JP6942465B2 - 抗ｐｄｌ１抗体製剤 - Google Patents

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Description

関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、その全内容が本明細書に参照により援用される２０１３年９月２７日出願の米国特許仮出願番号第６１／８８３９５３号の優先権の利益を主張する。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、その全内容が本明細書に参照により援用される：コンピュータで読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０２２０４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、データ記録：２０１４年９月２６日、サイズ：２４ＫＢ）。
本発明は、抗ＰＤＬ１抗体を含む安定な水性薬学的製剤に関する。
Ｔ細胞に２種類の異なるシグナルをもたらすことは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による休止Ｔリンパ球のリンパ球活性化について広く受け入れられたモデルである。Ｌａｆｆｅｒｔｙ等、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．ＳｃＬ ５３：２７−４２（１９７５）。このモデルはさらに、非自己から自己の区別及び免疫寛容を実現する。Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ １６９：１０４２−１０４９（１９７０）；Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ，Ｐ．Ａ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ９６：１８５−１９０（１９９９）；Ｊｅｎｋｉｎｓ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：３０２−３１９（１９８７）。１次シグナル又は抗原特異的シグナルは、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の場合、提示された外来抗原ペプチドを認識した後、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して伝達される。第２又は共刺激シグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現した共刺激分子によってＴ細胞に送達され、Ｔ細胞のクローン増殖、サイトカイン分泌及びエフェクター機能の促進を誘導する。Ｌｅｎｓｃｈｏｗ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：２３３（１９９６）。共刺激がなければ、Ｔ細胞は抗原刺激に対して不応性になる可能性があり、効果的な免疫応答を開始せず、さらに外来抗原に対して疲弊するか又は寛容を生じることもある。
２シグナルのモデルでは、Ｔ細胞は正負両方の２次共刺激シグナルを受け取る。このような正負シグナルの調節は、免疫寛容を維持し自己免疫を防止する一方で宿主の防御免疫応答を最大限にするために不可欠である。負の２次シグナルは、Ｔ細胞寛容を誘導するために必要と考えられるが、一方、正のシグナルはＴ細胞活性化を促進する。この単純な２シグナルのモデルによって未処理リンパ球をさらに正しく説明することができるが、宿主免疫応答は動的なプロセスで、共刺激シグナルは抗原に曝露したＴ細胞にももたらされる可能性がある。共刺激の機構は、共刺激シグナルの操作は細胞ベースの免疫応答を増強するか又は終了させる手段となることが示されたので、治療上興味深い。近年、阻害剤受容体、プログラム死１ポリペプチド（ＰＤ−１）の発現を誘導し持続させる同時にＴ細胞機能不全又はアネルギーが生じることが発見された。結果として、ＰＤ−１並びにＰＤ−１との相互作用によってシグナルを送るその他の分子、例えば、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌｌ）及びプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）を治療上の標的とすることは、強い関心が持たれている分野である。
ＰＤ−Ｌ１は、多くのがんにおいて過剰発現しており、予後不良と関連することが多い（Okazaki等、Intern. Immun. 2007 19(7):813）（Thompson RH等、Cancer Res 2006, 66(7):3381）。興味深いことに、腫瘍浸潤Ｔリンパ球の大部分は、正常組織のＴリンパ球及び末梢血Ｔリンパ球とは対照的に、ＰＤ−１を優勢に発現しており、腫瘍反応性Ｔ細胞におけるＰＤ−１の上方制御は抗腫瘍免疫応答の障害に関与し得ることを示唆している（Blood 2009 114(8):1537）。これは、ＰＤ−１を発現するＴ細胞と相互作用するＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞によって媒介されたＰＤ−Ｌ１シグナル伝達を利用して、Ｔ細胞活性化の減衰及び免疫監視機構の回避を引き起こすためであろう（Sharpe等、Nat Rev 2002）（Keir ME等、2008 Annu. Rev. Immunol. 26:677）。したがって、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を阻害することによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性の腫瘍殺滅を増強することができる。
ＰＤ−１並びにＰＤ−１との相互作用によってシグナルを送るその他の分子、例えば、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌｌ）及びプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）を治療上標的とすることは、強い関心が持たれている分野である。ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の阻害は、がん（例えば、腫瘍免疫）並びに急性及び慢性（例えば、持続的）の両方を含む感染を治療するために、Ｔ細胞免疫を増強する手段として提案されたことがある。しかし、この経路における標的を対象とする最適な治療薬が未だ商品化されておらず、重大な満たされていない医療上の必要性が存在する。
特許出願、特許公報及びユニプロットＫＢ／スイスプロット（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）寄託番号を含む本明細書で引用した参考文献は全て、それぞれ個々の参考文献が具体的かつ個々に参照により援用されることが示されているかのように、その全内容が本明細書に参照により援用される。
本明細書では、抗体を含む安定な水性薬学的製剤を提供する。この製剤は、抗体、（例えば、抗ＰＤＬ１抗体）、バッファー、スクロース及び界面活性剤を含み、この製剤のｐＨは約５．０から約７．０である。
一態様では、本明細書では安定な水性薬学的製剤を提供し、この製剤は約４０ｍｇ／ｍＬから約１２５ｍｇ／ｍＬの濃度の抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体、約１５ｍＭから約２５ｍＭの濃度のヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウム、約６０ｍＭから約２４０ｍＭの濃度のスクロース、約０．００５％（ｗ／ｖ）から約０．０６％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベートを含み、ｐＨは約５．０から約６．３である。
いくつかの実施態様では、製剤中のモノクローナル抗体は約４０ｍｇ／ｍＬから約８０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中のモノクローナル抗体は約５４ｍｇ／ｍＬから約６６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中のモノクローナル抗体は約６０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中のモノクローナル抗体は約６０ｍｇ／ｍＬから約１２５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中のモノクローナル抗体は約１２５ｍｇ／ｍＬである。
いくつかの実施態様では、製剤中の前記ヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの濃度は約１７ｍＭから約２２ｍＭである。いくつかの実施態様では、製剤中の前記ヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの濃度は約２０ｍＭである。
いくつかの実施態様では、製剤中の前記スクロースは約６０ｍＭから約１８０ｍＭである。いくつかの実施態様では、製剤中の前記スクロースは約１２０ｍＭである。いくつかの実施態様では、製剤中の前記スクロースは約２４０ｍＭである。
いくつかの実施態様では、製剤のｐＨは約５．５から約６．１である。いくつかの実施態様では、製剤のｐＨは約５．５から約５．８である。
いくつかの実施態様では、製剤中の前記ポリソルベートはポリソルベート２０である。いくつかの実施態様では、製剤中の前記ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０）は約０．０２％から約０．０４％である。
いくつかの実施態様では、製剤中の前記モノクローナル抗体は約６０ｍｇ／ｍＬで、製剤中のスクロースは約１２０ｍＭで、ｐＨは約５．８である。いくつかの実施態様では、製剤中の前記モノクローナル抗体は約１２５ｍｇ／ｍＬで、製剤中のスクロースは約２４０ｍＭで、ｐＨは約５．５である。
いくつかの実施態様では、製剤は、約６０ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体（例えば、本明細書で記載した抗ＰＤＬ１抗体）、約２０ｍＭの濃度のヒスチジンアセテート、約１２０ｍＭの濃度のスクロース及び０．０４％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０であるポリソルベートを含み、製剤のｐＨは約５．８である。
いくつかの実施態様では、製剤は、約１２５ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体、約２０ｍＭの濃度のヒスチジンアセテート、約２４０ｍＭの濃度のスクロース及び０．０２％の濃度のポリソルベート２０であるポリソルベートを含み、製剤のｐＨは約５．５である。
いくつかの実施態様では、製剤中の前記モノクローナル抗体は事前の凍結乾燥に供されない。いくつかの実施態様では、製剤中の前記モノクローナル抗体は完全長抗体である。いくつかの実施態様では、製剤中の前記モノクローナル抗体はＩｇＧ抗体である。いくつかの実施態様では、製剤中の前記モノクローナル抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施態様では、製剤中の前記モノクローナル抗体は抗原結合領域を含む抗体断片である。いくつかの実施態様では、抗体断片はＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片である。
いくつかの実施態様では、製剤中の前記モノクローナル抗体は、
（ａ）（１）アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（２）アミノ酸配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２）を含むＨＶＲ−Ｌ２；
（３）アミノ酸配列ＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む軽鎖可変領域；及び
（ｂ）（１）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号４）を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（２）アミノ酸配列ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ２；
（３）アミノ酸配列ＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号６）を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施態様では、製剤中の前記モノクローナル抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様では、製剤中の前記モノクローナル抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、及び配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様では、製剤中の前記モノクローナル抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様では、製剤中の前記モノクローナル抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様では、製剤中の前記モノクローナル抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施態様では、製剤中の前記モノクローナル抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する軽鎖、及び配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する重鎖を含む。
いくつかの実施態様では、抗体を含む製剤はガラスバイアル又は金属合金容器中で保存する。いくつかの実施態様では、金属合金は、３１６Ｌステンレススチール又はハステロイである。いくつかの実施態様では、製剤は２−８℃で少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも１８カ月又は少なくとも２４カ月間安定である。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体は、保存後に保存前の生物活性の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％を保持している。いくつかの実施態様では、生物活性はＰＤ−Ｌ１に結合する抗体によって測定される。
いくつかの実施態様では、本明細書で記載した製剤は滅菌されている。いくつかの実施態様では、本明細書で記載した製剤は、対象への投与に適している。いくつかの実施態様では、本明細書で記載した製剤は静脈内（ＩＶ）投与用である。
別の態様では、本明細書では前記及び本明細書で記載した安定な水性薬学的製剤の何れかを有する容器を含む製造品又はキットを提供する。いくつかの実施態様では、容器はガラスバイアル又は金属合金容器である。いくつかの実施態様では、金属合金は、３１６Ｌステンレススチール又はハステロイである。
別の態様では、本明細書では対象における疾患又は障害を治療するための方法であって、本明細書で記載した製剤の有効量を対象に投与することを含み、疾患又は障害が、感染、がん及び炎症疾患からなる群から選択される方法を提供する。
本明細書で記載した様々な実施態様の特性の１つ、いくつか又は全ては、本発明のその他の実施態様を形成するために組み合わせることができることを理解されたい。本発明のこれら及びその他の態様は、当業者には明らかとなろう。本発明のこれら及びその他の実施態様を、以下の詳細な説明によってさらに説明する。
ＪＭＰソフトウェアを使用したＩＣＩＥＦによる４０℃でのα−ＰＤＬ１製剤の安定性データの統計学的解析を示した一連のグラフである。Ａ）一部実施要因計画（ＤＯＥ）による平均メインピーク率低下。Ｂ）一部実施要因ＤＯＥによるメインピーク分析。メインピークは、分子のｐＩ（等電点）と同じｐＨを有するα−ＰＤＬ１荷電種を含有する。 ＪＭＰソフトウェアを使用したＩＣＩＥＦによる２５℃でのα−ＰＤＬ１製剤の安定性データの統計学的解析を示した一連のグラフである。Ａ）一部実施要因計画（ＤＯＥ）による平均メインピーク率低下。Ｂ）一部実施要因ＤＯＥによるメインピーク分析。メインピークは、分子のｐＩ（等電点）と同じｐＨを有するα−ＰＤＬ１荷電種を含有する。 ＪＭＰソフトウェアを使用したＳＥ−ＨＰＬＣによる４０℃でのα−ＰＤＬ１製剤の安定性データの統計学的解析を示した一連のグラフである。Ａ）一部実施要因計画（ＤＯＥ）による平均メインピーク率低下。Ｂ）一部実施要因ＤＯＥによるメインピーク分析。メインピークはα−ＰＤＬ１モノマーを含有する。 ＪＭＰソフトウェアを使用したＳＥ−ＨＰＬＣによる２５℃でのα−ＰＤＬ１製剤の安定性データの統計学的解析を示した一連のグラフである。Ａ）一部実施要因計画（ＤＯＥ）による平均メインピーク率低下。Ｂ）一部実施要因ＤＯＥによるメインピーク分析。メインピークはα−ＰＤＬ１モノマーを含有する。 様々な温度及び時間で保存した様々なα−ＰＤＬ１製剤の著しいＰＳ２０分解の欠如を示したグラフである。Ｆ１からＦ１０製剤中において蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）によって検出した製剤中に残存するＰＳ２０パーセント（％）の図である。ａは時間ゼロ（Ｔ０）である；ｂは４０℃、１Ｍである；ｃは２５℃、２Ｍである；ｄは５℃、２Ｍである；ｅは５℃、６Ｍである；ｆは５℃、６Ｍ、２０ｃｃガラスバイアル（ＧＶ）、高充填である；ｇは５℃、６Ｍ、２０ｃｃガラスバイアル（ＧＶ）、低充填である。 ガラスバイアル（ＧＶ）中において−２０℃又は５℃で最大６カ月間保存したα−ＰＤＬ１製剤の安定性を示した一連のグラフである。Ａ）−２０℃で指示した時間保存中５回の凍結解凍サイクル後の製剤中におけるモノマーパーセント（％）のグラフである。Ｂ）５℃で指示した時間保存した製剤中におけるモノマーパーセント（％）のグラフである。 ガラスバイアル（ＧＶ）中において−２０℃又は５℃で最大６カ月間保存したα−ＰＤＬ１製剤の安定性を示した一連のグラフである。Ｃ）−２０℃で指示した時間保存中５回の凍結解凍サイクル後に製剤から得られたメインピークパーセント（％）のグラフである。Ｄ）５℃で指示した時間保存した製剤から得られたメインピークパーセント（％）のグラフである。 ３回の凍結解凍サイクルを行いステンレススチール又はハステロイ小型缶で保存した後のα−ＰＤＬ１製剤の安定性を示した一連のグラフである。Ａ）指示した温度で３カ月間保存した後の製剤中におけるモノマーパーセント（％）のグラフである。Ｂ）指示した温度で３カ月間保存した後の製剤中におけるメインピークパーセント（％）のグラフである。 ２０ｃｃバイアル中におけるα−ＰＤＬ１製剤保存の安定性を示した一連のグラフである。Ａ）指示した温度で３カ月間保存した後の製剤中におけるモノマーパーセント（％）のグラフである。Ｂ）指示した温度で３カ月間保存した後の製剤中におけるメインピークパーセント（％）のグラフである。 様々な濃度のＰＳ２０を含有するα−ＰＤＬ１製剤のガラスバイアル中で撹拌したときの安定性を示した一連のグラフである。Ａ）指示した時間室温で撹拌した後の製剤中におけるモノマーパーセント（％）のグラフである。Ｂ）指示した時間室温で撹拌した後の３５０ｎｍでの吸収によって測定した濁度のグラフである。 ガラスバイアル中において指示した温度で一定期間保存し、その後撹拌を行ったα−ＰＤＬ１製剤の安定性を示した一連のグラフである。製剤中におけるモノマー変化パーセントをＳＥＣによって測定した。 漸増ｐＨによる１週間当たりのα−ＰＤＬ１低下率の比較を示した一連のグラフである。Ａ）４０℃で保存した後の製剤中における１週間当たりのモノマー損失パーセント（％）のグラフである。Ｂ）４０℃で保存した後の製剤中における１週間当たりのメインピーク低下パーセント（％）のグラフである。
Ｉ．定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の組成物又は生物系に限定されず、それらはもちろん変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用した用語は、特定の実施態様を説明するためだけのものであり、限定するものではないことも理解されたい。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用したように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈で特に明確に規定していなければ、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１分子」という場合、任意選択的にこのような分子の２個以上の組み合わせなどを含む。
本明細書では、「約」という用語は、本技術分野の当業者には容易に分かるそれぞれの値の通常の誤差範囲を意味する。本明細書で「約」値又はパラメータという場合、値又はパラメータ自体を対象とする実施態様を含み（記載する）。
本明細書で記載した本発明の態様及び実施態様は、態様及び実施態様「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含む（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」及び「から本質的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含むことを理解されたい。
「薬学的製剤」という用語は、活性成分の生物活性を有効にするような形態であり、製剤を投与する対象に許容不可能な毒性を有する他の成分を含有しない調製物を意味する。このような製剤は滅菌されている。「薬学的に許容される」賦形剤（ビヒクル、添加剤）は、対象哺乳動物に適度に投与して、使用した活性成分の有効用量をもたらすことができる賦形剤である。
「滅菌」製剤は、無菌的であるか、又は生きている微生物及びそれらの胞子全て含まないか、又は本質的に含まない。
「凍結」製剤は、０℃未満の温度の製剤である。一般的に、凍結製剤は凍結乾燥されておらず、事前又は事後の凍結乾燥にも供されない。ある種の実施態様では、凍結製剤には保存用の凍結原体（ステンレススチールタンクに入っている）又は凍結薬物製品（最終バイアル形状）が含まれる。
「安定な」製剤は、保存時に中に入っているタンパク質が物理安定性及び／又は化学安定性及び／又は生物活性を本質的に保持している製剤である。好ましくは、製剤は、保存時に物理的及び化学安定性並びに生物活性を本質的に保持している。保存期間は一般的に製剤の目的とする保存寿命に基づいて選択する。タンパク質安定性を測定するために様々な分析技術が当技術分野では利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７−３０１、Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）に概説されている。安定性は、選択した温度で選択した期間で測定することができる。安定性は、凝集体形成の評価によって（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、濁度を測定することによって、及び／又は視覚的検査によって）；陽イオン交換クロマトグラフィー、イメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）又はキャピラリーゾーン電気泳動を使用して電荷の不均一性を評価することによって；アミノ末端又はカルボキシ末端配列分析；質量分析；還元された抗体とインタクトな抗体を比較するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えば、トリプシン又はＬＹＳ−Ｃ）分析；抗体の生物活性又は抗原結合機能の評価などを含む様々な異なる方法で定性的に及び／又は定量的に評価することができる。不安定性には、凝集、脱アミド化（例えば、Ａｓｎ脱アミド化）、酸化（例えば、Ｍｅｔ酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えば、ヒンジ領域断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン（複数）、Ｎ末端伸張、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化の違いなどの何れか１つ又は複数が関与することができる。
色及び／又は透明性の視覚検査において、あるいはＵＶ光散乱又はサイズ排除クロマトグラフィーによって測定したとき、凝集、沈殿及び／又は変性の形跡がないか、又は非常に少ないことが示された場合、タンパク質は、薬学的製剤中において「物理安定性を保持している」。
所与の時間における化学安定性が、タンパク質が以下に定義したような生物活性をまだ保持していると考えられるようであれば、タンパク質は薬学的製剤中において「化学安定性を保持している」。化学安定性は、タンパク質の化学的に変化した形態を検出し、定量することによって評価することができる。化学的変化には、サイズの変更（例えば、クリッピング）を含んでいてもよく、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析／飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ）を使用して評価することができる。その他の種類の化学的変化には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー又はｉｃＩＥＦによって評価することができる電荷変化（例えば、脱アミド化の結果として生じる）が含まれる。
所与の時間において抗体の生物活性が、アッセイ（例えば、抗原結合アッセイ）で測定したとき、薬学的製剤を調製した時点に示された生物活性の少なくとも約６０％（アッセイの誤差内）であるならば、抗体は、薬学的製剤中において「生物活性を保持している」。抗体のその他の「生物活性」アッセイは、本明細書では以下に詳しく説明する。
本明細書では、モノクローナル抗体の「生物活性」には、抗体が抗原に結合し、インビトロ又はインビボにおいて測定することができる測定可能な生物学的応答を引き起こす能力が含まれる。
本明細書の「脱アミド化した」モノクローナル抗体とは、その１つ又は複数のアスパラギン残基を、例えば、アスパラギン酸又はイソ−アスパラギン酸に誘導体化したモノクローナル抗体である。
本明細書の「酸化した」モノクローナル抗体とは、その１つ又は複数のトリプトファン残基及び／又は１つ又は複数のメチオニンを酸化したモノクローナル抗体である。
本明細書の「糖化した」モノクローナル抗体とは、その１つ又は複数のリジン残基を糖化したモノクローナル抗体である。
「脱アミド化しやすい」抗体とは、脱アミド化を受けやすいことが見出された１つ又は複数の残基を含む抗体である。
「酸化しやすい」抗体とは、酸化を受けやすいことが見出された１つ又は複数の残基を含む抗体である。
「凝集しやすい」抗体とは、特に、凍結及び／又は撹拌においてその他の抗体分子（複数）と共に凝集することが見出された抗体である。
「断片化しやすい」抗体とは、例えば、そのヒンジ領域で、２つ以上の断片に切断されることが見出された抗体である。
「脱アミド化、酸化、凝集又は断片化を低減すること」によって、様々な製剤中に製剤化したモノクローナル抗体に関する脱アミド化、酸化、凝集又は断片化を防止するか、又は量を減少させることを目的とする。
製剤化した抗体は、好ましくは本質的に純粋であり、望ましくは本質的に均一である（例えば、夾雑タンパク質などを含まない）。「本質的に純粋な」抗体は、組成物中のタンパク質の総重量をベースにして少なくとも約９０重量％、好ましくは、少なくとも約９５重量％の抗体を含む組成物を意味する。「本質的に均一な」抗体は、組成物中のタンパク質の総重量をベースにして少なくとも約９９重量％の抗体を含む組成物を意味する。
「等張」とは、対象とする製剤がヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有することを意味する。等張製剤は一般的に、約２５０から３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば、蒸気圧又は氷凍結型浸透圧計を使用して測定することができる。
本明細書では、「バッファー」とは、その酸−塩基コンジュゲート成分の作用によるｐＨの変化に抵抗する緩衝化溶液を意味する。本発明のバッファーのｐＨは好ましくは約４．５から約７．０、好ましくは約５．６から約７．０、例えば、５．６から６．９、５．７から６．８、５．８から６．７、５．９から６．６、５．９から６．５、６．０、６．０から６．４又は６．１から６．３の範囲である。一実施態様では、バッファーのｐＨは、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９又は７．０である。例えば、リン酸ナトリウムはこの範囲でｐＨをコントロールするバッファーの一例である。
本明細書では、「界面活性剤」は、界面活性薬剤、好ましくは非イオン性界面活性剤を意味する。本明細書の界面活性剤の例には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグルコシドナトリウム；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−又はステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−又はステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−又はセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノールアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−又はイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−又はイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；メチルココイルタウリン酸ナトリウム又はメチルオレイルタウリン酸２ナトリウム；及びＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）系（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．）；ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール及びエチレン及びプロピレングリコールの共重合体（例えば、プルロニック、ＰＦ６８など）；などが含まれる。一実施態様では、本明細書の界面活性剤はポリソルベート２０である。
薬理的な意味では、本発明の場合、抗体の「治療的有効量」とは、抗体が有効である治療において、障害の予防又は治療に有効な量を意味する。「障害」は、抗体による治療で恩恵を受ける任意の症状である。これには、哺乳動物が問題の障害に罹りやすい病態を含む慢性及び急性の障害又は疾患が含まれる。
「保存剤」は、製剤中の細菌作用を本質的に抑え、したがって、例えば、多用途製剤の生産を容易にする、任意選択的に製剤に含めることができる化合物である。潜在的な保存剤の例には、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチル塩化アンモニウムの混合物）、及び塩化ベンゼトニウムが含まれる。その他の種類の保存剤には、フェノール、ブチル及びベンジルアルコールなどの芳香族アルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが含まれる。一実施態様では、本明細書の保存剤はベンジルアルコールである。
本明細書では、「治療」という用語は、臨床病理の経過中に治療する個体又は細胞の自然経過を変化させるために考案された臨床的介入のことである。治療の望ましい効果には、疾患進行速度の減速、病状の回復又は緩和、予後の寛解又は改善が含まれる。例えば、限定はしないが、がん性細胞の増殖の低下（又は破壊）、疾患から生じる症候の減少、疾患に罹患した患者の生活の質の向上、疾患の治療に必要なその他の治療薬の用量の減少、疾患の進行の遅延及び／又は個体の生存の延長を含む、がんに関連した１つ又は複数の症候が軽減又は除去されるならば、個体はうまく「治療されている」。
本明細書では、「疾患の進行の遅延」は、疾患（例えば、がん）の進行の遅滞、妨害、減速、猶予、安定化及び／又は延期を意味する。この遅延は、治療する疾患及び／又は個体の病歴に応じて、期間の長さを変更することができる。当業者には明らかなように、十分な、又は著しい遅延は、実際には、個体が疾患を発症しない予防を包含することができる。例えば、後期がん、例えば転移の発症を遅延することができる。
「有効量」は、特定の障害の測定可能な改善又は予防を達成するために必要な少なくとも最小限の量である。本明細書の有効量は、患者の病状、年齢、性別及び体重並びに個体において所望する応答を誘発する抗体の能力などの要素に応じて変化させることができる。有効量とはまた、治療上有益な効果が治療のいかなる毒性又は有害な効果よりも勝っている量である。予防的使用で、有益な、又は所望する結果には、危険性の排除若しくは軽減、重症度の低減、又は疾患の生化学的、組織学的及び／又は行動学的症候を含む疾患開始、疾患の進行中に表れる合併症及び中間の病理学的表現型の遅延などの結果が含まれる。治療的使用では、有益な、又は所望する結果には、疾患から生じる１つ又は複数の症候の減少、疾患に罹患した患者の生活の質の向上、疾患を治療するために必要なその他の治療薬の用量の減少、標的化などによる別の治療薬の効果の増強、疾患の進行の遅延、及び／又は生存の延長などの臨床的結果が含まれる。がん又は腫瘍の場合、薬物の有効量は、がん細胞数の低下、腫瘍サイズの縮小、周辺器官へのがん細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減速又は望ましくは停止）、腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速及び望ましくは停止）、ある程度の腫瘍増殖の阻害及び／又は障害に関連した１つ又は複数の症候のある程度の軽減において効果を有し得る。有効量は、１回又は複数回の投与で投与することができる。本発明の目的では、薬物、化合物又は薬学的組成物の有効量は、直接的又は間接的に予防的又は治療的治療を実現するために十分な量である。臨床の場合に理解されるように、薬物、化合物又は薬学的組成物の有効量は、別の薬物、化合物又は薬学的組成物と組み合わせて実現してもよく、又は実現しなくてもよい。したがって、「有効量」は、１つ又は複数の治療剤の投与の場合に考えることができ、単一の薬剤は、１つ又は複数のその他の薬剤と組み合わせて所望する結果を実現することができれば、有効量で投与されたと考えることができる。
