CN116731193A - 重组蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种重组蛋白及其应用，该重组蛋白包括：下列中的至少之一：D4‑2、C25、TPP‑1、PPL‑C和ERY2‑4，所述D4‑2的C端与所述C25的N端相连，所述C25的C端与所述TPP‑1的N端相连，所述TPP‑1的C端与所述PPL‑C的N端相连，所述PPL‑C的C端与所述ERY2‑4的N端相连。本发明所制备的重组蛋白可以有效解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，可以有效治疗或预防癌症，抗肿瘤效果得到显著提升。

Description

重组蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，涉及重组蛋白及其应用，更具体地，涉及重组蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、组合物、所述重组蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物在制备药物中的用途、药物。
背景技术
免疫检查点抑制剂(如抗CTLA-4、抗PD-1/PD-L1、抗LAG-3、抗CD47/SIRPα)靶向天然免疫稳态途径驱使更强的免疫应答对抗肿瘤，已成为一线晚期肿瘤的治疗策略，免疫检查点的封锁将克服肿瘤微环境中的免疫耐受性并增强抗肿瘤免疫力，诱发持续的肿瘤缓解。因此阻断抑制性信号，重新激活免疫功能已成为治疗癌症的有效手段，2011年，美国FDA批准CTLA-4抗体用于黑色素瘤的治疗，2014年批准PD-1抗体用于黑色素瘤及其它癌症治疗。虽然免疫阻断疗法具有特异性强、稳定性高的优势，但长期注射治疗易诱导机体产生抗抗体及补体介导的细胞毒作用：ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)及CDC(补体依赖的细胞毒作用)效应，其非特异性激活免疫***引起的离散毒性则会引起相应器官出现炎症症状，称之为免疫相关不良反应(immune-related adverse events，irAEs)，irAEs可涉及多***、多器官，发生时间无规律、治疗期间或治疗停止后的任何时间段都会发生，因此对irAEs的早期处理和护理是免疫检查点抑制剂安全使用的重要内容。
此外，在肿瘤微环境中也存在多种免疫抑制机制，即便阻断PD-L1、CTLA-4通路也不足以重新恢复免疫***。虽然PD-1或PD-L1抗体改变了许多晚期癌症患者的格局，包括黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、肾癌等取得了良好的长期效果。然而仅对部分患者有效，且可能产生毒性作用。同时，基因疗法虽然是治疗遗传疾病的潜在有效方法，但基因治疗的寡核苷酸和质粒DNA其大小、电荷和稳定性等因素不能被细胞有效的吸收，会严重影响疗效。因此，仍需进一步研发针对肿瘤免疫抑制的产品。
发明内容
本申请旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种商业选择。
本申请中，发明人设计了多种针对肿瘤模型的外源性注射蛋白，经过大量实验筛选后，获得优势重组蛋白，所述重组蛋白可以有效解决免疫应答抑制等问题，且相较于短肽具有体内半衰期较长的特点。更进一步地，发明人将所述编码所述重组蛋白的基因组装入肿瘤特异性T细胞，T细胞在肿瘤组织中持续表达分泌免疫检查点抑制性短肽，有效避免了短肽注射的组织穿透不足的问题，且避免了全身免疫***激活，对肿瘤患者有着非常重要的受益作用。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组蛋白。根据本发明的实施例，包括下列中的至少两种：D4-2、C25、TPP-1、PPL-C和ERY2-4。发明人通过大量实验对多种免疫检查点抑制肽进行重新组合和筛选，获得了多种优势重组蛋白，根据本发明实施例的所述重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，能够有效解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，可以有效治疗或预防癌症，抗肿瘤效果得到显著提升。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码第一方面所述的重组蛋白。根据本发明实施例的核酸编码的重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，能够有效解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，可以有效治疗或预防癌症，抗肿瘤效果得到显著提升。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体包括：第二方面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列，这些控制序列可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述重组蛋白，所述重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，能够有效解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，可以有效治疗或预防癌症，抗肿瘤效果得到显著提升。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备第一方面所述的重组蛋白的方法。根据本发明的实施例，包括：将第三方面所述的表达载体导入到细胞中；将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组蛋白。根据本发明实施例的方法所获得的重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，能够有效解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，可以有效治疗或预防癌症，抗肿瘤效果得到显著提升。