JP6886668B2 - 医療用検査装置及び細胞検査方法 - Google Patents

Description

本発明は、血液及び体液中の特定の細胞（血液・体液中に存在するがん細胞、幹細胞等）を捕捉できる医療用検査装置及び細胞検査方法に関する。

がん細胞が発生するとやがて、血液・体液中に出て来ることが知られており、血液中に出て来たがん細胞は、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）と呼ばれている。そして、この血中循環腫瘍細胞を調べることによるがんの治療効果の確認、予後寿命、投与前の抗がん剤の効果予測、がん細胞の遺伝子解析を用いた治療方法の検討、等が期待されている（特許文献１参照）。

しかしながら、血中循環腫瘍細胞は非常に数が少なく（数個〜数百個／血液１ｍＬ）、がん細胞を捕捉することが難しいという問題がある。

例えば、血中循環腫瘍細胞の捕捉技術として、Ｃｅｌｌ Ｓｅａｒｃｈシステムと呼ばれるものが知られているが、これは、抗原抗体反応（ＥｐＣＡＭ抗体で捕捉）を用いる技術であるため、ＥｐＣＡＭを発現しているがん細胞しか捕捉できず、補足可能ながん細胞の種類に制限がある。

特表２００５−５２３９８１号公報

本発明は、前記課題を解決し、ＥｐＣＡＭを発現していないがん細胞も含め、多くのがん細胞、幹細胞等の特定細胞を捕捉できる医療用検査装置及び細胞検査方法を提供することを目的とする。

本発明は、ウェル部を有する医療用検査装置であって、前記ウェル部の内面の少なくとも一部に親水性シラン化合物層が形成されている医療用検査装置に関する。

前記親水性シラン化合物は、下記式（Ｉ）で表される化合物であることが好ましい。

（式中、Ｒ^１１は、１価の炭化水素基を表す。Ｒ^１２及びＲ^１３は、同一若しくは異なって、２価の炭化水素基を表す。Ｘ^１１は、同一若しくは異なって、アルコキシ基を表す。Ｘ^１２は、同一若しくは異なって、１価の炭化水素基又はハロゲン基を表す。ｍは、１〜５０を表す。ｎは、０〜３を表す。）

前記式（Ｉ）で表されるシラン化合物は、下記式（Ｉ−１）で表される化合物であることが好ましい。

（式中、Ｒ^２１は、メチル基又はエチル基を表す。Ｘ^１１は、同一若しくは異なって、アルコキシ基を表す。Ｘ^１２は、同一若しくは異なって、１価の炭化水素基又はハロゲン基を表す。ｐは、１〜８を表す。ｍは、１〜５０を表す。ｎは、０〜３を表す。ｋは、１〜２０を表す。）

前記医療用検査装置は、前記親水性シラン化合物層にフィブロネクチンが吸着されていることが好ましい。

本発明は、前記医療用検査装置を用いて、血液又は体液中の細胞を調べる細胞検査方法に関する。

前記細胞検査方法は、血液又は体液を遠心分離により分画して前記血液又は前記体液中に含まれる特定細胞を回収し、次いで、前記医療用検査装置を用いて、得られた回収液中に含まれる特定細胞を親水性シラン化合物層に捕捉し、前記特定細胞を調べることが好ましい。

前記細胞検査方法は、前記遠心分離時に分離液を用いて分画することが好ましい。
前記分離液の密度が１．０６０〜１．１１５ｇ／ｍＬであることが好ましい。

前記遠心分離に用いる容器は、内表面の少なくとも一部の水の接触角が３０度以下であることが好ましい。

本発明によれば、ウェル部を有する医療用検査装置であって、前記ウェル部の内面の少なくとも一部に親水性シラン化合物層が形成されている医療用検査装置であるので、ＥｐＣＡＭを発現していないがん細胞も含め、多くのがん細胞、幹細胞等の特定細胞を捕捉できる。そのため、例えば、血液・体液中からがん細胞、幹細胞等の特定細胞を充分に捕捉でき、また、同時に他のタンパク質や細胞の粘着・接着も抑制できる。従って、がん細胞、幹細胞等の特定細胞を選択的に捕捉することが可能となる。

（ａ）、（ａ−１）、（ｂ）、（ｃ）は、内面にフィブロネクチン吸着親水性シラン化合物層が形成されたウェル部を有するマルチウェルプレート、スライドチャンバー、及び、シングルウェルの模式図の一例である。

〔医療用検査装置〕
本発明は、ウェル部を有する医療用検査装置であって、前記ウェル部の内面の少なくとも一部に親水性シラン化合物層が形成されている医療用検査装置である。前記医療用検査装置は、前記親水性シラン化合物層にフィブロネクチンが吸着されていることが好ましい。

