)等が挙げられる。合成吸着剤としてはXAD7HP(オルガノ社製)等が挙げられる。
以上、ケトース3-エピメラーゼを生産するアルスロバクター属微生物の、菌体破砕物中に存在するケトース3-エピメラーゼ粗酵素が担体に固定化されている、固定化酵素についての説明と同様に、本発明においては、固定化ケトース3-エピメラーゼとして、精製品又は粗精製品のケトース3-エピメラーゼを固定化したものを使用してもよく、またケトース3-エピメラーゼを産生する微生物を固定化したものを使用してもよい。さらにまた、粗酵素、精製酵素と同様に大腸菌発現酵素を固定化した固定化タンパク質を使用してもよいことはいうまでもない。
図12は、X線結晶構造解析による本酵素(組換え体の精製酵素)の立体構造を示す図面である。組換え体の精製酵素を用いて結晶化を行い、X線結晶解析によりY586-1株由来のケトース3エピメラーゼの構造を決定した。本酵素は4つのサブユニットが会合したホモ四量体(MolA、MolA、MolA、MolA)を形成している。SDS-PAGEにより確認された分子質量約36k Daをもつ各サブユニット構造はβ/αバレル構造を示し、中心部の活性部位には金属イオンが結合している。
本発明のケトース3-エピメラーゼは驚くべきことに、アミノ酸配列の同一性が70%台の変異体であっても、酵素活性を保持しつつ、かつ、配列番号1の野生型酵素に比べ、反応温度70℃と50℃におけるケトース3-エピメラーゼ活性の比(T70/T50)がより高く、かつ、60℃で1時間保温後の残存活性がより高いものが得られる。
部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行うことができる。そのような変異プライマーは、遺伝子内の改変対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその改変対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列(コドン)に代えて改変後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列(コドン)を有する塩基配列を含むように設計すればよい。
保存的置換は、例えば、塩基性アミノ酸(Arg、Lys、His)、酸性アミノ酸(Glu、Asp)、中性非極性アミノ酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met)、脂肪族アミノ酸(Ala、Val、Leu、Ile、Met)、極性アミノ酸(Gln、Asn、Ser、Thr)、芳香族アミノ酸(Phe、Trp、Tyr)等のグループ内により行われる。
また、元のアミノ酸よりも立体障害の少ないアミノ酸への置換、電荷を持つアミノ酸から電荷を持たないアミノ酸へ置換することもある。
本発明のケトース3-エピメラーゼは、耐熱性が野生型ケトース3-エピメラーゼよりも高い変異体が数多く得られる点でも優れている。
なお、以下の実験においてはD-アルロースをD-フラクトースに変換するD-アルロース3-エピメラーゼ活性を測定し、ケトース3-エピメラーゼ活性と表記する場合と、D-フラクトースをD-アルロースに変換するD-フラクトース3-エピメラーゼ活性を測定し、ケトース3-エピメラーゼ活性と表記した場合がある。本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
本発明者等はスクリーニングにより単離した数多くの菌を、D-アルロースを添加した液体培地に植菌して振とう培養を行い、D-フラクトースを基質としD-アルロースの生成量を測定することにより、ケトース3-エピメラーゼの活性を測定した。
このようにして、最も活性の高い菌株として微生物Y586-1株を見出し、Y586-1株は16SrRNA遺伝子塩基配列相同性に基づく系統解析により、アルスロバクター プロトフォルミエに属することが判明した。
(1)16SrRNA遺伝子塩基配列相同性
16SrRNA遺伝子領域を解析し、塩基数1,469bpを特定した。
(2)相同性検索