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体或表达第一方面所述的重组蛋白。根据本发明实施例的重组细胞在一定条件下表达分泌所获得的重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，可以有效解决免疫应答抑制的问题，且所述重组蛋白相较于免疫检查点抑制短肽具有更长的体内半衰期，可以有效治疗或预防癌症，抗肿瘤效果得到显著提升。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，包括：第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞。如前所述，根据本发明实施例的重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，能够有效解决免疫应答抑制的问题，且所述重组蛋白相较于免疫检查点抑制短肽具有更长的体内半衰期，因此，包含所述重组蛋白的组合物，如食品组合物、药物组合物等，同样可以有效解决免疫应答抑制的问题，且在体内的有效作用时间更长，可以有效治疗或预防癌症，具有显著的治疗或预防肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防癌症。根据本发明实施例的的重组蛋白、利用核酸、表达载体、重组细胞获得的重组蛋白或组合物中的部分蛋白在一定条件下可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，能够有效解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，可以有效治疗或预防癌症，抗肿瘤效果得到显著提升。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物包括：第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物。如前所述，本发明实施例的重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，进而可解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，因此，包含所述重组蛋白及其相关一系列物质的药物同样具有显著的治疗或预防癌症的作用。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种免疫效应细胞。根据本发明的实施例，所述免疫效应细胞携带前面所述的核酸分子、表达载体或表达前面所述的重组蛋白。根据本发明的具体实施例，所述效应细胞具有肿瘤特异性，T细胞在肿瘤组织中可以持续高表达并分泌免疫检查点抑制肽，有效避免了肽段注射的组织穿透不足的问题，且仅在肿瘤细胞表面进行表达，避免了全身免疫***激活，抗肿瘤效果显著，且具有较高的安全性、副作用较小。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种治疗或预防癌症的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括给予受试者前面所述的重组蛋白、表达载体、重组细胞、免疫效应细胞、组合物或药物。如前所述，本发明实施例的重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，进而可解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，因此，将所述重组蛋白及与其相关的一系列物质给予受试者，同样具有显著的治疗或预防癌症的作用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的重组蛋白Blockine及融合型Blockine(Fusion-Blockine)结构示意图，其中，n表示第n个免疫检查点抑制肽，n为正整数；
图2是根据本发明实施例的通过流式检测EGFP表达以鉴定Blockine、Fusion-Blockine对OT-1T细胞工程化改造的效率结果图；
图3是根据本发明实施例的通过针对HA标签的Dot-blot，鉴定OT-1T细胞分泌表达的Blockine-4的结果图；
图4是根据本发明实施例的蛋白Blockine1-6及Fusion-Blockine对肿瘤小鼠模型肿瘤生长的检测结果图，其中，Control表示对照组；以及
图5是根据本发明实施例的重组蛋白Fusion-Blockine-S、Fusion-Blockine-1～4对肿瘤小鼠模型肿瘤生长的检测结果图，其中，Control表示对照组。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组蛋白，包括下列中的至少两种：D4-2、C25、TPP-1、PPL-C和ERY2-4。发明人通过大量实验对多种免疫检查点抑制肽进行重新组合和筛选，获得了多种优势重组蛋白，所述重组蛋白可以有效解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，可以有效治疗或预防癌症，抗肿瘤效果得到显著提升。
根据本发明的一些具体实施例，上述重组蛋白还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述重组蛋白包括D4-2、C25、TPP-1、PPL-C和ERY2-4。
根据本发明的一些具体实施例，所述D4-2的C端与所述C25的N端相连，所述C25的C端与所述TPP-1的N端相连，所述TPP-1的C端与所述PPL-C的N端相连，所述PPL-C的C端与所述ERY2-4的N端相连。发明人通过大量实验对多种免疫检查点抑制肽进行重新组合和筛选，获得了多种优势重组蛋白，其中，当所述D4-2的C端与所述C25的N端相连，所述C25的C端与所述TPP-1的N端相连，所述TPP-1的C端与所述PPL-C的N端相连，所述PPL-C的C端与所述ERY2-4的N端相连时，获得的重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，能够有效解决免疫应答抑制的问题，且所述重组蛋白相较于单独的短肽D4-2、C25、TPP-1、PPL-C或ERY2-4具有更长的体内半衰期，可以有效治疗或预防癌症，抗肿瘤效果得到极显著的提升。
