CN110035773A - 新型抗ctla4抗体 - Google Patents

Abstract

本公开提供针对CTLA4的抗体和抗原结合片段，其可以阻断CTLA4与其配体的结合。本公开的抗体提供了用于治疗疾病如癌症的药剂。

Description

新型抗CTLA4抗体

发明领域

本公开主要涉及新型抗CTLA4抗体。

序列表的引用

本申请含有下表中所示的序列。序列表的计算机可读版本是与本申请一起提交，并通过引用的方式并入本文中。

背景技术

T细胞活化需要两个不同的信号。第一个信号是T细胞受体(TCR)与在MHC环境下呈递于抗原呈递细胞(APC)表面上的名义上的抗原之间的抗原特异性相互作用。第二个信号是通过多个潜在共刺激分子提供。T细胞的活化受多个机制紧密调控，包括扩大或下调T细胞反应的细胞表面蛋白质(Bretscher等人,(1970)《科学(Science)》69:1042；Bernard等人,(2002)《移植(Transplantation)》73:S31-S35)。CD28作为一种组成性表达的Ig家族蛋白质，是最佳表征的T细胞反应共刺激信号之一。CD28结合至在APC上的配体CD80(B7-1)和CD86(B7-2)，通过诱导产生白细胞介素-2(IL-2)和抗细胞凋亡因子而引起T细胞增殖。CTLA4是最先鉴别为共抑制分子的分子并且在调控体液和细胞免疫反应中起到重要作用(Brunet等人,(1987)《自然(Nature)》328:267-270)。CTLA4属于CD28超家族并且与CD28具有31％的总体氨基酸同一性。CTLA4是由二硫键连接的细胞外IgV域的同源二聚体构成。(Stamper等人,(2001)《自然》410:608-611)。与其它抑制性受体不同，CTLA4没有经典的基于免疫受体酪氨酸的抑制基元(ITIM)。尽管如此，但据报导，两种磷酸酶，即SHP-2和丝氨酸-苏氨酸磷酸酶蛋白质磷酸酶2A(PP2A)可与CTLA4的YVKM基元缔合(Rudd等人,(2009)《免疫学评论(Immunol Rev.)》229:12-26)。CD28和CTLA4共用CD80和CD86作为其天然配体。然而，CTLA4:B7相互作用的亲和力比CD28:B7相互作用的亲和力高超过10倍(Peach等人,(1994)《实验医学杂志(J Exp Med)》180:2049-2058)。由此允许CTLA4将B7配体与CD28隔离并拮抗CD28依赖性共刺激作用，这构成CTLA4针对T细胞活化的抑制性作用的一部分。还有研究提出，CTLA4可不依赖于TCR信号传输独特远端信号以减弱T细胞反应(Calvo等人,(1997)《实验医学杂志》186:1645-1653)。CTLA4通过与APC上的B7分子相互作用，诱导IDO表达，由此催化色氨酸转化成犬尿氨酸，导致局部色氨酸耗竭以及随后T细胞增殖和活化的抑制(Mellor等人,(2004)《国际免疫学(Int Immunol)》16:1391-1401)。脂筏相关CTLA4与TCR复合物紧密地相互作用并改变脂筏完整性和TCR介导的信号(Chikuma等人,(2003)《实验医学杂志》197:129-135)。此外，CTLA4还能因募集至活化T细胞上的突触而独立于B7连接起作用(Chikuma等人,(2005)《免疫学杂志》175:177-181)。

CTLA4基因敲除小鼠的表型明显地披露了CTLA4作为负调控因子的重要作用(Tivol等人,(1995)《免疫(Immunity)》3:541-547)。CTLA4缺陷型小鼠由于抗原识别后T细胞过量增殖以及CD80/CD86与CD28之间未被抵抗或无竞争的共刺激性相互作用，而发展大规模的急性致死性T淋巴细胞增殖性疾病，并伴随脾肿大、***病和多器官T淋巴细胞浸润。此外，CTLA4基因的多态现象与若干自身免疫性疾病(Gough等人,(2005)《免疫学评论》204:102-15)，包括1型糖尿病、甲状腺炎、全身性红斑狼疮和类风湿性关节炎有关。

CD28在大部分休眠和活化T细胞上表达，而CTLA4被局限于活化的T细胞，但组成性表达CTLA4的调节性T细胞(Treg)的情形除外。CTLA4对Treg和CD8效应细胞(Teff)起作用。CTLA4靶向转录因子Eomes以调控CD8⁺效应功能，并使IFNγ和颗粒酶B表达减少以及潜在细胞溶解性T细胞功能减弱。Treg细胞上CTLA4表达的损失将削弱其抑制功能并引起病理性自身免疫。CTLA4针对Teff的抑制作用以及针对Treg的刺激作用导致免疫反应衰减，并由此介导耐受性和/或无反应性(Carreno等人,(2000)《免疫学杂志》165:1352-1356；Chai等人,(2000)《免疫学杂志》165:3037-3042)。

已发现，CTLA4由于在免疫反应中具有负面作用而与癌症生长和发展存在一定相关性。CTLA4在肿瘤中Treg细胞上的表达水平高于肿瘤内Teff细胞，并且经显示，抗CTLA4需要结合至Treg细胞和Teff细胞来诱导完全肿瘤防护(Peggs等人,(2009)《实验医学杂志》206:1717)。另外，抗CTLA4介导的肿瘤破坏通常与肿瘤内CD4+Teff/Treg细胞的比率增加以及肿瘤内CD8+Teff/Treg细胞的比率增加有关(Quezada等人,(2006)《临床研究杂志(JClin Invest)》116:1935；Curran等人,(2010)《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad SciUSA)》107:4275)。

在用动物模型进行的早期研究中显示，抗体阻断CTLA4可加剧自身免疫性(Perrin等人,(1996)《免疫学杂志》157:1333-6；Hurwitz等人,(1999)《神经免疫学杂志(JNeuroimmunol)》73:57-62)。研究扩展至肿瘤免疫后显示，阻断CTLA4抑制性信号相应地可增强肿瘤特异性T细胞免疫并使现有肿瘤消退。在鼠类侵袭性结肠癌模型中，例如，Leach等人展示了CTLA4阻断的治疗功效。施用抗CTLA4抗体明显地抑制CD80阳性和CD80阴性结肠癌的肿瘤生长。另外，这一抑制作用引起针对肿瘤细胞继发暴露的免疫。此外，作者还显示用抗CTLA4治疗还减少鼠类纤维肉瘤Sa1N的生长(Leach等人,(1996)《科学》271:1734-1736)。近期的研究表明，通过阻断Teff细胞和Treg细胞上的CTLA4直接增强Teff细胞功能并伴随抑制Treg细胞活性，对于调节抗CTLA4抗体在癌症免疫疗法期间的完全治疗作用至关重要(Peggs等人,(2009)《实验医学杂志》206:1717-25)。

结合多种治疗性干预的CTLA4阻断的全面性已在多种小鼠肿瘤模型，如4T1(乳癌)、EL4(淋巴瘤)、CT26(结肠癌)中有报导(Jure-Kunkel等人,(2008)《临床肿瘤学杂志(JClin Oncol)》26增刊15:3048)。已结合疫苗(Saha等人,(2010)《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand J Immunol)》71:70-82)、化学疗法(Mokyr等人,(1998)《癌症研究(Cancer Res)》58:5301-5304)、放射(Dewan等人,(2009)《临床癌症研究》15:5379-5388)、胞嘧啶-磷酸鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)佐剂(Davila等人,(2003)《癌症研究》63:3281-3288)、抗体(Takeda等人,(2010)《免疫学杂志》184:5493-5501；Redmond等人,(2013)《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res)》2:142-53)和冷冻消融(Waitz等人,(2012)《癌症研究》72:430-439。)展示针对抗肿瘤活性的协同作用。例如，Jure-Kunkel等人使用3种不同的肿瘤细胞系：SA1N纤维肉瘤、M109肺癌和EMT-6***癌，展示了抗CTLA4抗体与伊沙匹隆(ixabepilone)的组合在这些肿瘤模型中显示协同性抗肿瘤作用，在70-100％的动物中获得持久的完全反应，由此产生比单独每一治疗高得多的功效。当用致死剂量的肿瘤细胞再攻击肿瘤完全消退的动物时，用伊沙匹隆加CTLA4抗体治疗动物可抑制随后的肿瘤，显示了保护性记忆免疫反应的产生(Jure-Kunkel等人,(2008)《临床肿瘤学杂志》26增刊15:3048)。

伊匹单抗(ipilimumab)，作为一种能够阻断CTLA4/B7相互作用的人抗CTLA4抗体(Keler等人,(2003)《免疫学杂志》171:6251-9)已在针对多种恶性病的多项临床试验中得到测试(Hoos等人,(2010)《肿瘤学论文集(Semin Oncol)》37:533-46；Ascierto等人,(2011)《转化医学杂志(J Transl Med)》9:196)。常常观察到肿瘤消退和疾病稳定化，并且伴随不良事件以及能够影响多个器官***的炎性浸润。在2011年，美国和欧盟基于先前治疗的晚期黑素瘤患者在III期试验中总存活率的提高而批准伊匹单抗用于治疗不可切除性或转移性黑素瘤(Hodi等人,(2010)《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》363:711-23)。

然而，由于伊匹单抗治疗在10-20％所治疗的人中出现T细胞活化和增殖，已将其与严重并且可能致命的免疫不良作用相关联。伊匹单抗治疗的成本极高。因此，仍然需要开发针对CTLA4的新型抗体。

发明简述

在一方面，本公开提供了结合至CTLA4的新型抗体或其抗原结合片段、编码其的多核苷酸和其使用方法。

在一个实施方式中，所述抗体或其片段结合至人CTLA4。在另一个实施方式中，所述抗体或其片段结合至人和食蟹猕猴CTLA4。在另一个实施方式中，所述抗体或其片段阻断T细胞上的CTLA4与其配体CD80和CD86的相互作用。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下组的重链CDR序列：SEQ ID NO:3、5、7、19、21和23。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下组的轻链CDR序列：SEQ ID NO:11、13、15、27、29和31。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下组的重链可变区：

a)包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:7的重链可变区；和

b)包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和/或SEQ ID NO:23的重链可变区。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下组的轻链可变区：

a)包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:15的轻链可变区；和

b)包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和/或SEQ ID NO:31的轻链可变区。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括：

a)包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:7的重链可变区；和包含SEQID NO:11、SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:15的轻链可变区；或

b)包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和/或SEQ ID NO:23的重链可变区；和包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和/或SEQ ID NO:31的轻链可变区。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下组的重链可变区：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37以及与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下组的轻链可变区：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39以及与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括：

a)包含SEQ ID NO:1的重链可变区和包含SEQ ID NO:9的轻链可变区；

b)包含SEQ ID NO:17的重链可变区和包含SEQ ID NO:25的轻链可变区；

c)包含SEQ ID NO:33的重链可变区和包含SEQ ID NO:35的轻链可变区；

d)包含SEQ ID NO:37的重链可变区和包含SEQ ID NO:39的轻链可变区；

e)与a)、b)、c)或d)具有至少80％序列同一性的重链可变区和轻链可变区。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段能够以不超过10^-9M(例如≤9×10^-10M、≤8×10^-10M、≤7×10^-10M、≤6×10^-10M、≤5×10^-10M、≤4×10^-10M、≤3×10^-10M、≤2×10^-10M或≤10^-10M)的KD值特异性结合至人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA4)蛋白质，所述KD值是通过表面等离子体共振结合分析测量。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以不超过10^-8M(例如≤9×10^-9M、≤8×10^-9M、≤7×10^-9M、≤6×10^-9M、≤5×10^-9M、≤4×10^-9M、≤3×10^-9M、≤2×10^-9M或≤10^-9M)或不超过10^-9M(例如不超过≤9×10^-10M、≤8×10^-10M、≤7×10^-10M、≤6×10^-10M、≤5×10^-10M、≤4×10^-10M、≤3×10^-10M、≤2×10^-10M或≤10^-10M)的KD值结合至猴CTLA4。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段能够以不超过600ng/ml(例如≤500ng/ml、≤400ng/ml、≤300ng/ml、≤200ng/ml、≤100ng/ml)的IC50抑制人CTLA4与其配体的结合，所述IC50是通过ELISA分析测量。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段能够以不超过30ng/ml(例如≤25ng/ml、≤20ng/ml、≤15ng/ml、≤10ng/ml、≤9ng/ml、≤8ng/ml、≤7ng/ml、≤6ng/ml、≤5ng/ml、≤4ng/ml、≤3ng/ml、≤2ng/ml、≤1ng/ml)的EC50结合至人CTLA4，所述EC50是通过ELISA分析测量。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段能够以不超过600ng/ml(例如≤500ng/ml、≤400ng/ml、≤300ng/ml、≤200ng/ml、≤100ng/ml)或不超过30ng/ml(例如≤25ng/ml、≤20ng/ml、≤15ng/ml、≤10ng/ml、≤9ng/ml、≤8ng/ml、≤7ng/ml、≤6ng/ml、≤5ng/ml、≤4ng/ml、≤3ng/ml、≤2ng/ml、≤1ng/ml)的IC50抑制人CTLA4与其配体的结合，所述IC50是通过FACS分析测量。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段能够以不超过6000ng/ml、不超过2400ng/ml、1200ng/ml或不超过400ng/ml的EC50结合至人CTLA4，所述EC50是通过FACS分析测量。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化单克隆抗体。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是由宿主细胞产生。

