JP6873456B2 - 細胞搬送システム - Google Patents
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Description
現在の生命科学分野では、コンピュータの演算処理速度の飛躍的な発展とも相関し、ハイスループット解析等の大規模解析技術の指向性が強い。そのため分析用容器として試料の大量処理が可能なマイクロウェルプレートが多用され、更に今後はマイクロチップ状の微小ホール及びチャンネルを備えたマイクロデバイス容器が発展することが予想される。
そこで、1細胞単位での細胞搬送操作を効率良く実行する技術開発が期待されているが、以下に示す主たる課題によりその実現が阻まれていた。
光学系におけるピント合わせの自動化技術としては、オートフォーカス画像処理によって焦点ズレを補正する制御手段が広く知られおり、当該技術は一般的な顕微鏡システムにおいても広く利用されている極めて有用な技術である。
顕微鏡におけるオートフォーカス制御機構としては、例えば、観測対象との焦点位置のズレを認識して当該ズレ量に応じた補正量を定量的に算出し、当該補正量に応じた焦点修正を自動的に実行する制御機構を挙げることができる(例えば、特許文献1等参照)。
このようなオートフォーカス阻害現象は、遺伝子等の解析を行うために対象細胞をPCRチューブ等に搬送する場面において発生しやすく、解析用酵素等を含む反応溶液(高額な試薬)を少量スケールにして行う場合に特に多発する現象である。この点では高価な酵素等を含む反応試薬が大量に必要となる大規模解析において深刻な作業遅延を引き起こす。
また、遺伝子等の解析では対象細胞をマイクロウェルプレートやPCRチューブ等に搬送する場面が求められるところ、反応チューブはポロプロピレン等の材質で構成される容器が多いため、ガラス等より透明度が低く、この点もオートフォーカスの自動認識を阻害する方向に作用する。
更に、キャピラリー管の管先が容器底面に近接する状況下にてピント合わせを行う場面においては、視野内の微量液内に入り込んだ管先の映り込み現象等の影響で高コントラスト化が更に顕著になり、オートフォーカス制御をより困難なものとしている。
対象細胞を1細胞単位で所望の容器内へ搬送する操作においては、搬送元容器における細胞「吸引」の確認、並びに、搬送先容器における細胞「吐出」の確認、を行いながら確実に操作を行う必要がある。即ち、対象の1細胞をピンポイントにて所望の容器内に搬送するためには、上記1)で挙げたピント合わせの自動化の課題とは別の要求として、微細キャピラリー管内に対象細胞が確実に吸引されたこと、並びに、微細キャピラリー管内から対象細胞が確実に吐出されたことを、試料ステージの底面方向又は上面方向に配設された対物レンズを介して顕微鏡で確認しながら確実に行う操作が求められる。
しかしながら、1細胞解析では微小スケールで解析を行うことが求められるところ、マイクロプレート等の微細容器を用いて容器底面にアクセスするためには、微細キャピラリー管をほぼ垂直に挿入して操作を行うことが必要となる。このような状況では対物レンズ又は光源の配設位置の関係で相対焦点深度が深く光路が阻害されやすくなり、微細キャピラリー管内に格納された細胞の状態を確認することが困難になる現象が発生する。
当該現象は、特に微小なマイクロプレートを用いた多検体処理の場合に顕在化する傾向があり、吸引又は吐出した細胞数を誤認する問題を誘発し作業を遅延させる原因となる。
これら上記課題は、飛躍的発展が予想される1細胞を対象とした大量解析技術の開発において認知された課題であり、「1細胞解析」を大規模に実行するために克服すべき課題と位置付けられる。
ここで、従来の一般的な顕微鏡システムを用いて1細胞解析等で要求される微量スケールでの細胞搬送操作を行う場合では、オートフォーカス制御が正常に機能しない状況であり且つ対象細胞の搬送元容器と搬送先容器の底面形状が相違して手動ピント合わせ操作が必須となるところ、一方、本発明者が着想した顕微鏡試料ステージでは、搬送元容器と搬送先容器のそれぞれの底面の相違に対応するピントが合う位置を次々に自動移動させながら、細胞吸引と細胞吐出を連続して効率良く実行できることを見出した。
当該自動移動及び制御は、顕微鏡試料ステージ(1物品)の駆動手段を自動制御するのみで実行可能であるため、簡易な制御手段の付加により実現可能な技術であった。
更に、本発明者が着想した顕微鏡試料ステージは、一般の市販の顕微鏡装置に配設可能な実施態様とすることが可能であるため、顕微鏡装置本体とは別途の汎用部材として使用することが可能であった。これは、ピント合わせ手段を顕微鏡装置と一体化した物品である対物レンズの上下移動に依存したシステムでは実現不可能な態様であり、需要者の装置導入においてコスト的に大きな利点を提供し得る。
更に、一般的な顕微鏡システムで細胞搬送を行う場合、顕微鏡試料ステージを移動させるたびに容器壁面との接触を避けるためのキャピラリー管の上下移動が必須動作として必要になる。この点、仮に一般的な顕微鏡システムに3次元座標の記憶及び自動調節を可能とする制御手段を設けたシステムを構築した場合、顕微鏡ステージ、対物レンズ、及びキャピラリー管(3物品)の駆動手段を3次元的に連動させた上で自動制御することが必要となる。これは本発明に係るシステムと比較して複雑な装置構成であり、使用時において分離した物品間の精密な連動動作の調整確認を利用者に課す複雑な装置システムとなる。更に、対物レンズを含めた連動した制御システムである必要上、顕微鏡装置本体と一体化した製品形態とならざるを得ず、需要者の装置導入においてコスト的に大きな負担となる。