根据本发明的一些具体实施例，包括SEQ ID NO:30示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列具有至少95％、90％、85％同一性的氨基酸序列。
Fusion-Blockine S具有如下所示的氨基酸序列：
YASYHCWCWRDPGRSAAWGQAILEGELAWLEGGGGGAGQLADLKRQLAWWKQAAKDWSISARYSAVYSIHPSWAVPMTYRAAVSVSHFQKVWVV(SEQ ID NO：30)。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸，所述核酸编码第一方面所述的重组蛋白。根据本发明实施例的一些具体实施例提供的核酸编码的重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，能够有效解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，可以有效治疗或预防癌症，抗肿瘤效果得到显著提升。
根据本发明的一些具体实施例，上述核酸还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述核酸具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
编码Fusion-Blockine S的基因具有如下所示的核苷酸序列：
AAGGACTGGAGTATAAGCGCCCGATACTCCGCAGTATACAGTATCCATCCCTCATGGCAGTTCCAATGACCTATCGCGCCGCATACGCCAGCTACCACTGCTGGTGCTGGAGGGACCCCGGCAGGAGCGTCTCCGTGAGCCACTTCCAGAAGGTGTGGGGCAGCCTGGGGGCAGGCCATATTGGAAGGCGAGCTTGCATGGCTGGAGGGCGGGGGCGGCGGTGCTGGCCAACTGGCCGACCTGAAACGGCAGCTTGCTTGGTGGAAGCAAGCTGCA(SEQ ID NO：8)。
需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体，所述表达载体包括：第二方面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列，这些控制序列可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。本发明一些具体实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述重组蛋白，所述重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，能够有效解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，可以有效治疗或预防癌症，抗肿瘤效果得到显著提升。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备第一方面所述的重组蛋白的方法，包括：将第三方面所述的表达载体导入到细胞中；将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组蛋白。根据本发明一些具体实施例的方法所获得的重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，能够有效解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，可以有效治疗或预防癌症，抗肿瘤效果得到显著提升。
根据本发明的一些具体实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述细胞为真核细胞。
根据本发明的一些具体实施例，所述真核细胞为哺乳动物细胞。
根据本发明的一些具体实施例，所述哺乳动物细胞包括选自CHO-K1、CHOS、293F、293T、CAR-T、TCR-T、TIL、CAR-NK、CAR-M和CAR-DC中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例，所述哺乳动物细胞不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞，所述重组细胞携带第二方面所述的核酸，或第三方面所述的表达载体。根据本发明一些具体实施例的重组细胞在一定条件下分泌所获得的重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，能够有效解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，可以有效治疗或预防癌症，抗肿瘤效果得到显著提升。
需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞可以为包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞，包括T细胞、BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞，且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述重组蛋白表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合重组蛋白表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述重组蛋白表达的条件。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种组合物，包括：第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞。如前所述，根据本发明一些具体实施例的重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，因此，包含所述重组蛋白的组合物，如食品组合物、药物组合物等，同样可以有效解决免疫应答抑制的问题，且在体内的有效作用时间更长，可以有效治疗或预防癌症，具有显著的治疗或预防肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
