WO2023100750A1 - 試料調製システム、試料調製方法、及び試料解析システム - Google Patents

試料調製システム、試料調製方法、及び試料解析システム Download PDF

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WO2023100750A1
WO2023100750A1 PCT/JP2022/043479 JP2022043479W WO2023100750A1 WO 2023100750 A1 WO2023100750 A1 WO 2023100750A1 JP 2022043479 W JP2022043479 W JP 2022043479W WO 2023100750 A1 WO2023100750 A1 WO 2023100750A1
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WO
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cell
cell group
cells
sample preparation
sample
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/043479
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English (en)
French (fr)
Inventor
克之 城口
望 北條
Original Assignee
国立研究開発法人理化学研究所
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q

Definitions

  • the present invention relates to a sample preparation system, a sample preparation method, and a sample analysis system.
  • the target single cell is picked from the cell group and subjected to analysis.
  • a cell delivery system described in Patent Document 1 is known as a technique for collecting a single target cell from a cell group.
  • a single cell is collected from a cell group while observing the inside of a petri dish with a microscope, and is discharged into a PCR tube.
  • the present invention was made to solve the above-mentioned problems, and the purpose is to realize a technique for preparing a sample containing cells for cell analysis while tracking the position of individual cells that form a cell group. intended to
  • a sample preparation system in a cell group in which a plurality of cells adhere to each other, at least a part of the adhesion between adjacent cells is separated and dispersed, in the process of dispersion, the individual cells forming the cell group and individual cells forming a cell group in which at least a part of the adhesion between the adjacent cells has been cut off.
  • a sample analysis system includes the sample preparation system according to one aspect of the present invention, and an analysis device that analyzes the sample prepared by the sample preparation system.
  • a sample preparation method is a step of separating and dispersing at least part of the adhesion between adjacent cells in a cell group in which a plurality of cells adhere to each other, wherein A step of dispersing the cell group while associating the cells with the individual cells forming the cell group in which at least part of the adhesion between the adjacent cells has been severed.
  • a sample containing cells for cell analysis can be prepared while tracking the positions of individual cells forming a cell group.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view showing an outline of a sample preparation system according to one embodiment of the present invention
  • FIG. FIG. 2 is a block diagram showing the essential configuration of the sample preparation system shown in FIG. 1
  • FIG. FIG. 2 is a diagram illustrating the flow of sample collection processing using the sample preparation system shown in FIG. 1
  • 3 is a three-dimensional fluorescence image of cell clusters immediately after staining in Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing changes in the position of cell nuclei along with the passage of time for cell dispersing enzyme treatment in Example 1.
  • FIG. 4 is a diagram showing changes in the position of cell nuclei in the process of cell dispersion by a convex lens in Example 1.
  • FIG. 10 is a diagram showing changes in position of cell nuclei accompanying movement of the convex lens in Example 1;
  • FIG. 2 is a diagram showing how a single cell is separated from a cell cluster using a glass needle in Example 1.
  • FIG. FIG. 2 is a diagram showing three-dimensional positions and movement trajectories of collected cells during dispersion, separation, and collection processes in Example 1.
  • FIG. 3 is a three-dimensional fluorescence image of cell nuclei immediately after staining in Example 2.
  • FIG. FIG. 10 is a diagram showing changes in the position of cell nuclei along with the elapse of cell-dispersing solution treatment time in Example 2.
  • FIG. FIG. 10 is a diagram showing changes in the position of cell nuclei in the process of cell dispersion by a lens in Example 2;
  • FIG. 10 is a diagram showing cell positions before and after cell dispersion on a two-dimensional plane in Example 2;
  • FIG. 1 is a cross-sectional view schematically showing a sample preparation system 100 according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 2 is a block diagram showing the essential configuration of the sample preparation system 100 shown in FIG.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the flow of sampling processing using the sample preparation system 100 shown in FIG.
  • the sample preparation system 100 is a system that prepares a sample to be analyzed from a cell group in which a plurality of cells adhere to each other.
  • samples to be analyzed include clusters with fewer cells than cell groups, small cell groups, single cells, part of the components that make up cells, part of components contained in cells, etc. is mentioned.
  • preparing the sample is intended to make the sample ready for analysis.
  • "preparing a sample” includes collecting (picking) a single cell from a cell group and transferring it onto a plate for cell analysis, or Separating a lump part and making it possible to analyze it in the solution etc. are also included.
  • the sample preparation system 100 constitutes the sample analysis system 1 together with the analysis device 200 .
  • the cells picked by the sample preparation system 100 are transported to the analysis device 200 for sample analysis.
  • the sample preparation system 100 includes a sample preparation robot 10, a microscope 20, a controller 30, and a storage device 300.
  • the sample preparation system 100 is used to collect at least part of the cell group M in the Petri dish (container) 14 .
  • the container containing the cell group M collected by the sample preparation system 100 is not limited to the petri dish 14, and may be any container capable of holding the cell group M, such as a tube or plate.
  • Such a container is preferably made of glass, resin, or the like, which is translucent (transparent in this embodiment) with respect to the observation light of the microscope 20 .
  • a cell group containing cells to be collected is a cell group in which a plurality of cells adhere to each other.
  • Such cell clusters may be two-dimensional structures such as sheet-like cell clusters, or three-dimensional structures such as cell clusters, tissues, and organoids.
  • the cell group M is preferably housed in the petri dish 14 together with a solution containing bead-like solid particles.
  • the solid particles contained in the solution are, for example, resin beads.
  • the solution may contain a culture medium.
  • sample preparation robot 10 The sample preparation robot 10 comprises three robotic arms: an aspiration arm (collection arm) 11 , a dispersion arm 12 and a separation arm 13 .
  • the suction arm 11 is used to suck target cells from the cell group M in the petri dish 14 and discharge them onto the plate 202 of the analysis device 200 .
  • another collection arm capable of collecting target cells from the cell group M may be used. Examples of other arms include needles that are inserted into and harvested from cells.
  • the suction arm 11 is used as the collection arm will be described as an example.
  • the suction arm 11 sucks at least part of the target cells from the cell group M dispersed on the two-dimensional plane (xy plane) in the petri dish 14 , that is, on the bottom surface of the petri dish 14 .
  • the suction arm 11 sucks cells separated from cell-cell junctions in the cell group M dispersed in the petri dish 14 .
  • a needle 11a is attached to the tip of the suction arm 11.
  • the suction arm 11 is configured to be rotatable in the x-axis direction in FIG. This allows the needle 11a of the suction arm 11 to access both the petri dish 14 of the sample preparation system 100 and the plate 202 of the analyzer 200, which are placed adjacent to each other.
  • the suction arm 11 has a plurality of joints, and by controlling the movements of the joints, the position of the tip of the needle 11a can be adjusted in each of the x-axis direction, the y-axis direction, and the z-axis direction. It is configured. In particular, by moving the tip of the needle up and down in the z-axis direction, the tip of the needle 11a can be inserted into and retracted from the petri dish 14 without moving the microscope stage 22, and the needle The tip of 11a can be inserted into the plate 202 or withdrawn.
  • the suction arm 11 is configured so that the position of the needle 11a can be adjusted either manually or electrically.
  • the suction arm 11 is provided with a plurality of motors (not shown) in order to electrically drive the suction arm 11 .
  • the suction arm 11 is controlled by the arm controller 31 included in the controller 30 of the sample preparation system 100 .
  • the form of the plurality of motors is not limited, and may be, for example, stepping motors or servo motors.