本発明者は、当該先端微細構造を備えた微細キャピラリー管を使用することによって、マイクロウェルプレートの微小ウェル等を微細キャピラリー管に垂直にアクセスさせた場合であっても、微細構造の管先が水平に又は適度な傾斜角度となるようにして容器底面にアクセス可能となることを見出した。これにより本発明者は、対物レンズ又は光源の配設が垂直方向であっても光路が遮断されず、微細キャピラリー管の先端管内の視認を容易に行うことが可能となることを見出した。
しかし、特許文献1はオートフォーカス制御による焦点補正技術を開示する内容の過ぎない文献であるため、1細胞解析を前提とした細胞搬送技術で見出されてきた「微液量」の溶液でのピント合わせの課題を開示又は示唆する記載はない。この点、当該課題を克服する解決手段として、オートフォーカス制御を「用いることなく」顕微鏡試料ステージ面に3次元方向の自由移動を可能とする駆動手段、並びに、前記顕微鏡試料ステージ面に関する制御手段を設ける着想を、特許文献1の記載から想到することはできない。
更に、引用文献1には、細胞搬送に関する微細キャピラリー管を開示する記載はなく、キャピラリー管内での格納細胞の視認性向上に関する微細キャピラリー管の管先微細構造に関する技術的特徴も開示するものでもない。
[項1]
対象細胞を1細胞単位で所望の搬送先容器に搬送することを可能とする細胞搬送システムであって、;
(A)試料ステージ面に試料容器保持手段を備え且つX軸、Y軸、及びZ軸方向への自動移動が可能な駆動手段を備えた顕微鏡試料ステージ、
(B)前記試料ステージ面に関する3次元座標が記憶可能であり、前記記憶された相対的位置情報に基づいて任意の設定された3次元座標へ前記試料ステージ面を自動移動させる制御手段、並びに、
(C)前記試料ステージ面の上方に配設される微細キャピラリー管であって、細胞吸引及び細胞吐出を行う先端微細構造が90〜150°の範囲にある屈曲又は湾曲した形状を含んでなる微細キャピラリー管、を備えてなる、;
ことを特徴とする、顕微鏡装置に配設して使用する細胞搬送システム。
[項2]
搬送先容器内の極微量で顕微鏡像が高コントラスト化した溶液に対して、オートフォーカス制御での焦点補正が正常に作動しない状況でも自動的なピント合わせ動作の実行が可能である、項1に記載の細胞搬送システム。
[項3]
前記微細キャピラリー管の先端微細構造が、内径5〜500μmの管構造であって、管先から5mm以下の範囲内に屈曲又は湾曲した形状部分を含んでなる先端微細構造である、項1又は2に記載の細胞搬送システム。
[項4]
前記顕微鏡試料ステージに備えられた駆動手段が、0.1〜100μm単位での移動動作を可能とする駆動部を有する第1〜第3のアクチュエーターがそれぞれの動作軸が3次元方向で異なる角度となるように配設されてなる構造、を含むものであり、;
顕微鏡試料ステージ支持手段に第1のアクチュエーターの支持体部が固定保持され、前記第1のアクチュエーターの駆動部に第2のアクチュエーターの支持体部が固定保持され、前記第2のアクチュエーターの駆動部に第3のアクチュエーターの支持体部が固定保持され、前記第3のアクチュエーターの駆動部に顕微鏡試料ステージのステージ面が固定されるものである、;
項1〜3のいずれかに記載の細胞搬送システム。
[項5]
更に顕微鏡装置を含んでなる、項1〜4のいずれかに記載の細胞搬送システム。
[項6]
項5に記載の細胞搬送システムを用いることを特徴とする、対象細胞を1細胞単位にて搬送先容器に搬送する方法。
これにより本発明では、細胞搬送操作においてオートフォーカス制御による焦点補正が正常に動作しない1細胞解析を想定した作業(即ち、細胞搬送元容器と搬送先容器の底面構造が異なり、且つ、搬送先容器の溶液が高コントラスト化している状況下)であっても、1細胞単位での効率的な細胞搬送を実行可能とする技術を提供することが可能となる。
更に本発明においては、例えば、従来一般的な顕微鏡装置への配設使用が可能である汎用性の高い細胞搬送システムの提供が可能となる。
本明細書中、3次元空間の軸方向を表す用語としてX軸、Y軸、及びZ軸方向という表現を使用する。ここで「X軸」とは、本発明に係る細胞搬送システムの正面視方向にて左右方向での水平軸を指す用語として使用する。また「Y軸」とは、同正面視方向にて手前奥方向での水平軸を指す用語として使用する。また「Z軸」とは、同正面視方向にて上下方向での垂直軸を指す用語として使用する。
本明細書中、細胞搬送システムの「正面視」とは、一般的な顕微鏡装置に配設した状態において顕微鏡の接眼レンズが備えられた方向からの視点を指す。
本発明は、対象細胞を1細胞単位で所望の搬送先容器に搬送することを可能とする細胞搬送システムに関する。
詳しくは、本発明は、対象細胞を1細胞単位で所望の搬送先容器に搬送することを可能とする細胞搬送システムであって、;
(A)試料ステージ面に試料容器保持手段を備え且つX軸、Y軸、及びZ軸方向への自動移動が可能な駆動手段を備えた顕微鏡試料ステージ、
(B)前記試料ステージ面に関する3次元座標が記憶可能であり、前記記憶された相対的位置情報に基づいて任意の設定された3次元座標へ前記試料ステージ面を自動移動させる制御手段、並びに、
(C)前記試料ステージ面の上方に配設される微細キャピラリー管であって、細胞吸引及び細胞吐出を行う先端微細構造が90〜150°の範囲にある屈曲又は湾曲した形状を含んでなる微細キャピラリー管、を備えてなる、;
ことを特徴とする、顕微鏡装置に配設して使用する細胞搬送システムに関する。
なお、本発明に係る細胞搬送システムに関する技術的範囲としては、当該必須となる特徴以外の特徴については、下記に記載した特徴の全て含む態様に限定されるものではない。
本発明に係る細胞搬送システム(1)は、その構成物品として顕微鏡試料ステージ(2)を備えてなるものである。本発明に係る顕微鏡試料ステージ(2)としては、X軸、Y軸、及びZ軸方向への自動移動が可能な駆動手段(21)を備えてなることを特徴とするものである。即ち、本発明に係る顕微鏡試料ステージ(2)においては、当該駆動手段を備えることによって試料ステージ面(20)の3次元座標空間における任意設定座標への自動的な自在移動が実現される。