需要注意的是，所述组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述组合物中所含的成分可以以整体施用于受试者，或者分开施用于受试者。当所述组合物中所含的成分分开地施用于受试者时，各个成分可以同时或依次施用于受试者。
在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防癌症。根据本发明一些具体实施例的的重组蛋白、利用核酸、表达载体、重组细胞获得的重组蛋白或组合物中的部分蛋白在一定条件下可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，进而有效解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，可以有效治疗或预防癌症，抗肿瘤效果得到显著提升。
根据本发明的一些具体实施例，上述药物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：胃癌、肠癌、头颈癌、黑色素瘤。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物，所述药物包括：第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物。如前所述，本发明实施例的重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，进而可解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，因此，包含所述重组蛋白将其相关一系列物质的药物同样具有显著的治疗或预防癌症的作用。
根据本发明的一些具体实施例，上述药物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：胃癌、肠癌、头颈癌、黑色素瘤。
根据本发明的一些具体实施例提供的药物，包括药学上可接受的载体和有效量的所述重组蛋白的活性成分。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞携带前面所述的核酸分子、表达载体或重组蛋白。根据本发明的具体实施例，所述免疫效应细胞具有肿瘤特异性，T细胞在肿瘤组织中可以持续高表达并分泌免疫检查点抑制肽，有效避免了肽段注射的组织穿透不足的问题，且仅在肿瘤细胞表面进行表达，避免了全身免疫***激活，抗肿瘤效果显著，且具有较高的安全性、副作用较小。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种治疗或预防癌症的方法，包括给予受试者前面所述的重组蛋白、表达载体、重组细胞、免疫效应细胞、组合物或药物。如前所述，本发明一些具体实施例的重组蛋白可以有效阻断表达免疫检查点PD-1/PD-L1、LAG-3、CTLA-4或CD47/SIRPα的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，进而可解决免疫应答抑制的问题，且相较于短肽具有更长的体内半衰期，因此，将所述重组蛋白及与其相关一系列物质的物质给予受试者，同样具有显著的治疗或预防癌症的作用。
下面将对实施例作具体介绍。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1表达载体的构建
本实施例中构建了Blockine及Fusion-Blockine的表达载体，具体的实验操作步骤如下：
表达载体的构建
1.1免疫检查点抑制肽的获得
发明人通过化学合成的方法获得编码免疫检查点抑制肽D4-2(Blockine1)、C25(Blockine2)、TPP-1(Blockine3)、PPL-C(Blockine4)、ERY2-4(Blockine5)的核苷酸序列，并利用上述核苷酸序列构建编码重组蛋白Fusion Blockine的核苷酸片段，分别为：FusionBlockine S:(D4-2)-(C25)-(TPP-1)-(PPL-C)-(ERY2-4)；Fusion Blockine 1:(TPP-1)-(ERY-2)-(D4-2)-(C25)-(PPL-C)；Fusion Blockine2:(PPL-C)-(D4-2)-(ERY2-4)-(C25)；Fusion Blockine 3:(TPP-1)-(D4-2)-(ERY2-4)-(PPL-C)-(C25)；Fusion Blockine 4:(C25)-(TPP-1)-(ERY2-4)-(D4-2)-(PPL-C)，上述物质具体的核苷酸序列如表1所示。
表1：
此外，发明人通过化学合成的方法获得编码人或小鼠IL-2分泌信号肽(SEQ IDNO:6)及HA(血凝素)(SEQ ID NO:7)标签的核苷酸序列，并将Blockine、Fusion Blockine分别与编码信号肽和标签的核苷酸序列进行连接，获得的核苷酸序列如表2所示：
表2：
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表2中所示核苷酸序列编码获得的Blockine、Fusion Blockine前体蛋白结构如图1所示，其中，Blockine、Fusion Blockine前体蛋白的N端与IL-2信号肽相连，C端与HA标签相连，信号肽帮助Blockine、Fusion Blockine蛋白进行定位，蛋白成熟后信号肽将水解脱离，因此，最终获得的Blockine、Fusion Blockine蛋白并不含有IL-2信号肽。