  • the needle 11a is a tubular member with both ends open, and one of its ends is airtightly connected to a pipe connected to a pump (not shown). Although detailed description of the pump is omitted, it is configured to be able to suck and discharge a very small volume of fluid (gas or liquid). Since the pump and the needle 11a are connected in an airtight state, the needle 11a can aspirate or eject cells according to the fluid aspirated or ejected by the pump.
  • the needle 11a may have a tapered shape that tapers toward the tip.
  • the opening diameter and inner diameter of the needle 11a may be any size that allows cells to be aspirated or ejected, and can be appropriately set according to the size of target cells.
  • the needle 11a may be made of glass, resin, or the like that is translucent (transparent in this embodiment) with respect to the observation light from the microscope 20 .
  • the dispersing arm 12 is used to press its tip against the cell group M in the petri dish 14 to separate and disperse at least part of the adhesion between adjacent cells in the cell group.
  • This process of dispersal is intended, by way of example, to disperse groups of cells into smaller clusters.
  • “dispersing a cell group into smaller clusters” is intended to divide a cell group into small cell groups (clusters) having fewer cells than the cell group.
  • “dispersing a cell group into smaller clusters” includes dividing one cell group into two or more clusters, and separating at least some of the cells contained in the cell group from adjacent cells. etc. are included.
  • the process of dispersion described above may include spreading the three-dimensional structure on a two-dimensional plane.
  • the process of dispersing described above may include stacking individual cells forming a cell group vertically and dispersing the cells three-dimensionally.
  • the cell cluster M against which the tip of the dispersing arm 12 is pressed may be treated with a dispersing enzyme in advance in the petri dish 14 so that the cell cluster M can be easily dispersed.
  • the method for dispersing the cell group M is not limited to the configuration using the dispersing arm 12, and as described later, other conventionally known cell dispersing methods may be used.
  • Sample preparation system 100 may not include dispersing arm 12 if other cell dispersing methods are used.
  • the dispersing arm 12 has a surface at its tip that presses the cell group M from the top of the cell group M toward the bottom surface of the petri dish 14 .
  • a configuration in which a convex lens 12a is attached to the distal end of the dispersion arm 12 will be described as an example.
  • the dispersing arm 12 disperses the cell cluster M by moving the convex lens 12a in the z-axis direction to press the cell cluster M from the top of the cell cluster M toward the bottom surface of the petri dish 14 .
  • the cell group M is a three-dimensional structure such as a cell mass, an organoid, or a part of tissue
  • the cell group M can be dispersed on a two-dimensional plane by pressing the convex lens 12a.
  • the convex lens 12a Since the convex lens 12a has a convex curved surface (convex portion), even if the posture of the convex lens 12a with respect to the petri dish 14 deviates from a parallel state, the ends of the convex lens 12a do not interfere with the petri dish 14. , can be appropriately pressed onto the cell group M. Also, the convex lens 12a can be easily aligned with the cell group M based on the position of the convex portion. The convex lens 12a is preferably pressed against the cell group M so that the tip of the convex portion (the lowest point of the convex lens 12a) contacts the cell group M first.
  • the convex lens 12a By moving the dispersion arm 12 in the x-axis direction or the y-axis direction, the convex lens 12a may be aligned so that it can be appropriately pressed against the cell group M. In addition, when the size of the convex lens 12a in the x-axis direction or the y-axis direction is small with respect to the cell group M, the convex lens 12a is moved over the cell group M in the x-axis direction or the y-axis direction so that the entire cell group M can be pressed. It may be moved axially.
  • the petri dish 14 contains a solution containing bead-like solid particles together with the cell group M
  • a flow is generated in the solution, and the solid particles are removed. move. Therefore, the convex lens 12a can be aligned with the cell group M by observing the movement of the solid particles.
  • the solid particles move centripetally or centrifugally around the lowest point of the convex lens 12a in the xy plane near the bottom surface of the petri dish 14.
  • the convex lens 12a By observing the movement of the solid particles (flow of the solution), the lowest point of the convex lens 12a can be identified.
  • the convex lens 12a may be positioned using a Newton ring-like image observed when the convex lens 12a approaches the bottom surface of the container as an index.
  • the dispersion arm 12 is configured so that the position of the convex lens 12a can be adjusted either manually or electrically.
  • the dispersion arm 12 is provided with a plurality of motors (not shown) in order to electrically drive the dispersion arm 12 .
  • the dispersing arm 12 is controlled by the arm controller 31 included in the controller 30 of the sample preparation system 100 .
  • the form of the plurality of motors is not limited, and may be, for example, stepping motors or servo motors.
  • the convex lens 12a may have a convex portion that protrudes in the direction to press the cell group M, and may not function as a lens.
  • the size and material are not particularly limited.
  • a glass substrate or a resin substrate can also be used instead of the convex lens 12a.
  • the convex lens 12a may be made of glass, resin, or the like, which is transparent to the observation light from the microscope 20 (transparent in this embodiment).
  • the size of the convex lens 12a in the x-axis direction and the y-axis direction is preferably large enough to cover the entire cell group M (larger than the cell group M). It may be smaller than the cell group M because it can be moved to and pressed against.
  • the shape of the convex lens 12a is preferably such that when it is pressed against the cell group M, the cell group M does not move in parallel.
  • the convex lens 12a is pressed against the cell group M and the cell group M moves parallel, the cell group M is out of the field of view of the microscope 20 and cannot be tracked, or the cell group M cannot be properly dispersed. I can't do it, and it's not good.
  • the convex lens 12a preferably moves in the z-axis direction in a state parallel to the bottom surface of the petri dish 14 and presses against the cell group M so that the cell group M can be appropriately dispersed. , deviation from parallelism is allowed.
  • the convex lens 12a is configured so that even when the convex lens 12a is pressed against the cell group M in a non-parallel state, the cell group M does not move out of the field of view of the microscope 20 and can appropriately disperse the cell group M. .
  • the shape of such a convex lens 12a it is as follows.
  • R ⁇ r/sin ⁇ (Formula 1) is preferably satisfied.
  • the upper limit of the radius r of the convex lens 12a depends on the space around the convex lens 12a (the size of the petri dish 14, etc.).
  • the radius r of the convex lens 12a is preferably larger than the major axis radius L1 of the cell group M, therefore L 1 ⁇ r ⁇ R (Formula 2) is preferably satisfied.
  • the radius r In order to prevent parallel movement of the cell group M when the convex lens 12a is pressed against the cell group M, the radius r must be larger than a certain value L 2 ( ⁇ L 1 ) (the value of L 2 changes due to deformation of the cell group M, friction between the cell group M and the convex lens 12a or the bottom surface of the petri dish 14, and the like). Therefore, the radius r is L 1 ⁇ L 2 ⁇ r ⁇ R (Formula 3) is preferably satisfied.
  • the shape of the convex lens 12a that can be appropriately pressed against the edge of the cell cluster M will be examined.
  • the major axis radius L3 of the cell group M when the convex lens 12a is pressed against the cell group M the lowest point of the convex lens 12a with the curvature radius R and the position shifted from the lowest point by the major axis radius L3
  • Separation arm 13 is used to separate intercellular adhesion in cell group M dispersed in petri dish 14 . Separation arm 13 separates intercellular adhesions in cell group M dispersed on the two-dimensional plane in petri dish 14 , that is, on the bottom surface of petri dish 14 .
  • a needle 13a is attached to the tip of the separation arm 13.