本明細書では、「と組み合わせて」とは、１治療様式を別の治療様式に加えて投与することを意味する。したがって、「と組み合わせて」とは、１治療様式を個体へのその他の治療様式の投与の前、最中、又は後に投与することを意味する。
「障害」とは、治療が有益である任意の症状で、限定はしないが、哺乳動物が問題の障害に罹りやすい病態を含む慢性及び急性の障害又は疾患が含まれる。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」という用語は、異常な細胞増殖にある程度関与した障害を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患とはがんである。一実施態様では、細胞増殖性疾患とは腫瘍である。
本明細書では「腫瘍」とは、悪性であろうと良性であろうと腫瘍性細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）及び増殖（ｐｒｏｌｅｆｅｒａｔｉｏｎ）全て、並びに前がん性及びがん性細胞及び組織全てを意味する。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」という用語は、本明細書で言及したように互いに相反しない。
「がん」及び「がん性」という用語は、典型的に未制御の細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理的状態を意味するか、又は述べる。がんの例には、限定はしないが、カルシノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ系腫瘍が含まれる。このようながんのより詳細な例には、限定はしないが、扁平上皮がん（例えば、上皮性扁平細胞がん）、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌及び肺の扁平癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を含む肺のがん、腹膜のがん、肝細胞がん、胃腸がん及び胃腸間質がんを含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ）又は胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん、膵臓がん、膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、尿路のがん、肝がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）又は腎（ｒｅｎａｌ）がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝細胞癌、肛門癌、陰茎癌、メラノーマ、表在性伸展メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、末端性黒子性メラノーマ、結節性メラノーマ、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性のＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）並びに母斑症、浮腫を伴う異常な血管増殖（脳腫瘍を伴うものなど）、メグズ症候群、脳及び頭部及び頸部のがん並びに随伴する転移が含まれる。ある種の実施態様では、本発明の抗体による治療に適したがんには、乳がん、結腸直腸がん、結腸がん、非小細胞肺がん、膠芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭部及び頸部のがん、卵巣がん、中皮腫及び多発性骨髄腫が含まれる。いくつかの実施態様では、がんは、小細胞肺がん、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、乳癌、胃がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）及び肝細胞癌から選択される。さらに、いくつかの実施態様では、がんは、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、膠芽細胞腫及び乳癌から選択され、これらのがんの転移型が含まれる。
「化学療法剤」は、がんの治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン及びメチルメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩＩ及びカリケアマイシンオメガＩＩ（例えば、Nicolaou等、Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照のこと）；ＣＤＰ３２３、経口アルファ−４インテグリンン阻害剤、ダイネミシンＡを含むダイネミシン；エスペラミシン；並びにネオカルチノスタチン発光団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発光団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルビシン、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルチノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標）、リポソームドキソルビシンＴＬＣ Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標）、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標）及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキセート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；コンブレタスタチン、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）のような葉酸リプレニッシャー；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシン及びアンサマイトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２トキシン、ベラキュリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ Ａ）、ロリジンＡ（ｒｏｒｉｄｉｎ Ａ）及びアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、アルブミン設計のナノ粒子製剤のパクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｍｅ−Ｐｏｕｌｅｎｅ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、オキサリプラチン（例えば、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））及びカルボプラチンなどのプラチナ剤；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））及びビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））を含む微小管形成からチューブリン重合を防ぐビンカ（ｖｉｎｃａ）、エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロン酸；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含むレチノイン酸などのレチノイド；クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））又はリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））などのビスホスホネート；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））などの異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；及び細胞増殖を抑制するＶＥＧＦ−Ａ；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリホシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ又はエトリコキシブ）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；ティピファニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ（ｏｒａｆｅｎｉｂ）、ＡＢＴ５１０；オブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））などのＢｃｌ−２阻害剤；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤；ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））などのセリン−スレオニンキナーゼ阻害剤；ロナファーニブ（ＳＣＨ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲ（商標））などのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤；及び前記の何れかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体、並びにシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロンの混合療法の略号であるＣＨＯＰ、及び５−ＦＵ及びロイコボリンと混合したオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））による治療レジメンの略号であるＦＯＬＦＯＸなどの２種類以上の前記の組み合わせ、前記の何れかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体、並びに前記の２種類以上の組み合わせが含まれる。
本明細書で定義した化学療法剤には、がんの増殖を促進することができるホルモンの効果を調節、抑制、ブロック又は阻害するように作用する「抗ホルモン剤」又は「内分泌療法薬」が含まれる。これらはホルモン自体であってもよく、限定はしないが、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びＦＡＲＥＳＴＯＮ．ｃｎｄｏｔ．トレミフェンを含む抗エストロゲン及び選択的なエストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）；例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾ−ルなどの副腎におけるエストロゲン産生を調節する、酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓなどの異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）などのリボザイム及びＨＥＲ２発現阻害剤；遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼＩ阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラミシン（米国特許第４６７５１８７号参照）並びに前記の何れかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体；並びに前記の２つ以上の組み合わせが含まれる。
本明細書で使用するときの「増殖阻害剤」とは、インビトロ又はインビボの何れかにおいて細胞の増殖を阻害する化合物又は組成物を意味する。一実施態様では、増殖阻害剤は抗体が結合する抗原を発現する細胞の増殖を妨害又は抑制する増殖阻害抗体である。別の実施態様では、増殖阻害剤は、Ｓ期の細胞の割合を著しく低下させる阻害剤であってもよい。増殖阻害剤の例には、Ｇ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤など、細胞周期進行を（Ｓ期以外の相で）ブロックする薬剤が含まれる。古典的なＭ期ブロッカーには、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、並びにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド及びブレオマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が含まれる。Ｇ１停止させる薬剤も、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、及びアラ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤もＳ期停止に波及する。さらなる情報はＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ編、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、第１章、表題「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ， ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ， ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」Ｍｕｒａｋａｍｉ等（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９５）、例えば、ｐ．１３に見出すことができる。タキサン（パクリタキセル及びドセタキセル）は、イチイ属に由来する抗がん剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリンダイマーから微小管の集合を促進し、脱重合を妨害することによって微小管を安定化し、細胞における有糸***の阻害を引き起こす。
「放射線療法」は、細胞が正常に機能する能力を制限するか又は細胞を一斉に破壊するために、細胞に十分な損傷を誘導するように方向付けされたガンマ線又はベータ線の使用を意味する。当該技術分野では投薬量及び治療期間を決定する公知の方法が多くあることを理解されよう。典型的な治療は、１回の投与で、１日当たり１０から２００ユニット（グレイ）の範囲の典型的な投薬量で行われる。
治療目的の「対象」又は「個体」とは、ヒト、飼育動物及び家畜、動物園、スポーツ又はペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳動物に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
本明細書では、「抗体」という用語を広義に使用しており、特にモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び所望する生物活性を表す限り抗体断片を含む。
「単離された」抗体とは、天然の環境の成分から同定及び分離及び／又は回収した抗体である。天然の環境の夾雑物成分は、抗体の研究、診断又は治療的使用に干渉する物質で、酵素、ホルモン及びその他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含み得る。いくつかの実施態様では、抗体は、（１）例えば、ローリー法によって測定したとき抗体９５重量％超まで、いくつかの実施態様では、９９重量％超まで、（２）例えば、スピニングカップシークエネーターを使用することによってＮ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、又は（３）例えば、クーマシーブルー若しくは銀染色を使用して、還元条件下若しくは非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製する。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分も存在しないので、組換え細胞内のインサイツにおける抗体は単離した抗体に含まれる。しかし、普通は単離された抗体は少なくとも１回の精製工程によって精製する。
「天然抗体」は通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ４量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合するが、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変動する。各重鎖と軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）、それに続くいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖可変ドメイン間の接触面を形成すると考えられる。
「定常ドメイン」という用語は、免疫グロブリンのその他の部分、抗原結合部位を含有する可変ドメインと比較してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の一部を意味する。定常ドメインは重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（総称してＣＨ）並びに軽鎖のＣＨＬ（又はＣＬ）ドメインを含有する。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と呼んでもよい。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と呼んでもよい。これらのドメインは一般的に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含有する。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位は、抗体間で配列が幅広く異なっており、その特定の抗原に対する特定の抗体それぞれの結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかし、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、ベータシート構造を連結し、場合によってその一部を形成するループを形成する３つのＨＶＲによって連結したベータシート配置を主にとる４つのＦＲ領域を含んでいる。各鎖のＨＶＲは、ＦＲ領域によって近接して一緒に保持され、その他の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat等、Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5版 National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991)を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
任意の哺乳動物種の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、これらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに区別される型の一方に分類することができる。
本明細書では、ＩｇＧ「アイソタイプ」又は「サブクラス」という用語は、定常領域の化学的及び抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンのサブクラスの何れかを意味する。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び３次元配置はよく知られており、一般的に、例えば、Ａｂｂａｓ等、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４版（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．、２０００）に記載されている。抗体は、抗体と１つ又は複数のその他のタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有結合によって形成されるより大きな融合分子の一部であってもよい。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、その実質的にインタクトな形態の抗体を意味し、以下で定義したような抗体断片は意味しない。この用語は特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を含む抗体を意味する。
本明細書の目的では、「ネイキッド抗体」とは、細胞傷害性部分又は放射標識にコンジュゲートされていない抗体である。
「抗体断片」は、好ましくは抗体の抗原結合領域を含むインタクトな抗体の一部を含む。いくつかの実施態様では、本明細書で記載した抗体断片は抗原結合断片である。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生じ、それぞれは単一の抗原結合（binding）部位及び名前がその容易に結晶化する能力を反映している残りの「Ｆｃ」断片を有する。ペプシン処理は、２つの抗原結合（combining）部位を有し、まだ抗原に架橋することが可能であるＦ（ａｂ’）２断片を生じる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。一実施態様では、２本鎖Ｆｖ種は強固な非共有結合によって結合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種における重鎖及び軽鎖に類似した「ダイマー」構造で結合することができるように、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインが可動性ペプチドリンカーによって共有結合的に結合することができる。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用してＶＨ−ＶＬダイマーの表面上に抗原−結合部位を定義するのはこの構造においてである。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原−結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＨＶＲだけを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体より親和性は低いが抗原を認識し抗原に結合する能力を有している。
Ｆａｂ断片は重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に抗体ヒンジ領域の１つ又は複数のシステインを含む数個の残基が付加されていることがＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片対として元々は生成された。抗体断片のその他の化学的カップリングもまた知られている。
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的には、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦＶが抗原結合に望ましい構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨとＶＬドメインとの間にさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４）、ｐｐ．２６９−３１５を参照のこと。
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を備えた抗体断片を意味し、この断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。非常に短いために同一鎖の２つのドメイン間でのペアリングを可能にするリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的にペアリングさせ、２つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは２価又は二重特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてより完全に記載されている。トリアボディ及びテトラボディはまたＨｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
本明細書では「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、例えば、個々の抗体を含む集団は、可能な突然変異体、例えば、少量で存在し得る天然に存在する突然変異体を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という形容は、個別の抗体の混合物ではない抗体の性質を示す。ある実施態様では、このようなモノクローナル抗体は通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含む方法により得られた。例えば、この選択方法は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの特有のクローンの選択であってもよい。選択された標的結合配列をさらに変化させることにより、例えば、標的への親和性の改善、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中における産生の向上、インビボでのその免疫原性の低減、多重特異性抗体の生成などが可能になり、変化させた標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。様々な決定基（エピトープ）を対象とする様々な抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、その他の免疫グロブリンには通常汚染されていないという点で有利である。
「モノクローナル」という形容は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の性質を示すものであり、抗体を任意の特定の方法によって産生する必要があることを意味するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495-97（1975); Hongo等、Hybridoma, 14（3): 253-260（1995), Harlow等、Antibodies: A Laboratory Manual,（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2版、1988);Hammerling等:A Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681（Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Clackson等、Nature, 352: 624-628（1991); Marks等、J. Mol. Biol. 222: 581-597（1992);Sidhu等、J. Mol. Biol. 338(2): 299-310（2004); Lee等、J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093（2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472（2004);及びLee等、J. Immunnol. Methods 284(1-2): 119-132（2004)参照）及びヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座又は遺伝子の一部又は全てを有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号、；国際公開第１９９６／３４０９６号；国際公開第１９９６／３３７３５号；国際公開第１９９１／１０７４１号；Jakobovits等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551（1993); Jakobovits等、Nature 362: 255-258（1993);Bruggemann等、Year in Immunnol. 7:33（1993); 米国特許第５５４５８０７号；５５４５８０６号；５５６９８２５号；５６２５１２６号；５６３３４２５号；及び５６６１０１６号;Marks等、Bio/Technology 10: 779-783（1992); Lonberg等、Nature 368: 856-859（1994); Morrison, Nature 368: 812-813（1994); Fishwild等、Nature Biotechnol. 14: 845-851（1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826（1996);及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunnol. 13: 65-93（1995)参照）を含む様々な技術によって作製することができる。
本明細書のモノクローナル抗体は特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同であるが、鎖（複数）の残りが別の種に由来するか、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体、並びに所望の生物活性を示す限りこのような抗体の断片を含む（例えば、米国特許第４８１６５６７号及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)を参照のこと）。キメラ抗体には、抗体の抗原結合領域が、例えば、対象とする抗原でマカクザルを免疫することによって産生された抗体に由来するＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体が含まれる。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒトイムノグロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲの残基が所望する特異性、親和性及び／又は能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲの残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体において見出されない残基を含んでいてもよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させるために行ってもよい。一般的に、ヒト化抗体は、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１種、通常２種の可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、任意選択的に免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含む。さらなる詳細は、例えば、Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）参照のこと。また、例えば、Ｖａｓｗａｎｉ及びＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ及びＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）；及び米国特許第６９８２３２１号及び７０８７４０９号を参照のこと。
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、及び／又は本明細書で開示したヒト抗体を作製する技術の何れかを使用して作製した抗体である。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当該技術分野で公知の様々な技術を使用して産生することができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９２）；Ｍａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）。ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用できる方法は、Ｃｏｌｅ等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載された方法である。またｖａｎ Ｄｉｊｋ及びｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ。Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５：３６８−７４（２００１）を参照のこと。ヒト抗体は、抗原曝露に応答してこのような抗体を産生するように改変されているが、その内因性の遺伝子座が無能にされているトランスジェニック動物、例えば、免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによって調製することができる（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関しては、例えば、米国特許第６０７５１８１号及び６１５０５８４号を参照のこと）。またヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されるヒト抗体に関しては、例えば、Ｌｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）を参照のこと。