另一方面，本公开提供了与本文所公开的抗体或其抗原结合片段竞争相同表位的抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是骆驼化单域抗体(camelizedsingle domain antibody)、双功能抗体、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、二硫键稳定的双功能抗体(ds diabody)、纳米抗体、域抗体或双价域抗体。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段还包含缀合物。

本公开还提供了编码本文所提供的抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸。本公开还提供了一种包含所述分离的多核苷酸的载体。本公开另外提供一种包含所述载体的宿主细胞。在某些实施方式中，本文所提供的多核苷酸与载体中的启动子如SV40启动子可操作地缔合。在某些实施方式中，包含本文所提供的载体的宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞或293F细胞。

另一方面，本公开提供了一种表达本文所公开的抗体或其抗原结合片段的方法。在某些实施方式中，所述方法包括在使编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸表达的条件下，培养宿主细胞。

另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含如本文所公开的抗体或其抗原结合片段。

另一方面，本公开提供了一种治疗个体中由CTLA4介导的疾病的方法。在某些实施方式中，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的如本文所公开的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述个体已被鉴别为患有可能对CTLA4抑制剂起反应的病症或病况。在某些实施方式中，所述疾病是癌症。

另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含如本文所公开的抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的载体。在某些实施方式中，所述药物载体可以是例如稀释剂、抗氧化剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质。

附图简述

图1是显示通过ELISA测量的鼠类抗体6F3和10B10的结合EC50的图。本图的上图显示了在一定鼠类抗体浓度范围内的吸光度，并且本图的下图显示了所计算的每一测试抗体的EC50。

图2显示了通过FACS所测量的鼠类抗体6F3和10B10的结合EC50。本图的上图显示了在一定鼠类抗体浓度范围内的平均荧光强度(MFI)，并且本图的下图显示了所计算的每一测试抗体的EC50。

图3显示了通过ELISA所测量的鼠类抗CTLA4抗体6F3和10B10阻断CTLA4配体CD80与CTLA4的结合。本图的上图显示了在一定抗体浓度范围内的吸光度。图3的下图示出了抗CTLA4抗体的阻断IC50。

图4显示了通过FACS所测量的鼠类抗CTLA4抗体6F3和10B10阻断CTLA4配体CD80与CTLA4的结合。本图的上图显示了在一定抗体浓度范围内的MFI。图4的下图示出了抗CTLA4抗体的阻断IC50。

图5是显示通过ELISA测量的人源化抗体6F3和10B10的结合EC50的图。本图的上图显示了在一定人源化抗体浓度范围内的吸光度，并且本图的下图显示了所计算的每一测试抗体的EC50。

图6显示了通过FACS所测量的人源化抗体6F3和10B10的结合EC50。本图的上图显示了在一定人源化抗体浓度范围内的平均荧光强度(MFI)，并且本图的下图显示了所计算的每一测试抗体的EC50。

图7显示了通过ELISA所测量的人源化抗CTLA4抗体6F3和10B10阻断CTLA4配体CD80与CTLA4的结合。本图的上图显示了在一定抗体浓度范围内的吸光度。图7的下图示出了抗CTLA4抗体的阻断IC50。

图8显示了通过FACS所测量的人源化抗CTLA4抗体6F3和10B10阻断CTLA4配体CD80与CTLA4的结合。本图的上图显示了在一定抗体浓度范围内的MFI。图8的下图示出了抗CTLA4抗体的阻断IC50。

图9是显示PBMC响应于不同浓度的鼠类抗CTLA4抗体产生IL-2(pg/mL)的图。从左到右，测试的鼠类抗CTLA4抗体是10B10、6F3、mIgG1同型对照。如在x轴上所示，每一抗体在浓度30μg/mL、10μg/mL、1μg/mL时进行测试。

图10是显示PBMC响应于不同浓度的鼠类抗CTLA4抗体产生IFN-γ(pg/mL)的图。从左到右，测试的鼠类抗CTLA4抗体是10B10、6F3、mIgG1同型对照。如在x轴上所示，每一抗体在浓度30μg/mL、10μg/mL、1μg/mL时进行测试。

图11是显示PBMC响应于不同浓度的人源化抗CTLA4抗体产生IL-2(pg/mL)的图。从左到右，测试的人源化抗CTLA4抗体是10B10、6F3、hIgG1同型对照。如在x轴上所示，每一抗体在浓度30μg/mL、10μg/mL、1μg/mL时进行测试。

图12是显示PBMC响应于不同浓度的人源化抗CTLA4抗体产生IFN-γ(pg/mL)的图。从左到右，测试的人源化抗CTLA4抗体是10B10、6F3、mIgG1同型对照。如在x轴上所示，每一抗体在浓度30μg/mL、10μg/mL、1μg/mL时进行测试。

图13是显示在HuGEMM模型中人源化CTLA4抗体对肿瘤生长的抑制作用的图。

发明详述

本公开的以下描述只为说明本公开的各种实施例。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对本公开的范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本公开范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式、变化和修改，并且应理解这样的等同实施例包括在本发明范围内。本中引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入本文中。

定义

本文中使用的术语“抗体”包括任意可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性(双价)抗体。一个天然的完整抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由一个可变区和第一、第二、第三恒定区组成，而每条轻链由一个可变区和一个恒定区组成。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，并且哺乳动物的轻链可分为λ或κ。抗体呈“Y”型，且Y型结构的颈部由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。Y型结构的每条臂包括一条重链的可变区和第一恒定区，其与一条轻链的可变区和恒定区结合。轻链和重链的可变区决定抗原的结合。每条链的可变区一般均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文所公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat、Chothia或Al-Lazikani命名法定义或标识(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,《分子生物学杂志(J Mol Biol)》,273(4):927(1997)；Chothia,C.等人,《分子生物学杂志》186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》,196,901(1987)；Chothia,C.等人,《自然》342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等人,国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health),Bethesda,Md.(1991))。其中，三个CDR由被称为框架区(FR)的侧面连续部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但展现多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有α、δ、ε、γ和μ重链，抗体可分别分为五个主要的类别或同型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。几个主要的抗体类别还可分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)等。

本文中使用的术语“抗原结合片段”指由含有一个或多个CDR的抗体部分或者任何其它结合至抗原但不包含完整天然抗体结构的抗体片段所形成的一种抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv－dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(双价的双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体、纳米抗体、域抗体和双价域抗体。抗原结合片段能够与亲本抗体结合相同的抗原。在某些实施方式中，抗原结合片段可以包含来自某特定人抗体的一个或多个CDR，移接至来自一个或多个不同人抗体的框架区。

抗体的“Fab”是指由一条轻链(包括可变区和恒定区)和一条重链的可变区和第一恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体。

“Fab'”是指包含了部分铰链区的Fab片段。

“F(ab')₂”指的是Fab'的二聚体。

抗体的“Fc”指的是由第一重链的第二和第三恒定区经二硫键结合至第二重链的第二和第三恒定区组成的那部分抗体。抗体的Fc部分负责多种不同的效应功能如ADCC和CDC，但不参与抗原的结合。

抗体的“Fv”指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由一条轻链的可变区结合至一条重链的可变区组成。

“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽连接序列连接而成的工程改造的抗体(Huston JS等人,《美国国家学院院刊(Proc NatlAcad Sci USA)》,85:5879(1988))。“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指由scFv连接到某抗体Fc区组成的工程改造的抗体。

“骆驼化单域抗体(Camelized single domain antibody)”、“重链抗体”或“HCAb(Heavy-chain-only antibodies，HCAb)”都是指含有两个V_H域而不含有轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.,《免疫方法杂志(J Immunol Methods)》231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,《生物技术杂志(J Biotechnol)》74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利第6,005,079号)。重链抗体最初从驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)衍生得到。虽然缺失轻链，骆驼化抗体(camelized antibodies)有确证的抗原结合全部功能(Hamers-Casterman C.等人,《自然》363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等人,《免疫遗传学(Immunogenetics)》54(1):39-47(2002)；Nguyen VK.等人,《免疫学(Immunology)》109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变域(VHH域)是最小的已知的由获得性免疫反应产生的抗原结合单元(Koch-Nolte F.等人,FASEB J 21(13):3490-8.(2007))。

“纳米抗体”是指一种抗体片段，其由一个来自重链抗体的VHH域和两个恒定域CH2和CH3组成。

“双功能抗体(diabody)”包括带有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中这些片段包含在同一条多肽链上相连的V_H域和V_L域(V_H-V_L或V_H-V_L)(请参见例如，Holliger P.等人,《美国国家科学院院刊》90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。两个域之间连接物很短，使同一条链上的两个域不能互相配对，从而迫使两个域与另一条链的互补域配对，形成两个抗体结合位点。这两个抗体结合位点可靶向结合相同或不同的抗原(或表位)。

“域抗体”是指仅含有一条重链的可变区或一条轻链的可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或多个V_H域由一个肽连接子共价接合并形成双价或多价域抗体。双价域抗体的两个V_H域可靶向作用于相同或不同的抗原。

在某些实施方式中，“(dsFv)₂”包含三条肽链：两个V_H部分间通过一个肽连接子相连，并通过二硫键与两个V_L部分结合。

在某些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”包含V_H1-V_L2(由一个肽连接子连接)和V_L1-V_H2(也是由一个肽连接子连接)，两者在V_H1和V_L1间通过二硫桥结合。

在某些实施方式中，“双特异性dsFv”或“dsFv-dsFv”包含三条肽链：V_H1-V_H2部分，其中两者的重链通过肽连接子(如：长的弹性连接子)相连，并通过二硫桥分别与V_L1和V_L2部分结合，每对通过二硫键配对的重链轻链具有不同的抗原特异性。

在某些实施方式中，“scFv二聚体”是双价双功能抗体或双价单链抗体(BsFv)，包含二聚化的两个V_H-V_L(由肽连接子连接)部分，其中一个部分的V_H与另一个部分的V_L协作形成两个结合位点，这两个结合位点可靶向结合相同抗原(或表位)或不同抗原(或表位)。在另一些实施方式中，“scFv二聚体”是双特异性双功能抗体，包含相互连接的V_H1-V_L2(由肽连接子连接)和V_L1-V_H2(由肽连接子连接)，其中V_H1和V_L1协作，并且V_H2和V_L2协作，且每个协作的配对具有不同的抗原特异性。

本文中使用的术语“人源化”当用于抗体或抗原结合片段时，是指抗体或抗原结合片段包含来源于非人动物的CDR、来源于人的FR区，以及来源于人的恒定区(当适用时)。由于人源化的抗体或抗原结合片段具有降低的免疫原性，其在某些实施方式中可用作人的治疗剂。在一些实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。在一些实施方式中，所述人源化抗体或抗原结合片段除了CDR序列是非人源的以外，基本上全部由人源序列组成。在一些实施方式中，所述来源于人的FR区可以包含与作为其来源的人源抗体相同的氨基酸序列，或其可以包含一些氨基酸改变，例如，不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸改变。在一些实施方式中，该氨基酸改变可以仅存在于重链FR区、仅存在于轻链FR区或同时存在于两条链中。在一些优选实施例中，所述人源化抗体包含人源FR1-3和人源JH和Jκ。

本文中使用的术语“嵌合”是指重链和/或轻链的一部分来源于一种物种且所述重链和/或轻链其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一个示例性的实例中，嵌合抗体可以包含来源于人的恒定区和来源于非人物种，如来源于小鼠的可变区。