この菌株の16SrRNA遺伝子の塩基配列について、BLASTサーチ(日本DNAデータバンク)により既知の菌種との相同性検索を行った。上記特定した塩基数1,469bpの塩基配列に対し、相同性98%以上であった菌株名と相同性(%)の値から、Y586-1株の微生物は、アルスロバクター プロトフォルミエ(
Arthrobacter protophormiae)であることを同定し、このY586-1株は、2018年11月7日で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに国際寄託し、受託番号NITE BP-02813として寄託された。その後、アルスロバクター ヒスチジノロボランス(Arthrobacter histidinolovorans)と判定されたため、受託番号NITE BP-02813の菌株の名称変更を独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに届け出て、2019年10月4日に承認された。
D-アルロース1.0%を炭素源とし硫安を窒素源とする無機塩培地に、アルスロバクター ヒスチジノロボランス(Arthrobacter histidinolovorans)Y586-1株(受託番号 NITE BP-02813)の種培養液1%(v/v)を無菌的に添加し、通気撹拌しながら30℃で24時間培養した。得られた培養液中のケトース3-エピメラーゼ活性は約2.694単位/100mL培養液であった。以下、この菌株を省略して、単に「Y586-1株」という。
結果を図2に示す。検討した培地の中で最も生育の低い無機塩培地での酵素の生産量が高いことがわかった。
遠心分離により培養液から菌体を回収した。回収した菌体は10mMトリス-HCl緩衝液(pH7.5)を用いて、洗浄した。次いで、菌体を10mlの10mMトリス-HCl緩衝液(pH7.5)に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー(日本エマソン株式会社)で細胞破砕した。破砕物を12000rpmで20分遠心し、その遠心上清を粗酵素とした。
精製前の酵素のケトース3-エピメラーゼの活性は、D-アルロースを基質とし、D-フラクトースの生成量を測定することにより測定した。具体的には、酵素反応液組成は、50mMトリス-HCl緩衝液(pH7.5)、0.1M D-アルロース、酵素液、2mM塩化マグネシウムを用い、70℃10分間反応し、2分間ボイルすることで反応を止めHPLCによって、反応後の液組成を測定する。酵素活性1単位は、上記条件下において、D-アルロースをエピマー化し1分間に1μmolのD-フラクトースを生成する酵素量と定義する。逆反応であるD-フラクトースからD-アルロースへエピ化する酵素単位についても、同様の条件で測定し同様に定義する。
1.イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーによる精製
粗酵素液をイオンクロマトグラフィーによって精製した。用いたカラムは緩衝液(20mMトリス-HCl pH7.5)で平衡化したHiTrapQ HPであり、DUO FLOWシステムを用い流速5ml/minで1M NaClの濃度勾配で0%から100%を5mlずつのフラクションに分けて分画した。酵素活性が検出されたフラクションを回収してイオン交換クロマト分離による精製酵素を得た。
常法に従いSDS-PAGE(ゲル濃度12.5%)を行い、精製酵素の純度を確認した。図3では、左が標準分子質量の蛋白質であり、中央のレーンが疎水クロマトグラフィーを用いて精製した後の酵素である。この結果は約36kDaに単一なバンドが認められ、これにより酵素は純粋に精製されたことが確認され、精製した本酵素のサブユニットの分子質量は、SDS‐PAGEによる分子質量が約36kDaであることが判明した。
比較対照の酵素として、特許文献5に記載されたアルスロバクター グロビフォルミス
(Arthrobacter globiformis)M30由来のケトース3-エピメラーゼを用いた。以下、「対照酵素」といい、「AgDAE」と表記することがある。
粗酵素および精製酵素であるケトース3-エピメラーゼ活性の測定については、実験4と同様の実験を行って酵素反応を行った。10分の酵素反応を各条件下で行い、D-アルロースから1分間に1μmolのD-フラクトースを生成する酵素量を1単位とした。反応後、反応液を3分間沸騰液中にいれることで反応を停止し、脱イオン処理後、HPLC分析により生成したD-フラクトースを測定した。