「種依存性抗体」は、第２の哺乳動物種の抗原の相同体に対するよりも、第１の哺乳動物種の抗原に対してより強力な結合親和性を有する抗体である。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原に「特異的に結合」するが（例えば、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８以下、好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）、２番目の非ヒト哺乳動物種の抗原の相同体に対する結合親和性は、ヒト抗原に対する結合親和性よりも少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍低い。種依存性抗体は、前記で定義した様々な種類の抗体の何れであってもよいが、好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
本明細書で使用した場合、「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」という用語は、配列が超可変であり、及び／又は構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般的に、抗体は６つのＨＶＲ；ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。天然抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示し、特にＨ３は抗体に良好な特異性を付与するときに特有の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕ等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７−４５（２０００）；Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１−２５（Lo編, Human Press, Totowa, N.J., 2003）を参照のこと。実際に、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科の抗体は軽鎖がない状態で機能的で安定である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８（１９９３）；Ｓｈｅｒｉｆｆ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６（１９９６）を参照のこと。
いくつかのＨＶＲの描写が使用され、本明細書に包含される。カバット相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。コチアは、代わりに構造的ループの位置に言及している（Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲとコチア構造的ループの間の折衷案で、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づく。これらのＨＶＲそれぞれの残基を以下に示す。
Figure 0006942465
ＨＶＲは、以下の通りの「拡大ＨＶＲ」を含んでいてもよい：ＶＬの２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７又は８９−９６（Ｌ３）、及びＶＨの２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義それぞれについて、上記のＫａｂａｔ等に従って番号が付されている。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義したようなＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
「カバット（Ｋａｂａｔ）と同様の可変ドメイン残基の番号付け」又は「カバットと同様のアミノ酸位置の番号付け」という用語及びその変形は、上記のＫａｂａｔ等の抗体の編集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを意味する。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲの短縮又はそれらへの挿入に対応する少ないアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含有していてもよい。例えば、重鎖可変ドメインには、Ｈ２の残基５２の後に１個のアミノ酸の挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、カバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含んでもよい。所与の抗体についての残基のカバット番号付けは、「標準の」カバット番号付け配列と抗体配列の相同な領域でアライメントすることによって決定することができる。
可変ドメイン（大体軽鎖の残基１−１０７及び重鎖の残基１−１１３）中における残基に言及するときは、カバット番号付けシステムを一般的に使用する（例えばKabat等、Sequences of Immunological Interest. 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。免疫グロブリン重鎖定常領域中における残基に言及するときは、「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」を一般的に使用する（例えば上記のＫａｂａｔ等に報告されているＥＵインデックス）。「カバットと同様のＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。
「直鎖状抗体」という表現は、Ｚａｐａｔａ等、（1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)に記載された抗体を意味する。簡単に説明すると、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合領域を形成する一対の直列Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は、二重特異性又は単一特異性であってもよい。
本明細書では、「特異的に結合する」又は「特異的な」という用語は、生物学的分子を含む分子の不均一な集団の存在下で標的の存在を決定する、標的と抗体の間の結合などの測定可能で再現可能な相互作用を意味する。例えば、標的（エピトープであってもよい）に特異的に結合する抗体は、その他の標的に結合するよりも高い親和性、結合力で、より容易に、及び／又はより長い期間この標的に結合する抗体である。一実施態様では、関連のない標的への抗体の結合範囲は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定したとき、標的への抗体の結合の約１０％未満である。ある種の実施態様では、標的に特異的に結合する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ又は≦０．１ｎＭである。ある種の実施態様では、抗体は、様々な種のタンパク質間で保存されているタンパク質のエピトープに特異的に結合する。別の実施態様では、特異的結合は排他的結合を含むことができるが、必ずしも必要ではない。
ＩＩ．抗体製剤及び調製物
本明細書では、本発明は抗ＰＤＬ１抗体などの抗体を含む安定な水性製剤に関する。いくつかの実施態様では、この製剤は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）、スクロース、バッファー及び界面活性剤を含み、この製剤のｐＨは約５．０から約７．０である。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体（例えば、本明細書で記載した抗ＰＤＬ１抗体）の量は約４０ｍｇ／ｍＬから約１２５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、バッファーはヒスチジン（例えば、ヒスチジンアセテート）又は酢酸ナトリウムである。いくつかの実施態様では、製剤中のバッファーの濃度は約１５ｍＭから約２５ｍＭである。いくつかの実施態様では、製剤中のスクロースは約６０ｍＭから約２４０ｍＭである。いくつかの実施態様では、製剤中の界面活性剤はポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０）である。いくつかの実施態様では、製剤中のポリソルベートの濃度は約０．００５％（ｗ／ｖ）から約０．０６％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施態様では、製剤のｐＨは約５．０から約６．３である。いくつかの実施態様では、本明細書では安定な水性薬学的製剤を提供し、この製剤は約４０ｍｇ／ｍＬから約１２５ｍｇ／ｍＬの濃度の抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体、約１５ｍＭから約２５ｍＭの濃度のヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウム、約６０ｍＭから約２４０ｍＭの濃度のスクロース、約０．００５％（ｗ／ｖ）から約０．０６％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベートを含み、ｐＨは約５．０から約６．３である。いくつかの実施態様では、製剤は、約１２５ｍｇ／ｍＬの量の抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体、約２４０ｍＭの濃度のスクロースを含み、ｐＨは約５．５である。いくつかの実施態様では、製剤は、約６０ｍｇ／ｍＬの量の抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体、約１２０ｍＭの濃度のスクロースを含み、ｐＨは約５．８である。
いくつかの実施態様では、製剤中の抗体は−２０℃で少なくとも約６カ月、少なくとも約１２カ月、少なくとも約１８カ月、少なくとも２年、少なくとも３年又は少なくとも４年間安定である。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体は２−８℃で少なくとも約６カ月、少なくとも約１２カ月、少なくとも約１８カ月、少なくとも２年又は少なくとも３年間安定である。いくつかの実施態様では、保存後、抗体は、保存前、すなわち、薬学的製剤を調製した時点に示された生物活性（例えば、標的への結合又は治療効力）の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％を保持している。
ある種の実施態様では、製剤は、約４０℃で少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８日間、又はそれ以上安定である。ある種の実施態様では、製剤は、約４０℃で少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８週間、又はそれ以上安定である。ある種の実施態様では、製剤は、約２５℃で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４カ月間、又はそれ以上安定である。ある種の実施態様では、製剤は、約５℃で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４カ月間、又はそれ以上安定である。ある種の実施態様では、製剤は、約−２０℃で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８カ月間、又はそれ以上安定である。ある種の実施態様では、製剤は、５℃又は−２０℃で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８カ月間、又はそれ以上安定である。さらに、製剤は、製剤の凍結（例えば、−２０℃、−４０℃又は−７０℃）及び解凍後、例えば、１、２、３、４又は５回の凍結解凍後に安定であることが好ましい。
Ａ．抗体（抗ＰＤＬ１抗体など）
いくつかの実施態様では、製剤中の抗体は、重鎖及び／又は軽鎖配列中に少なくとも１個のトリプトファン（例えば、少なくとも２個、少なくとも３個又は少なくとも４個）を含む。いくつかの実施態様では、アミノ酸トリプトファンは、抗体のＣＤＲ領域、フレームワーク領域及び／又は定常領域中にある。いくつかの実施態様では、抗体はＣＤＲ領域中に２個又は３個のトリプトファン残基を含む。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体は抗ＰＤＬ１抗体である。ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死１リガンド１）はまた、ＰＤＬ１、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−４、ＣＤ２７４及びＢ７−Ｈとして知られており、膜貫通タンパク質であり、ＰＤ−１との相互作用によってＴ細胞活性化及びサイトカイン産生を阻害する。いくつかの実施態様では、本明細書で記載した抗ＰＤＬ１抗体はヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。本明細書で記載した製剤を使用して製剤化することができる抗ＰＤＬ１抗体の例は、本明細書に参照により援用されるＰＣＴ特許出願国際公開第２０１０／０７７６３４号Ａ１及び米国特許第８２１７１４９号に記載されている。
いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体はＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との間及び／又はＰＤ−Ｌ１とＢ７−１との間の結合を阻害することができる。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体はヒト抗体である。
国際公開第２０１０／０７７６３４号Ａ１及び米国特許第８２１７１４９号で記載された抗ＰＤＬ１抗体は、本明細書で記載した製剤中に製剤化することができる。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体はＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域ポリペプチドを含み、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１配列はＧＦＴＦＳＸ１ＳＷＩＨ （配列番号１１）；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２配列はＡＷＩＸ２ＰＹＧＧＳＸ３ＹＹＡＤＳＶＫＧ （配列番号１２）；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３配列はＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号１３）であり、
さらに、Ｘ１はＤ又はＧであり、Ｘ２はＳ又はＬであり、Ｘ３はＴ又はＳである。
特定の一態様では、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴである。別の態様では、ポリペプチドは、式：（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）に従ってＨＶＲの間に並置された可変領域重鎖フレームワーク配列をさらに含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列はヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。他の態様では、フレームワーク配列はＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。さらに他の態様では、フレームワーク配列の少なくとも１つは以下の通りである：
ＨＣ−ＦＲ１はＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ （配列番号１４）
ＨＣ−ＦＲ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ （配列番号１５）
ＨＣ−ＦＲ３はＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ （配列番号１６）
ＨＣ−ＦＲ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ （配列番号１７）である。
さらに他の態様では、重鎖ポリペプチドはさらに、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む可変領域軽鎖と結合しており、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１配列はＲＡＳＱＸ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７Ｘ８Ａ （配列番号１８）；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２配列はＳＡＳＸ９ＬＸ１０Ｓ （配列番号１９）；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３配列はＱＱＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＰＸ１５Ｔ （配列番号２０）であり、
さらに、Ｘ４はＤ又はＶであり、Ｘ５はＶ又はＩであり、Ｘ６はＳ又はＮであり、Ｘ７はＡ又はＦであり、Ｘ８はＶ又はＬであり、Ｘ９はＦ又はＴであり、Ｘ１０はＹ又はＡであり、Ｘ１１はＹ、Ｇ、Ｆ又はＳであり、Ｘ１２はＬ、Ｙ、Ｆ又はＷであり、Ｘ１３はＹ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｆ又はＩであり、Ｘ１４はＨ、Ｖ、Ｐ、Ｔ又はＩであり、Ｘ１５はＡ、Ｗ、Ｒ、Ｐ又はＴである。
さらに他の態様では、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＶであり、Ｘ６はＳであり、Ｘ７はＡであり、Ｘ８はＶであり、Ｘ９はＦであり、Ｘ１０はＹであり、Ｘ１１はＹであり、Ｘ１２はＬであり、Ｘ１３はＹであり、Ｘ１４はＨであり、Ｘ１５はＡである。さらに他の態様では、軽鎖は、式（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）に従ってＨＶＲの間に並置された可変領域軽鎖フレームワーク配列をさらに含む。さらに他の態様では、フレームワーク配列はヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらに他の態様では、フレームワーク配列はＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらに他の態様では、フレームワーク配列の少なくとも１個が以下の通りである：
ＬＣ−ＦＲ１はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ （配列番号２１）
ＬＣ−ＦＲ２はＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ （配列番号２２）
ＬＣ−ＦＲ３はＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ （配列番号２３）
ＬＣ−ＦＲ４はＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ （配列番号２４）。
別の実施態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体又は抗原結合断片を提供し：
（ａ）重鎖はＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、さらに、
（ｉ）ＨＶＲ−Ｈ１配列はＧＦＴＦＳＸ１ＳＷＩＨ （配列番号１１）
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ２配列はＡＷＩＸ２ＰＹＧＧＳＸ３ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ３配列はＲＨＷＰＧＧＦＤＹ （配列番号１３）であり、
（ｂ）軽鎖はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、さらに、
（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１配列はＲＡＳＱＸ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７Ｘ８Ａ （配列番号１８）
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２配列はＳＡＳＸ９ＬＸ１０Ｓ （配列番号１９）、及び
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３配列はＱＱＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＰＸ１５Ｔ （配列番号２０）であり、
さらに、Ｘ１はＤ又はＧであり、Ｘ２はＳ又はＬであり、Ｘ３はＴ又はＳであり、Ｘ４はＤ又はＶであり、Ｘ５はＶ又はＩであり、Ｘ６はＳ又はＮであり、Ｘ７はＡ又はＦであり、Ｘ８はＶ又はＬであり、Ｘ９はＦ又はＴであり、Ｘ１０はＹ又はＡであり、Ｘ１１はＹ、Ｇ、Ｆ又はＳであり、Ｘ１２はＬ、Ｙ、Ｆ又はＷであり、Ｘ１３はＹ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｆ又はＩであり、Ｘ１４はＨ、Ｖ、Ｐ、Ｔ又はＩであり、Ｘ１５はＡ、Ｗ、Ｒ、Ｐ又はＴである。
特定の態様では、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴである。別の態様では、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＶであり、Ｘ６はＳであり、Ｘ７はＡであり、Ｘ８はＶであり、Ｘ９はＦであり、Ｘ１０はＹであり、Ｘ１１はＹであり、Ｘ１２はＬであり、Ｘ１３はＹであり、Ｘ１４はＨであり、Ｘ１５はＡである。さらに別の態様では、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＶであり、Ｘ６はＳであり、Ｘ７はＡであり、Ｘ８はＶであり、Ｘ９はＦであり、Ｘ１０はＹであり、Ｘ１１はＹであり、Ｘ１２はＬであり、Ｘ１３はＹであり、Ｘ１４はＨであり、Ｘ１５はＡである。
他の態様では、重鎖可変領域は（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のようにＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のようにＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。さらに他の態様では、フレームワーク配列はヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらに他の態様では、重鎖フレームワーク配列はカバットサブグループＩ、ＩＩ又はＩＩＩ配列に由来する。さらに他の態様では、重鎖フレームワーク配列はＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。さらに他の態様では、１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＨＣ−ＦＲ１ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１４）
ＨＣ−ＦＲ２ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ （配列番号１５）
ＨＣ−ＦＲ３ ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ （配列番号１６）
ＨＣ−ＦＲ４ ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ （配列番号１７）。
さらに他の態様では、軽鎖フレームワーク配列はカバットカッパＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。さらに他の態様では、軽鎖フレームワーク配列はＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらに他の態様では、１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＬＣ−ＦＲ１ ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ （配列番号２１）
ＬＣ−ＦＲ２ ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ （配列番号２２）
ＬＣ−ＦＲ３ ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ （配列番号２３）
ＬＣ−ＦＲ４ ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ （配列番号２４）。
さらに他の特定の態様では、抗体はさらにヒト又はマウスの定常領域を含む。さらに他の態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択する。さらに他の特定の態様では、ヒト定常領域はＩｇＧである。さらに他の態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択する。さらに他の態様では、マウス定常領域はＩｇＧ２Ａである。さらに他の特定の態様では、抗体のエフェクター機能は低下しているか、又は最小限である。さらに他の特定の態様では、最小限のエフェクター機能は「エフェクターのないＦｃ突然変異」又は非グリコシル化によって生じる。さらに他の実施態様では、エフェクターのないＦｃ突然変異は、定常領域におけるＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
さらに別の実施態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤＬ１抗体を提供し、
（ａ）重鎖はさらにＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号２５）、ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）及びＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号１３）それぞれに対して少なくとも８５％配列同一性を有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含み、又は
（ｂ）軽鎖はさらにＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号２７）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２８）及びＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号２９）それぞれに対して少なくとも８５％配列同一性を有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。
特定の態様では、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。別の態様では、重鎖可変領域は（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のようにＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のようにＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列はヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらに他の態様では、重鎖フレームワーク配列はカバットサブグループＩ、ＩＩ又はＩＩＩ配列に由来する。さらに他の態様では、重鎖フレームワーク配列はＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。さらに他の態様では、１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＨＣ−ＦＲ１ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１４）
ＨＣ−ＦＲ２ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ （配列番号１５）
ＨＣ−ＦＲ３ ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ （配列番号１６）
ＨＣ−ＦＲ４ ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ （配列番号１７）。
さらに他の態様では、軽鎖フレームワーク配列はカバットカッパＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。さらに他の態様では、軽鎖フレームワーク配列はＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらに他の態様では、１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＬＣ−ＦＲ１ ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ （配列番号２１）
ＬＣ−ＦＲ２ ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ （配列番号２２）
ＬＣ−ＦＲ３ ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ （配列番号２３）
ＬＣ−ＦＲ４ ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ （配列番号２４）。
さらに他の特定の態様では、抗体はさらにヒト又はマウスの定常領域を含む。さらに他の態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択する。さらに他の特定の態様では、ヒト定常領域はＩｇＧである。さらに他の態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択する。さらに他の態様では、マウス定常領域はＩｇＧ２Ａである。さらに他の特定の態様では、抗体のエフェクター機能は低下しているか、又は最小限である。さらに他の特定の態様では、最小限のエフェクター機能は「エフェクターのないＦｃ突然変異」又は非グリコシル化によって生じる。さらに他の実施態様では、エフェクターのないＦｃ突然変異は、定常領域におけるＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
さらに他の実施態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体を提供し、
（ａ）重鎖配列が重鎖配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号３０）
に対して少なくとも８５％配列同一性を有するか、又は
（ｂ）軽鎖配列が軽鎖配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦ
ＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号３１）
に対して少なくとも８５％配列同一性を有する。
特定の態様では、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。別の態様では、重鎖可変領域は（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のようにＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のようにＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列はヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。他の態様では、重鎖フレームワーク配列はカバットサブグループＩ、ＩＩ又はＩＩＩ配列に由来する。さらに他の態様では、重鎖フレームワーク配列はＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。さらに他の態様では、１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＨＣ−ＦＲ１ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１４）
ＨＣ−ＦＲ２ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ （配列番号１５）
ＨＣ−ＦＲ３ ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ （配列番号１６）
ＨＣ−ＦＲ４ ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ （配列番号１７）。
さらに他の態様では、軽鎖フレームワーク配列はカバットカッパＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。さらに他の態様では、軽鎖フレームワーク配列はＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらに他の態様では、１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＬＣ−ＦＲ１ ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ （配列番号２１）