  • the separation arm 13 is configured to be rotatable in the x-axis direction in FIG.
  • the separation arm 13 has a plurality of joints, and by controlling the movements of the joints, the position of the tip of the needle 13a can be adjusted in each of the x-axis direction, the y-axis direction, and the z-axis direction. It is configured. In particular, by vertically moving the position of the tip of the needle in the z-axis direction, the tip of the needle 13a can be inserted into or withdrawn from the petri dish 14 without moving the microscope stage 22.
  • the separation arm 13 is configured so that the position of the needle 13a can be adjusted either manually or electrically.
  • a hydraulic manipulator is used as an example.
  • Separation arm 13 is provided with a plurality of motors (not shown) for electrically driving separation arm 13 .
  • the separation arm 13 is controlled by the arm control section 31 included in the control section 30 of the sample preparation system 100 .
  • the form of the plurality of motors is not limited, and may be, for example, stepping motors or servo motors.
  • the needle 13a has a tapered shape that tapers toward the tip, and the outer diameter of the tip is sufficient as long as it can be inserted between cells to separate the intercellular adhesion. It can be appropriately set according to the adhesion state.
  • the needle 13a may be made of glass, resin, or the like that is translucent (transparent in this embodiment) with respect to the observation light from the microscope 20 .
  • the microscope 20 includes an imaging element 21 , a microscope stage 22 , a stage mechanism 23 , a light source 24 and a lens 25 .
  • the microscope 20 is placed on an anti-vibration table (not shown).
  • the imaging device 21 captures an image within the petri dish 14 formed by the lens 25 and generates image data representing the image.
  • the microscope 20 is preferably a microscope having specs suitable for detailed observation and analysis of cells. Image data generated by the imaging device 21 is sent to the storage device 300 and stored therein.
  • the imaging element 21 captures images (microscopic images) in the petri dish 14 from when the cell group M is dispersed until the cells are aspirated.
  • the imaging device 21 may capture an image in the petri dish 14 before the cell cluster M is dispersed or at the same time as the dispersion is started.
  • the imaging element 21 performs time-lapse imaging of images in the petri dish 14 at predetermined time intervals.
  • the time interval of the time-lapse imaging may be set to a value that allows tracking of changes in the position and state of the cell group M in the petri dish 14 .
  • the imaging device 21 may capture moving images inside the petri dish 14 .
  • the frame rate of the moving image may be set to a value that allows tracking of changes in the position and state of the cell group M in the petri dish 14 .
  • the imaging device 21 generates two-dimensional image data or three-dimensional image data of the image in the petri dish 14 .
  • the microscope stage 22 is a stage on which the petri dish 14 is placed.
  • the microscope stage 22 has a plate 22a and an outer frame 22b. Further, the microscope stage 22 is provided with a stage mechanism 23 for adjusting the position of the microscope stage 22 .
  • the plate 22a is a plate-like member on which the petri dish 14 is placed, and may be made of glass that is translucent to the observation light from the light source 24.
  • the outer frame 22b is a frame-shaped member for supporting the plate 22a, and is shaped to surround the outer edge of the plate 22a.
  • the outer frame 22b is supported by a stage mechanism 23 schematically shown in FIG. The position of the outer frame 22b can be adjusted by using the stage mechanism 23.
  • FIG. 1 A stage mechanism 23 schematically shown in FIG.
  • the stage mechanism 23 can translate the outer frame 22b in each of the x-axis direction, the y-axis direction, and the z-axis direction, and the main surface of the outer frame 22b (the main surface of the plate 22a) with respect to the xy plane. It is configured so that it can be tilted by
  • the stage mechanism 23 is configured so that the position of the outer frame 22b can be adjusted either manually or electrically.
  • the stage mechanism 23 is provided with a plurality of motors in order to electrically drive the stage mechanism 23 .
  • the stage mechanism 23 is controlled by the stage controller 32 included in the controller 30 of the sample preparation system 100 .
  • the form of the plurality of motors is not limited, and may be, for example, stepping motors or servo motors.
  • the relative relationship between the inside of the petri dish 14 and the microscope 20 is changed in a state in which the microscope 20 is adjusted so that the inside of the petri dish 14 on the microscope stage 22 is focused.
  • the target cells can be collected from the cell group M in the petri dish 14 without the focus (that is, in a focused state).
  • the sample preparation robot 10 is used to collect the desired cells, the desired cells can be tracked while the petri dish 14 is in focus.
  • the light source 24 is a light source that irradiates the petri dish 14 with observation light (illumination light, excitation light, etc.).
  • the objective lens 26 and the imaging device 21 are arranged below the microscope stage 22 , and the light source 24 is arranged above the microscope stage 22 .
  • the microscope stage 22, petri dish 14, needle 11a, convex lens 12a, and needle 13a are preferably translucent to the light from the light source .
  • the light source 24 may be arranged below the microscope stage 22 and the objective lens 26 and the imaging device 21 may be arranged above the microscope stage 22 .
  • the objective lens 26 and the imaging element 21 are arranged below the microscope stage 22, and the excitation light from the light source 24 is emitted from below or from the side of the cell group M in the petri dish 14. It can be configured to illuminate.
  • the objective lens 26 and the imaging element 21 are arranged above the microscope stage 22, and the excitation light from the light source 24 is irradiated from above or from the side of the cell group M in the petri dish 14. may Note that the configuration of the optical system including the light source 24, the objective lens 26, and the imaging device 21 is not limited to these configurations.
  • the position of the light source 24 is not limited as long as the irradiation direction of the excitation light described above can be realized. Further, the position of the image pickup device 21 is not limited as long as the light passing through the objective lens 26 is incident on the image pickup device 21 .
  • the lens 25 is composed of a plurality of lenses, some of which constitute the objective lens 26 .
  • the lens 25 forms an image in the petri dish 14 on the light receiving surface of the imaging device 21 .
  • the control unit 30 includes an arm control unit (adjustment mechanism) 31 , a stage control unit 32 , an image data acquisition unit 33 and a position identification unit (tracking unit) 34 .
  • the arm control unit 31 controls the driving of the three arms of the sample preparation robot 10, and adjusts the position of the tip of each arm.
  • the arm control unit 31 drives the dispersion arm 12 to position the convex lens 12a so that the lowest point of the convex lens 12a of the dispersion arm 12 faces the vicinity of the center of the cell group M. good too.
  • the arm control unit 31 also controls the movement of the convex lens 12a in the z-axis direction based on information (reference position) representing the position (lens height 0) where the lowest point of the convex lens 12a contacts the bottom surface of the petri dish 14.
  • the arm control unit 31 may move the convex lens 12a in the z-axis direction and press it against the cell group M, and then move the convex lens 12a in the x-axis direction and the y-axis direction. Further, the arm control section 31 may vibrate the convex lens 12a in the z-axis direction, the x-axis direction, or the y-axis direction.
  • the arm controller 31 preferably controls the convex lens 12a to press the cell cluster M until the cell cluster M is dispersed on the two-dimensional plane in the petri dish 14. .
  • the arm control unit 31 presses the convex lens 12a against the cell group M to disperse the cell group M, and then moves the convex lens 12a away from the cell group M in the z-axis direction. At this time, the arm control unit 31 may move the convex lens 12a away from the cell cluster M in the x-axis direction or the y-axis direction, and then move it away from the cell cluster M in the z-axis direction. After that, the arm control unit 31 drives the separation arm 13 to separate the intercellular adhesion, and drives the suction arm 11 to suck the target cells.