本発明に係る顕微鏡試料ステージ(2)としては、試料用容器を配置するステージ面(20)に試料容器保持手段(201)を備えた顕微鏡用の試料ステージ面を採用することができる。ここで、試料容器保持手段(201)としては、対象細胞を格納又は載置するための容器等を配置可能な手段であれば、光学顕微鏡用の試料ステージ面に採用可能な如何なる構造を用いることが可能であるが、細胞の搬送元容器及び搬送先容器に相当する2以上の試料容器を保持可能な構造であることが望ましい。
当該手段を実現するための具体的な構造としては、例えば、試料ステージ面の上面側に配設された2以上の部材による挟持手段を備えた半枠型構造物、弾性体等の押力によって容器等を固定可能な構造物、試料容器と嵌合可能な枠型を穿った構造物、等を例示することができるが、特にこれらに限定されるものではない。
ここで、通常の正立顕微鏡や倒立顕微鏡に適合可能な試料ステージの態様としては、透過照明を用いる場合での対物レンズと光源に挟まれる位置に試料ステージ面(20)が配設されることになるため、試料容器における試料を格納又は載置する部位に対応するステージ部分については、対物レンズ側と光源側との光路を確保するための光路透過構造を備えたものであることが好ましい。このような光路確保を担保するための構造としては、例えば、開口構造、窓構造、透光性部材にて形成された構造、等を採用することが可能である。当該光路確保部分を成形する部材として透光性部材を採用する場合には、光透過性に優れ且つ容器設置に耐える強度を備えたガラス、透明樹脂等を挙げることができる。
また、本発明に関する顕微鏡試料ステージの一態様においては、正立顕微鏡において落射照明を用いる顕微鏡装置の場合においては、当該試料ステージ面(20)において上記開口構造を備えた態様とすることは必須ではない。当該態様においては、試料容器を配設する部分が容器底面の設置に適した平面状の試料ステージを採用することが可能である。
本発明に係る顕微鏡試料ステージ(2)としては、X軸、Y軸、及びZ軸方向への自動移動が可能な駆動手段(21)を備えてなるものである。
本発明に係る顕微鏡試料ステージに備えられた駆動手段(21)としては、微小単位での移動動作を可能とする駆動部を有する第1〜第3のアクチュエーターがそれぞれの動作軸が3次元方向で異なる角度となるように配設されてなる構造、を含むものである。当該駆動手段を備えることによって試料ステージ面(20)の3次元座標空間における任意設定座標への自動移動が実現される。
本発明に係る顕微鏡試料ステージ(2)における一態様としては、;X軸方向の自在移動を可能とするアクチュエーター、Y軸方向の自在移動を可能とするアクチュエーター、並びにZ軸方向の自在移動を可能とするアクチュエーター、を備えてなり、;これらを連動して制御して3次元方向での自在な自動移動を可能とする駆動手段とすることができる。
また、別態様としては、;XY面における1方向の自在移動を可能とするアクチュエーター、XY面における前記1方向とは異なる角度方向での自在移動を可能とするアクチュエーター、並びにZX面若しくはZY面における1方向の自在移動を可能とするアクチュエーター、を備えてなり、;これらを連動して制御して3次元方向での自在な自動移動を可能とする駆動手段とすることもできる。
ここで、動力部及び駆動部としては、下記した粗移動及び微移動の実現を可能とする仕様のものであれば、特に制限なく使用することが可能である。
本発明に係るアクチュエーターの動力部(222、232、242)としては、制御手段による自動動作を実現するために、電気駆動によるモーターを利用したものが好適である。本発明に係るアクチュエーターの動力部及び駆動部としては、AC(交流電源)又はDC(直流電源)を利用したサーボモーターもしくはステッピングモーターを用いることが好適である。
ここで、第1〜第3のアクチュエーターの動作軸としては、それぞれの動作軸が3次元方向で異なる角度となるように組み合わせることによって、顕微鏡試料ステージ面(20)の3次元空間移動が実現可能となる。例えば、お互いの動作軸を30°〜150°、好ましくは45°〜135°程度に異なる角度となるように配設して組み合わせることによって、当該移動が実現可能となる。
本発明に係るシステムにおける好適態様としては、装置設計及び移動効率の観点から、3つの動作軸をそれぞれ直行させ、X軸移動用アクチュエーター、Y軸移動用アクチュエーター、Z軸移動用アクチュエーター、として組み合わせた態様とすることが好適である。
ここで、第1〜第3のアクチュエーターの組み合わせの順番としては、通常の顕微鏡システムへの適用を想定した場合であれば、試料ステージ支持手段、X軸移動用アクチュエーター、Y軸移動用アクチュエーター、Z軸移動用アクチュエーター、及び試料ステージ面、の順に組み合わせを採用することができるが(図1及び5参照)、各アクチュエーターの順番を入れ替えて組み合わせの態様を採用することも可能である。例えば、試料ステージ支持手段、Y軸移動用アクチュエーター、X軸移動用アクチュエーター、Z軸移動用アクチュエーター、及び試料ステージ面、の順に組み合わせたアクチュエーター複合構造体を構成することも可能である。また、装置態様によっては、試料ステージ支持手段、Z軸移動用アクチュエーター、X軸移動用アクチュエーター(又はY軸移動用アクチュエーター)、Y軸移動用アクチュエーター(又はX軸移動用アクチュエーター)、及び試料ステージ面、の順に組み合わせたアクチュエーター複合構造体を構成することも可能である。
また、顕微鏡試料ステージ支持手段(25)、第1〜第3のアクチュエーター(22、23、24)、試料ステージのステージ面(20)の間での固定態様にとしては、各部材どうしを直接固定する態様だけでなく、支持部材や保持部材等を介した間接的な固定態様も含まれる。