ＬＣ−ＦＲ２ ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ （配列番号２２）
ＬＣ−ＦＲ３ ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ （配列番号２３）
ＬＣ−ＦＲ４ ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ （配列番号２４）。
さらに他の特定の態様では、抗体はさらにヒト又はマウスの定常領域を含む。さらに他の態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択する。さらに他の特定の態様では、ヒト定常領域はＩｇＧである。さらに他の態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択する。さらに他の態様では、マウス定常領域はＩｇＧ２Ａである。さらに他の特定の態様では、抗体のエフェクター機能は低下しているか、又は最小限である。さらに他の特定の態様では、最小限のエフェクター機能は原核細胞における産生によって生じる。さらに他の特定の態様では、最小限のエフェクター機能は「エフェクターのないＦｃ突然変異」又は非グリコシル化によって生じる。さらに他の実施態様では、エフェクターのないＦｃ突然変異は、定常領域におけるＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
別のさらなる実施態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体を提供し：
（ａ）重鎖配列は重鎖配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）
に対して少なくとも８５％配列同一性を有し、又は
（ｂ）軽鎖配列は軽鎖配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦ
ＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号３１）
に対して少なくとも８５％配列同一性を有する。
特定の態様では、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。別の態様では、重鎖可変領域は（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のようにＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のようにＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列はヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。他の態様では、重鎖フレームワーク配列はカバットサブグループＩ、ＩＩ又はＩＩＩ配列に由来する。さらに他の態様では、重鎖フレームワーク配列はＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。さらに他の態様では、１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＨＣ−ＦＲ１ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１４）
ＨＣ−ＦＲ２ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ （配列番号１５）
ＨＣ−ＦＲ３ ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ （配列番号１６）
ＨＣ−ＦＲ４ ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号３３）。
さらに他の態様では、軽鎖フレームワーク配列はカバットカッパＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。さらに他の態様では、軽鎖フレームワーク配列はＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらに他の態様では、１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＬＣ−ＦＲ１ ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ （配列番号２１）
ＬＣ−ＦＲ２ ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ （配列番号２２）
ＬＣ−ＦＲ３ ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ （配列番号２３）
ＬＣ−ＦＲ４ ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ （配列番号２４）。
さらに他の特定の態様では、抗体はさらにヒト又はマウスの定常領域を含む。さらに他の態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択する。さらに他の特定の態様では、ヒト定常領域はＩｇＧである。さらに他の態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択する。さらに他の態様では、マウス定常領域はＩｇＧ２Ａである。さらに他の特定の態様では、抗体のエフェクター機能は低下しているか、又は最小限である。さらに他の特定の態様では、最小限のエフェクター機能は原核細胞における産生によって生じる。さらに他の特定の態様では、最小限のエフェクター機能は「エフェクターのないＦｃ突然変異」又は非グリコシル化によって生じる。さらに他の実施態様では、エフェクターのないＦｃ突然変異は、定常領域のＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
他の態様では、重鎖可変領域は（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のようにＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のようにＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。さらに他の態様では、フレームワーク配列はヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらに他の態様では、重鎖フレームワーク配列はカバットサブグループＩ、ＩＩ又はＩＩＩ配列に由来する。さらに他の態様では、重鎖フレームワーク配列はＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。さらに他の態様では、１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＨＣ−ＦＲ１ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ （配列番号３４）
ＨＣ−ＦＲ２ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ （配列番号３５）
ＨＣ−ＦＲ３ ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ （配列番号１６）
ＨＣ−ＦＲ４ ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号３３）。
さらに他の態様では、軽鎖フレームワーク配列はカバットカッパＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。さらに他の態様では、軽鎖フレームワーク配列はＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらに他の態様では、１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＬＣ−ＦＲ１ ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ （配列番号２１）
ＬＣ−ＦＲ２ ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ （配列番号２２）
ＬＣ−ＦＲ３ ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ （配列番号２３）
ＬＣ−ＦＲ４ ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ （配列番号３６）。
さらに他の特定の態様では、抗体はさらにヒト又はマウスの定常領域を含む。さらに他の態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択する。さらに他の特定の態様では、ヒト定常領域はＩｇＧである。さらに他の態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択する。さらに他の態様では、マウス定常領域はＩｇＧ２Ａである。さらに他の特定の態様では、抗体のエフェクター機能は低下しているか、又は最小限である。さらに他の特定の態様では、最小限のエフェクター機能は「エフェクターのないＦｃ突然変異」又は非グリコシル化によって生じる。さらに他の実施態様では、エフェクターのないＦｃ突然変異は、定常領域のＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
さらに別の実施態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤＬ１抗体を提供し、
（ｃ）重鎖はさらにＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号４）、ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）及びＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号６）それぞれに対して少なくとも８５％配列同一性を有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含み、又は
（ｄ）軽鎖はさらにＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２）及びＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号３）それぞれに対して少なくとも８５％配列同一性を有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。
特定の態様では、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。別の態様では、重鎖可変領域は（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のようにＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のようにＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列はヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらに他の態様では、重鎖フレームワーク配列はカバットサブグループＩ、ＩＩ又はＩＩＩ配列に由来する。さらに他の態様では、重鎖フレームワーク配列はＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。さらに他の態様では、１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＨＣ−ＦＲ１ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号３４）
ＨＣ−ＦＲ２ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ （配列番号３５）
ＨＣ−ＦＲ３ ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ （配列番号１６）
ＨＣ−ＦＲ４ ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫ （配列番号３３）。
さらに他の態様では、軽鎖フレームワーク配列はカバットカッパＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。さらに他の態様では、軽鎖フレームワーク配列はＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらに他の態様では、１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＬＣ−ＦＲ１ ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ （配列番号２１）
ＬＣ−ＦＲ２ ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ （配列番号２２）
ＬＣ−ＦＲ３ ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ （配列番号２３）
ＬＣ−ＦＲ４ ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ （配列番号２４）
さらに他の特定の態様では、抗体はさらにヒト又はマウスの定常領域を含む。さらに他の態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択する。さらに他の特定の態様では、ヒト定常領域はＩｇＧ１である。さらに他の態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択する。さらに他の態様では、マウス定常領域はＩｇＧ２Ａである。さらに他の特定の態様では、抗体のエフェクター機能は低下しているか、又は最小限である。さらに他の特定の態様では、最小限のエフェクター機能は「エフェクターのないＦｃ突然変異」又は非グリコシル化によって生じる。さらに他の実施態様では、エフェクターのないＦｃ突然変異は、定常領域のＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
さらに他の実施態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体を提供し：
（ａ）重鎖配列は重鎖配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫ（配列番号８）
に対して少なくとも８５％配列同一性を有し、又は
（ｂ）軽鎖配列は軽鎖配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号７）
に対して少なくとも８５％配列同一性を有する。
いくつかの実施態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体を提供し、この軽鎖可変領域配列は配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する。いくつかの実施態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体を提供し、この重鎖可変領域配列は配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する。いくつかの実施態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体を提供し、この軽鎖可変領域配列は配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有し、この重鎖可変領域配列は配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する。
さらに他の実施態様では、重鎖及び軽鎖配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体を提供し、
（ａ）重鎖配列は重鎖配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１０）
に対して少なくとも８５％配列同一性を有し、又は
（ｂ）軽鎖配列は軽鎖配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号９）
に対して少なくとも８５％配列同一性を有する。
いくつかの実施態様では、重鎖及び軽鎖配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体を提供し、この軽鎖配列は配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する。いくつかの実施態様では、重鎖及び軽鎖配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体を提供し、この重鎖配列は配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する。いくつかの実施態様では、重鎖及び軽鎖配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体を提供し、この軽鎖配列は配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有し、この重鎖配列は配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する。
いくつかの実施態様では、単離された抗ＰＤＬ１抗体は酸化されたモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、製剤中の酸化されたモノクローナル抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施態様では、製剤中の酸化されたモノクローナル抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、Ｗ３３、Ｗ５０又はＷ１０１の１つ又は複数が酸化されている。いくつかの実施態様では、製剤中の酸化されたモノクローナル抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、Ｍ２５３及びＭ４２９の１つ又は複数が酸化されている。いくつかの実施態様では、酸化されたモノクローナル抗体は、保存前、すなわち、薬学的製剤を調製した時点に示された生物活性（例えば、標的への結合又は治療効力）の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％を保持している。
いくつかの実施態様では、単離された抗ＰＤＬ１抗体は糖化されたモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、製剤中の糖化されたモノクローナル抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施態様では、製剤中の糖化されたモノクローナル抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、リジンの１つ又は複数が糖化されている。いくつかの実施態様では、製剤中の糖化されたモノクローナル抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、Ｋ６５が糖化されている。
いくつかの実施態様では、単離された抗ＰＤＬ１抗体は糖化されていない。
本明細書の実施態様の何れにおいても、単離された抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１、例えば、ユニプロットＫＢ／スイスプロット寄託番号Ｑ９ＮＺＱ７．１に示されたようなヒトＰＤ−Ｌ１又はその変異体に結合することができる。
さらに他の実施態様では、本明細書で記載した抗体の何れかをコードする単離された核酸を提供する。いくつかの実施態様では、核酸はさらに、以前に記載した抗ＰＤＬ１抗体の何れかをコードする核酸の発現に適したベクターを含む。さらに他の特定の態様では、ベクターは核酸の発現に適した宿主細胞中に存在する。さらに他の特定の態様では、宿主細胞は真核細胞又は原核細胞である。さらに他の特定の態様では、真核細胞は哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
抗体又はその抗原結合断片は、当該技術分野で公知の方法を使用して、例えば、既に記載した抗ＰＤＬ１抗体又は抗原結合断片の何れかをコードする核酸を発現に適した形態で含有する宿主細胞を、このような抗体又は断片の産生に適した条件下で培養し、抗体又は断片を回収することを含む方法によって、作製することができる。
Ｂ．抗体の調製
製剤中の抗体は抗体を生成するための当該技術分野で利用可能な技術を使用して調製し、その例示的な方法を以下の項でより詳細に説明する。
抗体は、対象とする抗原（すなわち、ＰＤ−Ｌ１、例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１）を対象とする。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドで、障害に罹患した哺乳動物に抗体を投与することによってこの哺乳動物に治療的利益をもたらすことができる。
（ｉ）抗原の調製
その他の分子に任意選択的にコンジュゲートさせた可溶型抗原又はそれらの断片を抗体生成のための免疫原として使用することができる。膜貫通分子、例えば、受容体については、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）を免疫原として使用することができる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として使用することができる。このような細胞は、天然の供給源（例えば、がん細胞株）に由来してもよく、又は膜貫通分子を発現するために組換え技術によって形質転換させた細胞であってもよい。その他の抗原及び抗体を調製するために有用なそれらの形態は当業者には明らかであろう。
（ｉｉ）ある種の抗体をベースにした方法
ポリクローナル抗体は、関連のある抗原及びアジュバントを複数回動物の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）に注射することによって動物で生じさせることが好ましい。免疫する種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又はダイズトリプシン阻害因子に、二機能性又は誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを使用して、関連抗原をコンジュゲートすることが有用であり得る。
例えば、（ウサギ又はマウスそれぞれに対して）１００μｇ又は５μｇのタンパク質又はコンジュゲートを３倍量の完全フロイントアジュバントと混合し、この溶液を複数の部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート又は誘導体に対して動物を免疫する。１カ月後、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５から１／１０のペプチド又はコンジュゲートを複数の部位に皮下注射することによって、この動物を追加免疫する。７日から１４日後、この動物から採血し、そして血清の抗体価をアッセイする。力価がプラトーになるまで動物を追加免疫する。好ましくは、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なるタンパク質とコンジュゲートしたもの、及び／又は異なる架橋試薬を介してコンジュゲートしたもので動物を追加免疫する。コンジュゲートは、タンパク質融合体として組換え細胞培養において作製することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤を適切に使用して免疫応答を増強する。
本発明のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載され、例えば、Ｈｏｎｇｏ等、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ等、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2版、1988）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ等、：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１（Elsevier, N.Y., 1981）及びヒト−ヒトハイブリドーマに関してはＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５−２６８（２００６）においてさらに記載されたハイブリドーマ法を使用して作製することができる。他の方法には、例えば、ハイブリドーマ細胞株からの天然のヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の産生に関する米国特許第７１８９８２６号に記載された方法が含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ及びＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０（３）：９２７−９３７（２００５）並びにＶｏｌｌｍｅｒｓ及びＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。
様々なその他のハイブリドーマ技術については、例えば、米国特許出願第２００６／２５８８４１号、米国特許出願第２００６／１８３８８７号（完全なヒト抗体）、米国特許出願第２００６／０５９５７５号、米国特許出願第２００５／２８７１４９号、米国特許出願第２００５／１００５４６号、米国特許出願第２００５／０２６２２９号及び米国特許第７０７８４９２号及び第７１５３５０７号を参照のこと。ハイブリドーマ法を使用したモノクローナル抗体産生の例示的プロトコールを以下に記載する。一実施態様では、マウス又はその他の適切な宿主動物、例えば、ハムスターを免疫して、免疫化に使用したタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することができるリンパ球を誘発する。抗体は、本発明のポリペプチド又はその断片及びアジュバント、例えば、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）／トレハロースジコリノミコレート（ＴＤＭ）の複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射によって動物で生じる（Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.）。本発明のポリペプチド（例えば、抗原）又はその断片は、当該技術分野で周知の方法、例えば、組換え法を使用して調製することができ、それらのいくつかを本明細書でさらに説明する。免疫した動物の血清の抗−抗原抗体をアッセイし、ブースター免疫は任意選択的で投与する。抗−抗原抗体を産生する動物のリンパ球を単離する。あるいは、リンパ球はインビトロにおいて免疫してもよい。
次に、適切な融剤、例えば、ポリエチレングリコールを使用してリンパ球を骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ｐ．５９−１０３（Academic Press, 1986）を参照のこと。効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性のある骨髄腫細胞を使用することができる。例示的骨髄腫細胞には、限定はしないが、マウスの骨髄腫株、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来する細胞及びアメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡ．から入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞が含まれる。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されたことがある（Kozbor, J. Immunnol., 133:3001(1984); Brodeur等、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63（Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
このように調製したハイブリドーマ細胞を播種し、適切な培地、例えば、融合していない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を含有する培地で増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠如しているならば、通常ハイブリドーマ用の培地はヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むものとし（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損Ｔ細胞の増殖を妨害する。好ましくは、例えば、Ｅｖｅｎ等、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２４（３）、１０５−１０８（２００６）において記載されたように、ウシ胎児血清などの動物由来血清の使用を抑えるために、血清を含まないハイブリドーマ細胞培養法を使用する。
ハイブリドーマ細胞培養物の生産性を改善するための手段としてのオリゴペプチドは、Ｆｒａｎｅｋ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１１−１２２（２００５）に記載されている。特に、標準的な培地はある種のアミノ酸（アラニン、セリン、アスパラギン、プロリン）又はタンパク質加水分解画分が強化されており、アポトーシスは３から６個のアミノ酸残基から構成される合成オリゴペプチドによって著しく抑制することができる。ペプチドは、ミリモル以上の濃度で存在する。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、本発明の抗体に結合するモノクローナル抗体の産生についてアッセイすることができる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定することができる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード分析によって測定することができる。例えば、Ｍｕｎｓｏｎ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０）を参照のこと。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、このクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、上記を参照のこと。この目的に適した培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、インビボにおいて増殖させることができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から適切に分離される。ハイブリドーマ細胞からタンパク質を単離するための１手法は米国特許出願第２００５／１７６１２２号及び米国特許第６９１９４３６号に記載されている。この方法には、結合方法において最小限の塩、例えば、離液系列塩を使用することが含まれ、好ましくは溶出方法において少量の有機溶媒を使用することも含まれる。
（ｉｉｉ）ある種のライブラリースクリーニング法
本発明の抗体は、所望する活性（一又は複数）を備えた抗体をスクリーニングするためにコンビナトリアルライブラリーを使用することによって作製することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成するため、及び所望する結合特性を有する抗体のこのようなライブラリーをスクリーニングするための種々の方法が当該技術分野では公知である。このような方法は一般的にＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（O'Brien等、Human Press, Totowa, N.J., 2001）に記載されている。例えば、対象とする抗体を生成する一方法は、Ｌｅｅ等、Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（２００４）、３４０（５）：１０７３−９３において記載されたようなファージ抗体ライブラリーの使用による。
原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片を示すファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択する。このようなファージライブラリーは、所望する抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによってパニングする。所望する抗原に結合することができるＦｖ断片を発現するクローンは抗原に吸着し、したがってライブラリー中の非結合クローンから分離する。次に、結合するクローンを抗原から溶出し、さらに抗原吸着／溶出サイクルを行うことによってさらに濃縮することができる。本発明の抗体の何れも、対象とするファージクローンを選択するために適した抗原スクリーニング法を設計し、次に、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１）、１−３巻に記載された対象とするファージクローンのＦｖ配列及び適切な定常領域（Ｆｃ）配列を使用して完全長抗体クローンを構築することによって得ることができる。