  • the arm control unit 31 presses the convex lens 12a against the cell group M to disperse the cell group M
  • the arm control unit 31 further presses the convex lens 12a against the dispersed cell group M to divide the cell group M into clusters with a smaller number of cells. You may control so that it may divide.
  • the arm control unit 31 When the convex lens 12a is pressed against the cell cluster M or when the convex lens 12a is moved away from the cell cluster M, the arm control unit 31 causes the cell cluster M to move in parallel with the movement of the convex lens 12a. It is preferable to control it so that it does not go out of the field of view. That is, it is preferable that the arm control unit 31 moves the convex lens 12a at such a speed that the cell group M does not move out of the field of view of the microscope 20 due to parallel movement.
  • the moving speed of the convex lens 12a is preferably slower than the time-lapse imaging interval of the imaging device 21 or the frame rate of the moving image.
  • the arm control unit 31 moves the convex lens 12a in the z-axis direction by several 1 ⁇ m per second.
  • the stage control unit 32 controls the stage mechanism 23 of the microscope stage 22 to adjust the positions of the plate 22 a and the outer frame 22 b, that is, the position of the petri dish 14 .
  • the stage control unit 32 can adjust the position of the petri dish 14 with respect to the imaging element 21, and also adjust the position of the petri dish 14 with respect to the three arms of the sample preparation robot 10.
  • the relative positions of the distal ends of the three arms provided in the sample preparation robot 10 and the petri dish 14 may be adjusted by either the arm control unit 31 or the stage control unit 32, or may be adjusted by both. . That is, the arm control unit 31 may drive each arm to adjust the position with respect to the petri dish 14, or the stage control unit 32 may drive the microscope stage 22 to adjust the position of the petri dish 14 with respect to each arm. or both. Therefore, both arm control section 31 and stage control section 32 can function as an adjustment mechanism of sample preparation system 100 .
  • the image data acquisition unit 33 acquires image data generated by the imaging element 21 and sends it to the position identification unit 34 and the storage device 300 .
  • the image data acquisition unit 33 may acquire image data each time the image sensor 21 generates image data, or may acquire image data at a predetermined timing.
  • the position identification unit 34 associates individual cells forming the cell group M with individual cells forming the cell group in which at least part of the adhesion between adjacent cells has been cut off.
  • the position identification unit 34 refers to the image data acquired by the image data acquisition unit 33, and identifies the position of each cell in the cell group M from before the cell group M is dispersed to when the cells are collected. identify.
  • the position identification unit 34 can identify the original position in the cell group M for the cells collected by the suction arm 11 .
  • the position identification unit 34 generates time-series images from when the cell group M is dispersed to when at least a part of the cell group is aspirated from the acquired image data, associates each cell between the images, and Track the location of each cell.
  • the position identification unit 34 tracks the position of each cell at each time point by reconstructing the result of scanning each pixel (x, y, z) obtained from a confocal microscope as a three-dimensional image. This may identify the original position in the cell group M of each cell.
  • the position identification unit 34 sends position data representing the position of each identified cell to the storage device 300 .
  • the position identification unit 34 can detect images before and after the dispersion process by means of a device that acquires a signal for detecting the position of each cell, in addition to referring to images taken during the dispersion process as described above.
  • the position of each cell may be associated.
  • the position identification unit 34 calculates the position of each cell at each time point from the information of each pixel instead of imaging the information of each pixel obtained from the confocal microscope.
  • the storage device 300 stores images captured by the imaging device 21 .
  • the storage device 300 stores the image data in the petri dish 14 generated by the imaging device 21 and imaged from before the cell group M is dispersed until at least part of the cell group is aspirated.
  • the storage device 300 may store position data identified by the position identification section 34 .
  • the storage device 300 may store information for controlling each arm, such as the position of the tip of each arm before adjustment by the arm control section 31, and the moving distance and moving speed of the tip of each arm.
  • sample preparation method A sample preparation method will be described.
  • the sample preparation method is, for example, sample preparation processing using the sample preparation system 100 .
  • (1) cell labeling, (2) cell dispersing enzyme treatment (dispersing step), (3) cell dispersing (dispersing step), and (4) one cell Separation and harvesting (harvesting process) are carried out.
  • an image in the petri dish 14 to be processed is acquired (imaging step), and with reference to the acquired image, the above (2) to Identify the location of each cell up to (4).
  • Cell labeling Cells are labeled in order to enable imaging and tracking of the cell group M to be processed.
  • Methods for labeling cells include a method of staining the nucleus, cell membrane, intracellular organelles, nuclear membrane, cytoplasm, DNA, etc., a method of emitting light using the function of enzymes in the cytoplasm, and a method of using the autofluorescence of cells. and methods of introducing a fluorescent reporter gene.
  • the cell group M in the medium is taken out, transferred to a container containing a staining solution to stain the nuclei and cell membranes, and transferred to a container containing a washing medium for washing. This labels the cells.
  • cell dispersal enzyme treatment In order to weaken the adhesion between cells in the cell group M, the cell group is treated with a cell dispersal enzyme.
  • Conventionally known cell dispersing enzymes can be used as enzymes used for cell dispersing enzyme treatment, and examples thereof include trypsin, collagenase, dispase, papain, hyaluronidase, protease, pronase, accutase, and the like.
  • a chelating agent, an antibody that inhibits intercellular binding, a low-molecular-weight compound, or the like may be used instead of the cell-dispersing enzyme. Examples of chelating agents include EDTA, which selectively binds Ca2 + .
  • the cell dispersing enzymatic treatment may not be performed, and (3) the cell dispersing treatment may be performed.
  • the order of (2) the cell-dispersing enzyme treatment and (3) the cell-dispersing treatment may be exchanged, and the cell group M after the cell-dispersing treatment may be treated with the cell-dispersing enzyme.
  • the stained cell group M is transferred into a petri dish 14 containing a solution containing dispersed enzymes and left for a predetermined period of time for enzymatic treatment.
  • the inside of the petri dish 14 during the cell dispersion enzyme treatment is imaged by the imaging element 21 to acquire image data of the cell group M during the enzyme treatment.
  • the imaging device 21 images the cell group M before the enzyme treatment.
  • the cell group M treated with the cell dispersing enzyme is dispersed using the convex lens 12 a of the dispersing arm 12 .
  • the convex lens 12a is moved above the cell group M, moved toward the bottom surface of the petri dish 14, and pressed against the cell group M.
  • the convex lens 12a is pressed until the cell group M is dispersed on a two-dimensional plane. After the cell group M is dispersed on the two-dimensional plane, the convex lens 12a is shifted in a direction parallel to the bottom surface of the petri dish 14 and then moved away from the bottom surface. The inside of the petri dish 14 during the cell dispersion process is imaged by the imaging element 21 to acquire image data of the cell group M during the dispersion process.
  • a target single cell is separated from the dispersed cell group M, and the separated cell is collected.
  • one target cell is separated by needle 13a of separation arm 13 from cell group M dispersed on a two-dimensional plane. Then, by sucking the separated cells with the needle 11a of the suction arm 11, the target cells are collected.
  • An image of the interior of the petri dish 14 during the process of separating and collecting one cell is captured by the imaging element 21 to obtain image data of the cell group M during the process of separating and collecting one cell.
  • sample preparation method among the steps (1) to (4), (2) cell dispersing enzyme treatment, (3) cell dispersing, and (4) separation and collection of one cell.
