JP6393614B2 - 毛様体周縁部様構造体の製造方法 - Google Patents
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Description
即ち、本発明は、
1.網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上である細胞凝集体を、Wntシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養した後、得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Wntシグナル経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程を含むことを特徴とする、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体の製造方法(以下、本発明製造方法と記すこともある。);
2.RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間が、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が50%〜1%の範囲内である期間であり、且つ、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体が、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が50%〜1%の範囲内である細胞凝集体であることを特徴とする前項1記載の製造方法;
3.得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が50%以上に至るまで、Wntシグナル経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養することを特徴とする前項2記載の製造方法;
4.前記網膜組織がヒト多能性幹細胞由来である前項1〜3のいずれか記載の製造方法;
5.前項1〜4のいずれか記載の製造方法により製造される毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体の毒性・薬効評価用試薬としての使用;
6.前項1〜4のいずれか記載の製造方法により製造される毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体の移植用生体材料としての使用;
等を提供するものである。
「凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞の凝集体を形成させて浮遊培養させる際に、「一定数の分散した幹細胞を迅速に凝集」させることで質的に均一な細胞の凝集体を形成させることをいう。
凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えば、ウェルの小さなプレート(96穴プレート)やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法などが挙げられる。
尚、細胞非接着性の培養器は、培養器の表面が細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理(例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理)されていないもの等を使用することがよい。
(1)多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
(2)第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程、及び
(3)第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程
第一工程で用いた無血清培地をそのまま本工程に用いる場合、「基底膜標品」を培地中に添加すればよい。
例えば、第三工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する。浮遊培養で用いられる培養器としては、上述のものが挙げられる。浮遊培養における培養温度、CO2濃度、O2濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約30〜40℃、好ましくは約37℃である。また、CO2濃度は、例えば約1〜10%、好ましくは約5%である。一方O2濃度については、例えば20〜70%、好ましくは20〜60%、より好ましくは30〜50%である。培養時間は特に限定されないが、通常48時間以上であり、好ましくは7日以上である。
浮遊培養終了後、凝集体をパラホルムアルデヒド溶液等の固定液を用いて固定し、凍結切片を作製する。得られた凍結切片を免疫染色し、網膜組織の層構造が形成されていることを確認すればよい。網膜組織は、各層を構成する網膜前駆細胞(視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞)がそれぞれ異なるため、これらの細胞に発現している上述のマーカーに対する抗体を用いて免疫染色することにより、層構造が形成されていることを確認することができる。
(1)まず、「網膜組織を含む細胞凝集体」の凍結切片を作製する。
(2)次いで、Raxタンパク質の免疫染色を、又は、Rax遺伝子を発現する細胞でGFP等の蛍光タンパク質が発現するように改変された遺伝子組換え細胞を用いた場合には前記蛍光タンパク質の発現を、蛍光顕微鏡等を用いて観察することにより、Rax遺伝子を発現する網膜組織領域を特定する。
(3)Rax遺伝子を発現する網膜組織領域が特定された凍結切片と同じ切片又は隣接する切片を試料として、Dapi等の核染色試薬を用いて核を染色する。そして、上記で特定されたRax遺伝子を発現する網膜組織領域の中において、染色された核の数を計測することにより、網膜組織領域の細胞数を測定する。