ウェル部の内面の少なくとも一部に親水性シラン化合物層を形成させているので、親水性シラン化合物のがん細胞、幹細胞等の特定細胞の接着（吸着）能力を非常に顕著に向上できる。従って、がん細胞、幹細胞等の特定細胞の捕捉性が大きく向上すると共に、血小板等の捕捉性が低下し、たんぱく質が多い状態では到底発揮し得ない特定細胞の選択的な捕捉効果を奏する。

具体的に説明すると、血中循環腫瘍細胞（数個〜数百個／血液１ｍＬ）等の体液中にでてきた腫瘍細胞（がん細胞等）は、非常に数が少なく、検査に供するには、採取した体液中に存在する腫瘍細胞をできる限り多く捕捉することが重要である。本発明では、親水性シラン化合物層を形成しているため、これに血液等の体液を接触させることで、体液中の腫瘍細胞等が親水性シラン化合物層に、多く吸着・接着される。そして、吸着された腫瘍細胞等の特定細胞の数を測定することで、血液や体液中の特定細胞数が判り、がん治療効果の確認等を期待できる。また、捕捉した特定細胞を培養し、その培養した細胞で抗がん剤等の効き目を確認することで、抗がん剤等の投与前に、体の外で、抗がん剤等の効き目を確認できると同時に、抗がん剤等の選定にも役立つ。

以下、本発明の好ましい実施形態の一例を、図を用いて説明する。
医療用検査装置としては、マルチウェルプレート（図１−１（ａ））、スライドチャンバー（図１−２（ｂ））、シングルウェル（シャーレ、（図１−２（ｃ）））等を用いた装置が挙げられ、がん細胞、幹細胞等の特定細胞を捕捉する目的で使用できる。

マルチウェルプレートを用いた医療用検査装置は、例えば、図１−１（ａ）のマトリクス状にウェル１１が配置されたマルチウェルプレート１を有する。マルチウェルプレート１は、円形に開口された複数のウェル１１を有している。スライドチャンバーを用いた医療用検査装置は、例えば、図１−２（ｂ）のスライドチャンバー２を有する。スライドチャンバー２は、ガラス等の基板上に、サンプル（血液、体液等）を注入できるチャンバーを備えた構造を有し、矩形のウェル１１を有している。

ウェル１１は、血液、体液等注入する凹部であり、注入した血液や体液の特定細胞の有無の確認、特定細胞数の計測、特定細胞の培養、薬の効き目の確認・選定を実施できる。

図１−１（ａ）は、一例として、４行６列の２４個のウェル１１を有する２４ウェルプレートを示しているが、マルチウェルプレート１は、ウェル１１を少なくとも２つ以上有していれば良く、ウェル１１の個数は任意である。２４ウェルプレートの他には、ウェル１１が、６個、９６個、３８４個等の汎用マルチウェルプレートでも良い。図１−２（ｂ）は、一例として、１個のウェルを有するスライドチャンバー（シングルウェル）、２個、４個、１２個のウェルに分割されたスライドチャンバーを示している。

医療用検査装置におけるマルチウェルプレート１、スライドチャンバー２、シングルウェル３（シャーレ）の構成材料としては、細胞検査時の観察で透明性が高いものがよく、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸等のアクリル樹脂（ポリアクリル樹脂）、シクロオレフィン樹脂（ポリシクロオレフィン）、カーボネート樹脂（ポリカーボネート）、スチレン樹脂（ポリスチレン）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステル樹脂、ポリジメチルシロキサン及びガラス（ホウけい酸ガラス、ソーダ石灰ガラス等）等が挙げられる。親水性シラン化合物のコーティングには、構成材料は親水性が高い方が良く、ポリアクリル樹脂やソーダ石灰ガラスが好ましい。

医療用検査装置が細胞捕捉用の場合、構成材料に金属材料も使用できる。金属材料としては、例えば、ステンレス、ニッケル−チタン合金、鉄、チタン、アルミニウム、スズ、亜鉛−タングステン合金などの金属が挙げられる。中でも、生体適合性の観点から、ステンレス、ニッケル−チタン合金が好ましい。

医療用検査装置は、ウェル１１（ウェル部）の内面に親水性シラン化合物層２１が形成されているが、前記構成材料と親水性シラン化合物層２１との間にプライマー層（図示せず）を形成してもよい。プライマー層としては、例えば、後述の親水性シラン化合物以外のアルコキシ基を有するシラン化合物を用いて形成される層を好適に使用できる。該アルコキシ基の炭素数は、好ましくは１〜２２、より好ましくは１〜１６である。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基及びブトキシ基からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。なかでも、エトキシ基及び／又はブトキシ基を有するシラン化合物がより好ましく、エトキシ基及びブトキシ基を有するシラン化合物が更に好ましい。前記アルコキシ基を有するシラン化合物は、アルキル基等の炭化水素基を有する化合物でもよい。該アルキル基の炭素数は、１〜６が好ましく、１〜４がより好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の炭素数１〜８のアルキル基等が挙げられる。