  • An image in the petri dish 14 is acquired, and the cells in the petri dish 14 are tracked.
  • time-series images are generated from when the cell group M is dispersed to when one cell is aspirated, and the position of each cell at each time point is extracted and tracked. Cell locations can be identified. Further, by tracking the cells in the petri dish 14 during the processes (2) to (4) above, it is also possible to obtain information on cell morphology and temporal changes.
  • the cell dispersion treatment is not limited to the method using the dispersion arm 12, and other cell dispersion methods may be used.
  • other cell dispersing methods conventionally known cell dispersing methods can be used. Examples include a method of vibrating cells, a method of heating cells, a method of leaving cells in a dispersed enzyme solution, Examples include a method of generating a solution flow such as shear stress, a method of generating an electric field or ultrasonic waves, and the like.
  • An example of a method of vibrating cells is the use of ultrasonic waves.
  • a method for heating cells there is a method in which a material that easily absorbs heat (such as gold particles) is adhered to the cell membrane and electromagnetic waves are applied.
  • the enzymatic reaction progresses with the passage of time and the cells undergo dispersal.
  • Cell dispersion treatment can be performed by As a result, not only analysis of each cell but also analysis of cells that function systematically with adjacent cells, analysis of interactions between adjacent cells, and the like can be performed.
  • the analysis device 200 is a device that analyzes samples collected in the sample preparation system 100 .
  • a conventionally known cell analysis device can be used as the analysis device 200 .
  • sample analysis in the analysis device 200 include RNA analysis, genome analysis, protein analysis, metabolite analysis, functional analysis such as proliferation ability, and the like. Since the sample preparation system 100 can collect cells without destroying them, the analyzer 200 can also perform functional analysis on a cell-by-cell basis. Moreover, since the sample preparation system 100 does not need to use fluorescent proteins for cell tracking, analysis of human specimens is also possible in the analyzer 200 . Further, the analysis using the analysis device 200 can include continuous observation of the cells and cell clusters in the solution in which the cell group M is dispersed.
  • Such analyzes include, for example, analysis of cell division ability, growth speed, motility, invasion ability, etc., ELISpot assay and comet assay. Furthermore, the analysis apparatus 200 performs not only analysis on a cell-by-cell basis, but also analysis on a sample (analysis on a cell-aggregate basis) in which cell aggregates such as pancreatic islets are regarded as one functional unit.
  • the cells are transported to the analysis device 200 by ejecting the cells sucked by the suction arm 11 of the sample preparation system 100 into each well of the plate 202 provided on the microscope stage 201 . Then, the analysis device 200 subjects the transported cells to various sample analyses. Cells can be transported from the suction arm 11 to the plate 202 while observing them with a microscope having an objective lens 203 .
  • the analysis device 200 acquires cells to be analyzed from the sample preparation system 100, acquires information on the original position of the target cells in the cell group M identified in the sample preparation system 100, and performs sample analysis. can be used. Therefore, not only analysis of each cell but also analysis of cells that function systematically with adjacent cells, analysis of interactions between adjacent cells, and the like can be performed.
  • the control block of the controller 30 of the sample preparation system 100 may be realized by a logic circuit (hardware) formed in an integrated circuit (IC chip) or the like, or may be realized by software.
  • the control unit 30 of the sample preparation system 100 is equipped with a computer that executes program instructions, which are software that implements each function.
  • This computer includes, for example, one or more processors, and a computer-readable recording medium storing the program.
  • the processor reads the program from the recording medium and executes it, thereby achieving the object of the present invention.
  • a CPU Central Processing Unit
  • the recording medium a "non-temporary tangible medium" such as a ROM (Read Only Memory), a tape, a disk, a card, a semiconductor memory, a programmable logic circuit, etc. can be used.
  • a RAM Random Access Memory
  • the program may be supplied to the computer via any transmission medium (communication network, broadcast wave, etc.) capable of transmitting the program.
  • any transmission medium communication network, broadcast wave, etc.
  • one aspect of the present invention can also be implemented in the form of a data signal embedded in a carrier wave in which the program is embodied by electronic transmission.
  • the sample preparation system 100 includes a microscope stage 22 on which a petri dish (container) 14 for containing a cell group M in which a plurality of cells adhere to each other and dispersing the cell group M is placed, and a sample from the dispersed cell group M.
  • a position identification unit 34 is provided for identifying the position of the sample from before dispersion to sampling.
  • the sample in the petri dish 14 is taken from the time of dispersing the cell group M to the time of collecting the sample from the cell group M, the sample is collected from the time of dispersing the cell group M based on the image. It is possible to generate time-series images until By extracting and tracking the position of the sample at each time point using the generated time-series images, the original position of the sample in the cell group M can be identified. Therefore, it is possible to acquire the positional information of the sample contained in the cell group M and collect the sample.
  • the cell group M is a three-dimensional structure, and the suction arm 11 preferably collects samples from the cell group M dispersed on a two-dimensional plane within the petri dish 14.
  • the cells are collected by dispersing the cell group M, which is a three-dimensional structure, on a two-dimensional plane in the petri dish 14, so that the target cells can be easily collected.
  • the cell group M which is a three-dimensional structure
  • the cell group M of the three-dimensional structure is dispersed on the two-dimensional plane, three-dimensional positional information of the target cell in the three-dimensional structure of the cell group M can be obtained.
  • sample preparation system 100 preferably further includes a dispersing arm 12 having a surface at its tip that presses the cell cluster M from the top of the cell cluster M toward the bottom surface of the petri dish 14 .
  • the cell cluster M can be dispersed in the Petri dish 14 by pressing the convex lens 12a at the tip of the dispersion arm 12 against the cell cluster M. Moreover, even if the cell group M is a three-dimensional structure, it can be dispersed on a two-dimensional plane in the petri dish 14 by pressing the convex lens 12a.
  • the dispersion arm 12 preferably has a projection projecting in the direction to press the cell group M at its tip.
  • the convex lens 12a at the tip of the dispersion arm 12 has a convex portion, it is possible to appropriately press the cell group M, and alignment with the cell group M is easy.
  • sample preparation system 100 preferably further includes an arm controller (adjustment mechanism) 31 that adjusts the position of the convex lens 12a at the tip of the dispersion arm 12 with respect to the cell group M.
  • arm controller adjustment mechanism
  • the arm control unit 31 by adjusting the position of the convex lens 12a with respect to the cell group M by the arm control unit 31, it is easy to adjust the position of the convex lens 12a with respect to the cell group M. can be pushed. Thereby, the cell group M can be appropriately dispersed.
  • the cell group M is preferably housed in the Petri dish 14 together with the bead-like solid particles.
  • the flow of the solution in the petri dish 14 can be observed by the movement of the solid particles, and the convex lens 12a can be properly aligned by referring to the flow of the solution.
  • the sample preparation system 100 further include a storage device 300 that stores images captured by the imaging element 21 .
  • a time-series image is generated from the image data stored in the storage device 300, and the position of each cell is extracted and tracked at each time point, thereby identifying the position of each cell. be able to.
  • the sample preparation system 100 preferably further includes a separation arm 13 that separates the sample from the dispersed cell group M, and the suction arm 11 sucks the sample separated by the separation arm 13 .
  • the sample analysis system 1 includes any of the sample preparation systems 100 described above and an analysis device 200 that analyzes the sample collected by the sample preparation system 100.