(4)Rax遺伝子を発現する網膜組織領域が特定された凍結切片と同じ切片又は隣接する切片を試料として、Chx10タンパク質の免疫染色を行う。上記で特定された網膜組織領域におけるChx10陽性細胞中の核の数を計測する。
(5)上記(3)及び(4)で計測された各々の核の数に基づいて、Chx10陽性細胞中の核の数を、上記で特定された網膜組織領域におけるChx10陽性細胞中の核の数で除することにより、「Chx10陽性細胞の存在割合」を算出する。
ここで、好ましい培養としては、例えば、浮遊培養を挙げることができる。また、好ましい培地としては、例えば、無血清培地を挙げることができる。
このような特定な期間を設定するには、前記「網膜組織を含む細胞凝集体」を試料として、当該試料中に含まれるRPE65遺伝子の発現有無又はその程度を、通常の遺伝子工学的手法を用いて測定すればよい。具体的には例えば、後述する実施例に記載されるように、前記「網膜組織を含む細胞凝集体」の凍結切片をRPE65タンパク質に対する抗体を用いて免疫染色する方法を用いてRPE65遺伝子の発現有無又はその程度を調べることができる。
ここで、好ましい培養としては、例えば、浮遊培養を挙げることができる。
本発明製造方法により製造された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体は、網膜細胞の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニング、疾患研究材料、創薬材料として利用可能である。また化学物質等の毒性や薬効の評価においても、光毒性、神経毒性等の毒性研究、毒性試験等に活用可能である。
本発明製造方法により製造された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体は、細胞損傷状態において、障害を受けた組織自体を補充する(例えば、移植手術に用いる)ため等に用いる移植用生体材料として用いることができる。
RAX::GFPノックインヒトES細胞(KhES-1由来;Nakano, T. et al. Cell Stem Cell 2012, 10(6), 771-785)を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載される方法に準じて培養した。培地には、DMEM/F12 培地(Invitrogen)に20%KSR (Knockout Serum Replacement;Invitrogen)、0.1mM 2−メルカプトエタノール、1mM ピルビン酸、5〜10ng/ml bFGFを添加した培地を用いた。培養された前記ES細胞を、0.25% trypsin-EDTA (Invitrogen)を用いてES細胞を単一分散した後、単一分散されたES細胞を非細胞接着性の96穴培養プレート(スミロン スフェロイド プレート,住友ベークライト社)の1ウェルあたり9×103細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5%CO2で浮遊培養した。その際に用いられた無血清培地は、G-MEM培地に20% KSR、0.1mM 2−メルカプトエタノール、1mM ピルビン酸、20μM Y27632、Wntシグナル経路阻害物質(3μM IWR1e)を添加した無血清培地であった。浮遊培養開始2日目から容積あたり1/100量のGFRマトリゲル(Invitrogen)を添加して浮遊培養した。浮遊培養開始12日目に容積あたり1/10量の牛胎児血清及びShhシグナル経路作用物質(100nM SAG)を添加して、合計18日間浮遊培養した。
このようにして製造された細胞凝集体を4%パラホルムアルデヒド固定し凍結切片を調製した。調製された凍結切片につき、GFP蛍光像の蛍光顕微鏡観察(図1)及び神経網膜前駆細胞のマーカーの1つであるChx10の免疫染色(図2)を行った。上記のようにして製造された細胞凝集体に含まれる網膜組織には、Chx10陽性細胞が40%程度存在していた(図2参照)。
実施例1と同様な方法を用いて、浮遊培養をより長時間行ったところ、浮遊培養開始から25日目にはChx10陽性細胞が80%程度または90%程度存在する網膜組織を含む細胞凝集体も得られた。
実施例1に記載された方法により製造された浮遊培養開始後18日目の網膜組織を含む細胞凝集体を、Wntシグナル経路作用物質(3μM CHIR99021)を含む無血清培地で3日間浮遊培養した。
得られた細胞凝集体を4%パラホルムアルデヒド固定し凍結切片を調製した。調製された凍結切片につき、GFP蛍光像の蛍光顕微鏡観察(図3)及び神経網膜前駆細胞のマーカーの1つであるChx10の免疫染色(図4)を行った。Wntシグナル経路作用物質を含む無血清培地で3日間浮遊培養した前記細胞凝集体に含まれる網膜組織には、Chx10陽性細胞が3%程度しか存在せず、Chx10陽性細胞の存在割合が明らかに減少していることが確認できた(図4参照)。このとき、前記細胞凝集体には、RPE65遺伝子を発現する細胞は出現していなかった。
実施例1及び実施例3に記載された方法により製造された浮遊培養開始後21日目(上記の「18日目」と「3日間」との合計日数)の細胞凝集体(Chx10陽性細胞の存在割合:3%程度)を、Wntシグナル経路作用物質を含まない血清培地(DMEM/F12、10%牛胎児血清、N2 supplement、0.5μM レチノイン酸等を含む)で、40% O2条件下で更に39日間浮遊培養した。
得られた細胞凝集体を4%パラホルムアルデヒド固定し凍結切片を調製した。調製された凍結切片につき、GFP蛍光像の蛍光顕微鏡観察(図5)及び毛様体周縁部のマーカーの1つであるRdh10の免疫染色(図6)を行った。上記のようにして、Wntシグナル経路作用物質を含まない血清培地で39日間浮遊培養した後の細胞凝集体において、網膜組織(具体的には、神経網膜)と網膜色素上皮との境界領域に存在する組織の中には、Rdh10陽性細胞(即ち、毛様体周縁部様構造体のマーカー遺伝子であるRdh10遺伝子を発現する細胞)が略均一な群領域として存在しており、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体が高効率で製造されたことが確認できた(図6参照)。