顕微鏡試料ステージ支持手段(25)の一態様としては、例えば、2以上の架台(251)を備えた自立型の態様であって、当該架台間を支持部材(252)で架橋された構造体を挙げることができる。当該態様においては、顕微鏡装置(6)に配設しての使用時において、顕微鏡装置の上面視及び正面視の両方の視点にて対物レンズ部分(62)を挟む位置に設置された状態になるように架台を配設した構造体とすることが好適である。架台としては、架台間を架橋する支持部材の高さを調節可能とするように、架台の支持柱に高さ調節手段を設けた態様とすることも可能である。
本発明に係る粗移動としては、装置態様の設計によって決定することが可能であるが、一態様としては次の移動幅を挙げることができる。例えば、X軸方向の駆動を行うアクチュエーター(22)としては、基準点に対して100cm以下の範囲にある移動幅、好ましくは基準点に対して50cm以下の範囲にある移動幅、より好ましくは30cm以下の範囲にある移動幅を挙げることができる。
また、Y軸方向への駆動を行うアクチュエーター(23)としては、基準点に対して100cm以下の範囲にある移動幅、好ましくは基準点に対して50cm以下の範囲にある移動幅、より好ましくは30cm以下の範囲にある移動幅を挙げることができる。
また、Z軸方向への駆動を行うアクチュエーター(24)としては、例えば基準点に対して30cm以下の範囲にある移動幅、好ましくは基準点に対して15cm以下の範囲にある移動幅を挙げることができる。
当該粗移動における移動速度としては、試料の液等が飛散せず且つ作業遅延にならない速度の範囲であれば特に制限はないが、例えばX軸方向及びY軸方向での移動では0.1〜20cm/秒程度の移動速度であることが好適である。また、Z軸方向での移動では0.01〜5cm/秒程度の移動速度であることが好適である。
ここで、「微移動」としては、μm単位での微細な距離の移動を指すものであり、具体的には0.1〜100μm単位での微小距離の移動を実現可能とするものでる。当該微小距離の移動動作は、微小単位での移動動作を可能とする駆動部を有する第1〜3のアクチュエーターによって実現される。
好ましくは50μm単位以下、より好ましくは20μm単位以下、更に好ましくは10μm以下での微細な距離の移動であることが好適である。当該値の下限としては、技術的及びコスト的な制限を克服可能であれば特に制限はないが、例えば0.2μm以上、好ましくは0.5μm以上、より好ましくは1μm以上であることが好適である。
なお、本発明においては、当該微移動の単位が小さいものほど微細ウェルやマイクロチップ等にも対応可能なハイエンドの装置態様が実現される。また、本発明においては、微移動の単位が比較的大きいものであっても廉価な仕様での装置態様が可能であり、製品用途に応じた実施態様を採用することが可能となる。
本発明に係る試料ステージ(2)としては、試料容器を配設する側の方向が上方垂直方向を向くように顕微鏡試料ステージ面(20)を水平に設計することが好適であるが、用途に応じては、試料ステージ面がZ軸方向に対して角度を有する面を形成するような態様を採用することも可能である。また、試料ステージ面(20)の角度を調整可能とする手段を設ける態様とすることも可能である。
本発明に係る細胞搬送システム(1)は、前記顕微鏡試料ステージ面(20)に関する3次元座標が記憶可能であり、前記記憶された相対的位置情報に基づいて任意の設定された3次元座標へ前記顕微鏡試料ステージ面(20)を自動移動させる制御手段を備えたものである。
本発明に係る制御手段(3)において位置座標を記憶させる態様としては、所定の座標を直接記憶させる態様により行うことが可能である。また、顕微鏡試料ステージ面(20)を3次元座標内の任意地点に移動させて、当該地点の座標を表示させ入力記憶する及び/又は自動記憶させる態様、等を採用することも可能である。
ここで、顕微鏡試料ステージ面(20)の任意位置への移動操作は、一態様としては、下記の制御手段にマニュアル操作モードを設けておき、ボタン操作等での電動駆動にて任意位置に微調整をして移動させることが可能である。また、別途の動力部(例えばツマミやハンドルの人力回動運動)を利用した駆動による位置調整手段を設ける態様を採用することも可能である。このような補助的な動力部としては、顕微鏡試料ステージ(2)の横方向や下方等に、上記アクチュエーターの駆動部(223、233、243)と連動したツマミやハンドル等の操作部材を配設し、当該操作部材を介した手動での回動動作等を、上記駆動手段における軸に沿った移動運動に変換可能とする装置態様とすることが可能である。
当該自動移動に関する動作としては、一態様としては、制御手段(3)により基準点及び/又は現在位置からの相対的な移動量を算出し、前記顕微鏡ステージの駆動手段(21)を構成する3軸方向に対応する各アクチュエーターのそれぞれの駆動量を正確に制御することにより、所定位置への顕微鏡試料ステージ面(20)の移動が達成される。
本発明に係る制御手段においては、上記記憶させた位置記憶情報に基づいて任意の位置座標に顕微鏡試料ステージ面(20)を順次自動移動させる細胞搬送システムが実現される。
そのため、本発明に係るシステムを用いて細胞の搬送元容器(51)から搬送先容器(53)に細胞を移動させる態様としては、微細キャピラリー管と容器壁との接触のない位置まで試料ステージのZ軸方向下方移動を行った後、XY平面方向での移動制御を行い、次いでZ軸方向での上方移動を行う軌跡となるように動作制御を行うことが好適である(図9参照)。