前記シラン化合物としては、１個のアルコキシ基を有するモノアルコキシシラン、２個のアルコキシ基を有するジアルコキシシラン、３個のアルコキシ基を有するトリアルコキシシラン、４個のアルコキシ基を有するテトラアルコキシシランが挙げられ、下記式（１）で示される化合物等を使用できる。
Ｒ^１１ _ｋＳｉ（ＯＲ^１２）_４−ｋ （１）
（式中、各々のＲ^１１、Ｒ^１２は、同一若しくは異なって、炭素数１〜８の飽和又は不飽和炭化水素基を表し、Ｒ^１１とＲ^１２は同一の基でも異なる基でもよい。ｋは０〜３の整数を表す。）
なかでも、２個以上のアルコキシ基を有する化合物が好ましく、３個以上のアルコキシ基を有する化合物がより好ましい。

前記式（１）において、Ｒ^１１、Ｒ^１２の炭素数は、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜４である。Ｒ^１１、Ｒ^１２は、飽和炭化水素基であることが好ましい。

具体的なモノアルコキシシランとしては、トリメチルメトキシシラン、トリメチルエトキシシラン、トリメチルプロポキシシラン、トリエチルメトキシシラン、トリエチルエトキシシラン、トリプロピルプロポキシシランなどが挙げられる。ジアルコキシシランとしては、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、ジメチルジプロポキシシラン、ジエチルジメトキシシラン、ジエチルジエトキシシラン、メチルエチルジメトキシシラン、メチルエチルジエトキシシラン、ジプロピルトリメトキシシランなどが挙げられる。トリアルコキシシランとしては、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、メチルトリプロポキシシラン、エチルトリメトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、プロピルトリメトキシシラン、プロピルトリエトキシシラン、ブチルトリメトキシシランなどが挙げられる。テトラアルコキシシランとしては、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、テトラブトキシシラン、ジブトキシジエトキシシラン、ブトキシトリエトキシシラン、エトキシトリエトキシシランなどが挙げられる。

前記シラン化合物として、下記式（２）で示される化合物も好適に使用できる。
（Ｒ^２１Ｏ）_ｍＳｉ（ＯＲ^２２）_ｎ （２）
（式中、Ｒ^２１及びＲ^２２は、同一若しくは異なって、炭素数１〜８の飽和又は不飽和炭
化水素基を表す。平均値として、ｍ＋ｎ＝４、ｍ≧ｎ≧０である。）

前記式（２）において、Ｒ^２１、Ｒ^２２の炭素数は、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜４である。また、Ｒ^２１、Ｒ^２２は、飽和炭化水素基であることが好ましい。

前記式（２）で示されるシラン化合物としては、例えば、下記式（２−１）で示されるブトキシ／エトキシ系テトラアルコキシシラン（フロロテクノロジー製「プライマーコートＰＣ−３Ｂ」）を使用できる。
式（２−１）
（Ｈ_３Ｃ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−）_ｍ−Ｓｉ−（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_３）_ｎ
（式中、平均値として、ｍ＋ｎ＝４、ｍ＞ｎ＞０である。）

ウェル１１は非貫通孔であり、マルチウェルプレート１、スライドチャンバー２、シングルウェル３等に設けられ、開口部を有している。ウェル１１には、開口から、血液や体液が注入される。また、がん細胞、幹細胞等の特定細胞の存在を確認した場合、特定細胞を培養するための培養液を注入することも可能である。

ウェル１１の開口のサイズは、特に限定されず、通常用いられるマルチウェルプレート１、シングルウェル３（シャーレ）の直径Ｒ、深さＤ、スライドチャンバー２の縦Ｘ、横Ｙ、深さＤを採用できる。図１−１（ａ）、図１−２（ｂ）では、マルチウェルプレート１のプレート、スライドチャンバー２のスライドの表面及び裏面に対して、ウェル１１の内側面が略垂直であるが、ウェル１１は、内側面が傾斜し、開口から底面にかけて窄まる形状でも良い。また、内側面が傾斜し、開口から底面にかけて拡がる形状でも良い。

図１−１（ａ）、図１−２（ｂ）では、ウェル１１は円形、矩形に開口しているが、ウェル１１の開口形状は任意であり、サンプルの導入が可能な任意の形状（三角形、楕円等）に開口したものを使用できる。

マルチウェルプレート１、スライドチャンバー２として、複数のウェル１１が分離可能なものも使用可能である。複数のウェルを有する場合、特定細胞数計測用ウェルと、特定細胞培養用ウェルとに分離使用でき、例えば、計測用ウェルでがん細胞の存在の有無を確認した上で、存在が確認された場合に培養用ウェルでがん細胞を培養し、その細胞で薬の効き目を確認できる。