ある種の実施態様では、抗体の抗原結合ドメインは約１１０個のアミノ酸の可変（Ｖ）領域２個から形成され、それぞれの領域は軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）からなり、何れも３個の超可変ループ（ＨＶＲ）又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を提示する。可変ドメインは、Ｗｉｎｔｅｒ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｎｏｌ．、１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されたように、ＶＨ及びＶＬが短い可動性のペプチドによって共有結合的に結合した単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はそれぞれが定常ドメインに融合し、非共有結合的に相互作用するＦａｂ断片の何れかとして、ファージ上に機能的に表すことができる。本明細書では、ｓｃＦｖをコードするファージクローン及びＦａｂをコードするファージクローンは総称して「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と呼ぶ。
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、Ｗｉｎｔｅｒ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｎｏｌ．、１２： ４３３−４５５（１９９４）に記載されたように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリーに無作為に組み換えることができ、その後、抗原結合クローンを検索することができる。免疫した供給源のライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等、ＥＭＢＯ Ｊ、１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されたように、未処理のレパートリーをクローニングすると、いかなる免疫化も行うことなく広範囲の自己及び非自己抗原にも対するヒト抗体の単一の供給源を提供することができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されたように、未処理のライブラリーはまた、幹細胞から再配列していないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードしインビトロにおいて再配列を達成して、合成によって作製することができる。
ある種の実施態様では、線状ファージを使用してマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩに融合させることによって抗体断片を表示する。抗体断片は、例えば、Ｍａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されたように、ＶＨ及びＶＬドメインが可動性ポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖に連結した１本鎖Ｆｖ断片として、又は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：４１３３−４１３７（１９９１）に記載されたように、１本の鎖がｐＩＩＩに融合し、他方が細菌宿主細胞の周辺質に分泌して、そこで野生型コートタンパク質のいくつかと置換することによってファージ表面上で表示されるようになるＦａｂ−コートタンパク質構造を構築するＦａｂ断片として表示することができる。
一般的に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から収集した免疫細胞から得られる。抗−抗原クローンに偏ったライブラリーを所望する場合、対象を抗原で免疫して抗体応答を生じさせ、脾臓細胞及び／又は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）以外の循環するＢ細胞をライブラリー構築物から回収する。一実施態様では、抗−抗原クローンに偏ったヒト抗体遺伝子断片ライブラリーは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する（機能的内因性抗体産生系を欠如した）トランスジェニックマウスにおいて抗−抗原抗体応答を生じさせることによって得られ、したがって抗原による免疫化によって抗原に対するヒト抗体を産生するＢ細胞が生じる。ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスの作製を以下に説明する。
抗−抗原反応細胞集団のさらなる濃縮は、抗原特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離するために適したスクリーニング法を使用して、例えば、抗原アフィニティークロマトグラフィー又は蛍光色素標識された抗原への細胞の吸着、その後の蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用した細胞分離によって得ることができる。
あるいは、免疫していないドナーの脾臓細胞及び／又はＢ細胞又はその他のＰＢＬの使用によって、可能な抗体レパートリーがよりよく表され、抗原に抗原性がない任意の動物（ヒト又は非ヒト）種を使用した抗体ライブラリーの構築も可能になる。インビトロにおいて抗体遺伝子構築物を組み込むライブラリーでは、再配列していない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供するために、対象から幹細胞を収集する。対象とする免疫細胞は、種々の動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、オオカミ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ及びトリ種などから得ることができる。
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸を対象とする細胞から回収し、増幅する。再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーの場合、所望するＤＮＡは、Ｏｒｌａｎｄｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６：３８３３−３８３７（１９８９）に記載されたように、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡをリンパ球から単離し、その後再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子の５’及び３’末端に合致するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって発現用の異なるＶ遺伝子レパートリーを作製することによって得ることができる。Ｖ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉ等（１９８９）及びＷａｒｄ等、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４−５４６（１９８９）に記載されたように、成熟Ｖ−ドメインをコードするエクソンの５’末端のバックプライマー及びＪセグメント内に基づくフォワードプライマーを用いてｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅することができる。しかし、ｃＤＮＡから増幅するためには、バックプライマーはまた、Ｊｏｎｅｓ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９：８８−８９（１９９１）に記載されたようにリーダーエキソン内に基づいていてもよく、フォワードプライマーは、Ｓａｓｔｒｙ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６：５７２８−５７３２（１９８９）に記載されたように定常領域内に基づくことができる。Ｏｒｌａｎｄｉ等（１９８９）又はＳａｓｔｒｙ等（１９８９）に記載されたように、相補性を最大限にするために、プライマーに縮重を組み込むことができる。ある種の実施態様では、ライブラリーの多様性は、免疫細胞の核酸試料中に存在する利用可能なＶＨ及びＶＬ配置全てを増幅するために、例えば、Ｍａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７（１９９１）の方法において記載されたように、又はＯｒｕｍ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：４４９１−４４９８（１９９３）の方法において記載されたように、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的とするＰＣＲプライマーを使用することによって最大限にする。増幅したＤＮＡを発現ベクター中にクローニングするために、Ｏｒｌａｎｄｉ等、（１９８９）に記載されたようにタグとして、又は、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載されたようにタグ付けしたプライマーを用いたさらなるＰＣＲ増幅によって、希少な制限部位をＰＣＲプライマー内の１末端に導入することができる。
合成によって再配列したＶ遺伝子のレパートリーは、Ｖ遺伝子セグメントからインビトロにおいて得ることができる。ヒトＶＨ遺伝子セグメントのほとんどをクローニングし、配列決定し（Tomlinson等、J. Mol. Biol., 227: 776-798（1992)において報告された）、マップで表し（Matsuda等、Nature Genet., 3: 88-94（1993)において報告された）、これらのクローニングしたセグメント（Ｈ１及びＨ２ループの主要な立体構造全てを含む）を使用して、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されたように、多様な配列及び長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーを用いて多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作製することができる。ＶＨレパートリーはまた、Ｂａｒｂａｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４４５７−４４６１（１９９２）に記載されたように、単一の長さの長いＨ３ループ中に着目した配列多様性全てを用いて作製することができる。ヒトＶκ及びＶλセグメントをクローニングし、配列決定し（Williams及びWinter, Eur. J. Immunnol., 23: 1456-1461（1993)において報告された）、合成軽鎖レパートリーを作製するために使用することができる。一連のＶＨ及びＶＬの折りたたみ、及びＬ３及びＨ３の長さに基づく合成Ｖ遺伝子レパートリーは、構造多様性に富んだ抗体をコードする。Ｖ遺伝子をコードするＤＮＡを増幅した後、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントを、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１−３８８（１９９２）の方法に従って、インビトロにおいて再配列することができる。
抗体断片のレパートリーは、いくつかの方法でＶＨとＶＬ遺伝子レパートリーを一緒に組み合わせることによって構築することができる。各レパートリーを様々なベクターで生成することができ、ベクターは、例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅ等、Ｇｅｎｅ、１２８：１１９−１２６（１９９３）に記載されたようにインビトロにおいて、又は、コンビナトリアル感染、例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：２２６５−２２６６（１９９３）に記載されたｌｏｘＰ系によってインビボにおいて、再度組み合わせることができる。インビボにおいて再度組み合わせる手法は、Ｆａｂ断片の２本鎖の性質を活用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換効率によって制約されるライブラリーサイズの限界を克服する。未処理のＶＨ及びＶＬレパートリーを別々に、１つをファージミドに、他方をファージベクターにクローニングする。次に、２つのライブラリーをファージミド含有細菌のファージ感染によって一緒にし、したがって、各細胞は異なる組み合わせを含有し、ライブラリーサイズは存在する細胞の数によってのみ制限される（約１０１２クローン）。両方のベクターは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコンで再結合してファージビリオン中にひとまとめにされるようにインビボにおいて再結合シグナルを含有する。これらの巨大なライブラリーは、親和性の良好な（Ｋｄ −１約１０−８Ｍ）多様な抗体を多数もたらす。
あるいは、このレパートリーは、例えば、Ｂａｒｂａｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載されたように、同じベクター中に順次クローニングするか、又は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載されたように、ＰＣＲによって一緒にアセンブリしてからクローニングすることができる。ＰＣＲアセンブリを使用して、ＶＨ及びＶＬ ＤＮＡを可動性ペプチドスペーサーをコードするＤＮＡと一緒にして１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成することもできる。さらに別の技術では、Ｅｍｂｌｅｔｏｎ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：３８３１−３８３７（１９９２）に記載されたように、「細胞内ＰＣＲアセンブリ」を使用してＶＨ及びＶＬ遺伝子をＰＣＲによってリンパ球内に一緒にし、その後、結合した遺伝子のレパートリーをクローニングする。
未処理のライブラリー（天然又は合成の何れか）によって生成した抗体の親和性は中程度（約１０６から１０７Ｍ−１のＫｄ −１）であるが、親和性成熟はまた、Ｗｉｎｔｅｒ等（１９９４）、上記において記載されたように、第２のライブラリーから構築し、再度選択することによってインビトロにおいて模倣させることができる。例えば、突然変異は、Ｈａｗｋｉｎｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９−８９６（１９９２）の方法において、又はＧｒａｍ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９：３５７６−３５８０（１９９２）の方法において、エラープローンポリメラーゼを使用することによって（Leung等、Technique 1: 11-15（1989)において報告された）インビトロにおいて無作為に導入することができる。さらに、親和性成熟は、例えば、選択した個々のＦｖクローンにおいて対象とするＣＤＲを包含するランダム配列を有するプライマーを用いたＰＣＲを使用して、１つ又は複数のＣＤＲを無作為に変異させ、親和性の高いクローンをスクリーニングすることによって実施することができる。国際公開第９６０７７５４号（１９９６年５月１４日に公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域中に突然変異誘発を導き、軽鎖遺伝子のライブラリーを生成する方法について記載している。別の有効な手法は、Ｍａｒｋｓ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０：７７９−７８３（１９９２）において記載されたように、ファージディスプレイによって選択したＶＨ又はＶＬドメインを免疫していないドナーから得られた天然に存在するＶドメイン変異体のレパートリーと再度一緒にして、鎖の再シャッフルを数回行って高い親和性をスクリーニングする手法である。この技術は、約１０−９Ｍ以下の親和性を備えた抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
ライブラリーのスクリーニングは、当該技術分野で公知の様々な技術によって実現することができる。例えば、抗原は、吸着プレートのウェルのコーティングに使用するか、吸着プレート上に固定された宿主細胞上に発現させるか、又はセルソーティングにおいて使用するか、又はストレプトアビジン被覆ビーズに捕捉させるためにビオチンにコンジュゲートするか、又はファージディスプレイライブラリーをパニングするための任意のその他の方法で使用することができる。
ファージライブラリー試料は、吸着剤を有するファージ粒子の少なくとも一部に結合するために適した条件下で、固定化されている抗原と接触させる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む条件は、生理的条件を模倣するように選択する。固体相に結合したファージを洗浄し、次に、例えば、Ｂａｒｂａｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８８：７９７８−７９８２（１９９１）によって記載されたように酸によって、又は、例えば、Ｍａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されたようにアルカリによって、又は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１）の抗原競合法と類似の手法における抗原競合によって溶出する。ファージは、１回の選択によって２０−１０００倍に濃縮することができる。さらに、濃縮したファージは、細菌培養において増殖させ、さらに選択を行うことができる。
選択の効率は、洗浄中の解離反応速度、単一のファージ上の複数の抗体断片が同時に抗原と関与できるかどうかを含む多くの要素に左右される。解離反応速度が速い（結合親和性が弱い）抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ及び固体相における高いコーティング密度の抗原を使用することによって保持することができる。高密度は、多価相互作用においてファージを安定化するだけでなく、解離したファージの再結合に好都合である。解離反応速度が遅い（結合親和性が良好である）抗体の選択は、Ｂａｓｓ等、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８：３０９−３１４（１９９０）及び国際公開第９２／０９６９０号に記載されたように、長い洗浄及び一価のファージディスプレイを使用することによって、Ｍａｒｋｓ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されたように、抗原の低いコーティング密度を使用することによって促進することができる。
抗原に対して様々な親和性を備えたファージ抗体を、親和性が少ししか異ならなくても選択することが可能である。しかし、選択した抗体のランダム突然変異（例えば、いくつかの親和性成熟技術において実施したような）は、ほとんどが抗原に結合し、いくつかは親和性が高い多くの変異体を生じる可能性がある。抗原を限定すると、希少な親和性の高いファージを選りすぐることができた。親和性の高い変異体を全て保持するために、過剰なビオチン化抗原であるが、抗原の標的モル親和定数よりも低いモル濃度のビオチン化抗原とファージを一緒にインキュベートすることができる。次に、結合親和性の高いファージをストレプトアビジン被覆常磁性ビーズによって捕捉することができる。このような「平衡捕捉」によって、大過剰の低親和性のファージから親和性が２倍だけ高い変異体クローンの単離を可能にする感受性を用いて、結合の親和性によって抗体を選択することが可能である。固体相に結合したファージの洗浄に使用した条件はまた、解離反応速度に基づいて区別するために操作することができる。
抗−抗原クローンは、活性に基づいて選択してもよい。ある種の実施態様では、本発明は、抗原を天然に発現する生細胞に結合するか、又は浮遊抗原若しくはその他の細胞構造に結合した抗原に結合する抗−抗原抗体を提供する。このような抗−抗原抗体に対応するＦｖクローンは、（１）前述したファージライブラリーから抗−抗原クローンを単離し、適切な細菌宿主において集団を増殖させることによってファージクローンの単離された集団を任意選択的に増幅する工程、（２）抗原並びにブロッキング及び非ブロッキング活性それぞれが所望される第２のタンパク質を選択する工程、（３）抗−抗原ファージクローンを固定化されている抗原に吸着させる工程、（４）過剰な第２のタンパク質を使用して第２のタンパク質の結合決定基と重複するか、又は共有する抗原結合決定基を認識する所望しない任意のクローンを溶出させる工程、並びに（５）吸着したままのクローンを工程（４）の後で溶出する工程によって選択することができる。任意選択的に、所望するブロッキング／非ブロッキング特性を備えたクローンを、本明細書で記載した選択方法を１回又は複数回反復することによってさらに濃縮することができる。
ハイブリドーマ由来モノクローナル抗体又は本発明のファージディスプレイＦｖクローンをコードするＤＮＡの単離は容易で、従来の方法を使用して（例えば、ハイブリドーマ又はファージＤＮＡ鋳型から対象とする重鎖及び軽鎖コード領域を特異的に増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって）配列決定する。単離したら、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、次に宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は普通なら免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中において所望するモノクローナル抗体の合成を行うことができる。細菌における抗体をコードするＤＮＡの組替え発現に関する概説には、Ｓｋｅｒｒａ等、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｎｏｌ．， ５： ２５６（１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｉｍｍｕｎｎｏｌ． Ｒｅｖｓ， １３０： １５１（１９９２）が含まれる。
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする公知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列はＫａｂａｔ等、上記から得ることができる）と結合し、完全又は部分的な長さの重鎖及び／又は軽鎖をコードするクローンを形成することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域をこの目的で使用することができること、並びにこのような定常領域は任意のヒト及び動物種から得ることができることを理解されよう。１動物種（例えば、ヒト）の可変ドメインＤＮＡに由来し、次に「ハイブリッド」完全長重鎖及び／又は軽鎖用のコード配列（複数）を形成するために別の動物種の定常領域ＤＮＡに融合させたＦｖクローンは、本明細書で使用した「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。ある種の実施態様では、ヒト可変ＤＮＡに由来するＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡに融合させ、完全又は部分的な長さのヒト重鎖及び／又は軽鎖用のコード配列（複数）を形成する。
本発明のハイブリドーマに由来する抗−抗原抗体をコードするＤＮＡはまた、例えば、ハイブリドーマクローンに由来する相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列に置換することによって改変することができる（例えば、Morrison等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855(1984)の方法のように）。ハイブリドーマ又はＦｖクローン由来抗体又は断片をコードするＤＮＡはさらに、免疫グロブリンのコード配列を非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全て又は一部に共有結合的に結合することによってさらに改変することができる。このようにして、本発明のＦｖクローン又はハイブリドーマクローン由来抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体を調製する。
（ｉｖ）ヒト化及びヒト抗体
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法は当該技術分野では公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からヒト化抗体に導入された１個又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と呼ばれることが多く、通常は「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲ（一又は複数）配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法（Jones等、Nature321:522-525(1986)；Riechmann等、Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等、Science,239:1534-1536(1988)）に従って本質的に実施することができる。したがって、このようなヒト化抗体は、キメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）であり、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が非ヒト種の対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は通常、いくつかのＣＤＲ残基及びおそらくいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位の残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製に使用される、軽鎖及び重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」法によって、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に、この齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体用のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Sims等、J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia等、J. Mol. Biol., 196:901 (1987)）。別の方法は、特定のサブグループの軽鎖又は重鎖の全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用してもよい（Carter等、Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta等、J. Immunol., 151:2623 (1993)）。
抗原に対する高い親和性及びその他の都合のよい生物学的特性を保持した抗体をヒト化することはさらに重要である。この目標を実現するために、方法の一実施態様によって、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列及び様々な概念上のヒト化生成物の分析プロセスによってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元立体構造を例示して表示するコンピュータプログラムを利用することができる。これらの表示を検証することにより、候補免疫グロブリン配列の機能発揮にこれらの残基が果たしそうな役割を分析すること、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基を分析することが可能になる。このようにして、標的抗原（複数）に対する親和性の増加などの所望する抗体特性を実現するように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択して組み合わせることが可能である。一般的に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的かつ最も実質的に関与する。
本発明のヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列（複数）を前述したような公知のヒト定常ドメイン配列（複数）と組み合わせることによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体産生用のヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．５１−６３（Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）及びＢｏｅｒｎｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：８６（１９９１）に記載されたことがある。
免疫化によって、内因性の免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することができる。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性の抗体産生の完全な阻害を引き起こすことが記載されている。このような生殖細胞系変異体マウスにヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを導入すると、抗原曝露に対してヒト抗体の産生が引き起こされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ等、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３（１９９３）；及びＤｕｃｈｏｓａｌ等、Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２５８（１９９２）を参照のこと。
遺伝子シャフリングはまた、非ヒト、例えば、齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することができ、このヒト抗体は元の非ヒト抗体と類似の親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法によって、本明細書で記載したファージディスプレイ技術によって得られた非ヒト抗体断片の重鎖又は軽鎖可変領域の何れかはヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換され、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖ又はＦａｂキメラの集団が生成される。抗原による選択は、１次ファージディスプレイクローンにおいてヒト鎖が対応する非ヒト鎖の除去によって破壊された抗原結合部位を修復する、すなわち、エピトープがヒト鎖相手の選択を管理（インプリント）する、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖ又はＦａｂの単離をもたらす。残存する非ヒト鎖を置換するためにこの方法を反復すると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ国際公開第９３／０６２１３号を参照のこと）。ＣＤＲグラフトによる非ヒト抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術によって非ヒト由来のＦＲもＣＤＲ残基も有さない完全なヒト抗体がもたらされる。
（ｖ）抗体断片
抗体断片は、酵素消化などの伝統的な手段によって、又は組換え技術によって生成することができる。ある種の状況では、抗体全体よりも抗体断片を使用することが有利である。より小さなサイズの断片は迅速な排出が可能で、固形腫瘍への接近を改善することができる。ある種の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ等、（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４を参照のこと。
抗体断片を生成するために様々な技術が開発されてきた。伝統的には、これらの断片はインタクトな抗体のタンパク質分解性消化によって得られた（例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照のこと）。しかし、これらの断片は、現在では組換え宿主細胞により直接生成することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は全て大腸菌で発現し分泌させることができるので、これら断片の大量生成が容易となる。抗体断片は前記で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992)）。別の手法によれば、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が長いＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片の生成のためのその他の方法は当業者には明らかであろう。ある種の実施態様では、抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦＶ）である。国際公開第９３／１６１８５号、米国特許第５５７１８９４号及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を除いたインタクトな結合部位を有する唯一の種類であり、したがって、これらはインビボにおける使用中に非特異的結合を低減するために適している可能性がある。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端の何れかで、エフェクタータンパク質の融合を行うように構築することができる。上記のＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ編、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋを参照のこと。抗体断片はまた、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体は単一特異性又は二重特異性であってよい。
（ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有し、このエピトープは通常異なる抗原から得られる。このような分子は通常は２つの異なるエピトープに結合するのみであるが（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、三重特異性抗体のようなさらなる特異性を備えた抗体も本明細書で使用する場合この表現に包含される。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
二重特異性抗体を作製する方法は当該技術分野では公知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な生成は、２本の鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいている（Millstein等, Nature, 305:537-539(1983)）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に組み合わさっているため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ１つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
異なった手法では、所望する結合特異性を備えた抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。ヒンジの少なくとも一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合が好ましい。軽鎖の結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を融合体の少なくとも１つに存在させることが一般的である。免疫グロブリン重鎖の融合体、所望するならば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクター中に挿入し、適切な宿主生物にコトランスフェクトする。これによって、構築で使用した３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、３つのポリペプチド断片の相互割合の調節の柔軟性が大きくなる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性ではないときは、２又は３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
この手法の一実施態様では、二重特異性抗体は、一方のアームにおける第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）とから構成される。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖が存在しないと分離法が容易になるので、この非対称的構造によって、所望する二重特異性化合物を所望しない免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することが容易になることが分かった。この手法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を生成するさらなる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
国際公開第９６／２７０１１号に記載された別の手法では、一対の抗体分子間の接触面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にすることができる。１接触面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の接触面からの１つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置換する。大きなアミノ酸側鎖を小さいアミノ酸側鎖（例えばアラニン又はスレオニン）と置換することによって、大きな側鎖（複数）と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を第２の抗体分子の接触面に作り出す。これによって、ホモダイマーなどの不要なその他の最終生成物に対するヘテロダイマーの収量を増大させる機構がもたらされる。
二重特異性抗体には架橋結合又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の１つがアビジンと結合し、他方がビオチンと結合していてもよい。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対して標的化するため（米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号及び欧州特許第０３０８９号）、提案されたことがある。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の便利な架橋方法を使用して作製することができる。適切な架橋結合剤は当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋結合技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を生成する技術もまた文献に記載されたことがある。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）はインタクトな抗体をタンパク質分解的に切断してＦ（ａｂ’）２断片を生成する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルヒド形成を防止する。生成したＦａｂ’断片は次にチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に転換する。次に、Ｆａｂ’-ＴＮＢ誘導体の１つをメルカプトエチルアミンを用いた還元によりＦａｂ’−チオールに再転換し、等モル量のその他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。生成した二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩によって、大腸菌からＦａｂ’−ＳＨ断片を直接回収することが容易になり、これは化学的に結合させて二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５：２１７−２２５（１９９２）は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記述している。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から別々に分泌させ、インビトロにおいて定方向化学カップリングさせて二重特異性抗体を形成した。
組換え細胞培養物から直接的に二重特異性抗体断片を作製し単離する様々な方法もまた記述されたことがある。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により２つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、次いで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作製する別の機構を提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間ペアリングを可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは別の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的にペアリングさせ、それによって２つの抗原−結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用することによる別の二重特異性抗体断片作製ストラテジーもまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｎｏｌ、１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
２価よりも多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｆｔ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
（ｖｉｉ）単一ドメイン抗体
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部を含む単一ポリペプチド鎖である。ある種の実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, Mass.;例えば、米国特許第６２４８５１６号Ｂ１を参照のこと）。一実施態様では、単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部からなる。
（ｖｉｉｉ）抗体変異体
いくつかの実施態様において、本明細書で記載した抗体のアミノ酸配列改変（複数）を検討する。例えば、抗体の結合親和性及び／又はその他の生物学的特性の改善が所望されることがある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換が含まれる。最終コンストラクトが所望の特性を有していることを条件として、最終コンストラクトに到達するために欠失、挿入、及び置換を任意に組み合わせることができる。配列形成時に、アミノ酸変更を対象の抗体アミノ酸配列に導入してもよい。
（ｉｘ）抗体誘導体
本発明の抗体は、当該技術分野で公知の容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含有するようにさらに改変することができる。ある種の実施態様では、抗体の誘導体化に適切な部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモ重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモ重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量であってもよく、分枝鎖であっても分枝鎖でなくてもよい。抗体に結合したポリマーの数は変動していてもよく、１つ以上のポリマーが結合する場合は、これらは同じか又は異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、改善するべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が規定の条件下で治療に使用されるかどうかなどを考慮して決定することができる。
（ｘ）ベクター、宿主細胞及び組換え法
抗体はまた、組換え法を使用して生成することができる。抗−抗原抗体の組換え生成のために、抗体をコードする核酸を単離し、さらにクローニングするため（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離し配列決定することができる。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分は一般的に、限定はしないが、以下の１つ又は複数を含む：シグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列。
（ａ）シグナル配列成分
本発明の抗体は、直接的だけでなく、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換えによって生成することができ、この異種ポリペプチドは、好ましくは、シグナル配列又はその成熟タンパク質若しくはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有するその他のポリペプチドである。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識されプロセシングを受ける（例えば、シグナルペプチダーゼによって切断される）シグナル配列である。天然の抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核宿主細胞に関しては、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ又は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母での分泌に関しては、天然のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含む）又は酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されたシグナルによって置換されていてもよい。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
（ｂ）複製開始点
発現ベクター及びクローニングベクターの両方とも、１つ又は複数の選択された宿主細胞中においてベクターが複製するのを可能にする核酸配列を含有する。一般的に、クローニングベクター内においては、この配列はベクターが宿主の染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にする配列であり、複製起点又は自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母及びウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド開始点は、酵母に適しており、種々のウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）が、哺乳動物細胞中におけるクローニングベクターのために有用である。一般的に、複製開始点成分は哺乳動物の発現ベクターには必要ではない（ＳＶ４０開始点は、単に初期プロモーターを含有するために一般的に使用することができる）。
（ｃ）選択遺伝子成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有することができる。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又はその他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート若しくはテトラサイクリンに耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性欠損を補完し、あるいは（ｃ）複合培地からは利用不可能な重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えば、桿菌属（Ｂａｃｉｌｌｉ）についてはＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
選択スキームの一例では、宿主細胞の増殖を停止させる薬物を利用する。異種遺伝子でうまく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、したがって選択計画において生存する。このような優性選択の例では、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に対して適切な選択マーカーの別の例は、抗体をコードする核酸を処理する能力のある細胞の同定を可能にするマーカー、例えば、ＤＨＦＲ、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは、霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。
例えば、ＤＨＦＲ遺伝子で形質転換した細胞は、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培地で形質転換体を培養することによって同定する。これらの条件下で、ＤＨＦＲ遺伝子は任意のその他の同時形質転換した核酸と共に増幅する。内因性ＤＨＦＲ活性を欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）を使用することができる。
あるいは、ＧＳ遺伝子で形質転換した細胞は、ＧＳの阻害剤であるＬ−メチオニンスルホキシイミンを含有する培地で形質転換体を培養することによって同定する。これらの条件下で、ＧＳ遺伝子は任意のその他の同時形質転換した核酸と共に増幅する。ＧＳ選択／増幅系は、前述したようなＤＨＦＲ選択／増幅系と組み合わせて使用することができる。
あるいは、対象とする抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子及び別の選択マーカー、例えば、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）で形質転換したか、又は同時形質転換した宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、選択マーカー、例えば、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８のための選択薬剤を含有する培地中での細胞増殖によって選択することができる。例えば、米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
酵母において使用するのに適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb等、Nature, 282:39 (1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠如した酵母の変異体株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６又はＡＴＣＣ番号ＰＥＰ４−１に対する選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：１２（１９７７）。次に、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０６２２又はＡＴＣＣ３８６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドによって補完される。
さらに、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイベロミセス酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の形質転換に使用することができる。あるいは、Ｋ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）について組換えウシキモシンの大規模産生のための発現系が報告された。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：１３５（１９９０）。クルイベロミセスの産業用株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多コピー発現ベクターも開示されたことがある。Ｆｌｅｅｒ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：９６８−９７５（１９９１）。
（ｄ）プロモーター成分
発現ベクター及びクローニングベクターは一般的に、宿主生物によって認識され、抗体をコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターを含有する。原核生物宿主での使用に適したプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼプロモーター系及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系並びにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし、その他の公知の細菌プロモーターも適している。細菌系で使用するためのプロモーターはまた、抗体をコードするＤＮＡに動作可能に連結されたシャインダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。
真核生物用のプロモーター配列は公知である。ほとんど全ての真核生物遺伝子は、転写が開始する部位より約２５から３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始点より７０から８０塩基上流に見出される別の配列はＣＮＣＡＡＴ領域で、ここでＮは任意のヌクレオチドであってもよい。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端にポリＡテイルを付加するためのシグナルとなり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列は全て、真核生物の発現ベクター中に適切に挿入される。
酵母宿主で使用するために適したプロモーター配列の例には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又はその他の解糖酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのためのプロモーターが含まれる。
増殖条件によってコントロールされる転写にさらに有利な誘導プロモーターであるその他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ並びにマルトース及びガラクトース利用を担う酵素のためのプロモーター領域である。酵母発現で使用するために適したベクター及びプロモーターはさらに欧州特許第７３６５７号に記載されている。酵母エンハンサーはまた、酵母プロモーターと共に有利に使用される。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られるプロモーター、又は異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから得られるプロモーター、熱ショックプロモーターによってコントロールすることができるが、但し、このようなプロモーターは宿主細胞系に適合している。
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製開始点も含有するＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４４１９４４６号中に開示されている。この系の改変は、米国特許第４６０１９７８号に記載されている。マウス細胞での単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターのコントロール下でのヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Ｒｅｙｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復は、プロモーターとして使用することができる。
（ｅ）エンハンサーエレメント成分
高等真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、そのベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加することが多い。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている。しかし、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例には、複製開始点（１００−２７０ｂｐ）の下流側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の下流側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Ｙａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７−１８（１９８２）も参照のこと。このエンハンサーは、５’位又は３’位でベクターの抗体コード配列にスプライスすることができるが、そのプロモーターの５’部位に位置することが好ましい。
（ｆ）転写終結成分
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又はその他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有する。このような配列は通常、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’、時には３’非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号及びそこに開示される発現ベクターを参照のこと。
（ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書のベクターにおいて、ＤＮＡのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、前述の原核細胞、酵母細胞又は高等真核細胞である。この目的に適した原核生物には、真正細菌、例えば、グラム陰性生物又はグラム陽性生物、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば、大腸菌などの大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウイニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）などのセラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）並びに枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）などの桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）（例えば、Ｂ．リケニフォルミスは１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０の４１ページに開示されている）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）並びにストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。宿主をクローニングする１つの好ましい大腸菌は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、その他の株、例えば、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）も適している。これらの例は、限定的ではなく例示的である。
特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ではないとき、例えば、治療抗体がそれ自体腫瘍細胞破壊に有効性を示す細胞傷害性剤（例えば、毒素）にコンジュゲートしているときは、完全長抗体、抗体融合タンパク質及び抗体断片は細菌中で産生することができる。完全長抗体は、循環中の半減期が長い。大腸菌中での産生は、より速く、より費用効果が高い。細菌中での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）並びにシグナル配列について記載している米国特許第５６４８２３７号（Ｃａｒｔｅｒ等）、米国特許第５７８９１９９号（Ｊｏｌｙ等）、米国特許第５８４０５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓ等）を参照のこと。大腸菌中での抗体断片の発現について記載したＣｈａｒｌｔｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻（B. K. C. Lo編、Humana Press, Totowa, N.J., 2003）、ｐｐ．２４５−２５４も参照のこと。発現後、抗体は可溶性画分中の大腸菌細胞ペーストから単離することができ、例えば、アイソタイプに応じてプロテインＡ又はＧカラムによって精製することができる。最終的な精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現した抗体の精製方法と類似の方法で実施することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が、抗体をコードするベクターに適したクローニング宿主又は発現宿主である。サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は一般的なパン酵母が下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかし、いくつかのその他の属、種及び株が本明細書では使用可能で有用である、例えば、***酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）；Ｋ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２４２４）、Ｋ．ブルガリカス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６０４５）、Ｋ．ウィッカーラミ（ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４１７８）、Ｋ．ウォルティ（ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６５００）、Ｋ．ドロソフィララム（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びＫ．マルシアヌス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などのクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主；ヤロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３０７０）；キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４２３４）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；並びに、例えば、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びＡ．ニデゥランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主などの糸状菌。治療用タンパク質を産生するための酵母及び糸状菌の使用について論じている概説については、例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）を参照のこと。
グリコシル化経路が「ヒト化」されており、ヒトグリコシル化パターンを部分的又は完全に備えた抗体の産生を引き起こすある種の真菌及び酵母株を選択することができる。例えば、Ｌｉ等、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）（ピキア・パストリス）におけるグリコシル化経路のヒト化について記載している）及びＧｅｒｎｇｒｏｓｓ等、上記を参照のこと。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）由来である。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体並びに、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）及びカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体及びカイコガＮＰＶのＢｍ−５株が市販されており、このようなウイルスは、本発明による本明細書のウイルスとして、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用することができる。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、アオウキクサ（Ｌｅｎｉｎａｃｅａｅ）、アルファルファ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生のためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載している）を参照のこと。
脊椎動物細胞は宿主として使用することができ、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖が常套的な手順になってきた。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞又は懸濁培養で増殖するためにサブクローニングした２９３細胞、Graham等、J. Gen Virol. 36:59 (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251（1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ ｒａｔ）肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８６０５）；マウス***腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather等、Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68（1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝がん株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。その他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216（1980)）；並びにＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に適したある種の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ及びＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻（B. K. C. Lo編, Humana Press, Totowa, N.J., 2003）、ｐｐ．２５５−２６８を参照のこと。