1.2表达载体的构建
将步骤1.1的表2中获得的携带编码IL-2信号肽和检测标签HA的Blockine及Fusion-Blockine的核苷酸序列分别通过同源重组利用BamH-1酶切连接至表达型逆转录病毒载体中(Addgene,#12282)。对获得的克隆载体进行测序，测序结果与预期一致。
实施例2重组蛋白的制备
从OT-I转基因小鼠的脾脏和***组织分离纯化CD8+T淋巴细胞，并进行激活，激活24小时后进行病毒转导；6小时后需更换含有20U/mL IL-2培养基继续培养，12小时后再次转导，为了提高转导效率，共进行4次病毒转导，期间需更换含有20U/mL IL-2培养基3次。更换新的培养基继续培养24小时后，利用流式分选分离工程改造T细胞。其中，T细胞分离、激活和病毒转导流程的具体操作步骤如下：
(1)包装逆转录病毒：利用PEI将实施例1获得的上述质粒转染进入逆转录病毒包装细胞系Plat-E细胞，采用RPMI-1640培养基(350-000-CL)进行培养，于48和72h后收集病毒上清；
(2)分离及转导T细胞：肿瘤特异性T细胞的培养需要预先在6孔板里包被3-5μg/mLanti-mouse-CD3ε抗体，用1*DPBS稀释，每孔添加1mL，37℃细胞培养箱中孵育1-3h或于4℃过夜，结束后用1*DPBS轻轻清洗一遍。利用MojoSort CD8 negative selection(Biolegend)磁珠分选试剂盒从OT-I小鼠的脾脏和***组织分离CD8+T细胞，铺入6孔板中，2mL/孔T细胞培养基，1*106-2*107/孔OT-I T细胞，加入2μg/mL anti-mouse-CD28抗体及20U/mL IL-2细胞因子激活24h。
(3)抗肿瘤OT-I T细胞激活后，分别将包装有单独短肽及融合短肽的病毒液上清(6mL/孔)，转导入1mL OT-I T细胞(1*106-2*107cells)中，加入10mM HEPES、500uL FBS、8μg/mL Polybrene，并于32℃，1200g离心90min后，培养过夜，6h后需更换含有20U/mL IL-2细胞因子的培养基，12h后进行二次病毒转导。共进行4次病毒转导。
(4)24h后Flow cytometry检测EGFP+阳性率，即检测转导效率，具体的实验结果如图2所示。
(5)检测目的短肽在T细胞外分泌表达：利用流式分选技术分选转导成功的T细胞(转导效率为63.3％以上为最佳，EGFP+，图2所示)；培养分选出的T细胞，24h后收集培养上清，利用Dot-blot实验验证Blockine的分泌效果，此处以Blockine-4蛋白的Dot-blot实验结果为例，其结果如图3所示；其中，获得的各蛋白的氨基酸序列如下所示：
免疫检查点抑制肽Blockine 1(D4-2)包括如下氨基酸序列：
KDWSISARYSAVYSIHPSW(SEQ ID NO:23)。
免疫检查点抑制肽Blockine 2(C25)包括如下氨基酸序列：
AVPMTYRAA(SEQ ID NO:24)。
免疫检查点抑制肽Blockine 3(TPP-1)包括如下氨基酸序列：
YASYHCWCWRDPGRS(SEQ ID NO:25)。
免疫检查点抑制肽Blockine 4(PPL-C)包括如下氨基酸序列：
VSVSHFQKVWVV(SEQ ID NO:26)。
免疫检查点抑制肽Blockine 5(ERY2-4)包括如下氨基酸序列：
AAWGQAILEGELAWLEGGGGGAGQLADLKRQLAWWKQAA(SEQ ID NO:27)。
人或小鼠IL-2分泌信号肽包括如下氨基酸序列：
MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:28)。
HA包括如下氨基酸序列：
YPYDVPDYA(SEQ ID NO:29)。
Fusion Blockine S包括如下所示的氨基酸序列：
YASYHCWCWRDPGRSAAWGQAILEGELAWLEGGGGGAGQLADLKRQLAWWKQAAKDWSISARYSAVYSIHPSWAVPMTYRAAVSVSHFQKVWVV(SEQ ID NO:30)。
Fusion Blockine 1包括如下所示的氨基酸序列：
VSVSHFQKVWVVKDWSISARYSAVYSIHPSWYASYHCWCWRDPGRSAAWGQAILEGELAWLEGGGGGAGQLADLKRQLAWWKQAAAVPMTYRAA(SEQ ID NO:31)。
Fusion Blockine 2包括如下所示的氨基酸序列：
YASYHCWCWRDPGRSKDWSISARYSAVYSIHPSWAAWGQAILEGELAWLEGGGGGAGQLADLKRQLAWWKQAAVSVSHFQKVWVVAVPMTYRAA(SEQ ID NO:32)。
Fusion Blockine 3包括如下所示的氨基酸序列：
AVPMTYRAAYASYHCWCWRDPGRSAAWGQAILEGELAWLEGGGGGAGQLADLKRQLAWWKQAAKDWSISARYSAVYSIHPSWVSVSHFQKVWVV(SEQ ID NO:33)。
Fusion Blockine 4包括如下所示的氨基酸序列：
KDWSISARYSAVYSIHPSWAVPMTYRAAYASYHCWCWRDPGRSVSVSHFQKVWVVAAWGQAILEGELAWLEGGGGGAGQLADLKRQLAWWKQAA(SEQ ID NO:34)。
实施例3重组蛋白抗肿瘤效应评估
本实施例对实施例2获得的重组蛋白Blockine-1、2、3、4、5、Fusion-Blockine-S和Fusion-Blockine-1～4进行抗肿瘤能力检测，具体的实验操作如下：
(1)构建荷瘤小鼠模型
发明人构建了黑色素肿瘤模型，将50只、6周龄雄性C57BL/6小鼠腹部两内侧下接种黑色素瘤(B16F10-Ova)细胞(2*105/只)，12d后肿瘤形成。
(2)肿瘤模型小鼠治疗