実施例1及び実施例3に記載された方法により製造された浮遊培養開始後21日目(上記の「18日目」と「3日間」との合計日数)の細胞凝集体(Chx10陽性細胞の存在割合:3%程度)を、実施例4と同様に、Wntシグナル経路作用物質を含まない血清培地(DMEM/F12、10%牛胎児血清、N2 supplement、0.5μM レチノイン酸等を含む)で、40% O2条件下で更に50日間浮遊培養した。
得られた細胞凝集体を4%パラホルムアルデヒド固定し凍結切片を調製した。調製された凍結切片につき、GFP蛍光像の蛍光顕微鏡観察(図7)、及び、毛様体周縁部のマーカーであるRdh10(図8)又はOtx1(図9)の免疫染色を行った。上記のようにしてWntシグナル経路作用物質を含まない血清培地で50日間浮遊培養した後の細胞凝集体において、網膜組織(具体的には、神経網膜)と網膜色素上皮との境界領域に存在する組織の中には、Rdh10陽性細胞(即ち、毛様体周縁部様構造体のマーカー遺伝子であるRdh10遺伝子を発現する細胞)が略均一な群領域として存在しており(図8参照)、Otx1陽性細胞(即ち、毛様体周縁部様構造体のマーカー遺伝子であるOtx1遺伝子を発現する細胞)も同様に存在していた(図9参照)。これらの結果から、当該製造方法により、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体が高効率で製造されたことが確認できた。
実施例1に記載された方法により製造された浮遊培養開始後18日目の細胞凝集体をWntシグナル経路作用物質を含む無血清培地中で3日間浮遊培養した後、実施例4及び実施例5と同様に、Wntシグナル経路作用物質を含まない血清培地中で46日間浮遊培養した。その後、増殖細胞を標識するためにBrdU存在下で1日間培養し、次いでBrdU非存在下で13日間培養した後に、EdU(Invitrogen)存在下で1日間培養した。得られた細胞凝集体を4%パラホルムアルデヒド固定して凍結切片を作製し、作製された凍結切片につき、抗Ki67抗体(図10左図)もしくは抗BrdU抗体(図10右図)を用いた蛍光免疫染色、または、EdUの発色反応(図10中図)を行った。
その結果、上記のようにしてWntシグナル経路作用物質を含まない血清培地で46日間浮遊培養した後の細胞凝集体において、毛様体周縁部様構造体がKi67陽性の増殖細胞であることがわかった(図10左図、矢印にて示す)。Ki67陽性細胞の90%以上がEdU陽性であることから(図10中図、矢印)、1日間のEdUの取り込みにより増殖細胞の90%以上が標識できることがわかった。一方、毛様体周縁部様構造体のKi67陽性細胞ではBrdUのシグナルが弱い(図10右図、矢印)ことから、前記Ki67陽性細胞がBrdU標識後の14日間持続的に増殖し続け、DNAに取り込まれたBrdUが希釈されたと考えられた。これらの結果から、上記のようにして培養された細胞凝集体において、毛様体周縁部様構造体がProgress zone(進行帯)であることがわかった。
実施例1に記載された方法により製造された浮遊培養開始後18日目の細胞凝集体をWntシグナル経路作用物質を含む無血清培地中で3日間浮遊培養した後、実施例4、実施例5及び実施例6と同様に、Wntシグナル経路作用物質を含まない血清培地中で46日間浮遊培養した。その後、増殖細胞を標識するためにBrdU存在下で1日間培養し、次いでBrdU非存在下で13日間培養した後に、EdU(Invitrogen)存在下で1日間培養し、さらにEdU非存在下で13日間培養した。得られた細胞凝集体の凍結切片を作製し、抗Ki67抗体(図11左図)、抗BrdU抗体(図11右図)もしくは抗Rdh10抗体(図11下図)による蛍光免疫染色、または、EdUの発色反応(図11中図)を行った。
その結果、上記のようにしてWntシグナル経路作用物質を含まない血清培地で46日間浮遊培養した後の細胞凝集体において、Rdh10陽性の毛様体周縁部様構造体(図11下図、矢印にて示す)がKi67陽性であることがわかった(図11左図)。前記毛様体周縁部様構造体のKi67陽性細胞において、EdU(図11中図)及びBrdU(図11右図)のシグナルが弱いことがわかった。従って、前記毛様体周縁部様構造体のKi67陽性細胞が27日間持続的に増殖し続け、DNAに取り込まれたEdUとBrdUが希釈されたと考えられた。これらの結果から、上記のようにして培養された細胞凝集体において、毛様体周縁部様構造体がProgress zone(進行帯)であることがわかった。
実施例1に記載された方法により製造された浮遊培養開始後18日目の細胞凝集体をWntシグナル経路作用物質を含む無血清培地中で3日間浮遊培養した後、実施例4、実施例5、実施例6及び実施例7と同様に、Wntシグナル経路作用物質を含まない血清培地中で75日間浮遊培養し、得られた細胞凝集体を解析した。当該細胞凝集体の一例として、毛様体周縁部様構造体(CMZ)を含まない細胞凝集体の位相差像(A、左列、上段)、毛様体周縁部様構造体を含まない細胞凝集体のCrx遺伝子発現細胞のGFP蛍光像(A、左列、下段)、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体の位相差像(A、右列、上段)、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体のCrx遺伝子発現細胞のGFP蛍光像(A、右列、下段)を示す。毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体のCrx遺伝子発現細胞のGFP蛍光像(A、右列、下段)では、右下部に、毛様体周縁部様構造体に近接して、層構造をもち連続した神経網膜が存在することがわかった(矢印にて示す)。