  • the sample analysis system 1 analyzes the sample collected in the sample preparation system 100 by the analysis device 200, so that not only the analysis of the components obtained from the cell such as RNA analysis, but also the cell using the cells collected without breaking Functional analysis of units is also possible.
  • the information regarding the original position of the target cell in the cell group M identified in the sample preparation system 100 can be referred to in the sample analysis in the analysis device 200.
  • the sample preparation method includes a step of dispersing a cell group M in which a plurality of cells adhere to each other, a step of collecting a sample from the dispersed cell group M, and an image taken during the steps from the dispersing step to the step of collecting the sample. and identifying the position of the sample from the step of dispersing to the step of collecting the sample with reference to the captured image.
  • Appendix 1 In a cell group in which a plurality of cells adhere to each other according to one aspect of the present invention, in the process of dispersing by separating at least part of the adhesion between adjacent cells, the individual cells forming the cell group and the A sample preparation system comprising a tracking unit that associates individual cells forming a group of cells from which at least a portion of adhesion between adjacent cells has been cut off.
  • Appendix 2 The sample preparation system of Appendix 1, wherein the cell population is a three-dimensional structure.
  • Appendix 4 The sample preparation system according to Appendix 3, wherein the dispersing arm has a convex portion on the surface that presses against the cell.
  • appendix 5 The sample preparation system according to appendix 3 or 4, further comprising an adjustment mechanism for adjusting the position of the tip of the dispersing arm with respect to the cell group.
  • Appendix 6 The sample preparation system according to any one of Appendices 1 to 5, further comprising a microscope for observing the cell group in the process of dispersing.
  • Appendix 7 The sample preparation system according to any one of Appendices 1 to 6, further comprising a collection arm that collects a portion of the cell group from which at least a portion of the adhesion between adjacent cells has been cut.
  • Appendix 8 The sample preparation system according to any one of Appendices 1 to 7, further comprising a separation arm that separates at least part of the adhesion between adjacent cells from the cell group in which the part is separated.
  • a sample analysis system comprising: the sample preparation system according to any one of Appendices 1 to 8; and an analysis device for analyzing the sample prepared by the sample preparation system.
  • a step of separating and dispersing at least part of the adhesion between adjacent cells in a cell group in which a plurality of cells adhere to each other, wherein at least the adhesion between individual cells forming the cell group and the adhesion between the adjacent cells A sample preparation method comprising the step of dispersing a cell group while associating with individual cells forming a cell group partially cut off.
  • Example 1 Cells were dispersed, tracked, and harvested while recording the positional information of each cell in a three-dimensional sample (organoid).
  • Three arms used for sample manipulation Three sets of arms (a suction arm, a dispersion arm, and a separation arm) that can be controlled to move in three axes (x-axis, y-axis, and z-axis) were installed around the microscope stage.
  • a glass tube with a suction/discharge pump (inner diameter 150 ⁇ m, Yodaka Giken Co., Ltd., A150S7522-6), (ii) a convex lens with a diameter of 2 mm and a curvature radius of 1 mm (AS ONE Corporation, 3- 6932-01), and (iii) a glass needle for cell separation (outer diameter 10 ⁇ m, Yodaka Giken Co., Ltd., A06S7522-6).
  • the positions of the convex lens in the x-axis direction, the y-axis direction, and the z-axis direction were finely adjusted using the Newton's ring-like image observed when the convex lens was in (close) contact with the bottom of the container as an index.
  • the height of the convex lens is gradually lowered in the solution, and the position where the Newton ring-like image is clearly observed for the first time (the lowest point of the convex lens is in contact with the bottom of the container, the convex lens is ) was determined. Further, the positions of the convex lens in the x-axis direction and the y-axis direction were determined by making fine adjustments so that the center of the observed image was positioned at the center of the microscope field. The positions of the convex lens in the x-axis direction, the y-axis direction, and the z-axis direction at this time were defined as the reference positions of the convex lens. After the reference position was determined, the convex lens was moved out of the container and held at a standby position where it would not interfere with the sample suction and discharge operations and the movement of the microscope stage.
  • FIG. 4 shows an acquired three-dimensional fluorescence image of the cell nucleus immediately after staining (z-axis interval: 5 ⁇ m, number of slices: 20).
  • FIG. 5 shows the obtained changes in the position of the cell nucleus with the lapse of cell dispersing enzyme treatment time.
  • FIG. 6 shows changes in the position of cells in the process of cell dispersion by a convex lens.
  • FIG. 7 shows the change in cell position accompanying the movement of the lens.
  • FIG. 8 shows how a single cell is separated from a sample cell cluster using a cell separation glass needle.
  • FIG. 9 shows the three-dimensional positions and movement trajectories of the isolated and harvested cells during the dispersion process.
  • the pixel coordinates (x, y) of the cell nucleus (near the center) of each cell recorded in , and the slice number (z) in the z-axis direction at the time of imaging are shown in a three-dimensional plot.
  • Each marker in FIG. 9 indicates the migration point of cells (12 cells) that are considered to be the same, and as an example, three cell migration trajectories are indicated by solid lines.
  • Example 2 While recording the positional information of each cell in the three-dimensional sample (organoid), the cells were dispersed and arranged on a two-dimensional plane.
  • a suction arm and a dispersion arm were used to carry out processing up to cell dispersion.
  • a sample dyeing container and a dispersion container were each coated with poly-L-lysine (Sigma-Aldrich, P8920) and used. Together with a sample container (Matsunami Glass, D11140H), the three containers were placed on the microscope stage.
  • the microscope stage was moved to move the center of the well of the dispersion container to the center of the field of view.
  • the dispersing arm was moved to adjust the x-axis and y-axis positions so that the lowest point of the convex lens was at the center of the microscope field.
  • the positions of the convex lens in the x-axis direction, the y-axis direction, and the z-axis direction were finely adjusted using the Newton's ring-like image observed when the convex lens was in (close) contact with the bottom of the container as an index.
  • the alignment of the convex lenses was performed in the same manner as in Example 1, except that the alignment of the convex lenses was performed without putting the dispersion liquid into the dispersion container, and the reference positions were determined.
  • Example solution staining solution, washing solution, cell dispersion A, cell dispersion B, diluent
  • Table 2 The sample solution was placed in a sample container, the staining solution and washing solution were placed in separate wells of the staining container, and the cell dispersion A was placed in a dispersing container.
  • FIG. 10 shows an acquired three-dimensional fluorescence image of the cell nucleus immediately after staining (z-axis interval: 2 ⁇ m, number of slices: 60, noise removal processed by Denoise.ai).
  • the convex lens is moved from the standby position, and the above 2-3. was moved to a point with a height of 200 ⁇ m from the reference position determined in . While observing the sample in a bright field, the convex lens was lowered little by little, and a three-dimensional fluorescence image was acquired at a position (height of 75 ⁇ m) where the convex lens approached the sample and started to touch the top of the sample.
  • the operation "moves +2 ⁇ m in the z-axis direction at a speed of 10 ⁇ m/sec, moves -3 ⁇ m, repeats a total of 5 vertical movements, and moves 5 ⁇ m downward from the original position" operation. was repeated to lower the lens position little by little.
  • three-dimensional fluorescence images were obtained at heights of 60, 50, 40, and 35 ⁇ m.
  • each cell that made up the three-dimensional sample was dispersed by the movement of the convex lens and recorded how it was arranged on the two-dimensional plane.
  • This recording tracked individual cells as they moved from a position in three-dimensional space to a position in a two-dimensional plane.