设置对照组和实验组，使用流式细胞术将实施例2获得的OT-1EGFP+阳性细胞分选后，通过眼眶静脉注射回输入黑色素肿瘤模型体内，回输量为2*105-5*105/只。其中，对照组分别给予上述肿瘤小鼠未转导且未表达短肽的T细胞(即转导实施例1所用的空载质粒的T细胞)进行过继性回输，实验组分别给予上述肿瘤小鼠转导并表达短肽或融合短肽的T细胞进行过继性回输，进行过继性回输后的小鼠饲养14天，治疗后每三天一次测量小鼠的肿瘤大小及体重，从而评估分泌型免疫检查点抑制肽的抗肿瘤效应。当肿瘤大小不超过1000mm3时，分离肿瘤浸润性淋巴细胞并分析肿瘤微环境的变化。
(3)治疗效果监测
具体的实验结果如图4和图5所示，其中，图4显示在第14天时Blockine-1、2、3、4、5及Fusion-Blockine-1均可以有效减缓小鼠肿瘤的生长，其中，Fusion-Blockine-1的效果最显著，Blockine-5(Blockine-PPLC)次之。图5显示，在第14天时，Fusion-Blockine-1、2、3、4、S均可以有效减缓小鼠肿瘤的生长，其中，Fusion-Blockine-S显示出更优秀的抗肿瘤效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 伯桢生物科技（杭州）有限公司
<120> 重组蛋白及其应用
<130> PDI210493
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<170> PatentIn version 3.5
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gttccaatga cctatcgcgc cgcatacgcc agctaccact gctggtgctg gagggacccc 120
ggcaggagcg tctccgtgag ccacttccag aaggtgtggg gcagcctggg ggcaggccat 180
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gccgacctga aacggcagct tgcttggtgg aagcaagctg caaaggactg gagtataagc 180
gcccgatact ccgcagtata cagtatccat ccctcatggg cagttccaat gacctatcgc 240
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cgcagtatac agtatccatc cctcatgggc agcctggggg caggccatat tggaaggcga 120
gcttgcatgg ctggagggcg ggggcggcgg tgctggccaa ctggccgacc tgaaacggca 180
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agcgcccgat actccgcagt atacagtatc catccctcat gggcagcctg ggggcaggcc 120
atattggaag gcgagcttgc atggctggag ggcgggggcg gcggtgctgg ccaactggcc 180
gacctgaaac ggcagcttgc ttggtggaag caagctgcag tctccgtgag ccacttccag 240
aaggtgtggg gcagttccaa tgacctatcg cgccgca 277
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ggcgggggcg gcggtgctgg ccaactggcc gacctgaaac ggcagcttgc ttggtggaag 180
caagctgcaa aggactggag tataagcgcc cgatactccg cagtatacag tatccatccc 240
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gcagttccaa tgacctatcg cgccgcatat ccatacgacg tgccagatta tgct 114
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tacgccagct accactgctg gtgctggagg gaccccggca ggagctatcc atacgacgtg 120
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atgtacagga tgcagctcct gtcttgcatt gcactgagtc tggcactcgt cacaaacagc 60
tacgccagct accactgctg gtgctggagg gaccccggca ggagcaagga ctggagtata 120
agcgcccgat actccgcagt atacagtatc catccctcat gggcagcctg ggggcaggcc 180
atattggaag gcgagcttgc atggctggag ggcgggggcg gcggtgctgg ccaactggcc 240
gacctgaaac ggcagcttgc ttggtggaag caagctgcag tctccgtgag ccacttccag 300
aaggtgtggg gcagttccaa tgacctatcg cgccgcatat ccatacgacg tgccagatta 360
tgct 364
<210> 22
<211> 364
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22
<400> 22
atgtacagga tgcagctcct gtcttgcatt gcactgagtc tggcactcgt cacaaacagc 60
gcagttccaa tgacctatcg cgccgcatac gccagctacc actgctggtg ctggagggac 120
cccggcagga gcgcagcctg ggggcaggcc atattggaag gcgagcttgc atggctggag 180