本発明に係る細胞搬送システム(1)における制御及び駆動動作は、微細キャピラリー管との位置関係を考慮し且つピント合わせをも可能とする一連の動作であるため、他の部材等の制御を要することなく顕微鏡試料ステージ単体のみの自立制御によって実行可能な動作である。そのため、対物レンズ等の制御及び微移動等の連動動作が不要であり、試料ステージに関する制御手段と駆動手段の構成により細胞搬送システムの構築が可能となる。
本発明に係る細胞搬送システム(1)は、顕微鏡試料ステージ面(20)上方に配設される微細キャピラリー管(4)を備えてなるものである。
ここで、本発明に係るシステムとしては、製品販売等の態様において微細キャピラリー管が上方配設「された」状態のものに制限されるものではなく、顕微鏡試料ステージ(2)と組み合わされて使用される微細キャピラリー管(4)を構成物品として備えてなる梱包状態等の製品形態が含まれるものである。
また、当該微細キャピラリー管(4)は、顕微鏡試料ステージ(2)とは別梱包や別発送の製品形態としている場合であっても、実質的に本発明に係る細胞搬送システム(1)の構成物品と一連不可分の製品形態と認められる場合には、本発明に係る細胞搬送システムの範囲に含まれる。
本発明に係る微細キャピラリー管(4)としては、管先付近を構成する構造として1細胞単位での細胞吸引及び細胞吐出に適した先端微細構造(41)を備えた構造が採用される。ここで、微細キャピラリー管の管先の先端微細構造(41)としては、細胞吸引及び細胞吐出を行う先端微細構造が一定角度の範囲にある屈曲又は湾曲した形状(43)(本明細書中、第1の屈曲又は湾曲形状と表現する場合がある。)を含んでなる微細構造を備えてなることが好適である。ここで、先端微細構造における屈曲又は湾曲形状(43)とは、具体的には、急激な角度変更、緩やかなカーブによる角度変更、浅い角度変更の連続的な繰り返しによる角度変更、等を伴った形状を挙げることができる。
ここで、当該先端微細構造(41)に含まれる屈曲形状等(43)の角度が鈍角すぎる場合には、管内の細胞状態への視野内に捉えることが難しくなり、一方、鋭角過ぎる場合には細胞の吸引吐出動作が阻害されやすくなるため、当該角度は上記範囲内に含まれるように適切に設定することが好適である。
当該管先の管壁厚としては、管先の強度を担保しえる壁厚であれば特に制限はないが、1〜100μm、好ましくは3〜50μmの範囲を挙げることができる。
また、先端微細構造(41)を構成する管形状としては、横断面が円状又は略円状である円管状又は略円管状であることが好適である。
本発明に係る微細キャピラリー管における管先微細構造より菅元側の構造(44)としては、上記先端微細構造(41)とは異なり、管全体の強度保特に適するようにある程度の管径を備えたものを採用することが可能である。本発明に係る微細キャピラリー管の一態様としては、例えば、屈曲又は湾曲形状より菅元側の管(44)の外径が、0.5mm以上、好ましくは0.6mm以上、より好ましくは0.7mm以上のものを採用することができる。また、上限としては、微量操作に適したサイズであり且つ試料容器の微細ウェル等への対応を考慮すると、3mm以下、好ましくは2mm以下、より好ましくは1.5mm以下を挙げることが好適である。
菅元側のキャピラリー管構造(44)としては、内容物視認性や操作性等に大きな影響が無い限りにおいては緩やかなカーブ等を有する構造を採用ことも可能であるが、但し、微細ウェル等の底面へのアクセスを考慮すると、好ましくは上記第1の屈曲又は湾曲形状より菅元側の少なくとも10mm以内の範囲、好ましくは少なくとも15mm以内の範囲では、直管状又は略直管状の形状であることが好適である。更に好ましくは当該部分が直管形状であることが好適である。
当該管先微細構造より菅元側のキャピラリー管(44)を構成する材質としては、キャピラリー管としての機能を果たし得る材質であれば、ガラス製、樹脂製、金属製等、特に制限はないが、好ましくは光透過性を備えたガラス素材又は透明性樹脂で成形されてなるものであることが好適である。当該素材としては、強度、耐久性、及びコスト等を踏まえると、透明性を備えたガラス素材を採用することが好適である。
微細キャピラリー管支持手段(48)の構造としては、微細キャピラリー管の管先の位置固定を実現可能とする支持部材であれば特に制限無く如何なる構造のものも採用することが可能である。例えば、当該支持手段としては、それ自体の独自の架台を備えた自立型の支持部材を採用することが可能である。また、当該支持部材としては、他の装置部材等(例えば、顕微鏡装置本体、上記顕微鏡試料ステージ支持手段、等)への接続によって、微細キャピラリー管の位置固定を可能とする部材を採用することも可能である。
本発明に係る細胞搬送システム(1)としては、上記に記載した顕微鏡試料ステージ(2)、制御手段(3)、微細キャピラリー管(4)、等以外の構成物品を含んでなるシステムが除外されるものではない。例えば、試料容器、各支持手段、微少液量ポンプ、入力手段、表示手段、等を含んでなるシステム態様も、本発明に係るシステムには含まれる。また、顕微鏡装置本体(6)に既に配設されて使用可能な状態のものについても、本発明に係る細胞搬送システムに含まれる。
本発明に係る細胞搬送システム(1)においては、上記段落1.に記載のシステム構成部材を顕微鏡装置(6)に配設使用することによって、1細胞単位での細胞搬送用途での使用が可能な高機能細胞搬送システムとして使用することが可能となる。
本発明に係る細胞搬送システム(1)では、上記段落に記載した構成の作用により、1細胞搬送技術において必要となる試料容器(5)の底面へのピント合わせ動作を、顕微鏡試料ステージ面(20)(1物品)の自動的な移動動作「のみ」によって実現することが可能となる。これにより、本発明に係るシステムでは、オートフォーカス制御での焦点補正が正常に作動しない高コントラスト化した溶液に対しても自動的なピント合わせ動作の実行が可能となり、搬送元容器と搬送先容器のそれぞれの底面の相違に対応するピントが合う位置を次々に行き来させながら、細胞吸引と細胞吐出を連続して効率良く実行することが可能となる。