50-80℃の様々な温度での反応を行い。至適温度を求めた反応条件は表1に示す。60℃から80℃の温度範囲が粗酵素の好適な温度であり、反応温度と相対活性を測定した結果を示す図1から、本酵素の粗酵素の至適温度はMg2+イオン添加時で70℃であることが明らかとなった。
実験3で製造した粗酵素液、50mMトリス-HCl緩衝液(pH7.5)、0.1M D-アルロース、2mM塩化マグネシウムを用い、70℃10分間反応し、2分間ボイルすることで反応を止めHPLCによって、反応後の液組成を測定する。酵素活性1単位(U)は、上記条件下において、D-アルロースをエピマー化し1分間に1μmolのD-フラクトースを生成する酵素量である。反応条件を表2に示す。
測定にあたり、反応の至適pHについてD-アルロースを基質として用い、各種緩衝液pH4~11を用いて70℃で10分反応し、生成したD-フラクトースを、HPLCを用いて測定することで求めた。
反応条件を表3に示す。使用した緩衝液を表4に示す。
表2に示した上記2.で至適温度を求めた反応条件(10分)による60℃での活性を100とした場合、60℃で1時間の保温処理した後の活性を測定することにより、その相対活性をもとめて酵素の熱安定性について検討した。熱処理条件としては、粗酵素液、緩衝液(50mMトリス-HCl pH7.5)、2mM MgCl2 の全量200μlとし、これを60℃で1時間保持した後氷水中で10分間冷却後、残存する酵素活性を常法に従って測定した。
表7に示すように、60℃で1時間の保温処理した後の残存活性は、本粗酵素では49.4%であるのに対して、対照酵素では、30.8%であり、本酵素は高い熱安定性を有することが判明した。
8種類のケトヘキソ―スを用いて精製後の本酵素の基質特異性について検討した。酵素反応組成は、下記表5に示したように各基質終濃度0.1M、終濃度50mMリン酸緩衝液 pH8.0で、70℃10分反応しHPLCによる分析によりそれぞれの糖からエピ化され生産されたケトースを測定した。
D-アルロースのエピ化活性を100としてそれぞれのケトースに対する活性を、相対活性として示している。
D-フラクトース(D-fructose)、D-アルロース(D-allulose)、D-ソルボース(D-sorbose)、D-タガトース(D-tagatose)、L-フラクトース(L-fructose)、L-アルロース(L-allulose)、L-ソルボース(L-sorbose)、L-タガトース(L-tagatose)を基質として活性を相対活性として、表6と図7に示す。
(1)反応温度70℃と50℃におけるケトース3-エピメラーゼ活性の比(T70/T50)
本酵素(組み換え体粗酵素)と対照酵素の粗酵素について、表2に示した上記2.で至適温度を求めた反応条件(10分)による70℃での活性と50℃における活性を測定してその比(T70/T50)を求めて耐熱性を検討した。
結果を表7に示す。T70/T50が、本酵素(組み換え体粗酵素)では1.78であり、対照酵素では1.54であることから、本酵素(組み換え体粗酵素)は高温で活性が相対的に高いことが示された。
(2)60℃で1時間保温後の残存活性
本酵素(組み換え体粗酵素)と対照酵素の粗酵素について、表2に示した上記2.で至適温度を求めた反応条件(10分)による60℃での活性を100とした場合、60℃で1時間の保温処理した後の活性を測定することにより、その相対活性をもとめて酵素の耐熱性の指標とした。熱処理条件としては、粗酵素液、緩衝液(50mM トリス-HCl pH7.5)、2mM MgCl2 の全量200μlとし、これを60℃で1時間保持した後氷水中で10分間冷却後、残存する酵素活性を常法に従って測定した。
結果を表7に示す。60℃1時間保温後、本酵素(組み換え体粗酵素酵素)は49.4であり、対照酵素は30.8であることから、本酵素(組み換え体粗酵素酵)の60℃における熱安定性が高いことが示された。
以下1ないし5は、野生株の粗酵素を用いた固定化に関する固定化の実験であり、実験2と同様に培養して回収したY586-1株の菌体を使用した。