本文中使用的“CTLA4”是指细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4，它是一种跨膜蛋白并且主要在活化Treg细胞的表面上表达。CTLA4是以较高亲和力结合CD80(B7-1)和CD86(B7-2)(两者都是在抗原呈递细胞(APC)上表达)的CD28的同源物。细胞介导的免疫的共刺激路径(即CD28结合T细胞表面上的CD80(B7-1)和CD86(B7-2))在T细胞活化、分化、组织迁移和周边耐受性诱导中起到作用(参见Salomon等人,2001,《免疫学年评(Ann Rev Immunol)》19:225)，而CTLA4与CD80/86的竞争性结合可阻断CD80/86-CD28相互作用并终止T细胞活化。代表性的人CTLA4氨基酸序列公开于GenBank登记编号：AAL07473.1，并且代表性的编码所述人CTLA4的mRNA核酸序列显示于GenBank登记编号：AF414120.1。

本文中使用的术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指，两分子间的非随机结合反应，如抗体和抗原间的反应。在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段特异性结合人和/或CTLA4，并且其结合亲和力(K_D)≤10^-6M(例如≤5×10^-7M，≤2×10^-7M，≤10^-7M，≤5×10^-8M，≤2×10^-8M，≤10^-8M，≤5×10^-9M，≤2×10^-9M，≤10^-9M，10^-10M)。本文中使用的K_D是指解离速率度与缔合速率的比值(k_off/k_on)，可使用表面等离子体共振法，例如使用如Biacore等仪器测定。

本文中使用的“阻断结合”或“竞争相同表位”的能力是指抗体或抗原结合片段将两个分子间(例如人CTLA4和抗CTLA4抗体)的结合相互作用抑制至任何可检测的程度的能力。在某些实施方式中，阻断两个分子间结合的抗体或抗原结合片段将两个分子间的结合相互作用抑制至少50％。在某些实施方式中，这样的抑制作用可以大于60％，大于70％，大于80％，或大于90％。

本文中使用的术语“表位”是指抗原中与抗体结合的特定原子基团或氨基酸。如果两种抗体展现出对抗原的竞争性结合，则其可能结合抗原内的相同表位。例如，如果本文所公开的抗体或抗原结合片段阻断示例抗体如6F3和10B10与人CTLA4的结合，则所述抗体或抗原结合片段可以被认为与那些示例性抗体结合相同的表位。

本文中使用的“6F3”或“鼠类6F3”是指具有含SEQ ID NO:3的重链CDR1、含SEQ IDNO:5的重链CDR2和含SEQ ID NO:7的重链CDR3以及含SEQ ID NO:11的轻链CDR1、含SEQ IDNO:13的轻链CDR2和含SEQ ID NO:15的轻链CDR3的小鼠单克隆抗体。

本文中使用的“人源化6F3”是指人源化的6F3单克隆抗体并且具有SEQ ID NO:33的重链可变区和SEQ ID NO:35的轻链可变区。

本文中使用的“10B10”或“鼠类10B10”是指具有含SEQ ID NO:19的重链CDR1、含SEQ ID NO:21的重链CDR2和含SEQ ID NO:23的重链CDR3以及含SEQ ID NO:27的轻链CDR1、含SEQ ID NO:29的轻链CDR2和含SEQ ID NO:31的轻链CDR3的小鼠单克隆抗体。

本文中使用的“人源化10B10”是指人源化的10B10单克隆抗体并且具有含SEQ IDNO:37的重链可变区和含SEQ ID NO:39的轻链可变区。

当“保守取代”用于氨基酸序列时是指将一个氨基酸残基用另一个具有类似理化特性的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在具有疏水性侧链的氨基酸残基间(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)、具有中性亲水性侧链的残基间(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)、具有酸性侧链的残基间(例如Asp、Glu)、具有碱性侧链的氨基酸间(例如His、Lys和Arg)或具有芳香族侧链的残基间(例如Trp、Tyr和Phe)进行保守取代。本领域已知保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，并因此能够保留蛋白质的生物活性。

当“序列同一性百分比”用于氨基酸序列(或核酸序列)时定义为在进行序列比对，并且必要时引入空位以使相同氨基酸(或核酸)数目达到最多后，在候选序列中，与参比序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。所述氨基酸残基的保守取代可以被认为或可以不被认为是相同残基。可以例如使用公开可用的工具，如BLASTN、BLASTp(可见于美国国家生物技术信息中心(U.S.National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)网站，也可参见Altschul S.F.等人,《分子生物学杂志》,215:403-410(1990)；Stephen F.等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,25:3389-3402(1997))、ClustalW2(可见于欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)网站，参见Higgins D.G.等人,《酶学方法(Methods in Enzymology)》,266:383-402(1996)；LarkinM.A.等人,《生物信息学(Bioinformatics)》(英国牛津(Oxford,England)),23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比。本领域技术人员可以使用所述工具提供的默认参数，或者可以根据比对的需要，如通过选择适合的算法定制参数。

本文中使用的“效应功能”是指由抗体Fc区与其效应物如C1复合物和Fc受体结合引起的生物活性。示例性的效应功能包括：由抗体与C1复合物上的C1q相互作用诱导的补体依赖性细胞毒性(CDC)、由抗体的Fc区与效应细胞上的Fc受体结合诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及吞噬作用。

本文中使用的对某种病况的“治疗”或“疗法”包括预防或减轻某种病况、减慢降低某种病况的发作或发展速率、降低发展某种病况的风险、预防或延迟与某种病况相关的症状的发展、减少或终止与某种病况相关的症状、产生某种病况的完全或部分消退、治愈某种病况，或其某一组合。

“被分离”的物质已通过人工由自然状态改变。如果自然界中出现某种“被分离”的组合物或物质，那么其已经自其原始状态改变或脱离其原始状态，或二者均有发生。例如，在活体动物体内天然存在的多核苷酸或多肽是未“被分离”的，但如果该多核苷酸或多肽与其在天然状态下共存的物质充分地分离，由此以基本上纯的状态存在，则可以认为其“被分离”。在某些实施方式中，抗体和抗原结合片段的纯度是至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％，其由电泳方法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)，或色谱法(如离子交换色谱或反相HPLC)确定。

本文中使用的术语“载体”是指，可将编码某蛋白的多核苷酸可操作地***其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。例如，载体的实例包括质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒。用作载体的动物病毒种类包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒和***多瘤空泡病毒(例如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择性元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起点。载体还可包括协助其进入细胞的物质，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白质外壳。

本文中使用的短语“宿主细胞”是指引入了外源多核苷酸和/或载体的细胞。

本文中使用的术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指可有效治疗能对CTLA4抗体起反应的疾病或病况的药物剂量或浓度。

术语“药学上可接受的”是指所指的载体、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐，总的来说在化学上和/或在物理上与构成制剂的其它成分相容，并在生理上与其接受者相容。

抗CTLA4抗体

抗CTLA4抗体6F3、10B10、人源化6F3和人源化10B10的CDR序列和重链或轻链可变区序列显示于下表1-4中。

表1.氨基酸SEQ ID NO

表2.重链CDR序列

表3.轻链CDR序列

表4.重链和轻链可变区以及全长序列

在某些实施方式中，本文所提供的一个或多个CDR序列可以被修饰或改变以使所获得的抗体的一种或多种特性相对于亲本抗体有所改善(如改善的抗原结合、改善的糖基化模式、降低的CDR残基上糖基化的风险、减少的CDR残基脱胺、增加的药代动力学半衰期、pH敏感性和对缀合的相容性)，且在其它方面与亲本抗体相当(即，除上述修饰和改变外另外具有相同组CDR序列的抗体)，或至少基本上保留了亲本抗体的抗原结合特性。

本领域技术人员应理解，本文中提供的CDR序列可以被修饰成包含一个或多个氨基酸取代，由此提供改善的生物活性，如改善的与人CTLA4的结合亲和力。例如，可以利用噬菌体展示技术产生并表达抗体变体库(如Fab或FcFv变体)，随后筛选与人CTLA4有结合亲和力的抗体。另一个实例中，可以用计算机软件虚拟地模拟所述抗体与人CTLA4的结合并鉴别抗体上形成结合界面的氨基酸残基。可以避免这些残基的取代以防止结合亲和力降低，或可以靶向这些残基进行取代以形成更强的结合。在某些实施方式中，CDR序列中的至少一个(或全部)取代是保守取代。

在某些实施方式中，所述抗体和抗原结合片段包含一个或多个CDR序列，这些序列与表1和2中所列的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，并且同时保留了与其亲本抗体类似或甚至高于其亲本抗体水平的与人CTLA4的结合亲和力，所述亲本抗体具有基本上相同的序列，但其相应的CDR序列与表1和2中所列的序列具有100％序列同一性。

在某些实施方式中，所述抗CTLA4抗体和其抗原结合片段被人源化。所述人源化抗体不具有人体中的免疫原性问题和/或如通常用人源化抗体所观察到的结合亲和力降低的问题。这些人源化抗体保持了与人CTLA4的结合亲和力，优选地结合亲和力水平类似于以下示例性抗体之一：6F3和10B10。

本文还包括了与本文所提供的抗CTLA4抗体和其抗原结合片段竞争相同表位的抗体和抗原结合片段。在某些实施方式中，所述抗体以低于10^-6M、低于10^-7M、低于10^-7.5M、低于10^-8M、低于10^-8.5M、低于10^-9M或低于10^-10M的IC₅₀值(即，50％抑制浓度)阻断6F3、10B10、人源化6F3或人源化10B10与人或猴CTLA4的结合。IC₅₀值是基于竞争分析如ELISA分析、放射性配体竞争结合分析和FACS分析测定。

在一些实施方式中，本文所提供的抗CTLA4抗体和其抗原结合片段能够以10^-6M(例如≤5×10^-7M、≤2×10^-7M、≤10^-7M、≤5×10^-8M、≤2×10^-8M、≤10^-8M、≤5×10^-9M、≤2×10^{- 9}M、≤10^-9M、10^-10M)的结合亲和力(Kd)特异性结合至人CTLA4，Kd是通过等离子体共振结合分析或ELISA测量。结合亲和性可以用K_D值表示，其通过当抗原和抗原结合分子的结合达到平衡时解离速率与结合速率的比值(k_off/k_on)计算得到。所述抗原结合亲和力(例如K_D)可以通过本领域已知的适合方法恰当地确定，所述方法包括例如使用仪器如Biacore的等离子体共振结合分析(参见例如Murphy,M.等人,《最新蛋白质科学实验指南(Currentprotocols in protein science)》,第19章,第19.14单元,2006)。

在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其片段与人CTLA4以0.05nM-1nM(例如0.1nM-0.9nM、0.1nM-0.8nM、0.1nM-0.7nM、0.1nM-0.6nM、0.1nM-0.5nM、0.1nM-0.4nM、0.1nM-0.3nM、或0.1nM-0.2nM)的EC₅₀(即50％结合浓度)结合。所述抗体与人CTLA4的结合可以通过本领域已知的方法，例如夹心分析如ELISA、Western印迹、其它结合分析测量。在一个示例性实例中，将待测抗体(即一抗)与固定化的人CTLA4结合，随后洗掉未结合抗体，引入标记的二抗，其能够与一抗结合并因此能够检测出结合的一抗。当使用固定化的CTLA4时可在酶标仪板上进行所述检测。

在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其片段以3nM-10nM(例如3.5nM-9.5nM、3.5nM-8.5nM或5nM-8.5nM)的IC₅₀抑制人CTLA4与人B7.1或B7.2的结合，IC₅₀是在竞争分析中测量。

在一些实施方式中，所述抗CTLA4抗体和其抗原结合片段还包含免疫球蛋白恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区包含重链和/或轻链恒定区。所述重链恒定区包含CH1、CH1-CH2或CH1-CH3区。在一些实施方式中，所述恒定区还可以包含一个或多个修饰以得到需要的特性。例如，所述恒定区可以被修饰以减少或耗竭一种或多种效应功能，改善FcRn受体结合，或引入一个或多个半胱氨酸残基。在一些实施方式中，所述抗CTLA4抗体和其抗原结合片段具有IgG4同型的恒定区，其具有降低的或耗竭的效应功能。已知有许多分析可用来评估ADCC或CDC活性，例如Fc受体结合分析、C1q结合分析和细胞裂解分析，并且本领域技术人员能够容易地选择。