医療用検査装置のマルチウェルプレート１、スライドチャンバー２、シングルウェル３（シャーレ）等において、ウェル１１の内側面は、少なくとも一部に親水性シラン化合物層が形成されている。医療用検査装置は、前記効果の観点から、親水性シラン化合物層にフィブロネクチンが吸着されていることが好ましい。図１−１（ａ）、（ａ−１）では、マルチウェルプレート１に親水性シラン化合物層２１が形成され、更に該親水性シラン化合物層２１にフィブロネクチン３１を吸着させている例を示している。スライドチャンバー２、シングルウェル３（シャーレ）でも同様に、親水性シラン化合物層を形成し、該層にフィブロネクチンを吸着させたものを使用できる。

ウェル１１内に、血液や体液を導入すると、これらに含まれるがん細胞、幹細胞等の特定細胞は、必要に応じてフィブロネクチン３１を吸着させた親水性シラン化合物層２１に吸着されると共に、血小板、赤血球等の吸着が抑制される。そのため、血液や体液の導入後に所定時間保持し、次いで、洗浄することで、特定細胞を親水性シラン化合物層２１に吸着できる。そして、吸着された特定細胞の数を測定することで、血液や体液中のがん細胞数が判り、がん治療効果の確認等が期待される。

ウェル１１の内面の少なくとも一部に、親水性シラン化合物を用いて形成された親水性シラン化合物２１層が形成されている。

親水性シラン化合物としては、特定細胞に対する選択的吸着性・接着性等の観点から、ポリアルキレンオキシド基を含有する親水性シラン化合物等が好ましく、例えば、［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン等の［アルコキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル］トリアルコキシシラン等を好適に使用できる。

ポリアルキレンオキシド基を含有する親水性シラン化合物としては、例えば、下記式（Ｉ）で表される化合物を好適に使用できる。

（式中、Ｒ^１１は、１価の炭化水素基を表す。Ｒ^１２及びＲ^１３は、同一若しくは異なって、２価の炭化水素基を表す。Ｘ^１１は、同一若しくは異なって、アルコキシ基を表す。Ｘ^１２は、同一若しくは異なって、１価の炭化水素基又はハロゲン基を表す。ｍは、１〜５０を表す。ｎは、０〜３を表す。）

式（Ｉ）において、Ｒ^１１の１価の炭化水素基としては、直鎖、環状若しくは分枝のアルキル基、アルケニル基、アリール基、アラルキル基等が挙げられ、特にアルキル基が好ましい。１価の炭化水素基は、置換又は非置換のいずれでもよい。式（Ｉ）において、Ｒ^１１の炭素数は、１〜１８が好ましく、１〜１０がより好ましく、１〜４が更に好ましい。Ｒ^１１の１価の炭化水素基の具体例としては、置換若しくは非置換のメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。

式（Ｉ）において、Ｒ^１２及びＲ^１３の２価の炭化水素基としては、直鎖、環状若しくは分枝のいずれの基でもよく、特に直鎖状の基が好ましい。２価の炭化水素基は、置換若しくは非置換のいずれでもよい。式（Ｉ）において、Ｒ^１２の２価炭化水素基として、具体的には、置換若しくは非置換の炭素数１〜３０のアルキレン基、炭素数２〜３０のアルケニレン基、炭素数５〜３０のシクロアルキレン基、炭素数６〜３０のシクロアルキルアルキレン基、炭素数６〜３０のアリーレン基、炭素数７〜３０のアラルキレン基等が挙げられる。なかでも、Ｒ^１２は、置換若しくは非置換の炭素数１〜１８のアルキレン基が好ましく、炭素数１〜１０のアルキレン基がより好ましく、炭素数１〜６のアルキレン基が更に好ましい。Ｒ^１３は、置換若しくは非置換の炭素数１〜２０のアルキレン基が好ましく、炭素数１〜１４のアルキレン基がより好ましく、炭素数１〜１２のアルキレン基が更に好ましい。Ｒ^１２及びＲ^１３の具体例としては、置換若しくは非置換のメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基などが挙げられる。

式（Ｉ）において、Ｘ^１１のアルコキシ基は、分岐、非分岐のいずれでもよい。式（Ｉ）において、アルコキシ基の炭素数は、１〜１２が好ましく、１〜８がより好ましく、１〜５が更に好ましい。アルコキシ基の具体例としては、メトキシ基、エトシキ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉｓｏ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトシキ基、ｔｅｒｔ−ブトシキ基、ペンチルオキシ基、へキシルオキシ基、へプチルオキシ基、２−エチルヘキシルオキシ基、オクチルオキシ基、ノニルオキシ基などが挙げられる。