1.菌体の超音波処理による粗酵素の取得
菌体10g(湿重量)を50mMトリス-HCl緩衝液(pH7.5)10mlに懸濁し、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザーで細胞破砕した。破砕物を12000rpmで30分遠心し、その遠心上清を粗酵素液とした。
純水でよく洗浄して膨潤させた後に50mMトリス-HCl緩衝液(pH7.5)で平衡化したイオン交換樹脂または合成吸着剤に上記で得た粗酵素液を添加し、4℃で24時間かけて粗酵素タンパク質を結合させた。次いで、50mMトリス-HCl緩衝液(pH7.5)で洗浄し、固定化酵素を得た。
予備実験として、強塩基性陰イオン交換樹脂(三菱ケミカル社製のSA10A、SA11A、SA12A、NSA100、SA20A、PA306S、PA308、PA312、PA316、HPA25L、PA408、PA412、PA418およびオルガノ社製のIRA904CL)、弱塩基性陰イオン交換樹脂(三菱ケミカル社製のWA10、WA20、WA21J、WA30およびオルガノ社製のFPA54、FPA60CL、FPA95)、または合成吸着剤(オルガノ社製のXAD7HP、XAD118ON)を用いた固定化試験を行い、イオン交換樹脂または合成吸着剤と粗酵素液の吸着による固定化酵素の活性発現率は30%以上であった、強塩基性陰イオン交換樹脂HPA25L、IRA904CL、弱塩基性陰イオン交換樹脂WA30、FPA54、FPA95、合成吸着剤XAD7HPを以降の試験に用いた。
固定化酵素の酵素活性の測定は、D-アルロースを基質として酵素反応させたときのD-フラクトースの生成量を測定することにより行った。
まず、100mgの固定化酵素樹脂、トリス-HCl緩衝液(pH7.5)(終濃度50mM)、及びD-アルロース(終濃度100mM)の溶液(400μl)を反応液組成とし、30℃恒温水槽で10~30分間反応させた後、100℃で2分間ボイルすることで直ちに反応を停止させた。この反応後の溶液を室温まで冷却してからイオン交換樹脂(200CT及びIRA67の混合樹脂(いずれもオルガノ社製))で脱塩し、さらにフィルター処理をして分析サンプルとした。分析は、高速液体クロマトグラフィー(カラム:GL-C611(Hitachi)、温度:60℃、溶離液:0.1mM NaOH、流速:1.0ml/分、検出器:RID-20A(島津))を用いて、生成したD-フラクトースのピーク面積を測定することにより行った。
酵素固定化に用いる担体による影響を確認するため、HPA25L、WA30、IRA904CL、FPA54、FPA95、XAD7HPの各担体に固定化した本酵素の酵素活性を比較した。なお、相対活性は、比較サンプルのうちピーク面積の最も大きいサンプルを100として算出することにより求めた。
図8、各種固定化酵素の相対活性を示す。合成吸着剤XAD7HPを用いて作製した固定化酵素の活性が、最も高いものであった。固定化される粗酵素量が多くなると、どの樹脂での相対活性も高くなった。
30-80℃の様々な温度での反応を行い、各種固定化酵素の担体ごとの相対活性を測定した結果を図9に示す。
Mg2+イオンを添加しなくても、添加しても、合成吸着剤であるXAD7HPによる固定化酵素は常温で、陰イオン交換樹脂であるHPA25L、IRA904CL、WA30による固定化酵素は高温での相対活性が高く、反応温度により固定化担体を選択すべきであることがわかった。
ケトース3-エピメラーゼ酵素をコードするDNAをアルスロバクター ヒスチジノロボランス(Arthrobacter histidinolovorans)Y586-1株からクローニングし、自律複製可能な組換えDNAの作製、酵素をコードするDNAの塩基配列の決定、及び形質転換微生物の調製を行った。
本菌のケトース3-エピメラーゼ酵素は既存の類似酵素と異なり、PCR増幅の手法や既存のタンパク質データベースを用いて単離することが出来なかった。そこで、Y586-1株の全ゲノム配列を決定し、そのゲノム配列中の全ORFのコードするタンパク質群のデータベースの構築を行った。Y586-1株培養菌体を供試菌体として株式会社マクロジェン・ジャパンに依頼し、PacBio-RSII/Sequelを用いた次世代シーケンス解析を行った。