ここで、顕微鏡視野内の高コントラスト化に起因したオートフォーカス阻害現象は、大量の遺伝子解析等を伴う1細胞分析のように、搬送先容器に充填した極微量溶液への搬送時に頻発する現象である。そのため、オートフォーカス制御に依存したピント合わせを必要としない本発明に係る細胞搬送システム(1)は、当該用途における効率の良い作業性を提供する技術となり得る。
なお、本発明に係るシステムの技術的特徴を鑑みると、使用可能な搬送先容器(53)はこれらのみに制限されることを意味するものではない。本発明に係るシステム(1)においては、口径の大きい試料容器の使用が可能であることに加えて、従来の顕微鏡技術等では適用が困難であった微細ウェル等への細胞吐出を伴う効率的な細胞搬送が可能となる。
詳しくは、本発明に係る細胞搬送システム(1)では、微細キャピラリー管の先端微細構造(41)の独特な形状によって、微小ウェル等を微細キャピラリー管に垂直に又はほぼ垂直にアクセスさせた場合であっても、微細構造である管先部分が水平に又は適度な傾斜角度となるように試料容器(5)の底面にアクセスさせることが可能となる。これにより本発明に係るシステム(1)では、対物レンズ又は光源の配設が垂直方向にある場合であっても、光路が微細キャピラリー管の菅元側(44)に遮られないため、微細キャピラリー管の先端(42)管内の細胞の状態を視認することが可能となる。即ち、当該管先微細構造における管内への細胞吸引、及び、管内からの細胞吐出の状態の視認確認を行うことが可能となる。
ここで、微細キャピラリー管の管先(42)が試料容器(5)の底面に「アクセスした」とは、容器底面の上面に接触した状態だけでなく、管先が底面にある細胞を吸引可能な程度に近接した状態も含まれる。具体的な距離の数値として表現すると、例えば2mm以内、好ましくは1mm以内、より好ましくは0.5mm以内の範囲にて近接した状態が含まれる。
ここで、本発明に係る当該アクセス動作においては、対物レンズ(62)からのピント焦点が存在する位置(54)と微細キャピラリー管の管先(42)の位置を固定した状態にして、顕微鏡試料ステージ面(20)の自動的な移動動作「のみ」によって実行可能となる。当該動作においては、微細キャピラリー管の管先(42)を固定状態のままにして、試料容器(5)の上面開口部から底面方向への管先(42)のアクセス動作が実行される。
本発明に係る当該アクセス動作においては、試料ステージ面(20)の移動動作の後に細胞吸引又は吐出を行うために微細キャピラリー管の先端(42)位置を微調整する操作を行うことも可能であるが、基本動作として管先側を積極的に移動させることは必須ではない。
ここで、本発明におけるアクセス動作においては、微少ウェルを備えたマイクロプレート等を用いた場合に、微細キャピラリー管の微細構造より菅元側構造部分を容器壁面に対して垂直に(又は、大きくても20°以内、好ましく10°以内)にしてアクセス動作を行う必要が生じるところ、本発明に係る微細キャピラリー管の先端微細構造(41)の特徴により、管先を水平に又は適度な傾斜角度となるようにして容器底面にアクセスさせることが可能となる。
本発明に係る細胞搬送システム(1)では、顕微鏡試料ステージ面(20)単体のみの自立制御によって、ピント合わせ動作を兼ね備えた微細キャピラリー管の管先(42)への自動アクセス動作が実行可能となる。そのため、本発明に係る細胞搬送システム(1)では、微細キャピラリー管(4)や対物レンズ(62)等の他部材の制御や連動動作等を伴うことなく、顕微鏡と一体化した装置構成となることを要しない細胞搬送システムの構築が可能となる。
本発明に係る細胞搬送システム(1)の顕微鏡装置(6)への配設態様としては、一態様としては、本発明に係る顕微鏡試料ステージ(2)を顕微鏡装置本体が元々備えている試料ステージ(61)の上方に又は当該試料ステージ(61)と代替して配設する態様が挙げることができる。
また、本発明に係る微細キャピラリー管支持手段(48)の配設態様としては、顕微鏡装置(6)本体に又は本実施例に係る顕微鏡試料ステージ(2)を構成する部材の不動部分に固定して、微細キャピラリー管(4)を試料ステージ面(20)の上方に配設して用いる態様を挙げることができる。
本発明に係る細胞搬送システム(1)は、例えば実施例3のような1細胞解析を想定した作業(即ち、細胞搬送元容器と搬送先容器の底面構造が異なり、且つ、搬送先容器の溶液が高コントラスト化している状況下)で使用した場合、細胞吸引から細胞吐出までに要する操作工程が次の4操作工程のみで実行可能となる。
即ち、i)顕微鏡試料ステージ面の自動移動及び自動ピント合わせ操作(Z軸方向への下方移動、XY方向への移動、Z軸方向への上方移動)、ii)搬送元容器での細胞吸引操作、iii)顕微鏡試料ステージ面の自動移動及び自動ピント合わせ操作(Z軸方向への下方移動、XY方向への移動、Z軸方向への上方移動)、iv)搬送先容器での細胞吐出操作、の「4つ」の操作工程のみで、簡便な操作のみで細胞搬送の実行が可能となる(図9参照)。
当該態様においては、搬送元容器と搬送先容器で底面形状が異なる場合を想定しているが、顕微鏡ステージ面の移動時にピント合わせ動作が同時的に行われるため、容器底を管先に移動させる動作とピント合わせ動作が「1動作のみ」によって達成可能となる。また、搬送先容器中の溶液としては、高コントラスト化してオートフォーカス制御が機能しない状況を想定しているが、本発明に係るシステムではオートフォーカス制御とは全く異なる原理により自動ピント合わせ動作を実行可能となる。
ここで、当該比較態様においては、オートフォーカスが機能しないことを補うために、「手動」によるピント合わせ操作が必要となる。更に、当該比較態様では、微細キャピラリー管と容器壁との接触を回避するため、微細キャピラリー管の上方及び下方への移動操作が必ず必要となる。