在某些实施方式中，所述抗体和其抗原结合片段可以用作抗体-药物缀合物、双特异性或多价抗体的基础分子。

本文所提供的抗CTLA4抗体和其抗原结合片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、标记的抗体、双价抗体或抗独特型抗体。重组抗体是在体外使用重组方法而非在动物体内制备的抗体。双特异性抗体或双价抗体是具有两种不同的单克隆抗体的片段的人工抗体，其能结合两种不同的抗原。“双价”的抗体或其抗原结合片段包含两个抗原结合位点。所述两个抗原结合位点可以结合至相同抗原，或者可以各自结合至不同的抗原，在这种情况下，所述抗体或抗原结合片段表征为“双特异性”的。

在一些实施方式中，抗CTLA4抗体和其抗原结合片段是骆驼化单域抗体、双功能抗体、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双功能抗体、纳米抗体、域抗体或双价域抗体。

在一些实施方式中，所述抗CTLA4抗体和其抗原结合片段还包含缀合物。可以设想，本文中所提供的抗体或抗原结合片段可与多种缀合物连接(参见例如"缀合物疫苗(Conjugate Vaccines)",《对微生物学与免疫学的贡献(Contributions to Microbiologyand Immunology)》,J.M.Cruse和R.E.Lewis、Jr.(编),Carger Press,New York,(1989))。这些缀合物可以通过共价结合、亲和结合、嵌入、同等结合(coordinate binding)、络合、缔合、掺混或加入等方法与所述抗体或抗原结合片段连接。在某些实施方式中，本文所公开的抗体和抗原结合片段可以被工程改造成在表位结合部分以外含有特定位点，这些位点可用来结合一种或多种缀合物。例如，这样的位点可包括一个或多个反应性氨基酸残基，例如半胱氨酸残基和组氨酸残基，用于协助与缀合物的共价连接。在某些实施方式中，抗体可间接地连接至缀合物，或通过另一种缀合物连接。例如，所述抗体或抗原结合片段可与生物素缀合，然后间接地与第二种缀合物缀合，其与亲和素缀合。所述缀合物可以是可检测的标记、药代动力学修饰部分、纯化部分或细胞毒性部分。可检测的标记的实例可以包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明(rhodamine)、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红(Texas Red))、酶-底物标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、³H、¹¹¹In、¹¹²In、¹⁴C、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、²¹¹At、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi和³²P、其它镧系元素、发光标记)、发色团部分、地高辛(digoxigenin)、生物素/亲和素、DNA分子或金以进行检测。在某些实施方式中，所述缀合物可以是药代动力学修饰部分如PEG，其帮助延长抗体的半衰期。其它适合的聚合物包括例如羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物等。在某些实施方式中，所述缀合物可以是纯化部分如磁珠。“细胞毒性部分”可以是对细胞有害的或可能损害或杀死细胞的任何试剂。细胞毒性部分的实例包括但不限于，紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))以及抗有丝***剂(例如长春新碱和长春碱)。

多核苷酸和重组方法

本公开提供了编码抗CTLA4抗体和其抗原结合片段的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸包含一个或多个如表1和2中所示的核苷酸序列，其编码表1中所提供的CDR序列。

在一些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码重链可变区并包含选自以下组的序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38，以及与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列。在一些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码轻链可变区并包含选自以下组的序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40，以及与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列。在某些实施方式中，同一性百分比是源自遗传密码的简并性，而编码的蛋白质序列保持不变。

使用本领域公知的重组技术，可以将编码所述抗CTLA4抗体和其抗原结合片段(例如包括表1中的序列)的分离的多核苷酸***载体中进行克隆(扩增DNA)或表达。在另一实施方式中，所述抗体可通过本领域公知的同源重组法制得。编码所述单克隆抗体的DNA可以使用常规的程序容易地分离和测序(例如通过使用寡核苷酸探针，该探针能够特异性结合至编码抗体重链和轻链的基因)。多种载体可供选择。载体组分通常包括但不限于，以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)和转录终止序列。

在一些实施方式中，所述载体***包括哺乳动物、细菌、酵母***等，并包含质粒，如但不限于pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO,pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2等，以及其它可从实验室获得和市售的载体。适合的载体可以包括质粒或病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

可以将包含编码所述抗体或抗原结合片段的多核苷酸的载体引入宿主细胞用于克隆或基因表达。本文中适用于克隆或表达所述载体中的DNA的宿主细胞是原核细胞、酵母或上述高级真核细胞。适用于此目的的原核细胞包括真细菌，如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如肠杆菌科如埃希氏菌属，例如大肠杆菌、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷白氏杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属如鼠伤寒沙门氏杆菌、沙雷氏菌属如粘质沙雷氏菌，和志贺氏菌属，以及杆菌属如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌、假单胞菌属如绿脓杆菌、和链霉菌属。

除了原核细胞以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也适合作为编码抗CTLA4抗体的载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母或面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。但是，许多其他属、种和株都比较常用且在本文中适用，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母属宿主如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC 16,045)、魏氏克鲁维酵母(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母；解脂耶氏酵母(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(EP183,070)；假丝酵母；里氏木霉(EP 244,234)；链孢霉；许旺酵母属如西方许旺酵母；和丝状真菌，如脉孢菌属、青霉菌属、弯颈霉属和曲霉菌属，如钩巢曲霉和黑曲霉。

本文中提供的适用于表达糖基化抗体或其抗原片段的宿主细胞由多细胞生物体衍生得到。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已发现多种杆状病毒株(baculoviralstrains)及其变体以及对应的许可性昆虫宿主细胞(permissive insect host cells)，来自于诸如以下的宿主：草地夜蛾(毛虫)、埃及斑蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)及家蚕。多种用于转染的病毒株是公开可得的，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的L-1变种和家蚕核型多角体病毒的Bm-5变种，并且这些病毒都可在本发明中使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。

但是，最感兴趣的是脊椎动物细胞，且脊椎动物细胞的培养(组织培养)已经成为常规操作。可用哺乳动物宿主细胞系的实例有SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆，Graham等人,《普通病毒学杂志(J.Gen Virol.)》36:59(1977))；幼地鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,《生殖生物学(Biol.Reprod.)》23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,《纽约科学院年报(Annals N.Y.Acad.Sci.)》383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。在一些优选的实施例中，所述宿主细胞是293F细胞。

用上述的可产生抗CTLA4抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将其在常规的营养培养基中培养，所述营养培养基经改良后适宜于诱导启动子、选择转化细胞或扩增编码目的序列的基因。

用于产生本文中所提供的抗体或抗原结合片段的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham's F10(Sigma)、最低基本培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM，Sigma)适用于培养所述宿主细胞。另外，在Ham等人,《酶学方法(Meth.Enz.)》58:44(1979)；Barnes等人,《分析生物化学(Anal.Biochem.)》102:255(1980)；美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号或第5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利申请Re.30,985中描述的任何培养基都可以用作所述宿主细胞的培养基。这些培养基中任一种都可补充必要的激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、氯化钙、氯化镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(如庆大霉素(GENTAMYCIN^TM)药物)、微量元素(定义为终浓度通常在微摩尔浓度范围内无机化合物)，和葡萄糖或与之等同的能量源。所述培养基还可含有本领域技术人员公知的适当浓度的任何其它必要的添加剂。所述培养基的条件，如温度、pH值等类似条件，是选择用于表达的宿主细胞此前所使用的条件，并且是本领域普通技术人员显而易见的。

在使用重组技术时，所述抗体可在细胞内、在壁膜空间中产生，或直接分泌至培养基中。如果所述抗体是在细胞内产生，则首先除去宿主细胞或溶解的片断的颗粒残骸，例如，可通过离心或超滤方法。Carter等人,《生物技术(Bio/Technology)》10:163-167(1992)描述了将分泌至大肠杆菌壁膜空间的抗体分离的方法。简要地说，在醋酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下，经约30分钟将细胞糊(cell paste)解冻。离心除去细胞碎片。如果所述抗体被分泌至培养基中，则一般首先使用市售的蛋白质浓度过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元，浓缩此类表达***的上清液。在任何前述的步骤中都可加入蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白水解，并且可以加入抗生素以防止偶然污染物的生长。

由所述细胞制备的抗体可使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱进行纯化，其中亲和色谱是优选的纯化技术。所述抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的物种和同种型决定了蛋白质A作为亲和配体是否适合。蛋白质A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人,《免疫方法杂志(J.Immunol.Meth.)》62:1-13(1983))。蛋白质G适用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人,EMBO J.5:1567 1575(1986))。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质，但也可选用其它基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯与用琼脂糖相比可实现更快的流速和更短的处理时间。如该抗体包含CH3域，则可用Bakerbond ABX.TM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)进行纯化。也可根据需要获得的抗体确定其它蛋白质纯化技术，如在离子交换柱中分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖凝胶(SEPHAROSE^TM)色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤之后，包含感兴趣的抗体和污染物的混合物可经历低pH疏水相互作用色谱法，用pH值在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如从约0至0.25M盐浓度)。

试剂盒

本公开提供了试剂盒，其包括用于结合生物样品中的CTLA4的抗CTLA4抗体。所述生物样品可以包括血浆。在一些实施方式中，所述试剂盒包括与可检测标记缀合的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在某些其它实施方式中，所述试剂盒包括未标记的抗CTLA4抗体或抗原结合片段，并且还包括能够结合至未标记的抗CTLA4抗体的被标记的二抗。所述试剂盒还可以包括使用说明和在试剂盒中将每个组件分隔开的包装。

在一些实施方式中，所述试剂盒可用于治疗、预防或延迟由CTLA4介导的疾病或病况。在某些实施方式中，所述抗CTLA4抗体或其抗原结合片段与可用于夹心分析如ELISA或免疫色谱分析中的底物或仪器连接。有用的底物或仪器可以是例如微量滴定板和试纸。

药物组合物和治疗方法

本公开进一步提供了药物组合物，其包含所述抗CTLA4抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的载体。

用在本文公开的药物组合物中的药学上可接受的载体可包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、掩蔽剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、其它本领域公知的组分或其多种组合。

适合的组分可包括例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。适合的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨醇、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公开，在包含本文所提供的抗体或抗原结合片段和缀合物的组合物中包括一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸，将减少所述抗体或抗原结合片段的氧化。对氧化作用的这一减少将防止或减少结合亲和力的损失，由此改善抗体稳定性并使保质期最长。因此，在某些实施方式中，提供的组合物中包含一种或多种本文所公开的抗体或抗原结合片段以及一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸。还提供了通过将本文中所提供的抗体或抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合来防止所述抗体或抗原结合片段氧化、延长其保质期和/或改善其功效的多种方法。

为进一步说明，药学上可接受的载体可包括例如水性媒剂如氯化钠注射液、林格氏液注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、或右旋糖和乳酸林格氏注射液、非水性媒剂如植物来源的不挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油、细菌抑制或真菌抑制浓度的抗微生物剂、等渗剂如氯化钠或右旋糖、缓冲液如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液、抗氧化剂如硫酸氢钠、局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因、助悬剂和分散剂如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮、乳化剂如聚山梨醇酯80(吐温(TWEEN)-80)、掩蔽剂或螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。用作载体的抗微生物剂可加入多剂量容器中的药物组合物中，其包括酚类或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯胺和苯索氯胺。适合的赋形剂可包括例如水、生理盐水、右旋糖、甘油或乙醇。适合的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂，或者如醋酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精之类试剂。

所述药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、丸剂、胶囊、片剂、持续释放制剂或粉末。口服制剂可以包括标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

在实施方式中，所述药物组合物被配制成可注射组合物形式。可注射的药物组合物可以通过任何常规的形式制备，如液体溶液、悬浮液、乳液、或适于产生液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。注射用制剂可包括注射即用的无菌和/或无热原溶液、在即将使用前现与溶剂组合的无菌干燥的可溶产品，如冻干粉，包括皮下片、注射即用的无菌悬浮液、在即将使用前现与媒剂组合的无菌干燥的不溶产品，以及无菌和/或无热原的乳液。所述溶液可以是水性或非水性的。