その結果、塩基数4,948,442bpと188,677bpの2つのコンティグが得られた。この2つのコンティグで約5.1Mbであることから、アルスロバクター ヒスチジノロボランス(Arthrobacter histidinolovorans)Y586-1株の全ゲノム配列をカバーできていると考えられる。
得られた約5.1MbのDNA配列を基に、Prokkaプログラムを用いて4,734個のORFを推定し、それぞれのORFについてアミノ酸配列を推定した。この4,734個のアミノ酸配列をY586-1株のタンパク質データベースとした。
上記のタンパク質データベースを用いて、タンパク質同定システムであるMASCOT server(マトリックスサイエンス社)に登録し、ケトース3-エピメラーゼ活性が見られたタンパク質の同定を行った。供試サンプルには、段落[0049]のSDS-PAGEの36kDaのバンドを用い、還元処理、アルキル化処理の後、トリプシン消化した断片をMALDI-TOF-MS解析に供した(図10)。
その結果、下記の289アミノ酸からなる配列1(配列表の配列番号1)のアミノ酸配列中で下線を引いて示すアミノ酸配列と87%の相似性が見られたことから、配列番号1のアミノ酸からなる本タンパク質がY586-1株のケトース3-エピメラーゼであることが強く示唆された。
MKIGCHGLVWTGR FDAEGIRYSVQK TKEAGFDLIEFPLMDPFSFDVATAKSALAEHGLTASASLGLSEATDVSSEDPAIVKAGEELLNRALDVLAELGATDFCGVIYSAMKKYMEPATEQGLSNSK AAVGRVVDR AAGLGINVSLEVVNRYETNVLNTGRQALSYLSDVKRPNLGVHLDTYHMNIEESDMFSPVLDTAEALKYVHIGESHRGYLGTGSVDFDNFFKALGRIGYDGPVVFESFSSAVVAPDLSRMLGIWRNLWADNEELGAHANAFIRDK LTAIKTIELH
(配列1 Y586-1株のタンパク質データベースを用いて同定したアミノ酸配列下線部で示すアミノ酸配列がMALDI-TOF-MSで得られたピークと一致した配列。)
アミノ酸配列より同定した遺伝子のDNA配列(配列表の配列番号2)を合成し、pQE60ベクター(Qiagen社)に組み込み、発現用大腸菌を形質転換した。構築した大腸菌発現系を用いて誘導酵素の確認を行った。SDS-PAGEの結果は図11に示すように、C末端にRSHHHHHHが付加された誘導タンパク質が可溶性画分に確認された。組換酵素はC末端にRSHHHHHHの付加アミノ酸配列があるため、Y586-1株精製酵素より約1kDa大きい。また、このバンドのケトース3-エピメラーゼ活性も確認された。
ATGAAAATTGGCTGCCACGGCCTGGTATGGACCGGCCGTTTCGACGCTGAAGGCATCCGCTACTCCGTCCAGAAGACCAAGGAAGCCGGGTTTGATCTGATCGAATTCCCGCTCATGGATCCCTTCTCCTTCGATGTGGCCACGGCAAAGTCGGCACTCGCAGAGCATGGTTTGACCGCCTCCGCATCATTGGGACTTTCCGAAGCTACGGATGTCAGCAGTGAAGATCCGGCCATTGTGAAAGCGGGGGAGGAGTTGCTCAACCGTGCCCTTGATGTTCTTGCGGAGCTGGGTGCCACCGACTTCTGCGGCGTGATCTACAGTGCGATGAAGAAGTACATGGAGCCGGCCACCGAGCAAGGCTTGAGCAACAGCAAGGCCGCTGTCGGGAGGGTGGTCGACAGGGCTGCTGGCCTGGGCATCAACGTCTCGCTTGAGGTCGTGAACCGGTATGAAACCAACGTGCTGAACACCGGGCGGCAGGCTCTGTCCTACCTCTCTGATGTCAAGCGGCCGAATCTAGGCGTTCATTTGGATACTTACCACATGAACATCGAGGAATCGGACATGTTCTCTCCGGTGCTGGACACCGCCGAGGCTCTTAAGTACGTGCACATTGGCGAGAGCCACCGAGGTTACCTCGGCACCGGGAGCGTCGATTTCGACAACTTCTTCAAGGCTCTTGGCCGCATCGGCTACGACGGACCGGTCGTCTTCGAATCATTCTCCTCCGCGGTCGTGGCCCCGGATCTGAGCCGCATGCTTGGCATCTGGCGCAACCTGTGGGCGGACAACGAAGAACTCGGCGCCCACGCCAACGCCTTCATACGCGACAAACTCACGGCCATCAAGACCATCGAACTGCACTAA