式（Ｉ）において、Ｘ^１２の１価の炭化水素基としては、Ｒ^１１の１価の炭化水素基と同様の基が挙げられる。Ｘ^１２のハロゲン基（ハロゲン原子）としては、フッ素、塩素、臭素などが挙げられる。

式（Ｉ）において、ｍは、１〜４０が好ましく、１〜３０がより好ましく、１〜２５が更に好ましい。
式（Ｉ）において、ｎは、１〜３が好ましく、２〜３がより好ましい。
なお、式（Ｉ）において、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｘ^１１、Ｘ^１２の置換基は、特に限定されず、水酸基などの官能基が挙げられる。

前記式（Ｉ）で表される親水性シラン化合物としては、例えば、下記式（Ｉ−１）で表される親水性シラン化合物を好適に使用できる。

（式中、Ｒ^２１は、メチル基又はエチル基を表す。Ｘ^１１は、同一若しくは異なって、アルコキシ基を表す。Ｘ^１２は、同一若しくは異なって、１価の炭化水素基又はハロゲン基を表す。ｐは、１〜８を表す。ｍは、１〜５０を表す。ｎは、０〜３を表す。ｋは、１〜２０を表す。）

式（Ｉ−１）において、Ｘ^１１、Ｘ^１２、ｍ、ｎは、前記と同様である。ｐは、１〜５が好ましく、１〜３がより好ましい。なお、−Ｃ_ｐＨ_２ｐＯ−で示される基は、直鎖若しくは分枝のいずれでもよく、特に直鎖状が好ましい。ｋは、１〜１６が好ましく、１〜１２がより好ましい。

親水性シラン化合物層２１（親水性シラン化合物を用いて形成される層）の膜厚は、好ましくは１〜３０ｎｍ、より好ましくは２〜２０ｎｍである。上記範囲内に調整することで、良好なタンパク質や細胞に対する低吸着性、がん細胞、幹細胞等の特定細胞に対する選択的吸着性・接着性が得られる。

親水性シラン化合物層２１上にフィブロネクチン３１を吸着させるという点から、フィブロネクチン濃度を、好ましくは０．５〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜２５０μｇ／ｍｌに調整した溶液、分散液等を用いることが好適である。上記範囲内の濃度に調整することで、良好なタンパク質や細胞に対する低吸着性、がん細胞、幹細胞等の特定細胞に対する選択的吸着性・接着性が得られる。

本発明の医療用検査装置は、例えば、図１の内面に必要に応じてフィブロネクチン３１を吸着させた親水性シラン化合物層２１が形成されているウェル１１を備えたマルチウェルプレート１、スライドチャンバー２、シングルウェル３（シャーレ）等に、更に必要に応じて他の部材（部品）を付加することにより、製造できる。

具体的には、親水性シラン化合物層２１が形成されたマルチウェルプレート１、スライドチャンバー２、シングルウェル３（シャーレ）等の場合、（１）親水性シラン化合物を各種溶剤に溶解・分散した親水性シラン化合物溶液・分散液を、ウェル１１の内部に注入し、所定時間保持する方法、（２）該親水性シラン化合物溶液・分散液をウェル１１の内面に塗工（噴霧）する方法、等、公知の手法により、ウェル１１の内面の全部又は一部に親水性シラン化合物溶液・分散液をコーティングすることで、親水性シラン化合物により形成される層が形成されたマルチウェルプレート１、スライドチャンバー２、シングルウェル３（シャーレ）等を製造できる。

溶剤、注入方法、塗工（噴霧）方法などは、従来公知の材料及び方法を適用できる。
（１）、（２）の保持時間は、ウェル１１の大きさ、導入する液種、等により適宜設定すれば良いが、５分〜１０時間が好ましく、１０分〜５時間がより好ましく、１５分〜２時間が更に好ましい。保持後、適宜、余分な親水性シラン化合物溶液・分散液を排出し、乾燥してもよい。

次いで、形成された親水性シラン化合物層２１にフィブロネクチン３１を吸着させる方法は特に限定されず、公知の方法を適用できる。例えば、親水性シラン化合物層２１にフィブロネクチン３１の緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ等）を公知の方法で接触させ、所定温度で所定時間放置し、必要に応じて洗浄する方法、等で吸着させることができる。温度、時間は適宜設定すればよく、例えば、１０〜６０℃、０．１〜１０時間程度で実施できる。

そして、作製されたフィブロネクチン３１が吸着された親水性シラン化合物層２１をウェル１１の内面の一部に形成したマルチウェルプレート１、スライドチャンバー２、シングルウェル３（シャーレ）等に、必要に応じて他の部品を追加することで、医療用検査装置を製造できる。

本発明では、他の部品として、フィブリノーゲンが吸着された部品を使用することが好ましい。検査用血液や体液を、血球細胞の接着に関係するフィブリノーゲンが吸着した部品に接触させることで、予め血球細胞数が減少し、がん細胞、幹細胞等の特定細胞の接着性・吸着性を向上できる。