宿主細胞は、抗体産生のために前述の発現ベクター又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体の選択又は所望する配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地で培養する。
（ｈ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために使用する宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。市販の培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ））が、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：２５５（１９８０）、米国特許第４７６７７０４号、第４６５７８６６号、第４９２７７６２号、第４５６０６５５号、又は第５１２２４６９号、国際公開第９０／０３４３０号、国際公開第８７／００１９５号、又は米国再発行特許第３０９８５号に記載される培地の何れかを宿主細胞の培地として使用することができる。これらの培地の何れにも、必要ならば、ホルモン及び／又はその他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン又は上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補給することができる。当業者に公知の任意のその他の必要な補給物も適切な濃度で含めることができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で既に使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
（ｘｉ）抗体の精製
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内、細胞周辺腔内又は培地中に直接分泌して産生させることができる。第１工程として抗体を細胞内で産生する場合、宿主細胞又は溶解した断片の何れかの微粒子デブリは、例えば、遠心又は限外濾過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２）は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離するための手法について記載している。簡単に説明すると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間にわたって解凍する。細胞デブリは、遠心によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、このような発現系からの上清は一般的に市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を使用してまず濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために前述の工程の何れかに含めることができ、抗生物質は外来の夾雑物の増殖を防止するために含めることができる。
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが一般的に好ましい精製工程の１つである。プロテインＡの親和性リガンドとしての適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに左右される。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖をベースとした抗体を精製するために使用することができる（Lindmark等、J. Immunnol. Meth. 62:1-13（1983)）。プロテインＧは、マウスのアイソタイプ全て及びヒトγ３に対して推奨される（Guss等、EMBO J. 5:15671575（1986)）。親和性リガンドが付着するマトリクスはほとんどの場合アガロースであるが、その他のマトリクスも利用可能である。力学的に安定なマトリクス、例えば、孔制御ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースを用いて達成することができる場合よりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。この抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が精製用に有用である。タンパク質精製のためのその他の技術、例えば、イオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆層ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿も回収される抗体に応じて利用可能である。
一般的に、研究、試験及び臨床で使用するための抗体を調製する様々な方法は当該技術分野ではよく確立されおり、前述の方法と一致し、及び／又は対象とする特定の抗体のために当業者によって適切であると考えられている。
Ｃ．生物活性のある抗体の選択
前述のように産生された抗体は、治療的観点から有利な特性を有する抗体を選択するため、又は抗体の生物活性を保持する製剤及び条件を選択するために、１つ又は複数の「生物活性」のアッセイを行うことができる。抗体が生じる抗原に対して、抗体が結合する能力について試験することができる。例えば、抗ＰＤＬ１抗体については、抗体の抗原結合特性は、ＰＤＬ１に結合する能力を検出するアッセイにおいて評価することができる。いくつかの実施態様では、抗体の結合は、例えば、飽和結合、ＥＬＩＳＡ及び／又は競合アッセイ（例えばＲＩＡ）によって測定することができる。また、抗体は、例えば、治療剤としての効率を評価するために、その他の生物活性アッセイを行うことができる。このようなアッセイは当該技術分野において公知であり、標的抗原及び抗体の目的の用途に左右される。例えば、抗体によるＰＤ−Ｌ１ブロックの生物学的効果はＣＤ８＋Ｔ細胞、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）マウスモデル及び／又は、例えば、米国特許第８２１７１４９に記載されたような同系の腫瘍モデルにおいて評価することができる。
対象とする抗原上の特定のエピトープに結合する抗体（例えば、ＰＤ−Ｌ１に対する例の抗ＰＤＬ１抗体の結合をブロックする抗体）をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ編（１９８８）に記載されたような常套的なクロスブロッキングアッセイを実施することができる。あるいは、例えば、Ｃｈａｍｐｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）に記載されたようなエピトープマッピングを実施して、抗体が対象とするエピトープに結合するかどうかを決定することができる。
Ｄ．製剤の調製
対象とする抗体を調製した後（例えば、本明細書で開示したように製剤化することができる抗体の産生技術を以下に詳述するが、当該技術分野においては公知である）、この抗体を含む薬学的製剤を調製する。ある種の実施態様では、製剤化する抗体は、事前の凍結乾燥に供されておらず、本明細書で対象とする製剤は水性製剤である。ある種の実施態様では、抗体は完全長抗体である。一実施態様では、製剤中の抗体はＦ（ａｂ’）２などの抗体断片であり、この場合、完全長抗体では生じないであろう問題（Ｆａｂへの抗体のクリッピングなど）に対処する必要があり得る。製剤中に存在する抗体の治療的有効量は、例えば、投与の所望される投与量及び方法（複数）を考慮することによって決定する。約２５ｍｇ／ｍＬから約１５０ｍｇ／ｍＬ、又は約３０ｍｇ／ｍＬから約１４０ｍｇ／ｍＬ、又は約３５ｍｇ／ｍＬから約１３０ｍｇ／ｍＬ、又は約４０ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬ、又は約５０ｍｇ／ｍＬから約１３０ｍｇ／ｍＬ、又は約５０ｍｇ／ｍＬから約１２５ｍｇ／ｍＬ、又は約５０ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬ、又は約５０ｍｇ／ｍＬから約１１０ｍｇ／ｍＬ、又は約５０ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬ、又は約５０ｍｇ／ｍＬから約９０ｍｇ／ｍＬ、又は約５０ｍｇ／ｍＬから約８０ｍｇ／ｍＬ、又は約５４ｍｇ／ｍＬから約６６ｍｇ／ｍＬが、製剤中の例示的抗体濃度である。
ｐＨ緩衝溶液中に抗体を含む水性製剤を調製する。本発明のバッファーのｐＨ範囲は、約ｐＨ５．０から約７．０である。ある種の実施態様では、ｐＨは、約５．０から約６．５、ｐＨは約５．０から約６．４の範囲、約５．０から約６．３の範囲、ｐＨは約５．０から約６．２の範囲、ｐＨは約５．０から約６．１の範囲、ｐＨは約５．５から約６．１の範囲、ｐＨは約５．０から約６．０の範囲、ｐＨは約５．０から約５．９の範囲、ｐＨは約５．０から約５．８の範囲、ｐＨは約５．１から約６．０の範囲、ｐＨは約５．２から約６．０の範囲、ｐＨは約５．３から約６．０の範囲、ｐＨは約５．４から約６．０の範囲、ｐＨは約５．５から約６．０の範囲、ｐＨは約５．６から約６．０の範囲、ｐＨは約５．７から約６．０の範囲又はｐＨは約５．８から約６．０の範囲である。本発明のある種の実施態様では、製剤のｐＨは６．０又は約６．０である。本発明のある種の実施態様では、製剤のｐＨは５．９又は約５．９である。本発明のある種の実施態様では、製剤のｐＨは５．８又は約５．８である。本発明のある種の実施態様では、製剤のｐＨは５．７又は約５．７である。本発明のある種の実施態様では、製剤のｐＨは５．６又は約５．６である。本発明のある種の実施態様では、製剤のｐＨは５．５又は約５．５である。本発明のある種の実施態様では、製剤のｐＨは５．４又は約５．４である。本発明のある種の実施態様では、製剤のｐＨは５．３又は約５．３である。本発明のある種の実施態様では、製剤のｐＨは５．２又は約５．２である。この範囲内にｐＨをコントロールするバッファーの例には、ヒスチジン（Ｌ−ヒスチジンなど）又は酢酸ナトリウムが含まれる。ある種の実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムを約１５ｍＭから約２５ｍＭの濃度で含有する。本発明のある種の実施態様では、バッファーは、ヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムを約１５ｍＭから約２５ｍＭ、約１６ｍＭから約２５ｍＭ、約１７ｍＭから約２５ｍＭ、約１８ｍＭから約２５ｍＭ、約１９ｍＭから約２５ｍＭ、約２０ｍＭから約２５ｍＭ、約２１ｍＭから約２５ｍＭ、約２２ｍＭから約２５ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ又は約２５ｍＭで含有する。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２０ｍＭ、ｐＨ５．０である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２０ｍＭ、ｐＨ５．１である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２０ｍＭ、ｐＨ５．２である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２０ｍＭ、ｐＨ５．３である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２０ｍＭ、ｐＨ５．４である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２０ｍＭ、ｐＨ５．５である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２０ｍＭ、ｐＨ５．６である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２０ｍＭ、ｐＨ５．７である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２０ｍＭ、ｐＨ５．８である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２０ｍＭ、ｐＨ５．９である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２０ｍＭ、ｐＨ６．０である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２０ｍＭ、ｐＨ６．１である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２０ｍＭ、ｐＨ６．２である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２０ｍＭ、ｐＨ６．３である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２５ｍＭ、ｐＨ５．２である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２５ｍＭ、ｐＨ５．３である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２５ｍＭ、ｐＨ５．４である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２５ｍＭ、ｐＨ５．５である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２５ｍＭ、ｐＨ５．６である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２５ｍＭ、ｐＨ５．７である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２５ｍＭ、ｐＨ５．８である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２５ｍＭ、ｐＨ５．９である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２５ｍＭ、ｐＨ６．０である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２５ｍＭ、ｐＨ６．１である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２５ｍＭ、ｐＨ６．２である。一実施態様では、バッファーはヒスチジンアセテート又は酢酸ナトリウムの量が約２５ｍＭ、ｐＨ６．３である。
製剤はさらに、スクロースを約６０ｍＭから約２４０ｍＭの量で含む。いくつかの実施態様では、製剤中のスクロースは、約６０ｍＭから約２３０ｍＭ、約６０ｍＭから約２２０ｍＭ、約６０ｍＭから約２１０ｍＭ、約６０ｍＭから約２００ｍＭ、約６０ｍＭから約１９０ｍＭ、約６０ｍＭから約１８０ｍＭ、約６０ｍＭから約１７０ｍＭ、約６０ｍＭから約１６０ｍＭ、約６０ｍＭから約１５０ｍＭ、約６０ｍＭから約１４０ｍＭ、約８０ｍＭから約２４０ｍＭ、約９０ｍＭから約２４０ｍＭ、約１００ｍＭから約２４０ｍＭ、約１１０ｍＭから約２４０ｍＭ、約１２０ｍＭから約２４０ｍＭ、約１３０ｍＭから約２４０ｍＭ、約１４０ｍＭから約２４０ｍＭ、約１５０ｍＭから約２４０ｍＭ、約１６０ｍＭから約２４０ｍＭ、約１７０ｍＭから約２４０ｍＭ、約１８０ｍＭから約２４０ｍＭ、約１９０ｍＭから約２４０ｍＭ、約２００ｍＭから約２４０ｍＭ、約８０ｍＭから約１６０ｍＭ、約１００ｍＭから約１４０ｍＭ、又は約１１０ｍＭから約１３０ｍＭである。いくつかの実施態様では、製剤中のスクロースは、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２１０ｍＭ、約２２０ｍＭ、約２３０ｍＭ又は約２４０ｍＭである。
いくつかの実施態様では、製剤中の抗体濃度は約４０ｍｇ／ｍＬから約１２５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体濃度は、約４０ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬから約１１０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬから約９０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬから約８０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬから約７０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬ又は約１００ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体濃度は約６０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体濃度は約６５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体濃度は約７０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体濃度は約７５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体濃度は約８０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体濃度は約８５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体濃度は約９０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体濃度は約９５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体濃度は約１００ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体濃度は約１１０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体濃度は約１２５ｍｇ／ｍＬである。
いくつかの実施態様では、界面活性剤を抗体製剤に添加する。例示的界面活性剤には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）又はポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８など）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。添加する界面活性剤の量は、製剤化した抗体の凝集を低減し、及び／又は製剤中における微粒子の形成を最小限にし、及び／又は吸着を低減するような量である。例えば、界面活性剤は約０．００１％から約０．５％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在していてもよい。いくつかの実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、約０．００５％から約０．２％、約０．００５％から約０．１％、約０．００５％から約０．０９％、約０．００５％から約０．０８％、約０．００５％から約０．０７％、約０．００５％から約０．０６％、約０．００５％から約０．０５％、約０．００５％から約０．０４％、約０．００８％から約０．０６％、約０．０１％から約０．０６％、約０．０２％から約０．０６％、約０．０１％から約０．０５％、又は約０．０２％から約０．０４％である。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．００５％又は約０．００５％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．００６％又は約０．００６％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．００７％又は約０．００７％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．００８％又は約０．００８％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．００９％又は約０．００９％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．０１％又は約０．０１％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．０２％又は約０．０２％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．０３％又は約０．０３％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．０４％又は約０．０４％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．０５％又は約０．０５％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．０６％又は約０．０６％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．０７％又は約０．０７％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．０８％又は約０．０８％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．１％又は約０．１％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．２％又は約０．２％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．３％又は約０．３％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．４％又は約０．４％の量で存在する。ある種の実施態様では、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）は、製剤中に０．５％又は約０．５％の量で存在する。
一実施態様では、製剤は前記で定義した薬剤（例えば、抗体、バッファー、スクロース及び／又は界面活性剤）を含有し、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール及びベンゼトニウムＣｌなどの１つ又は複数の保存剤を本質的に含まない。別の実施態様では、特に製剤が複数投与製剤の場合、保存剤を製剤中に含めてもよい。保存剤の濃度は、約０．１％から約２％、好ましくは約０．５％から約１％の範囲であってもよい。製剤の所望する特徴に悪影響を及ぼさないならば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．編（１９８０）に記載されるものなどの１つ又は複数の薬学的に許容されるその他の担体、賦形剤又は安定剤を製剤中に含めてもよい。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いられる投薬量及び濃度ではレシピエントに非毒性であり、追加的緩衝剤、共溶媒、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、ポリエステルなどの生分解性ポリマー、及び／又は塩形成対イオンである。本明細書での例示的な薬学的に許容される担体には、介在性薬物分散剤、例えば、可溶型中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶型ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．）がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含むある例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開番号第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加的グリコサミノグリカナーゼと組み合わせる。
本明細書の製剤はまた、治療する特定の適応症に必要な１つ以上のタンパク質を含有していてもよく、好ましくは、その他のタンパク質に悪影響を及ぼさない補完的活性を備えたものである。例えば、抗体が抗ＰＤＬ１である場合、これは別の薬剤（例えば、化学療法剤及び抗悪性腫瘍薬）と組み合わせてもよい。
いくつかの実施態様では、製剤中の抗体の物理安定性、化学安定性又は生物活性を評価するか又は測定する。当該技術分野において公知で、本明細書の実施例で記載したいかなる方法も、製剤中の抗体の安定性及び生物活性を評価するために使用することができる。例えば、製剤中の抗体の安定性は、限定はしないが、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ若しくはＳＥ−ＨＰＬＣ）、イメージキャピラリー等電点電気泳動（ＩＣＩＥＦ）、ペプチドマッピング、少量光遮蔽（ＨＩＡＣ）アッセイ並びにＣＥ−ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）及びＣＥ−グリカン分析などのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）技術によって測定することができる。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体は、−２０℃で少なくとも約６カ月、少なくとも約８カ月、少なくとも約１０カ月、少なくとも約１２カ月、少なくとも約１４カ月、少なくとも約１６カ月、少なくとも約１８カ月、少なくとも約２０カ月、少なくとも約２１カ月、少なくとも約２２カ月、少なくとも約２３カ月、少なくとも約２４カ月、少なくとも約３年又は少なくとも約４年間安定である。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体は、２℃から８℃（例えば、５℃）で少なくとも約６カ月、少なくとも約８カ月、少なくとも約１０カ月、少なくとも約１２カ月、少なくとも約１４カ月、少なくとも約１６カ月、少なくとも約１８カ月、少なくとも約２０カ月、少なくとも約２１カ月、少なくとも約２２カ月、少なくとも約２３カ月又は少なくとも約２４カ月間安定である。いくつかの実施態様では、抗体（すなわち、抗体モノマー）の安定性は、保存後に製剤中でサイズ排除クロマトグラフィーによって測定する。いくつかの実施態様では、抗体（すなわち、抗体モノマー）の安定性は、保存後に製剤中でイメージキャピラリー等電点電気泳動によって測定する。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体モノマーの全タンパク質（例えば、抗体及び凝集体を含む）と比較した割合は、−２０℃で少なくとも約６カ月、少なくとも約１２カ月、少なくとも約１８カ月又は少なくとも約２４カ月保存した後で、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％又は約９５％を上回る。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体モノマーの（例えば、抗体及び凝集体を含む）と比較した割合は、２℃から８℃（例えば、５℃）で少なくとも約６カ月、少なくとも約１２カ月、少なくとも約１８カ月又は少なくとも約２４カ月保存した後で、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％又は約９５％を上回る。いくつかの実施態様では、製剤中の抗体モノマーの（例えば、抗体及び凝集体を含む）と比較した割合は、室温（例えば、約１５℃から２５℃）で少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約６時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２０時間又は少なくとも約２４時間撹拌した後で、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％又は約９５％を上回る。いくつかの実施態様では、製剤中の全凝集（例えば、高分子量種及び低分子量種）の割合は、−２０℃で少なくとも約６カ月、少なくとも約１２カ月、少なくとも約１８カ月又は少なくとも約２４カ月保存した後で、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％又は約１０％の何れかを下回る。いくつかの実施態様では、製剤中の全凝集（例えば、高分子量種及び低分子量種）の割合は、２℃から８℃（例えば、５℃）で少なくとも約６カ月、少なくとも約１２カ月、少なくとも約１８カ月又は少なくとも約２４カ月保存した後で、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％又は約１０％の何れかを下回る。いくつかの実施態様では、製剤中の全凝集（例えば、高分子量種及び低分子量種）の割合は、室温（例えば、約１５℃から２５℃）で少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約６時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２０時間又は少なくとも約２４時間撹拌した後で、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％又は約１０％の何れかを下回る。本明細書の実施態様の何れかにおいて、安定な製剤はガラスバイアル、金属合金容器、又は静脈内（ＩＶ）バッグ内に保存することができる。いくつかの実施態様では、金属合金は、３１６Ｌステンレススチール又はハステロイである。
インビボ投与のために使用する製剤は滅菌すべきである。これは、製剤の調製前、又は後に滅菌濾過膜による濾過によって容易に遂行される。
ＩＩＩ．治療方法及び抗体製剤の投与方法
製剤は、抗体による治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに、公知の方法、例えば、静脈内投与によって（例えば、ボーラスとして、又は一定期間にわたる連続的注入によって）、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、髄腔内、経口、局所又は吸入経路によって投与する。一実施態様では、製剤は哺乳動物に静脈内投与によって投与する。このような目的で、製剤は、例えば、シリンジを使用して又はＩＶラインを介して注射することができる。一実施態様では、製剤は哺乳動物に皮下投与によって投与する。
抗体の適切な投薬量（「治療的有効量」）は、例えば、治療する症状、症状の重症度及び経過、抗体を予防目的かそれとも治療目的で投与するのか、治療歴、患者の病歴及び抗体に対する応答、使用する抗体の種類及び主治医の裁量に左右される。抗体は、患者に単回、又は一連の治療にわたって適切に投与し、診断後から任意の時点で患者に投与することができる。抗体は、単独治療又は問題の症状を治療するのに有用なその他の薬物若しくは療法と組み合わせて投与することができる。
一般的な提案として、ヒトに投与する抗体の治療的有効量は、１回又は複数回の投与に関わらず約０．０１から約５０ｍｇ／患者の体重ｋｇの範囲である。いくつかの実施態様では、使用した抗体は、例えば、約０．０１から約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約３５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約５ｍｇ／ｋｇ又は約０．０１から約１ｍｇ／ｋｇで毎日投与する。いくつかの実施態様では、抗体は１５ｍｇ／ｋｇで投与する。しかし、その他の投薬計画も有用であり得る。一実施態様では、本明細書で記載した抗ＰＤＬ１抗体は、２１日サイクルの１日目に約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ又は約１４００ｍｇの用量でヒトに投与する。用量は、１回用量又は複数回用量（例えば、２又は３回用量）として、例えば点滴で投与することができる。併用治療において投与した抗体の用量は、１回の治療と比較して低減することができる。この療法の経過は、従来の技術によって容易にモニターされる。
本明細書で記載した抗ＰＤＬ１抗体を含有する製剤は、様々なインビトロ及びインビボ診断及び治療適用において使用することができる。例えば、抗体を含有する製剤は、対象又は個体の疾患又は障害（例えば、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用によって媒介される疾患又は障害）を治療するために投与することができる。
いくつかの実施態様では、疾患又は障害はがんである。いくつかの実施態様では、がんは局所進行性又は転移性である。いくつかの実施態様では、がんは、固形腫瘍、血液がん、膀胱がん、脳がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、胃がん、神経膠腫、頭部がん、白血病、肝臓がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、リンパ腫、骨髄腫、頸部がん、卵巣がん、メラノーマ、膵臓がん、腎がん、唾液腺がん、胃がん、胸腺上皮がん、甲状腺がん並びに頭部及び頸部の扁平上皮癌からなる群から選択する。いくつかの実施態様では、治療する対象又は個体は、ＰＤ−Ｌ１陽性がん細胞（例えば、ＩＨＣによって検出する）を有する。