  • FIG. 12 shows changes in the position of cells in the process of cell dispersion by a convex lens.
  • FIG. 13 shows changes in cell positions before and after dispersion on a two-dimensional plane.
  • the present invention can be used in the medical field and the like by using it for cell analysis.
  • sample analysis system M cell group 10 sample preparation robot 11 suction arm (collection arm) 12 dispersion arm 12a convex lens 13 separation arm 14 petri dish (container) 21 imaging device 22 microscope stage 31 arm control section (adjustment mechanism) 34 localization unit (tracking unit) 100 sample preparation system 200 analysis device 300 storage device

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Abstract

試料調製システム（１００）は、複数の細胞が互いに接着した細胞群において、隣接する細胞間の接着の少なくとも一部を切り離して分散する、分散のプロセスにおいて、細胞群をなす個々の細胞と、隣接する細胞間の接着の少なくとも一部が切り離された細胞群をなす個々の細胞との対応付けを行う位置同定部（３４）を備えている。これにより、細胞を採取すると共に、採取した細胞の元の細胞群における位置を特定する技術を実現する。

Description

試料調製システム、試料調製方法、及び試料解析システム
　本発明は、試料調製システム、試料調製方法、及び試料解析システムに関する。
　培養細胞塊や組織のような細胞群に含まれる細胞の個々の性質を解析する場合、細胞群の中から目的の単一細胞をピッキングし、解析に供する。細胞群から目的の単一細胞を採取する技術として、特許文献１に記載された細胞搬送システムが知られている。
　特許文献１に記載されたシステムにおいては、シャーレ内を顕微鏡により観察しながら、細胞群から単一細胞を採取し、ＰＣＲチューブ内へ吐出する。
日本国特開２０１８－６８１６９号公報
　癌細胞のように隣接する細胞と組織的に機能するような細胞の解析や、隣接細胞間の相互作用を解析するような場合には、個々の細胞の性質だけでなく、これらの細胞の細胞群内における位置に関する位置情報も重要である。したがって、細胞解析において、個々の細胞の性質と共に、細胞の位置情報も得られることが望ましい。
　特許文献１に記載されたシステムでは、顕微鏡で観察しながら細胞を採取するが、このとき、各細胞は容易に採取可能なように分散又は分離している。したがって、細胞群内における各細胞の元の位置情報が失われており、採取した細胞の位置情報を得ることは困難である。特に、細胞塊や組織の一部のような三次元サンプルにおいては、サンプル中における三次元位置情報を保持したまま細胞を採取することは困難である。
　本発明の上述した問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、細胞群をなす個々の細胞の位置を追跡しながら、細胞解析を行う細胞を含む試料を調製する技術を実現することを目的とする。
　本発明の一態様に係る試料調製システムは、複数の細胞が互いに接着した細胞群において、隣接する細胞間の接着の少なくとも一部を切り離して分散する、分散のプロセスにおいて、前記細胞群をなす個々の細胞と、前記隣接する細胞間の接着の少なくとも一部が切り離された細胞群をなす個々の細胞との対応付けを行う追跡部を備えている。
　本発明の一態様に係る試料解析システムは、本発明の一態様に係る試料調製システムと、前記試料調製システムにより調製した試料を解析する解析装置とを備えている。
　本発明の一態様に係る試料調製方法は、複数の細胞が互いに接着した細胞群において、隣接する細胞間の接着の少なくとも一部を切り離して分散する工程であって、前記細胞群をなす個々の細胞と、前記隣接する細胞間の接着の少なくとも一部が切り離された細胞群をなす個々の細胞との対応付けを行いながら、前記細胞群を分散する工程を包含する。
　本発明の一態様によれば、細胞群をなす個々の細胞の位置を追跡しながら、細胞解析を行う細胞を含む試料を調製することができる。
本発明の一実施形態に係る試料調製システムの概略を示す断面矢視図である。 図１に示した試料調製システムの要部構成を示すブロック図である。 図１に示した試料調製システムを用いた試料採取処理の流れを説明する図である。 実施例１における、染色直後の細胞塊の三次元蛍光画像である。 実施例１における、細胞分散酵素処理時間の経過に沿った細胞核の位置変化を示す図である。 実施例１における、凸レンズによる細胞分散の過程における細胞核の位置変化を示す図である。 実施例１における、凸レンズの移動に伴う細胞核の位置変化を示す図である。 実施例１における、ガラスニードルを用いて細胞塊から一細胞を分離する様子を示す図である。 実施例１における、採取した細胞について、分散、分離、及び採取過程における三次元位置及び移動軌跡を示す図である。 実施例２における、染色直後の細胞核の三次元蛍光画像である。 実施例２における、細胞分散溶液処理時間の経過に沿った細胞核の位置の変化を示す図である。 実施例２における、レンズによる細胞分散の過程における細胞核の位置の変化を示す図である。 実施例２における、二次元平面上における細胞分散前後の細胞位置を示す図である。
　以下、本発明の一実施形態に係る試料調製システム１００ついて、図１～３を参照して説明する。図１は、本発明の一実施形態に係る試料調製システム１００の概略を示す断面矢視図である。図２は、図１に示した試料調製システム１００の要部構成を示すブロック図である。図３は、図１に示した試料調製システム１００を用いた試料採取処理の流れを説明する図である。
　〔試料調製システム１００〕
　試料調製システム１００は、複数の細胞が互いに接着した細胞群から、解析の対象となる試料を調製するシステムである。解析の対象となる「試料」の例として、細胞群よりも細胞数の少ないクラスタ、小細胞群、単一細胞、細胞を構成する構成要素の一部、細胞中に含まれる成分の一部等が挙げられる。また、「試料の調製」には、試料を解析できる状態にすることが意図される。一例として、「試料の調製」には、細胞群から単一細胞を採取（ピッキング）し、細胞解析に供するプレート上に搬送することや、細胞群が含まれる溶液中において解析の対象となる細胞塊部分を分離し、その溶液中にて解析できるようにすること等も含まれる。本実施形態においては、試料として、主に、単一細胞を採取する場合を例として説明する。試料調製システム１００は、解析装置２００と共に、試料解析システム１を構成している。試料解析システム１においては、試料調製システム１００によりピッキングした細胞を、解析装置２００へ搬送し、試料解析に供する。