在某些实施方式中，单位剂量的肠胃外制剂是包装在安瓿、小瓶或带有针的注射器中。如本领域所知并且实践的，所有肠胃外施用的制剂都应为无菌且无热原的。

在某些实施方式中，无菌的冻干粉末是通过将本文所公开的抗体或抗原结合片段溶解于适合溶剂中来制备。所述溶剂可含有一种提高粉末或由粉末制备的复水溶液的稳定性，或改善粉末或复水溶液的其它药理组分的赋形剂。可用的赋形剂包括但不限于水、右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它适合试剂。溶剂可含有缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其它磁力诶本领域技术人员公知的缓冲剂，在一个实施例中，缓冲剂的pH呈中性。接着在本领域技术人员公知的标准条件下对所述溶液进行无菌过滤，然后冻干将提供所希望的制剂。在一个实施例中，将所得溶液分装至小瓶中冻干。每支小瓶可包含单次剂量或多次剂量的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段或其组合物。每支小瓶中的装入量可略微高于单次剂量或多次剂量所需的量(例如10％过量)，从而有助于取样精确和剂量精确。冻干粉可在适当的条件下储存，如在约4℃至室温下储存。

用注射用水将冻干粉复水得到用于肠胃外施用的制剂。在一个实施例中，向冻干粉中加入无菌和/或无热原水或其它适合液体载体来实现复水。精确量取决于所给选定疗法，并且可根据经验确定。

还提供了治疗方法，其包括将治疗有效量的本文所提供的抗体或抗原结合片段施用给有需要的受试者，由此治疗或预防与CTLA4相关的病况或病症。在另一方面，提供了治疗受试者中会从免疫反应上调获益的病况的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所提供的抗体或抗原结合片段。

本文中所提供的抗体或抗原结合片段的治疗有效量将取决于本领域公知的多种因素，例如体重、年龄、过往病史、现用药物治疗、受试者的健康状况和交叉反应的可能性、过敏、敏感性和不良副作用，以及给药途径和肿瘤发展的程度。本领域普通技术人员(例如医生或兽医)可根据这些和其它情况或要求按比例降低或增加剂量。

在某些实施方式中，本文中所提供的抗体或抗原结合片段可按约0.01mg/kg至约100mg/kg(例如约0.01mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg)的治疗有效剂量施用。在这些实施方式中的某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段是以约50mg/kg或更少的剂量施用，并且在这些实施方式中的某些实施方式中，所述剂量是10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、3mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少、或0.1mg/kg或更少。在某些实施方式中，施用剂量可随治疗过程变化。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可比后续施用剂量高。在某些实施方式中，可取决于施用对象的反应调整在治疗过程中的施用剂量。

剂量方案可通过调整达到最优的所希望反应(例如治疗反应)。例如，可施用单次剂量或经一段时间施用若干分剂量。

本文中公开的抗体和抗原结合片段可通过本领域公知的任何途径施用，例如肠胃外施用(例如皮下注射、腹膜内注射、静脉内注射，包括静脉内输注、肌肉内注射或皮内注射)或非肠胃外施用(例如口服给药、鼻内给药、舌下给药、直肠给药或外用给药)途径。

与CTLA4有关的病况和病症可以是免疫相关疾病或病症。在某些实施方式中，CTLA4相关病况和病症包括肿瘤和癌症，例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、间皮瘤、黑素瘤、头颈癌、甲状腺癌、肉瘤、***癌、成胶质细胞瘤、子***、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈样真菌病、梅克尔氏细胞癌(merkel cell cancer)和其它血液科恶性疾病，如经典霍奇金氏淋巴瘤(classical Hodgkin lymphoma，CHL)、原发纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、EBV阳性和阴性PTLD，以及EBV相关弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、浆母细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌和HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、中枢神经***(CNS)赘瘤，如原发性CNS淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤和癌症是转移性的，尤其是表达PD-L1的转移性肿瘤。在某些实施方式中，PD-1相关病况和病症包括自身免疫性疾病，如全身性红斑狼疮(SLE)、牛皮癣、全身性硬皮病、自身免疫性糖尿病等。在某些实施方式中，PD-1相关病况和病症包括感染性疾病如慢性病毒感染，例如乙型肝炎、丙型肝炎、疱疹病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)、HIV、巨细胞病毒、I型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、人***瘤病毒、腺病毒、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒流行病、细环病毒(Torquetenovirus)、JC病毒或BK病毒引起的病毒感染。

使用方法

本公开还提供了使用所述抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的方法。

在一些实施方式中，本公开提供了治疗个体中由CTLA4介导的病况的方法，其包括施用治疗有效量的所述抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述个体已被鉴别为患有可能对CTLA4拮抗剂起反应的病症或病况。在某些实施方式中，所述病症或病况包括肿瘤或癌症。

在某些实施方式中，与一种或多种上述额外治疗剂组合施用的本文所公开的抗体或抗原结合片段可以与所述一种或多种额外治疗剂同时施用，并且在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段和所述额外治疗剂可以作为同一药物组合物的一部分施用。但是，与另一治疗剂“组合”施用的抗体或抗原结合片段不需要与该治疗剂同时施用或与该治疗剂以同一组合物施用。本文中使用的短语“组合”的含义还包括，在另一种治疗剂之前或之后施用的抗体或抗原结合片段也被认为是与该治疗剂“组合”施用，即使所述抗体或抗原结合片段与第二种试剂通过不同途径施用。在可能的情况下，与本文中公开的抗体或抗原结合片段组合施用的额外治疗剂可根据该额外治疗剂的产品说明书中所列的方案，或根据外科医生的案头参考书2003(Physicians'Desk Reference，第57版；Medical EconomicsCompany；ISBN:1563634457；第57版(2002年11月))，或根据本领域众所周知的方案施用。

以下实例旨在更好地说明本发明，且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明在本发明的范围内的特定实施例。本领域熟练技术人员可在不实施创造能力且在不偏离本发明范围情况下开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，可对本文所述程序作出多种改动，同时仍然包括在本发明范围内。发明人意在将这样的变动包括在本发明的范围内。

实施例1

小鼠免疫接种和针对人CTLA4的小鼠抗体的产生

为了产生针对人CTLA4的抗体，通过PCR获得编码以下与标签(Tag)融合的CTLA4细胞外结构域开放阅读框的cDNA：与组氨酸标签融合(hCTLA4-His，SEQ ID NO:49)、与小鼠Fc融合(hCTLA4-mFc，SEQ ID NO:51)和与人Fc标签融合(hCTLA4-hFc，SEQ ID NO:53)，并将其分别亚克隆至表达载体pcDNA3.1(Invitrogen目录号：V-790)中。在Freestyle 293细胞中短暂表达之后，用NTA柱(GE healthcare)纯化hCTLA4-HisTag，并用蛋白质G柱(GEhealthcare)纯化hCTLA4-mFc和hCTLA4-hFc。

为了使产生杂交瘤细胞系所需的小鼠免疫，将100μg人CTLA4-mFc融合蛋白和100μl完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant)混合，并通过皮下注射将混合物分别施用给五只6至7周龄BALB/c小鼠。两周之后，使用与上文所描述相同的方法，将抗原(先前注射量的一半)与不完全弗氏佐剂混合，并通过皮下注射将混合物施用给每只小鼠。一周之后，进行最后一次加强免疫。三天后，从每只小鼠的尾部收集血液以获得血清。然后，用PBS以1/1000稀释血清，并进行ELISA以分析识别人CTLA4-mFc的抗体的效价是否增加。随后，选出获得足量抗体的小鼠，并对选出的小鼠进行细胞融合程序。

在细胞融合实验前三天，通过腹膜内注射对每只小鼠施用50μg人CTLA4-mFc融合蛋白。将每只经过免疫接种的小鼠麻醉，然后提取其位于身体左侧上的脾脏并用筛网研磨以分离细胞，将其与培养基(RPMI1640)混合以制备脾细胞悬浮液。对所述悬浮液离心以收集细胞层。将所获得的1×10⁸个脾细胞与1.5×10⁷个骨髓瘤细胞(Sp2/0)混合，并对所述混合物离心以使细胞沉淀。将沉淀物缓慢分散并用PEG Hybri-Max(Sigma Inc.，目录号：7181)处理。将混合的细胞以每孔0.1ml分配至96孔板中，并在37℃、5％CO₂恒温箱中培育。第1天，通过向各孔中再加入0.1ml含有血清和HAT加2×甲氨蝶呤的培养基来饲养细胞。第3天和第7天，用0.1ml新制HT培养基更换各孔中的0.1ml培养基。典型地在第9-14天之间进行筛选。

实施例2

基于ELISA和FACS分析选择产生针对人CTLA4的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

使用人CTLA4-hFc进行ELISA结合分析。用100μl含2μg/ml CTLA4-hFc(CrownBio)的涂布缓冲液(PBS，Hyclone，目录号：SH30256.01B)涂布96孔板(Costar，目录号：9018)，在4℃下保持过夜。抽吸各孔，并通过加入200μl含1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA，Roche，目录号：738328)的阻断缓冲液并在37℃下培育1小时来阻断非特异性结合位点。在用洗涤缓冲液(含0.05％(v/v)吐温-20(Sigma，目录号：P1379)的PBS)洗涤板三次之后，加入100微升/孔的杂交瘤上清液的适合稀释液于阻断缓冲液中并在室温下培育1小时。洗涤板并与100微升/孔含山羊抗小鼠IgG(H+L)(Thermo，目录号：31432)的阻断缓冲液一起培育60分钟。在洗涤板之后，加入100微升/孔底物溶液TMB(eBioscience，目录号：00-4201-56)并在室温下培育板2分钟。加入100微升/孔终止溶液(2N H₂SO₄)以停止反应。产生比色信号并使用AutoPlate SpectraMax Plus(供应商：Molecular Devices；型号：MNR0643；软件：SoftMax Prov5.4)在450nm下读取。通过此方法，重复选择产生高度特异性地结合至人CTLA4蛋白质的抗体的杂交瘤细胞系。

通过阻断生物素化人CD80-mFc与人CTLA4-mFc的结合来进行基于ELISA的配体阻断分析。使CTLA4-mFc抗原(CrownBio)悬浮于PBS(Hyclone，目录号：SH30256.01B)缓冲液(2μl/ml，100微升/孔)中并将其涂布于96孔板(Costar，目录号：9018)上，在4℃下保持过夜。使用以下洗涤缓冲液洗涤板3次：PBS+0.05％吐温20(Sigma，目录号：P1379)。将200μl阻断缓冲液(PBS+1％BSA(Roche，目录号：738328))加入各孔中，在37℃下培育1小时，并洗涤3次。将各种浓度(杂交瘤上清液于PBS中的适合稀释液)的抗CTLA4抗体加入各孔(100微升/孔)中并在37℃下培育1小时。加入配体(0.1μg/ml CD80-mFc-生物素，100微升/孔)，在37℃下培育2小时并洗涤3次。加入二抗(亲和素HRP，eBioscience目录号：E07418-1632，1:500，100微升/孔)，在37℃下培育0.5小时，并洗涤3次。加入TMB(Sigma，目录号：T0440，100微升/孔)，并在室温下培育3分钟。加入2N H₂SO₄(100微升/孔)停止反应。产生比色信号并使用Auto Plate SpectraMax Plus(供应商：Molecular Devices；型号：MNR0643；软件：SoftMaxPro v5.4)在450nm下读值。

使用hCTLA4-293T细胞系对抗体进行细胞结合分析。使用2×10⁵个293T-CTLA4细胞，通过将其放入96孔培养板的每个孔中来进行各反应。在4℃下，将细胞与指定抗体(20μg/ml并稀释至1/5)一起培育1小时。用FACS缓冲液洗涤细胞三次。将二抗(PE山羊抗小鼠：1:200；PE小鼠抗人：1:10)以100微升/孔加入细胞中，并在4℃下培育40分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞三次并通过FACS分析。

进行基于FACS的配体阻断分析以确定抗CTLA4杂交瘤抗体是否阻断生物素化人CD80与hCTLA4-293T细胞的结合。使表达CTLA4的293T细胞悬浮于FACS缓冲液(含3％胎牛血清的PBS)中。在96孔板中，将各种浓度的测试杂交瘤抗体加入细胞悬浮液中并在4℃下培育60分钟。将生物素标记的CD80蛋白质加入各孔中并在4℃下培育60分钟。洗涤板3次，并加入小鼠抗生物素PE抗体(Biolgend，目录号409004)。使用FACS测定进行流式细胞术分析。

本研究的结果描绘于图1-4中。抗CTLA4单克隆抗体可以结合固相(图1)和细胞表面(图2)上的CTLA4。这些抗体还可以阻断CD80与96孔板上(图3)或用人CTLA4转染的293T细胞上(图4)的CTLA4的结合。这些数据展示，抗CTLA4抗体可以结合CTLA4并阻断其与配体CD80的结合。