いくつかの実施態様では、疾患又は障害は感染である。いくつかの実施態様では、感染は持続感染である。いくつかの実施態様では、感染はウイルス感染、細菌感染、真菌感染、蠕虫感染又は原虫感染である。いくつかの実施態様では、ウイルス感染は、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球好性ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、呼吸器多核体ウイルス及び／又はライノウイルスからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、細菌感染は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）種、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ）種及びトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、原虫感染は、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）種、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）種、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）種、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種及び条虫（Ｔａｅｎｉａ）種からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、真菌感染は、ブラストミセス症、コクシジオイデス症、ヒストプラスマ症、カンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギルス症、ムコール症及びニューモシスチス症からなる群から選択される。
いくつかの実施態様では、疾患又は障害は炎症疾患である。いくつかの実施態様では、炎症疾患は、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、関節炎、ベーチェット病、ベルジェ病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、胆管炎、クローン病、皮膚筋炎、糖尿病１型、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、蕁麻疹、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、紅斑性狼瘡、ループス腎炎、多発性硬化症、重症筋無力症、臓器移植片拒絶反応、パーキンソン病、天疱瘡、悪性貧血、多発筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー症候群、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、甲状腺炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される。
いくつかの実施態様では、抗体を含有する製剤は、疾患又は障害を治療するために対象又は個体に別の治療剤と組み合わせて投与することができる。例えば、がんを治療するために、本明細書で記載した抗ＰＤＬ１抗体製剤は、別の抗がん治療（例えば、化学療法薬又は異なる抗体治療）と組み合わせて投与することができる。
ＩＶ．製造品又はキット
本発明の別の実施態様では、本発明の水性薬学的製剤を保持する容器を含む製品又はキットを提供し、任意選択的にその使用についての指示を提供する。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、バッグ及びシリンジが含まれる。この容器は、ガラス、プラスティック（例えば、ポリ塩化ビニル又はポリオレフィン）又は金属合金（例えば、ステンレススチール又はハステロイ）などの様々な材料から形成することができる。例示的容器は、３００ｃｃ金属合金容器（例えば、−２０℃で保存するため）である。別の例示的容器は、１０−５０ｃｃガラスバイアル（例えば、２−８℃で保存するため）である。例えば、この容器は１０ｃｃ、１５ｃｃ、２０ｃｃ又は５０ｃｃガラスバイアルである。容器は、製剤を保持し、ラベルが貼ってあるか又は関連付けられており、容器には使用の指示を示すことができる。さらに、製造品には、その他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的な、及び使用者の立場から所望されるその他の材料、並びに使用説明書を含む添付文書を含めることができる。いくつかの実施態様では、製造品はさらに、１つ又は複数の別の薬剤（例えば、化学療法剤及び抗腫瘍性剤）を含む。１つ又は複数の薬剤のために適した容器には、例えば、瓶、バイアル、バッグ及びシリンジが含まれる。
本明細書は、当業者が本発明を実施することができるように十分であると考えられる。前記の説明から、本明細書で示し記述したものに加えて本発明の様々な改変が当業者には明らかになり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。本明細書で引用した全出版物、特許、特許出願は、全目的のために全体を参照により本明細書に援用する。
本発明は、以下の実施例を参照にしてより完全に理解されよう。しかし、これらは、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書で記載した実施例及び実施態様は例示するためだけのものであって、それらの見方の様々な改変又は変化が当業者には想定され、本出願の精神及び範囲内並びに添付の特許請求の範囲内に含まれるものであることを理解されたい。
実施例１： 抗ＰＤＬ１抗体の製剤開発
抗ＰＤＬ１抗体（α−ＰＤＬ１）は、ＰＤＬ１／ＰＤ１相互作用を阻害することによってＴ細胞機能を回復させることを目的としたＣＨＯ由来のグリコシル化されていなＩｇＧ１抗体である。開発着手時の課題には、Ｔｒｐ酸化の可能性及びＣＤＲ領域内又はＣＤＲ近くの糖化及びいくつかのメチオニン酸化が含まれた。予備頑健性研究によって、以前標的としたｐＨ（ｐＨ５．５）よりも高いｐＨが最適であることが示された。標的とする投与量は固定用量であるが、重量をベースにした用量も考慮した。様々な製剤の安定性を分析する分析研究を実施し、一製剤（α−ＰＤＬ１ ６０ｍｇ／ｍＬ、Ｈｉｓ ＡｃＯ ２０ｍＭ ｐＨ５．８、スクロース １２０ｍＭ、ＰＳ２０ ０．０４％）を選択した。最初の製剤研究では、原体（ＤＳ）及び薬物製品（ＤＳ）中における３年までの安定性が支持される。
方法及び材料
α−ＰＤＬ１製剤の製造
限外濾過／ダイアフィルトレーションを行ったα−ＰＤＬ１材料で製剤開発研究を行った。１００００ダルトン透析カセットを使用して、材料を様々な製剤バッファー中で透析した。透析後、タンパク質濃度を調節して標的濃度に到達させ、ＰＳ２０ １０％保存溶液を添加して、標的ＰＳ２０濃度を実現した。製剤化した材料を無菌的に充填容積１ｍＬの２−ｃｃ Ｆｏｒｍａ Ｖｉｔｒｕｍガラスバイアルに充填し、１３ｍｍ Ｄａｉｋｙｏ ７７７−１栓で密閉した。試料を直立で５℃、２５℃又は４０℃の何れかで保存した。
色、外観及び透明性（ＣＡＣ）
試料の色、外観及び透明性は、欧州薬局方（ＥＰ）の方法（Council of Europe. European Pharmacopoeia, 2008, 7版、EP 2.2.2及びEP 2.2.1）に記載されたように、室温で、白色蛍光灯下で、黒及び白の背景の下で目視検査によって測定した。３ｃｃガラスバイアルに各試験した試料１ｍＬを充填した。対応する試料容量のネガティブコントロール（精製水）を比較用に使用した。
タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度は、０．９％生理食塩水で約０．５ｍｇ／ｍＬに試料体積を希釈し、Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３分光光度計（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）でＵＶ吸光度を測定して決定した。試料は、０．９％生理食塩水をブランクとして、約２８０ｎｍ及びまた３２０ｎｍのＡｍａｘで吸光度を測定した。ＡｍａｘとＡ３２０の間の差を計算して修正Ａｍａｘを得、１．５ｍＬ ｃｍ−１ｍｇ−１の吸収率で最終タンパク質濃度を測定するために使用した。
濁度測定
試料の３５０ｎｍでの平均光学濃度をＡｇｉｌｅｎｔ８４５３分光光度計で光路長１−ｃｍの石英キュベット中で測定した。精製水をブランクとして使用した。
肉眼では見えない粒子用の光遮蔽法（ＨＩＡＣアッセイ）
試料の粒子カウントは、ＨＩＡＣ−Ｒｏｙｃｏモデル９７０３（ＨＡＣＨ、Ｌｏｖｅｌａｎｄ、ＣＯ．）によって測定した光遮蔽を使用して実施した。ＰｈａｒｍＳｐｅｃ ｖ２．０を使用して、ミリリットル当たりの粒子の平均累積数≧２μｍ、≧５μｍ、≧１０μｍ及び≧２５μｍを各試料について作表した。各試料について全部で１．６ｍＬを消費して４回の読み取りを試験毎に実施し、最初の読み取りは廃棄し、残りを３回の読み取りを平均化した。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ又はＳＥ−ＨＰＬＣ）
サイズ変種の分布は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってＴｏｓｏＨａａｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｃｏｌｕｍｎ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を使用して３０℃でＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ．ＵＳＡ）で測定した。試料は全て希釈せずに５０μｇをカラムに注射し６０分間かけて溶出し、２８０ｎｍでのＵＶ吸収を調べた。２つの異なるＳＥＣ法を試料試験に使用した。方法１は、リン酸カリウム０．２０Ｍ、塩化カリウム０．２５Ｍ、ｐＨ６．２を使用し、方法２はリン酸カリウム０．２０Ｍ、塩化カリウム０．２５Ｍ、ｐＨ６．２、移動相として１０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールを使用した。結果は、曲線下面積全体に対する相対的なパーセントピーク面積として報告する。
イメージキャピラリー等電点電気泳動（ＩＣＩＥＦ）
電荷変異体の分布は、ｉＣＥ２８０分析器（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用してフルオロカーボンをコーティングしたキャピラリーカートリッジ（１００μｍ×５ｃｍ）を用いてｉＣＩＥＦによって評価した。両性電解質溶液は、精製水中のメチルセルロース（ＭＣ）０．３５％、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ３−１０担体両性電解質０．７５％、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ８−１０．５担体両性電解質４．２％及びｐＩマーカー７．４０ ０．２％及びｐＩマーカー９．７７ ０．１５％の混合物からなった。陽極液は、リン酸８０ｍＭで、陰極液は水酸化ナトリウム１００ｍＭであり、何れもメチルセルロース０．１０％の溶液であった。試料は精製水で希釈し、ＣｐＢを各希釈試料に酵素対基質比１：１００で添加し、その後３７℃で２０分間インキュベートした。ＣｐＢ処理した試料は、両性電解質溶液と混合し、次いで１５００Ｖの電位を１分間、その後３０００Ｖの電位を１０分間導入することによって泳動した。泳動したα−ＰＤＬ１電荷変異体の画像は、２８０ｎｍ紫外線をキャピラリーから電荷結合素子デジタルカメラのレンズに通過させることによって得た。次に、この画像を分析して、様々な電荷変異体の分布を測定した。
ペプチドマッピング
ペプチドマッピング技術を使用してトリプトファン（Ｗ）及びメチオニン（Ｍ）の酸化をモニターした。α−ＰＤＬ１ペプチドマップを作成するために、ジスルフィド結合を低減し、カルボキシメチル誘導体を生成するために得られた遊離チオールを変化させる方法において、タンパク質をジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びヨード酢酸（ＩＡＡ）に曝露した後、タンパク質をトリプシンで消化した。得られたペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分離し、２１４ｎｍでモニターした。トリプシンペプチドの質量は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を使用して、分離した消化混合物のＬＣ−ＭＳ分析によって測定した。
結果
バッファー系の選択
製剤開発中に、２種類のバッファー系を評価した。１つは、スクロース２４０ｍＭを含むヒスチジンアセテート２０ｍＭ、ｐＨ５．５であり、もう１つはコハク酸アルギニン２００ｍＭ、ｐＨ５．５であった。安定性の促進研究によって、α−ＰＤＬ１はコハク酸アルギニンバッファーと比較してヒスチジンアセテートバッファーにおいてより安定であることが明らかになった（表１）。したがって、さらに製剤を開発するためにヒスチジンアセテートを選択した。
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安定剤の選択
スクロース（１２０ｍＭ）は、凍結／解凍によって誘導される凝集からタンパク質を保護する能力並びに原体（ＤＳ）及びその後の薬物製品（ＤＰ）の２℃−８℃保存の長期凍結保存中における凍結保護物質としての機能に基づいて、α−ＰＤＬ１液体製剤用の安定剤として選択した。
製剤開発中、Ｌ−ヒスチジンアセテート２０ｍＭ、ｐＨ５．５、ポリソルベート２０ ０．０２％（ｗ／ｖ）及び０ｍＭから１２０ｍＭの範囲の様々な濃度のスクロース中のα−ＰＤＬ１ ５０ｍｇ／ｍＬに凍結／解凍を５回行った。ＳＥ−ＨＰＬＣによって測定した生成物の品質によって、スクロース６０ｍＭが凍結／解凍によって誘導されるα−ＰＤＬ１ ＨＭＷＳの増加を防止するのに十分であることが示された（表２）。また、スクロース１２０ｍＭは、−２０℃で少なくとも６カ月凍結保存したとき、原体の安定性を維持することが示された（表３）。したがって、凍結／解凍研究並びに−２０℃で保存した原体の長期安定性の結果に基づいて、１２０ｍＭの濃度のスクロースをα−ＰＤＬ１液体製剤用の凍結保護物質として選択した。
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予備製剤頑健性研究：タンパク質濃度、ｐＨ及びポリソルベート２０濃度の選択。
α−ＰＤＬ１製剤パラメータのタンパク質安定性に対する効果をさらに調べるために一部実施要因実験計画（ＤＯＥ）を使用した。全部で１２種の異なるα−ＰＤＬ１製剤を試験した（１０個の実験及び２個の中心点）。研究で変化させた３つの要素は、０．５単位間隔で５．０−６．０の範囲のｐＨ、４０−１２０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のタンパク質及び０．００５％−０．０６％（ｗ／ｖ）の濃度範囲のポリソルベート２０であった（表４）。製剤は全て、表４に示したように最後の２つ製剤以外はスクロース１２０ｍＭを含むヒスチジンアセテート２０ｍＭで緩衝化した。ヒスチジンアセテート２５ｍＭ製剤は、酸化の危険性に関して最悪の場合と考えられるので評価した。酢酸ナトリウム２０ｍＭバッファーは、予備のバッファー系として評価し、ヒスチジンアセテートバッファーと比較した。製剤は、２５℃で２カ月間及び４０℃で１カ月間保存した。前記の研究による安定性データは、製剤パラメータ間の相互作用についてＪＭＰソフトウェア（ＪＭＰ、バージョン９、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して統計学的に解析した。
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ｐＨ５．０及び５．５と比較すると、４０℃及び２５℃でＩＣＩＥＦによって測定したように、ｐＨ６．０の製剤はメインピーク減少率がわずかにゆっくりである（図１Ａ−Ｂ及び図２Ａ−Ｂそれぞれ）。ＩＣＩＥＦでは、メインピーク減少に対する濃度の影響はあまり認められなかった。製剤Ｆ１の分析によって、酸性変異体ではＩＣＩＥＦにおいて主にメインピーク減少への関与が増加しており、一方、塩基性電荷変異体ではピーク減少への関与はあまりなかった。同じ保存条件下では、４０℃及び２５℃でＳＥ−ＨＰＬＣによって測定したように、ｐＨ６．０の製剤はモノマーピーク減少率が緩やかであった（それぞれ図３Ａ−Ｂ及び図４Ａ−Ｂ）。製剤Ｆ１の分析によって、ＳＥＣにおいて高い温度（すなわち、４０℃及び２５℃）ではＨＭＷＳ及びＬＭＷＳの両方の形成がモノマー減少に関与したことが示された。ＳＥＣ及びＩＣＩＥＦの何れにおいても、ｐＨ率プロファイルによって、α−ＰＤＬ１にはｐＨ５．５−６．０が最適なｐＨ範囲であることが明らかになった。ｐＨ５．５超でタンパク質の安定性が最適な範囲内であり、製剤化原体及び薬物製品において±０．３ｐＨ単位の範囲が許容されるように、ｐＨ５．８を目標として選択した。
前記製剤研究によって、ＳＥ−ＨＰＬＣによって測定すると、１２０ｍｇ／ｍＬのα−ＰＤＬ１製剤は、ｐＨ範囲５．０−６．０では同じｐＨでの４０ｍｇ／ｍＬ製剤と比較してＨＭＷＳ形成率が高いため、モノマーピーク減少率がわずかに高いが有意ではないことが明らかになった（図３Ａ−Ｂ及び図４Ａ−Ｂ）。これらのデータに基づいて、製品安定性の改善した製剤を支援し、患者への投与を容易にするため、６０ｍｇ／ｍＬの濃度のα−ＰＤＬ１を選択した。
前記の統計学的解析において示されたように、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）の濃度範囲０．００５％−０．０６％（ｗ／ｖ）ではタンパク質安定性に対する影響はないことが認められた（図１−４）。
ポリソルベート２０原材料に含有される過酸化水素不純物はトリプトファン（Ｗ）及びメチオニン（Ｍ）の酸化を引き起こす可能性があることが知られている。Ｌ−ヒスチジンはまた、前記の酸化の危険性を増加させる可能性がある。高濃度のポリソルベート２０及びＬ−ヒスチジンを含有する最悪の場合を選択した製剤の試料をペプチドマッピングによって分析した。分析の結果、高濃度のヒスチジン（ヒスチジンアセテート２５ｍＭバッファー）及び大量のＰＳ２０（ＰＳ２０ ０．０６％）を組み合わせても酸化の危険性はあまり示されず（表５）、ヒスチジンバッファーはα−ＰＤＬ１を製剤化する使用に適していることが示された。
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保存時の製剤中のＰＳ２０の分解の可能性を評価するため、製剤Ｆ１からＦ１０（表４）を４０℃で１カ月、２５℃で２カ月、５℃で２カ月若しくは５℃で６カ月保存した。高温（すなわち、４０℃及び２５℃）及び５℃の保存温度の何れにおいても評価した製剤においてＰＳ２０の分解は認められなかった。選択した製剤（すなわち、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３及びＦ６）の充填量を７ｍＬ（高充填量）又は４ｍＬ（低充填量）に変更し、次に５℃で６カ月間保存してもＰＳ２０分解率にあまり影響はなかった（図５）。
５℃で６カ月間保存したときの様々な製剤における肉眼で見えない粒子（ＳｂＶＰ）の形成は、安定性の測定としてＨＩＡＣアッセイによって評価した（表６）。ＳｂＶＰの測定可能な変化は、試験した製剤では認められなかった。

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製剤の安定性を凍結解凍実験でさらに調べた。製剤Ｆ１からＦ１０（表４）に−２０℃で保存中に凍結解凍を５回行うか、又は５℃の高い保存温度で０から６カ月間保存して、その後製剤中のα−ＰＤＬ１モノマーの割合（図６Ａ及びＢ）及びメインピークの割合（図６Ｃ及びＤ）をＳＥＣ及びＩＣＩＥＦによって分析した。凍結解凍サイクル後及び指示した時間保存後に、モノマー割合及びメインピーク割合にあまり変化は認められなかった。
Ｆ２製剤における原体安定性（表４）は、ステンレススチール小型缶中において−２０℃で６カ月まで保存中に５回の凍結解凍サイクルを実施し、その後ＣＡＣ、ＳＥＣ及びＩＣＩＥＦによって安定性を測定することによって評価した（表７）。−２０℃で最大６カ月間保存後、変化は認められなかった。
Figure 0006942465
α−ＰＤＬ１ １００ｍｇ／ｍＬ、ヒスチジンアセテート２０ｍＭ、スクロース１２０ｍＭ、ＰＳ２０ ０．０４％、ｐＨ５．６を含有する製剤における原体安定性は、３回の凍結解凍サイクルを実施し、その後ステンレススチール小型缶又はハステロイ小型缶中において−２０℃、５℃又は２５℃で最大３カ月間保存し、その後ＳＥＣによって安定性を測定することによって評価した（図７Ａ及びＢ）。ｐＨ５．６で保存したステンレススチールとハステロイ小型缶の間には差は認められなかった。原体は、３回の凍結解凍サイクル後−２０℃で最大３カ月間安定だった。ステンレススチール及びハステロイ小型缶にはわずかな差があるが、両方とも原体保存に使用するのに適切であった。
α−ＰＤＬ１ ５０ｍｇ／ｍＬ、ヒスチジンアセテート２０ｍＭ、スクロース１２０ｍＭ、ＰＳ２０ ０．０４％、ｐＨ５．６を含有する製剤における原体安定性は、２０ｃｃバイアル中に１６ｍＬ充填し、−５℃、２５℃又は４０℃で最大３カ月間保存し、その後ＳＥＣ及びＩＣＩＥＦによって安定性を測定することによって評価した（図８Ａ及びＢ）。５℃で３カ月保存後、変化は認められなかった。４０℃におけるｐＨ５．６での１月当たり分解率は、それぞれ、ＳＥＣでは０．６６％、ＩＣＩＥＦ分析では２２％であった。
ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＩＣＩＥＦによって測定したメインピーク分解率に基づいたＦ１２製剤中におけるバッファーの評価によって、酢酸ナトリウムバッファーはヒスチジンアセテートバッファーと類似のタンパク質安定性をもたらすことが示された（表８）。試験した２つの製剤は、Ｌ−ヒスチジンアセテート２０ｍＭ、スクロース１２０ｍＭ及びポリソルベート２０ ０．０４％（ｗ／ｖ）、ｐＨ５．５中のα−ＰＤＬ１ ５０ｍｇ／ｍＬ及び酢酸ナトリウム２０ｍＭ、スクロース１２０ｍＭ及びポリソルベート２０ ０．０４％（ｗ／ｖ）、ｐＨ５．５中のα−ＰＤＬ１ ０ｍｇ／ｍＬであった。
表8.40℃でヒスチジンアセテート及び酢酸ナトリウム中でのICIEF及びSE HPLCメインピークによるα-PDL1のゼロ次分解率

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全体的に見て、ＤｏＥ設計による安定性研究によって、４０℃ではＩＣＩＥＦによるメインピーク減少に対して濃度の影響はあまりなかったが、低ｐＨではメインピーク率がわずかに速く減少した（図１Ａ−Ｂ）。４０℃では、ＳＥ−ＨＰＬＣによっても著しい相互作用は認められなかったが、高濃度の製剤はより速いモノマー減少を示した（図３Ａ−Ｂ）。低ｐＨではモノマー減少率がより速いことも見出された。類似の結果が２５℃で認められた（図２Ａ−Ｂ及び図４Ａ−Ｂ）。統計学的解析によって、試験した製剤パラメータの何れの間にも実際上意味のある相互作用（結合）はないことが明らかになった。
撹拌及び熱ストレス研究
ガラスバイアル中において撹拌ストレスを受けたとき、漸増濃度のＰＳ２０の存在下での薬物製品の安定性を調べた。ヒスチジンアセテート２０ｍＭ、スクロース１２０ｍＭ、ｐＨ５．５中において５７ｍｇ／ｍＬを含有する製剤を０．００５％から０．０６％の範囲の様々な濃度のＰＳ２０と共に２ｃｃガラスバイアルに１ｍＬ充填して評価した。ガラスバイアルを室温で７０ｒｐｍで３日間撹拌してから、ＳＥＣ（図９Ａ）及び濁度（図９Ｂ）測定によって安定性を測定した。ＰＳ２０レベルが０．００５−０．０６％の間の製剤は、撹拌中に安定性に変化はなかった。しかし、ＰＳ２０を欠如した製剤は、ＨＭＷＳ増加のためにモノマー減少の増加が示された。この実験では、ＰＳ２０ ０．００５％はガラスバイアル中での撹拌ストレスからタンパク質を保護するために十分であった。
様々な温度及び時間で保存し、次にガラスバイアル中において撹拌ストレスを受けたときの薬物製品製剤（表４）の安定性を調べた。製剤Ｆ１−Ｆ１０はそれぞれ２ｃｃガラスバイアル中に１ｍＬ充填して評価した。ガラスバイアルを室温で７０ｒｐｍで１日間撹拌してから、ＳＥＣ（図１０）によって安定性を測定した。この実験において、４０℃、２５℃又は５℃で長時間保存したとき、撹拌は薬物製品の安定性に影響を及ぼさない。
病院設備でしばしば行われるＩＶバッグ輸送を支持するために、ヒスチジンアセテート２０ｍＭ、スクロース２４０ｍＭ、ｐＨ５．５及びポリソルベート２０ ０．００５％−０．０２％（ｗ／ｖ）中で製剤化したα−ＰＤＬ１でＩＶバッグ撹拌研究を実施した。等張塩化ナトリウム溶液（ＮａＣｌ０．９％）を含有する最も一般的に利用される２５０ｍＬポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）又はポリオレフィン（ＰＯ）ＩＶバッグに４００−６００ｍｇのα−ＰＤＬ１溶液を注射し、オービタル振盪器を使用して１００ｒｐｍで５℃で最大６時間振盪することによって評価した。この研究の結果は重量をベースにした投与を支持し、輸送中の肉眼で見える粒子の形成（タンパク質沈殿に関連する）を防止するためにタンパク質溶液中にポリソルベート２０ ０．０１５％（ｗ／ｖ）が最小限必要であることを示した（表９）。さらに、保存寿命にわたるポリソルベート２０分解の危険性を軽減するために、ポリソルベート２０濃度を０．０２％（ｗ／ｖ）から０．０４％（ｗ／ｖ）に増加させた。
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α−ＰＤＬ１製剤の安定性の評価
マスターセルバンク及びワーキングセルバンクから生成した材料に対して、ヒスチジンアセテート２０ｍＭ、スクロース１２０ｍＭ及びＰＳ２０ ０．０４％を含有する製剤において５．２から６．３のｐＨ範囲にわたるｐＨスクリーニングをさらに実施した（表１０）。ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＩＣＩＥＦによる分析によって、ｐＨ５．７−６．３が化学的及び物理的にかなり安定で、製剤においてｐＨ５．５−６．３の可能な範囲が適切であることが示された（図１１Ａ及びＢ）。ｐＨが高いとモノマー及びメインピーク分解率が低下し、約ｐＨ５．７と６．３の間で減少率は平坦化する。
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α−ＰＤＬ１製剤におけるトリプトファン（Ｗ）及びメチオニン（Ｍ）酸化に対する製剤賦形剤の影響を調べた。ペプチドマッピングによって、酸化の著しい増加はないことが示された。ヒスチジンアセテート２０ｍＭ、スクロース１２０ｍＭ及びＰＳ２０ ０．０４％、ｐＨ５．８の溶液を含有する製剤は、薬物製品又は原体の何れかについて製剤を高温で１カ月間保存したとき、トリプトファン及びメチオニン酸化の明白な増加を示さなかった（表１１）。

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これらの製剤研究の結果及び統計学的解析に基づいて、ヒスチジンアセテート２０ｍＭ、スクロース１２０ｍＭ、ポリソルベート２０ ０．０４％、標的ｐＨ５．８中のα−ＰＤＬ１ ６０ｍｇ／ｍＬからなる液体製剤を臨床研究に選択した。
臨床治験用の投薬量は、患者当たりα−ＰＤＬ１ １２００ｍｇのフラット用量で実施するものとする。２０ｃｃガラスバイアルに名目上２０ｍＬ充填した（α−ＰＤＬ１ １２００ｍｇ）バイアル構成を標的製品プロファイルに合致するように選択した。
凍結／解凍研究は、Ｌ−ヒスチジンアセテート２０ｍＭ、スクロース１２０ｍＭ及びポリソルベート２０ ０．０２％（ｗ／ｖ）、ｐＨ５．８中のα−ＰＤＬ１ ６０ｍｇ／ｍＬを含有する目的の製剤で実施した。凍結／解凍を５回行った後のアッセイ結果によって、スクロース１２０ｍＭが凍結／解凍によって誘導される凝集からα−ＰＤＬ１を保護することが確認された（表１２）。目的の液体製剤の類似の長期安定性によって、２−８℃で６カ月にわたって安定であることが示された（表１３）。この製剤の３６カ月にわたる継続的モニタリングが進行中である。α−ＰＤＬ１原体及び薬物製品の標的製剤及び試験した研究範囲を表１４に示す。
Figure 0006942465
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α−ＰＤＬ１薬物製品（６０ｍｇ／ｍＬ）は等張塩化ナトリウム溶液（ＮａＣｌ０．９％）で希釈後点滴によって投与するので、活性成分の適合性及び安定性は以下にシミュレートした調製及び投与条件下で試験した：１）臨床研究における投与範囲を含むように、ＮａＣｌ０．９％を含有する点滴バッグ中において２．４−９．６ｍｇ／ｍＬの範囲で（希釈後の名目上の濃度）α−ＰＤＬ１薬物製品を希釈すること；２）等張塩化ナトリウム溶液を含有する点滴バッグに短期曝露すること（バッグ製品接触面材料はＰＶＣ又はポリオレフィンからなる）；３）ＩＶ点滴ライン（製品接触面はＰＶＣ又はポリオレフィンからなる）を使用すること；及び４）０．２μｍインラインフィルター（ＰＥＳのフィルター膜）を使用すること。
試料は、拡散光に曝露して２℃−８℃で２４時間、又は３０℃で２４時間保存後に試験した。試料は、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＩＣＩＥＦによる純度、タンパク質濃度（ＵＶによる）、光遮蔽、色、透明度／乳白による肉眼では見えない粒子、及びｐＨを含む安定性を示す適切な方法を使用して試験した（表１５）。

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前述したようにシミュレートした投与研究で試験した製品は、試験した条件下で物理的及び化学的に安定であった。様々な製品接触材料から構成される点滴バッグ、点滴セット、フィルター及び／又はＩＶ投与補助器具を付加しても十分に適格である。
静的安定性に加えて、薬物製品において貯蔵寿命にわたって観察することができたおそらく最低のＰＳ２０レベルであるＰＳ２０ ０．０２％を含むヒスチジンアセテート２０ｍＭ、スクロース１２０ｍＭ、ｐＨ５．８中で製剤化したα−ＰＤＬ１についてＩＶバッグ撹拌研究を実施する。撹拌は、２−８℃で、１００ｒｐｍの速度のオービタル振盪機で実施する。データによって、薬物製品中のＰＳ２０が０．０２％の場合、α−ＰＤＬ１はＩＶバッグ中で希釈後５℃での撹拌に対して安定である（表１６）。
実施例で使用した抗体の配列
α−ＰＤＬ１軽鎖可変領域
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号７）
α−ＰＤＬ１重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫ（配列番号８）
α−ＰＤＬ１完全軽鎖
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号９）
α−ＰＤＬ１完全重鎖
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１０）

Claims (22)

  1. 約５４ｍｇ／ｍＬから約６６ｍｇ／ｍＬの濃度の抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体、約１７ｍＭから約２２ｍＭの濃度のヒスチジンアセテート、約６０ｍＭから約１８０ｍＭの濃度のスクロース、約０．０２％（ｗ／ｖ）から約０．０４％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベートを含むｐＨ約５．５から約６．１の安定な水性薬学的製剤であって、
    前記モノクローナル抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、製剤。
  2. 製剤中の前記モノクローナル抗体が約６０ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の製剤。
  3. 前記ヒスチジンアセテートが約２０ｍＭの濃度である、請求項１又は２に記載の製剤。
  4. 製剤中の前記スクロースが約１２０ｍＭである、請求項１から３の何れか一項に記載の製剤。
  5. 製剤が約５．５のｐＨを有する、請求項１から４の何れか一項に記載の製剤。
  6. 製剤が約５．８のｐＨを有する、請求項１から４の何れか一項に記載の製剤。
  7. 製剤中の前記ポリソルベートがポリソルベート２０である、請求項１から６の何れか一項に記載の製剤。
  8. 製剤中の前記モノクローナル抗体が約６０ｍｇ／ｍＬであり、製剤中のスクロースが約１２０ｍＭであり、前記製剤が約５．８のｐＨを有する、請求項１に記載の製剤。
  9. 前記モノクローナル抗体が約６０ｍｇ／ｍＬの量であり、前記ヒスチジンアセテートが約２０ｍＭの濃度であり、前記スクロースが約１２０ｍＭの濃度であり、前記ポリソルベートが０．０４％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０であり、前記製剤が約５．８のｐＨを有する、請求項１に記載の製剤。
  10. 前記モノクローナル抗体が事前の凍結乾燥に供されない、請求項１から９の何れか一項に記載の製剤。
  11. 前記モノクローナル抗体が、ガラスバイアル又は金属合金容器中で保存される、請求項１から１０の何れか一項に記載の製剤。
  12. 金属合金が、３１６Ｌステンレススチールである、請求項１１に記載の製剤。
  13. ２−８℃で少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも１８カ月又は少なくとも２４カ月間安定である、請求項１から１２の何れか一項に記載の製剤。
  14. 製剤中の抗体が保存後にその生物活性の少なくとも約８０％を保持している、請求項１３に記載の製剤。
  15. 生物活性がＰＤ−Ｌ１に結合する抗体によって測定される、請求項１４に記載の製剤。
  16. 滅菌されている、請求項１から１５の何れか一項に記載の製剤。
  17. 対象への投与に適している、請求項１から１６の何れか一項に記載の製剤。
  18. 静脈内（ＩＶ）投与用である、請求項１から１７の何れか一項に記載の製剤。
  19. 請求項１から１８の何れか一項に記載の安定な水性薬学的製剤を保持する容器を含む製造品。
  20. 容器がガラスバイアル又は金属合金容器である、請求項１９に記載の製造品。
  21. 金属合金が３１６Ｌステンレススチールである、請求項２０に記載の製造品。
  22. 対象における疾患又は障害を治療するための組成物であって、請求項１から１８の何れか一項に記載の製剤の有効量を含み、疾患又は障害が、感染、がん及び炎症疾患からなる群から選択される組成物。
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