〔細胞検査方法〕
本発明の細胞検査方法は、前述の医療用検査装置を用いて、血液又は体液中の細胞を調べる細胞検査方法である。前記のとおり、本発明の医療用検査装置は、がん細胞、幹細胞等の特定細胞の捕捉性が向上すると共に、血小板等の捕捉性が低下し、特定細胞の選択的な捕捉効果が得られるため、これを用いて血液又は体液中の細胞を調べることで、前述のがん治療効果の確認、体の外での抗がん剤等の効き目の確認、抗がん剤等の選定、等が期待できる。

前記細胞検査方法としては、特定細胞が濃縮され、捕捉性が向上する観点から、先ず、血液又は体液を遠心分離により分画して前記血液又は前記体液中に含まれる特定細胞を回収し、次いで、前記医療用検査装置を用いて、得られた回収液中に含まれる特定細胞を親水性シラン化合物層に捕捉し、前記特定細胞を調べる（検査する）方法が好ましい。

遠心分離に用いる容器は、特定細胞の回収性の観点から、該容器の内表面の少なくとも一部の水の接触角が３０度以下であることが好ましく、より好ましくは２０度以下、更に好ましくは１０度以下である。
なお、水の接触角は、容器の内表面に蒸留水２μｌを滴下し、３０秒後の接触角をθ／２法（室温）で測定することで測定できる。

遠心分離は、公知の方法を採用でき、例えば、公知の遠心分離装置で実施できる。
遠心分離は、遠心力２００〜３０００Ｇ（×Ｇ）の条件下で実施することが好ましい。２００Ｇ以上であると、血球細胞の分離が良くなると同時に、特定細胞のロス（赤血球等と同じ分画に入るなどによるロス）が減るため、特定細胞の選択的な捕捉効果を奏する。一方、３０００Ｇ以下であると、特定細胞へのストレスが抑制され、本来の細胞の性質が維持される。より好ましくは３００〜２８００Ｇ、更に好ましくは４００〜２５００Ｇである。

遠心分離の時間、温度は、血球細胞の分離性等の観点から、適宜設定すれば良く、例えば、１〜１２０分（好ましくは１〜６０分）、２〜４０℃（好ましくは３〜３０℃）の条件で実施すれば良い。

遠心分離では、遠心分離時に分離液を用いて分画することが好ましい。これにより、特定細胞（がん細胞等）等を含む単核球層、赤血球等を含む層、等に好適に分画できる。

密度勾配遠心法に用いられる分離液は、血液中の細胞の分画に適した比重を有し、また細胞を破壊することのない浸透圧及びｐＨを有するよう調製したものであればよい。媒体としては、密度勾配遠心分離法に使用可能な媒体を使用できる。分離液は、２０℃での比重が１．０６０〜１．１１５ｇ／ｍＬであることが好ましい。また、分離液のｐＨは、４．５〜７．５が好ましい。

代表的な媒体（分離液）としては、スクロース、フィコール（スクロースとエピクロロヒドリンの共重合物）、パーコール（ポリビニルピロリドンの被膜を有するコロイド状シリカ製品）が挙げられる。フィコールは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ファルマシアバイオテク（株））、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（シグマ アルドリッチ ジャパン（株））、リンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（ニコメッド、オスロ（ノルウェー））等；パーコールは、Ｐｅｒｃｏｌｌ（シグマ アルドリッチ ジャパン（株））等；の製品が市販されている。

分離液の密度（２０℃）は、特定細胞の回収性の観点から、１．０６０〜１．１１５ｇ／ｍＬであることが好ましく、１．０６０〜１．０８５ｇ／ｍＬであることがより好ましい。

このような遠心分離による分画、前記回収により、特定細胞をロスなく回収できるようになる。従って、赤血球や血小板が分離、除去され、がん細胞、幹細胞等の特定細胞の濃度を高めた試料を作製できる。

回収する分画中の赤血球をより少なくする点から、血液又は体液中に溶血剤を混合（添加）させた後、遠心分離を施すことが好ましい。溶血剤は、物理的又は化学的に赤血球に作用し、赤血球を溶解する試薬である。溶血剤としては、従来使用されているものを使用でき、例えば、塩化アンモニウム、合成界面活性剤及びアルコールが挙げられる。

血液又は体液中の血球細胞同士を凝集させた後、遠心分離を施すこと、すなわち、遠心分離前に、先ず血液又は体液中の血球細胞同士を凝集させることが好ましい。血球細胞同士を凝集させる方法は、このような凝集が可能な方法であれば、特に限定されないが、なかでも、抗原抗体反応を利用する方法を好適に使用できる。具体的には、血球凝集反応等の凝集反応法を好適に利用できる。