实施例3

进行亚克隆以获得单克隆抗体克隆以及抗hCTLA4抗体的纯化

亚克隆是基于有限稀释的过程，并且被设计成用于获得产生单克隆抗体的各个杂交瘤克隆。对各杂交瘤进行多轮(4轮)有限稀释。对于每一轮亚克隆，通过基于ELISA和FACS的阻断分析测试克隆。

对总计二十种抗hCTLA4杂交瘤抗体进行抗体纯化。在含有10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素、2％L-谷氨酰胺和1％调整过的NaHCO₃溶液的Dulbecco改良型Eagle培养基(GIBCO；加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,Calif.)的Invitrogen Corporation)中培养杂交瘤细胞。接着，使选定杂交瘤细胞适应无血清培养基并使用蛋白质G柱(GEhealthcare)自上清液中纯化出抗体。在用PBS洗涤之后，使用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱结合的抗体，随后使用2.0M Tris进行pH中和。使用Ultra-15离心浓缩器(Amicon)进行缓冲液交换和抗体浓缩。

实施例4

基于ELISA和FACS分析表征纯化的鼠类抗hCTLA4抗体的结合和配体阻断活性

进一步基于ELISA和FACS分析表征纯化的杂交瘤抗体。应用的方法类似于以上在实施例2中描述的方法，不过在这些情况下，使用了纯化的抗体测量EC50和IC50。表5-8显示了抗体6F3和10B10的结果。

表5.基于ELISA测定的鼠类抗CTLA4抗体的结合EC50

ng/ml	6F3	10B10
			EC50	24.97	12.68

表6.基于ELISA测定的鼠类抗CTLA4抗体的阻断IC50

ng/ml	6F3	10B10
			IC50	526.3	594.0

表7.基于FACS测定的鼠类抗CTLA4抗体的结合EC50

ng/ml	6F3	10B10
			EC50	1179	305.5

表8.基于FACS测定的鼠类抗CTLA4抗体的阻断IC50

ng/ml	6F3	10B10
			IC50	525.7	511.3

实施例5

鼠类抗CTLA4抗体的Biacore分析

为了进一步表征所述抗体的结合特征，使用Biacore(Biacore 3000，GE)对杂交瘤抗体进行表征以阐明结合动力学并计算平衡结合常数。这一分析是使用小鼠抗体捕获试剂盒(BR-1008-38，GE)，通过捕获方法进行。在pH 5.0的固定缓冲液中将抗小鼠Fc mab稀释至25μg/ml之后，用表9中显示的参数，以5μl/min流动速率进行固定。动力学操作是通过以下步骤进行：1)以10μl/min流动速率注入配体，通常注入0.5-1分钟；2)以30μl/min流动速率注入选定的分析物，通常注入3分钟，这些分析物随后在相同流速注入的操作缓冲液(1×PBS-P20)中解离，通常解离5-10分钟；以及3)以10μl/min流动速率注入再生溶液10mM甘氨酸pH 1.7，通常注入1-2分钟。

表9.Biacore参数.

事件	注射液	条件
			活化	EDC/NHS(1:1混合物)	7分钟
固定	稀释过的抗人Fc mAb	4分钟以达到约7000RU的固定水平
			去活化	盐酸乙醇胺	7分钟

本研究的结果示于表10中。6F3和10B10都与CTLA4具有高结合亲和力。

表10.抗CTLA4杂交瘤抗体与CTLA4的结合动力学。

	ka(1/Ms)	kd(1/s)	Kd(M)	Chi2
					10B10	6.93E+05	1.52E-04	2.19E-10	0.39
6F3	5.98E+05	2.44E-04	4.09E-10	0.24

实施例6

各物种间和各类似分子间的交叉反应性

为了评估各抗体的物种交叉反应性，通过RT-PCR克隆小鼠和食蟹猕猴CTLA4，使其在Freestyle 293细胞中表达并纯化。使用基于蛋白质的ELISA测试抗体与食蟹猕猴CTLA4的结合。本研究的结果显示，抗体以相等亲和力结合至人和食蟹猕猴CTLA4并以相较于人CTLA4类似的功效阻断CD80与食蟹猕猴CTLA4的结合。在所用任何分析中，没有选定的抗体以可检测的亲和力结合小鼠CTLA4。与人ICOS和CD28无交叉反应。

实施例7

抗CTLA4杂交瘤抗体对PBMC产生细胞因子的影响

通过CTLA4杂交瘤抗体对阻断淋巴细胞效应细胞中CTLA4信号传导路径的影响来评价该抗体的活性。通过使用Histopaque(Sigma，目录号1077-1)制备新鲜分离的人PBMC，并在2×10⁶个细胞/毫升的浓度下，在补充有10％FBS的RPMI 1640中用5ng/ml金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)(Sigma)刺激。接着，在CTLA4抗体存在或不存在下，向96孔板上的每个孔(2×10⁵个细胞/孔)中加入100μl PBMC。测试一系列浓度(30μg/ml、10μg/ml、1μg/ml)的抗体。在37℃下培育72或96小时之后，对96孔板离心并收集上清液，使用ELISA试剂盒(R&DSystems，目录号：DY285)测量IL-2和IFN-γ的产生。使用同型对照抗体作为阴性对照。本研究的结果提供于图9(IL-2分泌)和图10(IFN-γ分泌)中，展示了抗CTLA4单克隆抗体6F3和10B10可以促进PBMC对IFN-γ和IL-2的分泌。相比之下，含有同型对照抗体的培养物未显示IFN-γ或IL-2分泌的任何增加。

实施例8

抗CTLA4抗体cDNA序列克隆和人源化

免疫球蛋白cDNA的克隆

使用通过RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，目录号：74104)自产生hCTLA4抗体的杂交瘤细胞系分离的总RNA作为模板，用II逆转录酶(Life Technology，目录号：18064-14)，根据制造商的说明书，合成cDNA的第一条链。接着，在50μl体积反应混合物中，使用简并小鼠IgG引物对cDNA产物进行PCR(Kettleborough等人,(1993)《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunology)》23:206-211；Strebe等人,(2010)《抗体工程(AntibodyEngineering)》1:3-14)。在S1000^TM热循环仪(Bio-Rad，目录号：184-2000)中进行以下30个循环的反应：94℃，1.5分钟变性；50℃，1分钟退火；以及72℃，1分钟合成。在第30个循环结束时，在72℃下再培育反应混合物7分钟用于延伸。

在含有0.5μg/ml溴化乙锭的1％琼脂糖/Tris-硼酸盐凝胶中对PCR混合物进行电泳。自所述凝胶切下具有预期大小的DNA片段(约400bp的重链和轻链)并纯化。将3μl纯化的PCR产物克隆至pMD-18T载体(Takara，目录号：D101A)中并将该载体转化至OneTOP10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen，目录号：C4040-03)中。通过菌落PCR，使用通用M13正向和反向引物筛选克隆，并从每个反应中选出10个阳性克隆，使用M13正向引物和M13反向引物在两个方向上进行DNA测序。

自相应杂交瘤克隆扩增抗体6F3(SEQ ID NO:1和9)、10B10(SEQ ID NO:17和25)的可变区序列。这些抗体显示出所希望的功能，如阻断CTLA4与CD80的结合以及增强T细胞活化和细胞因子释放。

抗体人源化设计

使用CDR移植方法使6F3和10B10抗体人源化(美国专利第5,225,539号，以全文引用的方式并入本文中)。将鼠类抗体6F3和10B10的轻链和重链可变链序列与通过搜索NCBI数据库得到的在结构生物信息学研究合作组织(Research Collaboratory forStructural Bioinformatics，RCSB)蛋白质数据库中的序列相比较。基于具有最高序列同源性的VH和VL结构分别生成6F3和10B10的模型。

通过搜索IMGT/Domain Gap Align 3D结构数据库，即http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi，从与小鼠6F3和10B10抗体具有高同源性氨基酸序列的人抗体生殖系中选出将移植小鼠6F3和10B10抗体VH和VL中的互补决定区(CDR)的模板人抗体。对于6F3，选定的模板人VH是IGHV1-46*01和IGHJ4*01的组合，并且选定的模板人VL是IGKV1-NL1*01和IGKJ4*01的组合。对于10B10，选定的模板人VH是IGHV4-30-4*07和IGHJ1*01的组合，并且选定的模板人VL是IGKV1-33*01和IGKJ4*01的组合。

分别用鼠类6F3和10B10抗体的CDR取代前述模板人抗体的CDR氨基酸序列。此外，用来自小鼠6F3和10B10抗体VH和VL的所需氨基酸序列移植上文提到的模板人抗体VH和VL的框架以得到功能性人源化抗体。对于6F3和10B10的VH和VL，使前述模板人抗体框架氨基酸的若干位点回复突变成小鼠6F3和10B10抗体中的相应氨基酸序列。为了使6F3抗体轻链可变区人源化，使48位的氨基酸从Leu(L)突变成Val(V)；并且为了使6F3抗体重链可变区人源化，使48位的氨基酸从Met(M)突变成Ile(I)，67位的氨基酸从Val(V)突变成Ala(A)，69位的氨基酸从Met(M)突变成Leu(L)，71位的氨基酸从Arg(R)突变成Ala(A)，73位的氨基酸从Thr(T)突变成Lys(K)，78位的氨基酸从Val(V)突变成Ala(A)，并且93位的氨基酸从Ala(A)突变成Thr(T)。对于人源化10B10抗体的轻链可变区，第4位的氨基酸从Met(M)突变成Leu(L)，且71位的氨基酸从Phe(F)突变成Tyr(Y)；并且对于人源化10B10抗体的重链可变区，27位的氨基酸从Gly(G)突变成Tyr(Y)，30位的氨基酸从Ser(S)突变成Thr(T)，48位的氨基酸从Ile(I)突变成Met(M)，67位的氨基酸从Val(V)突变成Ile(I)，并且71位的氨基酸从Val(V)突变成Arg(R)。

人源化6F3抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别显示为SEQ ID NO:33和35。编码所述重链和轻链可变区的DNA序列分别显示为SEQ ID NO:34和36。人源化10B10抗体的可变轻链和可变重链的氨基酸序列分别显示为SEQ ID NO:37和39。编码所述氨基酸序列的DNA碱基序列分别显示为SEQ ID NO:38和40。

产生人源化6F3或10B10抗体的IgG1同型(h6F3-IgG1和h10B10-IgG1)。h6F3-IgG1(SEQ ID NO:41和43)、h10B10-IgG1(SEQ ID NO:45和47)的全长重链和轻链氨基酸序列提供于上表4中。

人源化6F3和10B10抗体的构建和表达

合成编码人源化6F3和10B10抗体轻链和重链的DNA并将其克隆至表达载体pcDNA3.1(Invitrogen，目录号：V-790)中。用100μg所述人源化重链和轻链表达质粒分别转染Freestyle 293细胞(200mL，10⁶个/mL)并培养6天。接着，用蛋白质-G柱(GE healthcare)纯化上清液中的人源化抗体。

实施例9

表征人源化抗CTLA4抗体的结合活性和结合特异性以及配体阻断活性

在产生和纯化人源化6F3-hIgG1和10B10-hIgG1抗体之后，使用基于ELISA的结合和CTLA4/CD80阻断分析，以及基于FACS的结合和CTLA4/CD80阻断分析测定抗体的结合和特异性。所用方法类似于以上在实施例4中描述的方法。

图5(上栏)分别展现了人源化6F3和10B10抗体的CTLA4结合曲线。图5的下栏显示了由ELISA结合数据计算的各测试抗体的EC50，并且展示人源化6F3和10B10抗体可以与CTLA4结合。相比之下，hIgG1同型对照抗体未展现任何CTLA4结合。

类似地，在基于FACS的结合分析中，人源化6F3和10B10抗体(图6，上栏)都展示与CTLA4的较强结合。由FACS结合数据计算的人源化6F3和10B10抗体的EC50分别示于图6的下栏中。

图7(上栏)分别显示了基于ELISA进行的人源化6F3抗体和人源化10B10抗体的配体阻断分析的结果。对各人源化抗体的IC50的定量示于图7的下栏中。

图8显示，如通过基于FACS的配体阻断分析所测量，人源化6F3抗体和人源化10B10抗体都阻断CTLA4与CD80的结合。图8的下栏提供了各人源化抗体的IC50。