(配列2 Y586-1株のタンパク質データベースを用いて同定したDNA配列 下線部で示す終止コドンに当たる塩基はクローニングの際には除去した。)
配列1のアミノ酸配列と78.5%のアミノ酸配列同一性を有する、下記配列3(配列表の配列番号3)の変異体と、76.8%のアミノ酸配列同一性を有する、下記配列4(配列表の配列番号4)の変異体とを作成し、上記実験6の2.と6.と同じ方法で、その粗酵素の酵素活性、耐熱性を測定した。
[配列3](配列番号3)(下線部は、配列番号1と相違するアミノ酸)
MNIGCHGLVWTGTFDADGIRLAVEKTKQAGFDLIEFPLMDPFSFDVAAAQAALAEHGLAVSASLGLSDETDITSSDPAVVAAGEALLLRAVDVLAELGGTHFCGVIYSAMKKYMDPVTPEGLASSRRTIARVADHAAERGVSVSLEVVNRYETNVLNTARQALAYLGEVDRPNLGIHLDTYHMNIEESDMFAPVLDAAPALRYVHIGESHRGYLGTGTVDFDTFFKALGRIGYDGPIVFESFSSAVVAPDLSRMLGIWRNLWTDNDELGAHANAYIRDKLVAVDSIRLH
[配列4](配列番号4)(下線部は、配列番号1と相違するアミノ酸)
MNIGCHGLVWTGNFDAEGIRLAVHKTREAGFDLIEFPLMDPFTFDVSVAKDALEEYDIAVSASLGLSEETDVTSADPAVAAAGEALLIKAVDVLADLGGEHFCGVIYSAMKKYMEPVTPEGLASSKAAIARVADHAAARGVSVSLEVVNRYETNVLNTARQALAYIAEVDRPNLGIHIDTYHMNIEESDMFTPVLDAAPALRYVHIGESHRGYLGTGTVDFDTFFKALGRIGYNGPIVFESFSSAVVAPDLSRMLGIWRNLWNDNDELGAHANAYIRDKLVAVDSIRLH
本発明の配列番号1で表されるケトース3-エピメラーゼのアミノ酸配列と、対照酵素(アルスロバクター グロビフォルミス(Arthrobacter globiformis)由来のケトース3-エピメラーゼ)(特許文献5)のアミノ酸配列を比較して、アミノ酸残基が異なる部位はケトース3-エピメラーゼ活性への関与が小さいと予想し、配列番号1のその相違する部位のアミノ酸等を、部位特異的変異操作による塩基置換により変化させて各種のケトース3-エピメラーゼ変異体を作成し、その中から、野生型より耐熱性の高いアミノ酸置換変異体が得られる部位のものを選択した。
組換えによって得られた各1アミノ酸置換変異体の粗酵素のT70/T50と60℃で1時間保温後の残存活性を測定した。そのうち、T70/T50または60℃で1時間保温後の残存活性のいずれかが、対照酵素より高い変異体を選択したところ、表9の18の部位のアミノ酸置換体であった。
T70/T50が対照酵素のAgDAE(1.54)を上回る部位特異的変異酵素が37種中30種、そのうち親株野生型組換え酵素Y586-1株 DAE(1.78)を上回る変異酵素は37種中20種得られた(表10)。
また、60℃1時間保温後の残存活性が対照酵素のAgDAE(30.8%)を上回る部位特異的変異酵素が37種中37種、そのうち親株野生型組換え酵素Y586-1株 DAE(49.4%)を上回る変異酵素は37種中36種得られた(表11)
以上の結果から、本発明のケトース3-エピメラーゼは、部位特異的変異を行うことにより、さらに熱安定性が高まる変異体が多数得られるという優れた有用な酵素であることがわかった。
特に、従来のケトース3-エピメラーゼに比べて、培養液から得られる総活性が対照酵素の約3倍高いので、本発明の酵素によりD-アルロースの大量生産が可能になる。