ggcgggggcg gcggtgctgg ccaactggcc gacctgaaac ggcagcttgc ttggtggaag 240
caagctgcaa aggactggag tataagcgcc cgatactccg cagtatacag tatccatccc 300
tcatgggtct ccgtgagcca cttccagaag gtgtgggtat ccatacgacg tgccagatta 360
tgct 364
<210> 23
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 23
<400> 23
Lys Asp Trp Ser Ile Ser Ala Arg Tyr Ser Ala Val Tyr Ser Ile His
1 5 10 15
Pro Ser Trp
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 24
<400> 24
Ala Val Pro Met Thr Tyr Arg Ala Ala
1 5
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 25
<400> 25
Tyr Ala Ser Tyr His Cys Trp Cys Trp Arg Asp Pro Gly Arg Ser
1 5 10 15
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 26
<400> 26
Val Ser Val Ser His Phe Gln Lys Val Trp Val Val
1 5 10
<210> 27
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 27
<400> 27
Ala Ala Trp Gly Gln Ala Ile Leu Glu Gly Glu Leu Ala Trp Leu Glu
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gln Leu Ala Asp Leu Lys Arg Gln Leu
20 25 30
Ala Trp Trp Lys Gln Ala Ala
35
<210> 28
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 28
<400> 28
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 29
<400> 29
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 30
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 30
<400> 30
Tyr Ala Ser Tyr His Cys Trp Cys Trp Arg Asp Pro Gly Arg Ser Ala
1 5 10 15
Ala Trp Gly Gln Ala Ile Leu Glu Gly Glu Leu Ala Trp Leu Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gln Leu Ala Asp Leu Lys Arg Gln Leu Ala
35 40 45
Trp Trp Lys Gln Ala Ala Lys Asp Trp Ser Ile Ser Ala Arg Tyr Ser
50 55 60
Ala Val Tyr Ser Ile His Pro Ser Trp Ala Val Pro Met Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Ala Ala Val Ser Val Ser His Phe Gln Lys Val Trp Val Val
85 90
<210> 31
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 31
<400> 31
Val Ser Val Ser His Phe Gln Lys Val Trp Val Val Lys Asp Trp Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Arg Tyr Ser Ala Val Tyr Ser Ile His Pro Ser Trp Tyr
20 25 30
Ala Ser Tyr His Cys Trp Cys Trp Arg Asp Pro Gly Arg Ser Ala Ala
35 40 45
Trp Gly Gln Ala Ile Leu Glu Gly Glu Leu Ala Trp Leu Glu Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Ala Gly Gln Leu Ala Asp Leu Lys Arg Gln Leu Ala Trp
65 70 75 80
Trp Lys Gln Ala Ala Ala Val Pro Met Thr Tyr Arg Ala Ala
85 90
<210> 32
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 32
<400> 32
Tyr Ala Ser Tyr His Cys Trp Cys Trp Arg Asp Pro Gly Arg Ser Lys
1 5 10 15
Asp Trp Ser Ile Ser Ala Arg Tyr Ser Ala Val Tyr Ser Ile His Pro
20 25 30
Ser Trp Ala Ala Trp Gly Gln Ala Ile Leu Glu Gly Glu Leu Ala Trp
35 40 45
Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gln Leu Ala Asp Leu Lys Arg
50 55 60
Gln Leu Ala Trp Trp Lys Gln Ala Ala Val Ser Val Ser His Phe Gln