本発明においては、上記細胞搬送システム(1)を用いることを特徴とする対象細胞を1細胞単位で所望の搬送先容器に搬送する方法に関する発明が含まれる。当該方法を構成する工程としては、上記段落に記載の操作手順等が参照される。
本発明に係る細胞搬送システムの一態様として、以下に示す構成物品を備えてなる細胞搬送システムを製造した。
本実施例に係る細胞搬送システム(1)を構成するX軸、Y軸、及びZ軸方向への自動移動を可能とする顕微鏡試料ステージ(2)を製作した。本実施例に係る顕微鏡試料ステージ(2)の構造を図1〜3及び5に示す。
本実施例における顕微鏡試料ステージ(2)は、試料ステージ面(20)、X軸移動用アクチュエーター(22)、Y軸移動用アクチュエーター(23)、及びZ軸移動用アクチュエーター(24)から主として構成されてなる。
試料ステージ面(20)の上面は試料容器保持手段(201)を備えてなり、試料容器(5)を設置する中央付近に開口構造を備えてなる。
各アクチュエーターは、支持体部(221、231、241)、前記支持体部の内部に埋設された動力部(222、232、242)、及び前記動力部からの力により軸に沿った移動動作を行う駆動部(223、233、243)等を主要部材として構成される構造体である。各アクチュエーターは、各軸方向の自在移動を可能とする電動駆動手段を備えたアクチュエーター部材である。本実施例に係るアクチュエーターの動力部及び駆動部としては、DC(直流電源)駆動を利用したサーボモーター(RCP6ロボシリンダ、IAI社製)を用いた。
顕微鏡試料ステージ支持手段の架橋された支持体(252)には、X軸移動用アクチュエーターの支持体部(221)が固定保持され、:前記X軸移動用アクチュエーターの駆動部(223)にはY軸移動用アクチュエーターの支持体部(231)が固定保持され、;前記Y軸移動用アクチュエーターの駆動部(233)にはZ軸移動用アクチュエーターの支持体部(241)が固定保持され、;前記Z軸移動用アクチュエーターの駆動部(243)には、顕微鏡試料ステージのステージ面(20)が固定されてなる。
本実施例に係る細胞搬送システム(1)の構成物品である微細キャピラリー管(4)を製作した。本実施例に係る微細キャピラリー管の外観を図4に示す。
微細キャピラリー管(4)は、先端から1.25mmの位置の先端微細構造部分(41)に100°の第1の屈曲形状(43)を備えてなり、先端部分(42)は内径φ0.05mmの直円管形状である。第1の屈曲形状より菅元側(44)は、先端微細構造(41)より太い外径φ1mmの直円管形状で構成されてなり、第1の屈曲形状より菅元側22mmの位置に、第1の屈曲形状の屈曲方向とは反対の方向に105°屈曲した第2の屈曲形状(45)を備えてなる。
微細キャピラリー管(4)は、先端微細構造及び菅元側構造を含む全体がボロシリケイトガラスにて一体成型されてなる。
本実施例では、上記細胞搬送システムの構成物品を市販の顕微鏡装置(6)である倒立式光学顕微鏡製品(CKX41、オリンパス社製)に配設したシステムを構築した。本実施例においては、上記製作した顕微鏡試料ステージ(2)は、顕微鏡装置(6)本体が元々備えているステージ面(61)の上方であり且つ照明手段(63)の下方の位置に配設して用いる態様を示す。また、本実施例においては、微細キャピラリー管支持手段(48)は、顕微鏡装置(6)本体が元々備えている試料ステージ(61)の側面に接続固定し、当該管先(42)が本実施例に係る顕微鏡試料ステージ面(20)の上方に配設して用いる態様を示す。
本実施例にて製造した細胞搬送システム(1)の仕様を以下に示す。
X軸方向移動範囲: 20cm
Y軸方向移動範囲: 10cm
Z軸方向移動範囲: 5cm
ステージ移動速度: 5cm/秒
最小微移動単位: 5μm
[微少液量ポンプ]
種類: 油充填式無振動ポンプ
設定流量: 300〜900pL
[微細キャピラリー管]
先端微細構造: 先端1.25mmでの100°屈曲形状
管径: 先端内径φ0.05mm、菅元外径φ1mm
材質: 透明ボロシリケート製
実施例1で製造した細胞搬送システム(本発明品1)を用いて1細胞解析を想定した操作を行う場合において、従来技術と比較した自動ピント合わせ動作の性能評価を行った。
また、1μLの蒸留水を搬送先容器(53)であるポリプロピレン製の8連PCRキャップの底面に分注し、上記とは別の試料容器保持手段(201)に配置した。ここで、PCRキャップ底面の微量溶液は、表面張力により液面がドロップ状化していることを確認した。
次いで、スライドグラスの上側表面(容器底面)の3次元座標、及び、8連PCRキャップのうちの1つの底面の3次元座標を設定し、ピント焦点位置が対物レンズ4倍でワーキングディスタンス10mmになるよう設定した。次いで、スライドグラス上表面にピントが合った状態であることを確認して微細粒子の1つを微細キャピラリー管内に吸引し、8連PCRキャップの1つ容器の底面上面を微細キャピラリー管の管先位置に自動移動させ、手動での焦点合わせ等を行わない状態で顕微鏡像の状態を確認した。
一方、比較試験として、オートフォーカス制御による焦点補正機能を備えた従来の顕微鏡装置を用いて、上記8連PCRキャップ底の微量溶液に対する自動ピント合わせ操作を実行したところ、高コントラス化現象の発生により自動焦点補正が正常に機能せず、鮮明な顕微鏡像を得ることができなかった。
このことから、本発明に係る細胞搬送システムにおいては、1細胞解析を想定した作業(即ち、細胞搬送元容器と搬送先容器の底面構造が異なり、且つ、搬送先容器の溶液が高コントラスト化している状況下)であっても、顕微鏡試料ステージの移動動作を1動作行うのみによって、ピント合わせ動作を同時的に実行可能であることが示された。