また、酵素の至適温度が70℃と高く、高耐熱性酵素であることから、至適温度の60~70℃付近での反応において、より高いD-アルロースの生産収率がもたらされる。
また、本発明のケトース3-エピメラーゼは、種々の固定化方法によって活性の高い固定化酵素を得ることができ、固定化酵素を用いることで、連続的で大量のエピ化反応を行うことが可能である。工業的に固定化できることで、目的とするケトースの大量生産ができる。
さらに、本発明のケトース3-エピメラーゼのアミノ酸置換変異体には、変異前の本酵素より熱安定性が高いものが多数含まれる。
したがって、本発明のケトース3-エピメラーゼとその製造方法の確立は、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きい。
Claims (22)
- アルスロバクター(Arthrobacter)属に属する微生物由来のケトース3-エピメラーゼであって、SDS-PAGEで測定した分子質量が36kDaであり、下記(A)および(B)の基質特異性と下記(C)および(D)の理化学的性質を有するケトース3-エピメラーゼ。
(A)D-またはL-ケトースの3位をエピマー化し、対応するD-またはL-ケトースを生成する活性を有する。
(B)D-またはL-ケトヘキソースの中ではD-アルロースに対する3位のエピ化活性が最も高い。
(C)反応至適pHは6~8である。
(D)反応至適温度は60℃である。 - 基質特異性が、D-アルロース、D-タガトース、L-タガトース、D-フラクトース、L-アルロースの順である、請求項1に記載のケトース3-エピメラーゼ。
- アルスロバクター属に属する微生物がアルスロバクター ヒスチジノロボランス(Arthrobacter histidinolovorans)である、請求項1または2に記載のケトース3-エピメラーゼ。
- アルスロバクター属に属する微生物が特許微生物寄託センターに受託番号NITE BP-02813として寄託されているアルスロバクター ヒスチジノロボランス Y586-1株である、請求項1ないし3のいずれかに記載のケトース3-エピメラーゼ。
- 以下の(a)または(b)に記載のタンパク質。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列と75%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は、配列番号1で表されるアミノ酸配列におけるH6、S63、M110、E146、E152、D179、H182、H205、R211、E240のいずれの部位のアミノ酸も置換されておらず、かつ配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の立体構造を保持するアミノ酸配列であって、下記(A)および(B)のケトース3-エピメラーゼ活性を有し、かつ反応温度70℃と50℃におけるケトース3-エピメラーゼ活性の比(T70/T50)が1.55以上であるタンパク質。
(A)D-またはL-ケトースの3位をエピマー化し、対応するD-またはL-ケトースを生成する活性を有する。
(B)D-またはL-ケトヘキソースの中ではD-アルロースに対する3位のエピ化活性が最も高い。 - 以下の(a)または(b)に記載のタンパク質。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列と75%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は、配列番号1で表されるアミノ酸配列におけるH6、S63、M110、E146、E152、D179、H182、H205、R211、E240のいずれの部位のアミノ酸も置換されておらず、かつ配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の立体構造を保持するアミノ酸配列であって、下記(A)および(B)のケトース3-エピメラーゼ活性を有し、かつ60℃で1時間保温後の残存活性が31%以上であるタンパク質。
(A)D-またはL-ケトースの3位をエピマー化し、対応するD-またはL-ケトースを生成する活性を有する。