表11.基于ELISA测定的人源化抗CTLA4抗体的结合EC50

ng/ml	6F3	10B10
			EC50	2.012	2.932

表12.基于ELISA测定的人源化抗CTLA4抗体的阻断IC50

ng/ml	6F3	10B10
			IC50	295.1	284.9

表13.基于FACS测定的人源化抗CTLA4抗体的结合EC50

ng/ml	6F3	10B10
			EC50	2335	5279

表14.基于FACS测定的人源化抗CTLA4抗体的阻断IC50

ng/ml	6F3	10B10
			IC50	435.1	25.27

实施例10

人源化6F3和10B10抗体的Biacore动力学分析

如实施例5中所描述，利用Biacore3000测量CTLA4与人源化CTLA4抗体之间的结合动力学。解离常数KD是根据关系式KD＝kd/ka，由所测定的速率常数计算。如表15中所示，人源化抗CTLA4抗体6F3和10B10以与其鼠源对应抗体类似的亲和力结合人CTLA4。

表15.人源化抗CTLA4抗体与CTLA4的结合动力学。

	ka(1/Ms)	kd(1/s)	Kd(M)	Chi2
					6F3	2.95E+05	1.30E-04	4.41E-10	0.27
10B10	4.14E+05	1.13E-04	2.73E-10	0.79

实施例11

人源化抗CTLA4抗体对PBMC产生细胞因子的影响

如实施例6中所描述，通过人源化CTLA4抗体对阻断淋巴细胞效应细胞中的CTLA4信号传导途径的影响来评估该抗体的活性。本研究的结果提供于图11(IL-2分泌)和图12(IFN-γ分泌)中，展示了抗CTLA4单克隆抗体6F3和10B10可以促进IFN-γ和IL-2分泌。相比之下，含有同型对照抗体的培养物未显示IFN-γ或IL-2分泌的增加。

实施例12

人源化CTLA4抗体对肿瘤生长抑制的影响

使用CTLA4HuGEMM评价人源化10B10抗体的体内抗肿瘤活性，CTLA4HuGEMM是一类在C57BL/6小鼠中具有含人源化外显子2和外显子3的嵌合人/小鼠CTLA4基因的基因工程改造小鼠模型(GEMM)。在每只小鼠的右后侧腹皮下接种MC38小鼠结肠腺癌细胞(1×10⁶个)以产生肿瘤。当平均肿瘤尺寸达到约75mm³时，基于小鼠的肿瘤尺寸对小鼠随机地分组并在同一天开始抗体治疗。用PBS将同型对照和测试抗体新鲜配制成1mg/mL，并每周两次(BIW)以10mg/kg通过腹腔注射(i.p.)给药小鼠，持续3周。每周两次测量肿瘤尺寸和体重，并以(1-(治疗组中第21天肿瘤体积-第0天肿瘤体积/对照组中第21天肿瘤体积-第0天肿瘤体积)×100％)计算肿瘤生长抑制(TGI)。

如图13中所示，第2组中的人源化抗CTLA4抗体10B10产生显著抗肿瘤活性(p<0.001)且在第21天其TGI是84.85％。

虽然已经参照具体实施方式(其中一些是优选实施方式)具体地描述并显示了本公开，但本领域的技术人员应理解，可以在不脱离本文所公开的本公开的精神和范围内对本公开进行各种形式上和细节上的改变。

序列表

<110> 中美冠科生物技术（太仓）有限公司

<120> 新型抗CTLA4抗体

<130> 061557-8017WO01

<160> 54

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 123

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 1

Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Met Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Gly Ala Arg Ala Thr Val Tyr Asn Tyr Val Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 369

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 2

caggtcaagc tgcaggagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg 60

tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaaa tgcactggat gaagcagaca 120

cctgtgcatg gcctggaatg gattggagtt attgatcctg aaactggtgg tattacctac 180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atggagttcc tcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aagacgggga 300

gctcgggcta ccgtatataa ctatgttatg gactattggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 3

Asp Tyr Glu Met His

1 5

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 4

gactatgaaa tgcac 15

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 5

Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 6

gttattgatc ctgaaactgg tggtattacc tacaatcaga agttcaaggg c 51

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 7

Arg Gly Ala Arg Ala Thr Val Tyr Asn Tyr Val Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 8

cggggagctc gggctaccgt atataactat gttatggact at 42

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 9

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Arg Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Gly Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 10

<211> 321

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 10

gacattgtga tgacccagac tacagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaatattcac aattatttag catggtatca acagaaacag 120

ggaagatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct taggagatgg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 240

gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 11

Arg Ala Ser Glu Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 12

cgagcaagtg agaatattca caattattta gca 33

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 13

Asn Ala Lys Thr Leu Gly Asp

1 5

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 14

aatgcaaaaa ccttaggaga t 21

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 15

Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr

1 5

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 16

caacattttt ggagtactcc gtggacg 27

<210> 17

<211> 119

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 17

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Arg Phe Asp Gly Asn Asn Asn Tyr Asn Pro Phe Leu

50 55 60

Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Glu Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Gly Thr Trp Gly Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 357

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 18

gatgtacagc ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgacac cttctcagtc tctgtctctc 60

acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt cctggaactg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacataaggt tcgacggtaa caataactac 180

aacccatttc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctgagaa ccagtttttc 240

ctgaagttga attctgtgac tactgaggac acagctacat attactgtgc aagaaactat 300

ggtacctggg gggctatgga cttctggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 19

Ser Gly Tyr Ser Trp Asn

1 5

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 20

agtggttatt cctggaac 18

<210> 21

<211> 16

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 21

Tyr Ile Arg Phe Asp Gly Asn Asn Asn Tyr Asn Pro Phe Leu Lys Asn

1 5 10 15

<210> 22

<211> 48

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 22

tacataaggt tcgacggtaa caataactac aacccatttc tcaaaaat 48

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 23

Asn Tyr Gly Thr Trp Gly Ala Met Asp Phe

1 5 10

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 24

aactatggta cctggggggc tatggacttc 30

<210> 25

<211> 106

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 25

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Met Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Asn Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Asn Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Met Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 26

<211> 318

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 26

gatattgtgc tgacacagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 60

atcacttgca agacaagcca agacattaat aaatatatgg cttggtacca acacaagcct 120

ggaaaaggtc ctaggctgct catatattac acatctatat tacagccggg catcccatcc 180

aggttcagtg gaagtgggtc tgggacagat tattccttca gcatcaacaa cctggagcct 240

gaagatattg caacttatta ttgtcaacag tatgataatc tgaacacatt cggagggggg 300

accatgttgg aaataaag 318

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 27

Lys Thr Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Met Ala

1 5 10

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 28

aagacaagcc aagacattaa taaatatatg gct 33

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 29

Tyr Thr Ser Ile Leu Gln Pro

1 5

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 30

tacacatcta tattacagcc g 21

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 31

Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Asn Thr

1 5

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 32

caacagtatg ataatctgaa caca 24

<210> 33

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Gly Ala Arg Ala Thr Val Tyr Asn Tyr Val Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 34

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 34

caggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaagaagc caggcagctc cgtgaaggtg 60

tcttgtaagg ccagcggcta caccttcaca gactatgaga tgcactgggt gcggcaggca 120

ccaggacagg gactggagtg gatcggcgtg atcgatcctg agaccggcgg catcacatac 180

aaccagaagt ttaagggcag ggccaccctg acagccgaca agagcacctc cacagcctat 240

atggagctgt ctagcctgag gtccgaggat accgccgtgt actattgcac acggagaggc 300

gccagagcca ccgtgtacaa ttatgtgatg gactactggg gccagggcac cctggtgaca 360

gtctcgagc 369

<210> 35

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Gly Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 36

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 36

gacatccaga tgacacagtc ccctagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgta gagcctctga gaacatccac aattacctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct ggtgtacaac gcaaagaccc tgggcgacgg agtgccatct 180

cggttcagcg gatccggatc tggcacagac tataccctga caatctctag cctgcagcca 240

gaggattttg ccacctacta ttgccagcac ttctggagca ccccctggac atttggcggc 300

ggcaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 37

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 37

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Arg Phe Asp Gly Asn Asn Asn Tyr Asn Pro Phe Leu

50 55 60

Lys Asn Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Gly Thr Trp Gly Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 38

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 38

caggtgcagc tgcaggagtc cggaccagga ctggtgaagc catctcagac cctgagcctg 60

acatgtgccg tgtccggcta ctctatcacc agcggctatt cctggaattg gatcaggcag 120

ccacctggca agggactgga gtggatgggc tacatccgct tcgatggcaa caataactat 180

aatccctttc tgaagaaccg gatcaccatc tccagagaca catctaagaa tcagttctcc 240

ctgaagctga gctccgtgac cgcagcagat acagccgtgt actattgcgc aaggaactac 300

ggaacatggg gagcaatgga cttttggggc cagggcaccc tggtgacagt ctcgagc 357

<210> 39

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 39

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Asn Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 40

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 40

gacatccagc tgacccagtc ccctagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga cagggtgacc 60

atcacctgta agacatctca ggatatcaac aagtacatgg cctggtatca gcagaagcca 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctactat acctctatcc tgcagcccgg cgtgcctagc 180

agattcagcg gctccggctc tggcaccgat tacaccttta caatctctag cctgcagccc 240

gaggacatcg ccacatacta ttgccagcag tatgataacc tgaatacctt tggcggcggc 300

acaaaggtgg agatcaag 318

<210> 41

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Gly Ala Arg Ala Thr Val Tyr Asn Tyr Val Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 42

<211> 1359

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 42

caggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaagaagc caggcagctc cgtgaaggtg 60

tcttgtaagg ccagcggcta caccttcaca gactatgaga tgcactgggt gcggcaggca 120

ccaggacagg gactggagtg gatcggcgtg atcgatcctg agaccggcgg catcacatac 180

aaccagaagt ttaagggcag ggccaccctg acagccgaca agagcacctc cacagcctat 240

atggagctgt ctagcctgag gtccgaggat accgccgtgt actattgcac acggagaggc 300

gccagagcca ccgtgtacaa ttatgtgatg gactactggg gccagggcac cctggtgaca 360

gtctcgagcg cctccaccaa gggcccatcc gtgttccctc tggcaccctc cagcaagagc 420

acaagcggag gcaccgccgc actgggctgc ctcgtgaagg actacttccc agaacccgtg 480

accgtcagct ggaatagcgg cgctctgacc agcggagtcc acactttccc cgcagtgctg 540

cagtccagcg gcctgtacag cctgagcagc gtggtcactg tgccaagcag cagcctgggc 600

actcagacct acatctgcaa cgtcaaccac aagcccagca acacaaaggt ggacaagagg 660

gtcgagccca agtcctgcga taagacccac acctgccctc catgtcccgc ccccgagctg 720

ctgggaggac ccagcgtctt cctgtttccc cccaagccaa aggacaccct gatgatcagc 780

aggacccccg aagtgacctg cgtcgtggtg gacgtgagcc acgaagatcc cgaggtgaag 840

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaagtg cacaacgcca agacaaaacc cagggaggag 900

cagtataaca gcacctacag ggtcgtgagc gtcctgaccg tgctgcacca agactggctg 960

aacggcaagg agtataagtg caaggtgagc aacaaggcac tgcccgcccc catcgagaag 1020

accatttcca aggccaaggg gcaacctagg gagccacagg tctacactct gccccctagc 1080

agggacgagc tgaccaagaa ccaggtctcc ctgacttgcc tggtgaaggg gttttatccc 1140

agcgacatcg ccgtcgagtg ggagagcaat ggccagcccg aaaacaacta caagaccaca 1200

ccccctgtgc tggacagcga cggcagcttc tttctgtata gcaaactgac agtggataag 1260

agcagatggc agcagggcaa cgtgttctcc tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaat 1320

cactacaccc agaagtccct gagcctgagc cccggcaaa 1359

<210> 43

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Gly Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 44

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 44

gacatccaga tgacacagtc ccctagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60

atcacatgta gagcctctga gaacatccac aattacctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct ggtgtacaac gcaaagaccc tgggcgacgg agtgccatct 180

cggttcagcg gatccggatc tggcacagac tataccctga caatctctag cctgcagcca 240

gaggattttg ccacctacta ttgccagcac ttctggagca ccccctggac atttggcggc 300

ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgcaccaa gcgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagctttaac agaggcgagt gctga 645

<210> 45

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 45

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Arg Phe Asp Gly Asn Asn Asn Tyr Asn Pro Phe Leu