毛様体周縁部様構造体を含まない細胞凝集体(CMZ-)と、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体(CMZ+)に関して、層構造をもち連続した神経網膜が細胞凝集体円周の10%以上存在する細胞凝集体の割合を、Crx遺伝子発現細胞の形態を指標として測定した(図12B)。その結果、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体(CMZ+)の方が、毛様体周縁部様構造体を含まない細胞凝集体(CMZ-)と比べて、層構造をもち連続した神経網膜をもつ細胞凝集体の割合が高いことがわかった。
Claims (11)
- 網膜組織を含むヒト多能性幹細胞由来の細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上である細胞凝集体を、Wntシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り2日間〜5日間培養して、網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が3%程度以下に減少した細胞凝集体を得た後、
得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現しておらず網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が3%程度以下に減少した細胞凝集体」を、Wntシグナル経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程を含むことを特徴とする、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体の製造方法であって、該Wntシグナル経路作用物質は、Wntにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである、方法。 - 前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上である細胞凝集体が、下記(1’)〜(2’)の工程を含む方法により調製され得る細胞凝集体である、請求項1記載の製造方法。
(1’)ヒト多能性幹細胞を浮遊培養することによりヒト多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程
(2’)形成された細胞凝集体を浮遊培養してChx10陽性細胞の存在割合が20%以上である網膜組織を形成させる工程 - 前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上である細胞凝集体が、下記(1)〜(3)の工程を含む方法により調製され得る細胞凝集体である、請求項1記載の製造方法。
(1)ヒト多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
(2)第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程、及び
(3)第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程 - 得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現しておらず網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が3%程度以下に減少した細胞凝集体」を、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が50%以上に至るまで、Wntシグナル経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記Wntシグナル経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程が、Wntシグナル経路作用物質を含まない血清培地中で培養する工程である、請求項1〜4のいずれか1項記載の製造方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法により製造される細胞凝集体であって、毛様体周縁部様構造体と網膜色素上皮と神経網膜とを含む細胞凝集体から、神経網膜を物理的に切り出す工程を含む、神経網膜の製造方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法により製造される毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体の毒性・薬効評価用試薬としての使用。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法により製造される毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体の、移植用生体材料を製造するための使用。
- 毛様体周縁部様構造体と、網膜色素上皮と、神経網膜とを有するヒト由来の細胞凝集体であって、細胞凝集体の表面が前記神経網膜で覆われ、該神経網膜が該網膜色素上皮で覆われていないことを特徴とし、且つ
以下(A)および(B)の特徴を有する細胞凝集体。
(A)層構造を有する連続した神経網膜が細胞凝集体円周の10%以上存在する
(B)網膜色素上皮と神経網膜とは、毛様体周縁部様構造体に対して、同一の細胞凝集体内でその外周に沿って隣接して存在している - 請求項9に記載の細胞凝集体から、神経網膜を物理的に切り出す工程を含む、神経網膜の製造方法。
- 請求項9に記載の細胞凝集体を含む、移植用生体材料。
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