このような凝集工程で、血液又は体液に血球凝集反応を利用して細胞同士を凝集させると、その後、作製された凝集物を含むサンプルに遠心分離処理を施した際に、血球細胞を含む凝集物が除去される。従って、親水性シラン化合物層に対し、サンプル中に高濃度で残存する特定細胞（がん細胞、幹細胞等）を効果的に捕捉できる。

血球細胞同士の凝集には、例えば、赤血球及び白血球凝集抗体試薬（赤血球及び白血球凝集抗体組成物）を好適に使用できる。遠心分離処理時に、比重ががん細胞等の特定細胞に近い一部の白血球の分離が悪くなるが、上記抗体組成物を用いて抗原抗体反応を利用し、赤血球と白血球を結合・凝集させると、特定細胞と比重の異なる赤血球、血小板等だけでなく、白血球と特定細胞の分離も良好になり、特定細胞の接着・捕捉性を向上できる。

なお、前記血球細胞同士の凝集前に、血液又は体液を希釈し、次いで、遠心分離を施してもよい。希釈方法としては、ヒト血液のｐＨ（約７．４）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝溶液や、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）等の液体培地、を用いる方法があり、具体的には、採取した血液又は体液に緩衝溶液を加えて希釈することや、液体培地に採取した血液又は体液を加えて希釈することができる。希釈により、採取した血液又は体液に比べて、たんぱく質濃度を減少させることができる。

また、前記血球細胞同士の凝集後に、血液又は体液を希釈し、次いで、遠心分離を施してもよい。希釈方法は同様の方法を採用できる。

更に前記細胞検査方法は、予め血球細胞数を減少させ、がん細胞、幹細胞等の特定細部の接着性・吸着性を向上できる観点から、医療用検査装置に導入（注入、滴下等）する前に、血液又は体液をフィブリノーゲンが吸着された部品に接触させる方法が好ましい。例えば、フィブリノーゲンが吸着された部品として、採血用注射器、採血管又は遠心分離管を用いることで、前記効果が顕著に得られる。

以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

（実施例１）
Ｇｅｌｅｓｔ社製の「ＳＩＭ６４９２．７」（２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン、ＣＨ_３Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_６−９−（ＣＨ_２）_３Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３）の水／メタノール（５０質量％／５０質量％）の０．２５質量％溶液を作製した。
スランドチャンバー（スライドガラス部：ソーダ石灰ガラス、チャンバーサイズ：２０ｍｍ×２０ｍｍ）に、前記溶液を１００μｌ注入して、室温で静置した（１７時間）。その後、５０℃６時間で真空乾燥した後、水で洗浄することで、親水性シラン化合物層が形成された検査装置を作製した。

（実施例２）
Ｇｅｌｅｓｔ社製の「ＳＩＭ６４９２．７」をＧｅｌｅｓｔ社製の「ＳＩＭ６４９２．７２」（２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン、ＣＨ_３Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_９−１２−（ＣＨ_２）_３Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３）に変更した以外は、実施例１と同様に検査装置を作製した。

（実施例３）
Ｇｅｌｅｓｔ社製の「ＳＩＭ６４９２．７」をＧｅｌｅｓｔ社製の「ＳＩＭ６４９２．７３」（２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン、ＣＨ_３Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_{２１−２４}−（ＣＨ_２）_３Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３）に変更した以外は、実施例１と同様に検査装置を作製した。

（実施例４）
Ｇｅｌｅｓｔ社製の「ＳＩＭ６４９２．７」をＧｅｌｅｓｔ社製の「ＳＩＭ６４９３．４」（メトキシトリエチレンオキシプロピルトリメトキシシラン、ＣＨ_３Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_３−（ＣＨ_２）_３Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３）に変更した以外は、実施例１と同様に検査装置を作製した。

（実施例５）
Ｇｅｌｅｓｔ社製の「ＳＩＭ６４９２．７」をＧｅｌｅｓｔ社製の「ＳＩＭ６４９３．７」（メトキシトリエチレンオキシウンデシルトリメトキシシラン、ＣＨ_３Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_３−（ＣＨ_２）_１１Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３）に変更した以外は、実施例１と同様に検査装置を作製した。

（実施例６）
Ｇｅｌｅｓｔ社製の「ＳＩＭ６４９２．７」（２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン、ＣＨ_３Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_６−９−（ＣＨ_２）_３Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３）の水／メタノール（５０質量％／５０質量％）の０．２５質量％溶液を作製した。
スランドチャンバー（スライドガラス部：ソーダ石灰ガラス、チャンバーサイズ：２０ｍｍ×２０ｍｍ）に、前記溶液を１００μｌ注入して、室温で静置した（１７時間）。その後、５０℃６時間で真空乾燥した後、水で洗浄することで、親水性シラン化合物層が形成された。
更に、形成した親水性シラン化合物層の表面に、フィブロネクチンを吸着させた。具体的にはフィブロネクチンのＰＢＳ溶液（リン酸緩衝生理食塩水）２００μｇ／ｍｌを作製し、４０℃１時間放置した後、ＰＢＳ溶液で洗浄することで検査装置を作製した。