(B)D-またはL-ケトヘキソースの中ではD-アルロースに対する3位のエピ化活性が最も高い。 - 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸置換変異体からなるタンパク質であって、配列番号1で表されるアミノ酸配列のH56、T59、A60、P77、L94、L97、D101、A109、A128、V129、V132、S144、S167、P172、E199、A200、K202、S218から選ばれる少なくとも1つの部位のアミノ酸置換を有し、下記(A)および(B)のケトース3-エピメラーゼ活性を有し、かつ配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質より、反応温度70℃と50℃におけるケトース3-エピメラーゼ活性の比(T70/T50)が高いか、または60℃で1時間保温後の残存活性が高い変異体からなるタンパク質。
(A)D-またはL-ケトースの3位をエピマー化し、対応するD-またはL-ケトースを生成する活性を有する。
(B)D-またはL-ケトヘキソースの中ではD-アルロースに対する3位のエピ化活性が最も高い。 - 請求項5ないし7のいずれかに記載のタンパク質をコードするDNA。
- 配列番号2で表される塩基配列若しくはその相補的配列からなるDNA。
- 下記(a)または(b)に記載のDNAであることを特徴とする請求項8に記載のDNA。
(a)配列番号2で表される塩基配列若しくはその相補的配列の一部若しくは全部を含む配列からなるDNA、
(b)配列番号2で表される塩基配列からなるDNAと75%以上の配列同一性を有するDNA - 請求項8ないし10のいずれかに記載のDNAを含有する組換えベクター。
- 請求項11に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換宿主細胞。
- 請求項1または2に記載のケトース3-エピメラーゼを生産する、特許微生物寄託センターに受託番号NITE BP-02813として寄託されているアルスロバクター ヒスチジノロボランス Y586-1株。
- 請求項1ないし4のいずれかに記載のケトース3-エピメラーゼが担体に固定化されていることを特徴とする固定化酵素。
- 請求項1ないし4のいずれかに記載のケトース3-エピメラーゼを生産するアルスロバクター属微生物の、菌体破砕物中に存在するケトース3-エピメラーゼ粗酵素が担体に固定化されていることを特徴とする固定化酵素。
- 前記担体が、イオン交換樹脂、有機高分子担体、および/または無機担体である、請求項14または15に記載の固定化酵素
- 請求項5ないし7のいずれかに記載のタンパク質が、担体に固定化されていることを特徴とする固定化タンパク質。
- 前記担体が、イオン交換樹脂、有機高分子担体、および/または無機担体である、請求項17に記載の固定化タンパク質。
- 請求項1ないし4のいずれかに記載のケトース3-エピメラーゼを生産するアルスロバクター属微生物を培地中で培養し、微生物菌体中に当該ケトース3-エピメラーゼを蓄積させ、これを採取するケトース3-エピメラーゼの製造方法。
- 前記培地がD-アルロースを添加した無機塩培地である、請求項19に記載のケトース3-エピメラーゼの製造方法。
- 請求項12に記載の形質転換宿主細胞を培地で培養し、培養物からケトース3-エピメラーゼ活性を有するタンパク質を採取する、ケトース3-エピメラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
- D-またはL-ケトースから選ばれる1種以上を含有する溶液に、請求項1ないし4のいずれかに記載のケトース3-エピメラーゼ、請求項5ないし7のいずれかに記載のタンパク質、請求項14ないし16のいずれかに記載の固定化酵素、または、請求項17または18に記載の固定化タンパク質を作用させて、該ケトースの3位をエピマー化し、対応するケトースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするケトースの製造方法。
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