65 70 75 80
Lys Val Trp Val Val Ala Val Pro Met Thr Tyr Arg Ala Ala
85 90
<210> 33
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 33
<400> 33
Ala Val Pro Met Thr Tyr Arg Ala Ala Tyr Ala Ser Tyr His Cys Trp
1 5 10 15
Cys Trp Arg Asp Pro Gly Arg Ser Ala Ala Trp Gly Gln Ala Ile Leu
20 25 30
Glu Gly Glu Leu Ala Trp Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gln
35 40 45
Leu Ala Asp Leu Lys Arg Gln Leu Ala Trp Trp Lys Gln Ala Ala Lys
50 55 60
Asp Trp Ser Ile Ser Ala Arg Tyr Ser Ala Val Tyr Ser Ile His Pro
65 70 75 80
Ser Trp Val Ser Val Ser His Phe Gln Lys Val Trp Val Val
85 90
<210> 34
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 34
<400> 34
Lys Asp Trp Ser Ile Ser Ala Arg Tyr Ser Ala Val Tyr Ser Ile His
1 5 10 15
Pro Ser Trp Ala Val Pro Met Thr Tyr Arg Ala Ala Tyr Ala Ser Tyr
20 25 30
His Cys Trp Cys Trp Arg Asp Pro Gly Arg Ser Val Ser Val Ser His
35 40 45
Phe Gln Lys Val Trp Val Val Ala Ala Trp Gly Gln Ala Ile Leu Glu
50 55 60
Gly Glu Leu Ala Trp Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gln Leu
65 70 75 80
Ala Asp Leu Lys Arg Gln Leu Ala Trp Trp Lys Gln Ala Ala
85 90

Claims (14)

1.一种重组蛋白，其特征在于，包括下列中的至少两种：
D4-2、C25、TPP-1、PPL-C和ERY2-4。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，包括D4-2、C25、TPP-1、PPL-C和ERY2-4。
3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，所述D4-2的C端与所述C25的N端相连，所述C25的C端与所述TPP-1的N端相连，所述TPP-1的C端与所述PPL-C的N端相连，所述PPL-C的C端与所述ERY2-4的N端相连。
4.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白具有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少95％、90％、85％同一性的氨基酸序列。
5.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-4任一项所述的重组蛋白。
6.根据权利要求5所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求5或6所述的核酸。
8.一种制备权利要求1-4任一项所述的重组蛋白的方法，其特征在于，包括：
将权利要求7所述的表达载体导入到受体细胞中；
将携带有所述表达载体的受体细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述受体细胞包括真核细胞；
任选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞，
任选地，所述哺乳动物细胞包括选自T细胞、CHO-K1、CHOS、293F、293T、CAR-T、TCR-T、TIL、CAR-NK、CAR-M和CAR-DC中的至少之一。
10.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求5或6所述的核酸、权利要求7所述的表达载体或表达权利要求1-4任一项所述的重组蛋白。
11.一种免疫效应细胞，其特征在于，携带权利要求5或6所述的核酸、权利要求7所述的表达载体或表达权利要求1-4任一项所述的重组蛋白；
任选地，所述免疫效应细胞为T细胞，优选为CD8+T细胞。
12.一种组合物，其特征在于，包括：
权利要求1-4任一项所述的重组蛋白、权利要求5或6所述的核酸、权利要求7所述的表达载体、权利要求10所述的重组细胞或权利要求11所述的免疫效应细胞。
13.权利要求1-4任一项所述的重组蛋白、权利要求5或6所述的核酸、权利要求7所述的表达载体、权利要求10所述的重组细胞、权利要求11所述的免疫效应细胞或权利要求12所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防癌症；
任选地，所述癌症包括选自下列中的至少之一：胃癌、肠癌、头颈癌和黑色素瘤。
14.一种药物，其特征在于，包括：权利要求1-4任一项所述的重组蛋白、权利要求5或6所述的核酸、权利要求7所述的表达载体、权利要求10所述的重组细胞、权利要求11所述的免疫效应细胞或权利要求12所述的组合物，所述药物用于治疗或预防癌症；
任选地，所述癌症包括选自下列中的至少之一：胃癌、肠癌、头颈癌和黑色素瘤。
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