（比較例１）
スランドチャンバー（スライドガラス部：ソーダ石灰ガラス、チャンバーサイズ：２０ｍｍ×２０ｍｍ）を使用した（未処理）。

実施例、比較例で作製した医療用検査装置を以下の方法で評価した。結果を表１に示す。

〔親水性シラン化合物層（コーティング層）の膜厚〕
ウェル内面の親水性シラン化合物層の膜厚は、ＴＥＭを使用し、加速電圧１５ｋＶ、１０００倍で測定（撮影）した。

〔全血にがん細胞を添加したスパイク血試験〕
染色をしたヒト結腸癌由来上皮細胞（ＨＴ−２９）を全血に１００個／血液１ｍＬになる様に懸濁させた（スパイク血）。これに等量の液体培地を入れて希釈した（希釈スパイク血）。次に１５ｍＬの遠心分離管に、分離液（ＬｙｍｐｈｏＰｒｅｐ：密度１．０７７±０．００１ｇ／ｍＬ）を入れて、その上に上記希釈スパイク血を入れて、８００Ｇ２０分（室温：２３℃）の条件で遠心分離を行った。そして単核球層を分離した。分離した単核球層にリン酸バッファー（ＰＢＳ）溶液を添加して、遠心分離を再度行い、濃縮を行った。遠心分離後の最下層にできた塊をＦＢＳ（ウシ胎児血清）１０％添加液体培地（最初の全血量と同じ液量）で懸濁させた。この懸濁液を用いて、スライドチャンバーに１ｍｌずつ注入し、３７℃で１時間接着させた。その後、ＰＢＳ溶液で未接着の細胞を洗浄した。次いで、蛍光顕微鏡で接着したがん細胞数をカウントトした。なお、比較例１の接着数を１００として、相対値で比較した。

親水性シラン化合物層を形成した実施例１〜６は、ガラス表面である比較例１に比べ、がん細胞の接着数（相対値）が大幅に向上した。

１ マルチウェルプレート
２ スライドチャンバー
３ シングルウェル（シャーレ）
１１ ウェル
２１ 親水性シラン化合物層
３１ フィブロネクチン

Claims (10)

1. ウェル部を有する医療用検査装置であって、
   前記ウェル部の内面の少なくとも一部に親水性シラン化合物層が形成されており、
   前記親水性シラン化合物は、下記式（Ｉ）で表される化合物である医療用検査装置。
   

   

   （式中、Ｒ^１１は、１価の炭化水素基を表す。Ｒ^１２及びＲ^１３は、同一若しくは異なって、２価の炭化水素基を表す。Ｘ^１１は、同一若しくは異なって、アルコキシ基を表す。Ｘ^１２は、同一若しくは異なって、１価の炭化水素基又はハロゲン基を表す。ｍは、１〜５０を表す。ｎは、１〜３を表す。）
2. 前記式（Ｉ）で表されるシラン化合物は、下記式（Ｉ−１）で表される化合物である請求項１記載の医療用検査装置。
   

   

   （式中、Ｒ^２１は、メチル基又はエチル基を表す。Ｘ^１１は、同一若しくは異なって、アルコキシ基を表す。Ｘ^１２は、同一若しくは異なって、１価の炭化水素基又はハロゲン基を表す。ｐは、１〜８を表す。ｍは、１〜５０を表す。ｎは、１〜３を表す。ｋは、１〜２０を表す。）
3. 前記ｍが、１〜２５を表す請求項１又は２記載の医療用検査装置。
4. 前記親水性シラン化合物層にフィブロネクチンが吸着されている請求項１〜３のいずれかに記載の医療用検査装置。
5. 前記親水性シラン化合物層の膜厚が、１〜３０ｎｍである請求項１〜４のいずれかに記載の医療用検査装置。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の医療用検査装置を用いて、血液又は体液中の細胞を調べる細胞検査方法。
7. 血液又は体液を遠心分離により分画して前記血液又は前記体液中に含まれる特定細胞を回収し、次いで、前記医療用検査装置を用いて、得られた回収液中に含まれる特定細胞を親水性シラン化合物層に捕捉し、前記特定細胞を調べる請求項６記載の細胞検査方法。
8. 前記遠心分離時に分離液を用いて分画する請求項７記載の細胞検査方法。
9. 前記分離液の密度が１．０６０〜１．１１５ｇ／ｍＬである請求項８記載の細胞検査方法。
10. 前記遠心分離に用いる容器は、内表面の少なくとも一部の水の接触角が３０度以下である請求項７〜９のいずれかに記載の細胞検査方法。

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