実施例1で製造した細胞搬送システム(本発明品1)を用いて1細胞解析を想定した細胞搬送操作を行った場合において、従来技術と比較した細胞搬送操作の効率評価を行った。
次いで、スライドグラスの上側表面(容器底面)の3次元座標、及び、8連PCRキャップのそれぞれの底面の3次元座標を設定し、ピント焦点位置が対物レンズ4倍でワーキングディスタンス10mmになるよう設定した。スライドグラスから8連PCRキャップのそれぞれのホールに微細粒子を1つずつ搬送する操作を行った。
具体的には、本発明に係る細胞搬送システム(本発明品1)では、対物レンズからのピント焦点が存在する位置(54)と微細キャピラリー管の管先(42)位置を固定した状態のまま、細胞搬送動作が可能となることが示された。当該動作の特徴により本発明品1では、細胞吸引から細胞吐出までの1回の動作に要する操作工程は、表2に示した4つの操作工程のみで実行可能であることが示された(図9参照)。また、これらの操作工程は簡便なボタン操作のみで実行可能であった。
最終的に、比較品1を用いて細胞吸引から細胞吐出までの1回の動作を行うためには、表2に示した9つの操作工程が必要であり、8連PCRキャップのそれぞれへの繰り返し操作を行う場合の労力は大きかった。
これにより本発明に係る細胞搬送システム(1)では、細胞搬送操作の繰り返し工程が多く必要な多検体解析であるほど、作業効率の点での利点を発揮し得る構成的特徴を備えたシステムであることが示された。
2.顕微鏡試料ステージ(3次元空間移動試料ステージ)
201.試料容器保持手段
221.支持体部
222.動力部
223.駆動部
225.ケーブル
231.支持体部
232.動力部
233.駆動部
235.ケーブル
241.支持体部
242.動力部
243.駆動部
244.ケーブル
251.架台
252.支持部材
31.入力手段(タッチパネルコントローラー)
32.モニター(顕微鏡像出力手段)
41.先端微細構造
42.管先
43.第1の屈曲又は湾曲形状
44.菅元側管構造
45.第2の屈曲又は湾曲形状
46.微少液量ポンプ
47.溶液供給管
48.微細キャピラリー管支持手段
49.微細キャピラリー管操作手段
51.搬送元容器
52.試料
53.搬送先容器
54.ピント焦点が存在する位置
61.元々の顕微鏡試料ステージ
62.対物レンズ
63.照明手段
64.接眼レンズ
本発明は、特には1細胞解析の効率を大幅に向上させる基盤技術として有効に利用され、がん研究、幹細胞研究、iPS細胞研究、バイオ医薬品研究、微生物物質生産等の研究進展にも貢献することが期待される。
Claims (3)
- 試料ステージ面に試料容器である搬送元容器及び搬送先容器を保持した細胞搬送システムを用いて、当該細胞搬送システムが備える微細キャピラリー管の先端微細構造の管先にて当該試料ステージ面の搬送元容器から搬送先容器内の溶液に、対象細胞を1細胞単位にて搬送する方法であって、;
前記細胞搬送システムが、対象細胞を1細胞単位で所望の搬送先容器に搬送することを可能とする細胞搬送システムであって、(構成物品A)試料ステージ面に試料容器保持手段を備え且つX軸、Y軸、及びZ軸方向への自動移動が可能な駆動手段を備えた顕微鏡試料ステージ、(構成物品B)前記試料ステージ面に関する3次元座標が記憶可能であり、前記記憶された相対的位置情報に基づいて任意の設定された3次元座標へ前記試料ステージ面を自動移動させる制御手段、(構成物品C)前記試料ステージ面の上方に配設される微細キャピラリー管であって、細胞吸引及び細胞吐出を行う先端微細構造が100〜120°の範囲にある屈曲又は湾曲した形状を含んでなる微細キャピラリー管、並びに、(構成物品D)光学顕微鏡装置、を備えてなる、細胞搬送システムであり、;
(搬送先容器内の溶液)前記搬送先容器内の溶液が極微量で表面張力によって液面がドロップ状化して顕微鏡像が高コントラスト化した溶液であり、;
(工程A)光学顕微装置の対物レンズからのピント焦点が存在する位置を搬送元容器の底面に合う位置とし、微細キャピラリー管の先端微細構造の管先を前記ピント焦点が合った状態で管内に細胞吸引できる位置とし、前記ピント焦点の位置及び微細キャピラリー管の先端微細構造の管先の位置を固定した状態にし、
(工程B)当該試料ステージ面に保持された前記搬送先容器の底面を、予め記憶された相対的位置情報に基づいて設定された3次元座標へ当該試料ステージ面をZ軸方向への下方移動、XY平面方向での移動、及びZ軸方向への上方移動の順に自動移動させることによって移動させ、当該移動によって当該対物レンズからのピント焦点が存在する位置及び先端微細構造の管先を固定した状態のままで当該搬送先容器内の微量溶液に対するピント合わせ動作を行う、;
工程を含む、前記対象細胞を1細胞単位にて搬送する方法。 - 前記微細キャピラリー管の先端微細構造が、内径5〜500μmの管構造であって、管先から5mm以下の範囲内に屈曲又は湾曲した形状部分を含んでなる先端微細構造である、請求項1に記載の対象細胞を1細胞単位にて搬送する方法。
- 前記顕微鏡試料ステージに備えられた駆動手段が、0.1〜100μm単位での移動動作を可能とする駆動部を有する第1〜第3のアクチュエーターがそれぞれの動作軸が3次元方向で異なる角度となるように配設されてなる構造、を含むものであり、;
顕微鏡試料ステージ支持手段に第1のアクチュエーターの支持体部が固定保持され、前記第1のアクチュエーターの駆動部に第2のアクチュエーターの支持体部が固定保持され、前記第2のアクチュエーターの駆動部に第3のアクチュエーターの支持体部が固定保持され、前記第3のアクチュエーターの駆動部に顕微鏡試料ステージのステージ面が固定されるものである、;
請求項1又は2に記載の対象細胞を1細胞単位にて搬送する方法。
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