50 55 60

Lys Asn Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Gly Thr Trp Gly Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 46

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 46

caggtgcagc tgcaggagtc cggaccagga ctggtgaagc catctcagac cctgagcctg 60

acatgtgccg tgtccggcta ctctatcacc agcggctatt cctggaattg gatcaggcag 120

ccacctggca agggactgga gtggatgggc tacatccgct tcgatggcaa caataactat 180

aatccctttc tgaagaaccg gatcaccatc tccagagaca catctaagaa tcagttctcc 240

ctgaagctga gctccgtgac cgcagcagat acagccgtgt actattgcgc aaggaactac 300

ggaacatggg gagcaatgga cttttggggc cagggcaccc tggtgacagt ctcgagcgcc 360

tccaccaagg gcccatccgt gttccctctg gcaccctcca gcaagagcac aagcggaggc 420

accgccgcac tgggctgcct cgtgaaggac tacttcccag aacccgtgac cgtcagctgg 480

aatagcggcg ctctgaccag cggagtccac actttccccg cagtgctgca gtccagcggc 540

ctgtacagcc tgagcagcgt ggtcactgtg ccaagcagca gcctgggcac tcagacctac 600

atctgcaacg tcaaccacaa gcccagcaac acaaaggtgg acaagagggt cgagcccaag 660

tcctgcgata agacccacac ctgccctcca tgtcccgccc ccgagctgct gggaggaccc 720

agcgtcttcc tgtttccccc caagccaaag gacaccctga tgatcagcag gacccccgaa 780

gtgacctgcg tcgtggtgga cgtgagccac gaagatcccg aggtgaagtt caactggtac 840

gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag acaaaaccca gggaggagca gtataacagc 900

acctacaggg tcgtgagcgt cctgaccgtg ctgcaccaag actggctgaa cggcaaggag 960

tataagtgca aggtgagcaa caaggcactg cccgccccca tcgagaagac catttccaag 1020

gccaaggggc aacctaggga gccacaggtc tacactctgc cccctagcag ggacgagctg 1080

accaagaacc aggtctccct gacttgcctg gtgaaggggt tttatcccag cgacatcgcc 1140

gtcgagtggg agagcaatgg ccagcccgaa aacaactaca agaccacacc ccctgtgctg 1200

gacagcgacg gcagcttctt tctgtatagc aaactgacag tggataagag cagatggcag 1260

cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaatca ctacacccag 1320

aagtccctga gcctgagccc cggcaaa 1347

<210> 47

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 47

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Asn Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 48

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 48

gacatccagc tgacccagtc ccctagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga cagggtgacc 60

atcacctgta agacatctca ggatatcaac aagtacatgg cctggtatca gcagaagcca 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctactat acctctatcc tgcagcccgg cgtgcctagc 180

agattcagcg gctccggctc tggcaccgat tacaccttta caatctctag cctgcagccc 240

gaggacatcg ccacatacta ttgccagcag tatgataacc tgaatacctt tggcggcggc 300

acaaaggtgg agatcaagcg tacggtggcc gcaccaagcg tcttcatctt cccgccatct 360

gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420

agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480

agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540

agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600

agctcgcccg tcacaaagag ctttaacaga ggcgagtgct ga 642

<210> 49

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 49

aaagcaatgc acgtggccca gcctgctgtg gtactggcca gcagccgagg catcgccagc 60

tttgtgtgtg agtatgcatc tccaggcaaa gccactgagg tccgggtgac agtgcttcgg 120

caggctgaca gccaggtgac tgaagtctgt gcggcaacct acatgacggg gaatgagttg 180

accttcctag atgattccat ctgcacgggc acctccagtg gaaatcaagt gaacctcact 240

atccaaggac tgagggccat ggacacggga ctctacatct gcaaggtgga gctcatgtac 300

ccaccgccat actacctggg cataggcaac ggaacccaga tttatgtaat tgatccagaa 360

ccgtgcccag attctgacca tcatcaccac catcac 396

<210> 50

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 50

Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg

1 5 10 15

Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr

20 25 30

Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu

35 40 45

Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Thr Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp

50 55 60

Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr

65 70 75 80

Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val

85 90 95

Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr

100 105 110

Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp His His

115 120 125

His His His His

130

<210> 51

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 51

aaagcaatgc acgtggccca gcctgctgtg gtactggcca gcagccgagg catcgccagc 60

tttgtgtgtg agtatgcatc tccaggcaaa gccactgagg tccgggtgac agtgcttcgg 120

caggctgaca gccaggtgac tgaagtctgt gcggcaacct acatgacggg gaatgagttg 180

accttcctag atgattccat ctgcacgggc acctccagtg gaaatcaagt gaacctcact 240

atccaaggac tgagggccat ggacacggga ctctacatct gcaaggtgga gctcatgtac 300

ccaccgccat actacctggg cataggcaac ggaacccaga tttatgtaat tgatccagaa 360

ccgtgcccag attctgacgc caaaaccaca gccccctccg tgtatcctct ggctcccgtc 420

tgcggagaca caaccggcag ctccgtcaca ctgggctgtc tcgtcaaggg ctacttcccc 480

gagcctgtca cactgacctg gaactccggc tccctgtcct ccggagtgca taccttcccc 540

gccgtgctcc aatccgatct gtacacactc tccagcagcg tcaccgtgac ctccagcacc 600

tggcctagcc agagcatcac ctgcaatgtg gcccaccctg ccagcagcac caaggtggac 660

aagaagatcg agcctagggg ccccaccatt aaaccctgcc ccccttgcaa atgccctgct 720

cccaacctcc tcggcggacc ttccgtgttc attttccccc ccaagatcaa ggacgtgctc 780

atgatctccc tgagccctat cgtcacctgt gtggtcgtgg atgtgtccga agatgatccc 840

gacgtgcaga tctcctggtt cgtcaacaat gtggaggtgc acacagccca gacccagacc 900

cacagggagg attataactc caccctgagg gtcgtcagcg ctctccccat ccagcaccag 960

gactggatga gcggcaagga gttcaaatgc aaggtcaata ataaggacct gcccgccccc 1020

atcgagagga ccattagcaa acccaagggc agcgtcaggg ctccccaagt gtacgtgctg 1080

cctccccctg aggaggagat gaccaaaaag caggtcacac tcacctgcat ggtcaccgac 1140

ttcatgcccg aagatatcta cgtcgagtgg accaataacg gaaagacaga gctcaactac 1200

aagaataccg agcctgtcct ggacagcgac ggcagctact tcatgtacag caagctgagg 1260

gtcgagaaga aaaactgggt ggagaggaac agctacagct gttccgtggt ccacgagggc 1320

ctgcataacc accacaccac caaatccttc tccagaaccc ccggcaag 1368

<210> 52

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 52

Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg

1 5 10 15

Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr

20 25 30

Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu

35 40 45

Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Thr Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp

50 55 60

Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr

65 70 75 80

Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val

85 90 95

Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr

100 105 110

Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Ala Lys

115 120 125

Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr

130 135 140

Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser

180 185 190

Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys

195 200 205

Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu

210 215 220

Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala

225 230 235 240

Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile

245 250 255

Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val

275 280 285

Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln

305 310 315 320

Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp

325 330 335

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val

340 345 350

Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr

355 360 365

Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu

370 375 380

Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr

385 390 395 400

Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr

405 410 415

Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr

420 425 430

Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys

435 440 445

Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

450 455

<210> 53

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 53

aaagcaatgc acgtggccca gcctgctgtg gtactggcca gcagccgagg catcgccagc 60

tttgtgtgtg agtatgcatc tccaggcaaa gccactgagg tccgggtgac agtgcttcgg 120

caggctgaca gccaggtgac tgaagtctgt gcggcaacct acatgacggg gaatgagttg 180

accttcctag atgattccat ctgcacgggc acctccagtg gaaatcaagt gaacctcact 240

atccaaggac tgagggccat ggacacggga ctctacatct gcaaggtgga gctcatgtac 300

ccaccgccat actacctggg cataggcaac ggaacccaga tttatgtaat tgatccagaa 360

ccgtgcccag attctgacgg taccagatct agagagccca aatcttctga caaaactcac 420

acatgcccac cgtgcccagc acctgaattc gagggtgcac cgtcagtctt cctcttcccc 480

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggactcctg aggtcacatg cgtggtggtg 540

gacgtaagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 600

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 660

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 720

aacaaagccc tcccaacccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 780

gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 840

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 900

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 960

ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1020

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1080

ccgggtaaa 1089

<210> 54

<211> 363

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 54

Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg

1 5 10 15

Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr

20 25 30

Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu

35 40 45

Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Thr Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp

50 55 60

Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr

65 70 75 80

Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val

85 90 95

Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr

100 105 110

Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gly Thr

115 120 125

Arg Ser Arg Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

130 135 140

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

145 150 155 160

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

165 170 175

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

180 185 190

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

195 200 205

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

210 215 220

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

225 230 235 240

Asn Lys Ala Leu Pro Thr Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

245 250 255

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

260 265 270

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

275 280 285

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

290 295 300

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

305 310 315 320

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

325 330 335

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

340 345 350

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355 360

Claims (31)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包括选自以下组的重链CDR序列：SEQ ID NO:3、5、7、19、21和23。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包括选自以下组的轻链CDR序列：SEQID NO:11、13、15、27、29和31。

3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包括选自以下组的重链可变区：

a)包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:7的重链可变区；和

b)包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和/或SEQ ID NO:23的重链可变区。

4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包括选自以下组的轻链可变区：

a)包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:15的轻链可变区；和

b)包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和/或SEQ ID NO:31的轻链可变区。

5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包括：

a)包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:7的重链可变区；和包含SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:15的轻链可变区；或

b)包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和/或SEQ ID NO:23的重链可变区；和包含SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:29和/或SEQ ID NO:31的轻链可变区。

6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包括选自以下组的重链可变区：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37以及与其具有至少80％序列同一性的同源序列。

7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包括选自以下组的轻链可变区：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39以及与其具有至少80％序列同一性的同源序列。

8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包括：

a)包含SEQ ID NO:1的重链可变区和包含SEQ ID NO:9的轻链可变区；

b)包含SEQ ID NO:17的重链可变区和包含SEQ ID NO:25的轻链可变区；

c)包含SEQ ID NO:33的重链可变区和包含SEQ ID NO:35的轻链可变区；

d)包含SEQ ID NO:37的重链可变区和包含SEQ ID NO:39的轻链可变区；

e)与a)、b)、c)或d)具有至少80％序列同一性的重链可变区和轻链可变区。

9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过10^-9M的KD值特异性结合至人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA4)蛋白质，所述KD值是通过表面等离子体共振结合分析测量。

10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以不超过10^-8M或不超过10^-9M的KD值结合至猴CTLA4。

11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过600ng/ml或不超过300ng/ml的IC50抑制人CTLA4与其配体的结合，所述IC50是通过ELISA分析测量。

12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过30ng/ml或不超过3ng/ml的EC50结合至人CTLA4，所述EC50是通过ELISA分析测量。

13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过600ng/ml或不超过30ng/ml的IC50抑制人CTLA4与其配体的结合，所述IC50是通过FACS分析测量。

14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过6000ng/ml、不超过2400ng/ml、1200ng/ml或不超过400ng/ml的EC50结合至人CTLA4，所述EC50是通过FACS分析测量。

15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是人源化单克隆抗体。

16.根据权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化单克隆抗体是由宿主细胞产生的。

17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

18.一种抗体或其抗原结合片段，其与根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争相同表位。

19.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是骆驼化单域抗体、双功能抗体、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、二硫键稳定的双功能抗体、纳米抗体、域抗体或双价域抗体。

20.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，还包括缀合物。

21.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

22.一种载体，包括根据权利要求21所述的分离的多核苷酸。

23.一种宿主细胞，包括根据权利要求22所述的载体。

24.一种表达根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，包括在使根据权利要求21所述的多核苷酸表达的条件下，培养根据权利要求23所述的宿主细胞。

25.一种试剂盒，包括根据权利要求1至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

26.一种治疗个体中由CTLA4介导的疾病的方法，包括：向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述个体已被鉴别为患有可能对CTLA4抑制剂起反应的病症或病况。

28.根据权利要求26所述的方法，其中所述疾病是癌症。

29.一种药物组合物，包括根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的载体。

30.根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的用途，其是用于制备供治疗可受益于免疫反应上调的病况用的药物。

31.根据权利要求30所述的用途，其中所述病况是癌症。