　試料調製システム１００は、試料調製ロボット１０、顕微鏡２０、制御部３０、及び記憶装置３００を備えている。試料調製システム１００は、シャーレ（容器）１４内の細胞群Ｍの少なくとも一部を採取するために用いられる。試料調製システム１００により採取される細胞群Ｍを収容する容器は、シャーレ１４に限定されず、チューブやプレートのように、細胞群Ｍを保持可能なものであればよい。このような容器は、顕微鏡２０の観察光に対して透光性を有する（本実施形態においては透明な）ガラス製、樹脂製等であることが好ましい。
　試料調製システム１００において、採取される細胞が含まれる細胞群は、複数の細胞が互いに接着した細胞群である。このような細胞群は、シート状の細胞クラスタのような二次元構造体であっても、細胞塊、組織、オルガノイドのような三次元構造体であってもよい。
　試料調製システム１００において、細胞群Ｍは、ビーズ状の固体粒子を含む溶液と共にシャーレ１４内に収容されていることが好ましい。溶液に含まれる固体粒子は、一例として、樹脂ビーズである。また、溶液には培地が含まれていてもよい。
　（試料調製ロボット１０）
　試料調製ロボット１０は、吸引アーム（採取アーム）１１、分散アーム１２、及び分離アーム１３の３つのロボットアームを備えている。
　＜吸引アーム１１＞
　吸引アーム１１は、シャーレ１４内の細胞群Ｍから対象となる細胞を吸引し、解析装置２００のプレート２０２に吐出するために用いられる。なお、吸引アーム１１の替わりに、対象となる細胞を細胞群Ｍから採取可能な他の採取アームを用いてもよい。他のアームの例として、細胞に差し込んで細胞を採取するニードルが挙げられる。本実施形態では、採取アームとして、吸引アーム１１を用いる場合を例として説明する。
　吸引アーム１１は、シャーレ１４内の二次元平面（ｘｙ平面）上、すなわち、シャーレ１４の底面上に分散した細胞群Ｍから対象となる細胞の少なくとも一部を吸引する。一例として、吸引アーム１１は、シャーレ１４内に分散した細胞群Ｍにおいて、細胞間接合が分離され、切り離された細胞を吸引する。
　吸引アーム１１の先端には、ニードル１１ａが取り付けられている。吸引アーム１１は、図１のｘ軸方向に回転可能に構成されている。これにより、吸引アーム１１のニードル１１ａが、隣接して載置された、試料調製システム１００のシャーレ１４と解析装置２００のプレート２０２との両方にアクセス可能となっている。
　また、吸引アーム１１は複数のジョイントを有しており、ジョイントの動きを制御することにより、ニードル１１ａの先端の位置を、ｘ軸方向、ｙ軸方向及びｚ軸方向の各方向に調節可能に構成されている。特に、ニードルの先端の位置をｚ軸方向に上下動させることによって、顕微鏡ステージ２２を動かすことなく、ニードル１１ａの先端をシャーレ１４内に挿入させたり、退避させたりすることができ、かつ、ニードル１１ａの先端をプレート２０２内に挿入させたり、退避させたりすることができる。
　吸引アーム１１は、手動及び電動のいずれの方法でもニードル１１ａの位置を調整できるように構成されている。なお、電動で吸引アーム１１を駆動するために、吸引アーム１１は、複数のモータ（図示せず）を備えている。電動で吸引アーム１１を駆動する場合、吸引アーム１１は、試料調製システム１００の制御部３０が備えているアーム制御部３１により制御される。なお、複数のモータの態様は限定されるものではなく、例えば、ステッピングモータであってもよいし、サーボモータであってもよい。
　ニードル１１ａは、両端が開放された管状部材であり、その端部の一方が、ポンプ（図示せず）に接続されている配管に気密された状態で接続されている。なお、ポンプについての詳細な説明を省略するが、微小な体積の流体（気体又は液体）を吸引及び吐出可能なように構成されている。ポンプとニードル１１ａとが気密された状態で接続されているので、ニードル１１ａは、ポンプが行う流体の吸引又は吐出に応じて、細胞を吸引又は吐出することができる。
　ニードル１１ａは、先端に向かって先細りするテーパ形状であり得る。ニードル１１ａの開口径及び内径は、細胞を吸引又は吐出可能な大きさであればよく、対象となる細胞の大きさに応じて適宜設定され得る。ニードル１１ａは、顕微鏡２０からの観察光に対して透光性を有する（本実施形態においては透明な）ガラス製、樹脂製等であればよい。
　＜分散アーム１２＞
　分散アーム１２は、シャーレ１４内の細胞群Ｍにその先端を押し付けて、細胞群において、隣接する細胞間の接着の少なくとも一部を切り離して分散するために用いられる。この分散のプロセスは、一例として、細胞群をより小さなクラスタに分散させることを意図している。ここで、「細胞群をより小さなクラスタに分散させる」とは、細胞群を、構成する細胞の数が細胞群より少ない小細胞集団（クラスタ）に分割することが意図される。他の例として、「細胞群をより小さなクラスタに分散させる」には、１つの細胞群を２以上のクラスタに分割すること、細胞群に含まれる細胞の少なくとも一部が隣接する細胞から離れること等が含まれる。
　また、後述するように、上述した分散のプロセスにおいて、細胞群をなす個々の細胞と、クラスタをなす個々の細胞との対応付けを行う。そのため、「細胞群をより小さなクラスタに分散させる」とは、この対応付けが可能な程度に各細胞や細胞塊を分散させることであり得る。さらに、細胞群が三次元構造体である場合には、上述した分散のプロセスには、三次元構造体を二次元平面上に広げることも含まれ得る。また、上述した分散のプロセスには、細胞群をなす個々の細胞を上下に積み上げ、細胞を三次元的に分散させることも含まれ得る。
　分散アーム１２の先端を押し付ける細胞群Ｍは、予めシャーレ１４内において分散酵素で処理し、細胞群Ｍが分散しやすい状態になっていてもよい。なお、細胞群Ｍを分散させる方法としては、分散アーム１２を用いる構成に限定されず、後述するように、従来公知の他の細胞分散方法を用いてもよい。他の細胞分散方法を用いる場合には、試料調製システム１００は、分散アーム１２を備えていなくてもよい。
　分散アーム１２は、その先端部に、細胞群Ｍの上部からシャーレ１４の底面の方向に細胞群Ｍを押し付ける面を有する。本実施形態においては、分散アーム１２の先端部に凸レンズ１２ａが取り付けられている構成を例として説明する。分散アーム１２は、凸レンズ１２ａをｚ軸方向に移動させることにより、細胞群Ｍの上部からシャーレ１４の底面の方向に細胞群Ｍを押し付け、細胞群Ｍを分散させる。細胞群Ｍが、細胞塊、オルガノイド、又は組織の一部のような三次元構造体である場合、凸レンズ１２ａを押し付けることにより、細胞群Ｍを二次元平面上に分散させることができる。
　凸レンズ１２ａは凸状の曲面（凸部）を有しているので、シャーレ１４に対する凸レンズ１２ａの姿勢が平行な状態からずれた場合であっても、凸レンズ１２ａの端部がシャーレ１４に干渉せず、細胞群Ｍに適切に押し付けることができる。また、凸レンズ１２ａは、凸部の位置に基づき、細胞群Ｍに対して容易に位置合わせすることができる。凸レンズ１２ａは、その凸部の先端（凸レンズ１２ａの最下点）が最初に細胞群Ｍに接するように、細胞群Ｍに押し付けられることが好ましい。
　分散アーム１２を、凸レンズ１２ａをｘ軸方向又はｙ軸方向に移動させることで、細胞群Ｍに適切に押し付け可能なように凸レンズ１２ａを位置合わせしてもよい。また、凸レンズ１２ａのｘ軸方向又はｙ軸方向の大きさが細胞群Ｍに対して小さい場合に、細胞群Ｍの全体を押し付け可能なように細胞群Ｍ上で凸レンズ１２ａをｘ軸方向又はｙ軸方向に移動させてもよい。
　また、シャーレ１４内には、細胞群Ｍと共にビーズ状の固体粒子を含む溶液が収容されているので、凸レンズ１２ａを溶液中においてｚ軸方向に動かすことにより、溶液に流れが生じ、固体粒子が動く。そのため、固体粒子の動きを観察することで、細胞群Ｍに対して凸レンズ１２ａを位置合わせすることができる。一例として、溶液内で凸レンズ１２ａをｚ軸方向に動かすと、シャーレ１４の底面近くのｘｙ平面において、凸レンズ１２ａの最下点を中心として求心的又は遠心的な方向に固体粒子が動く。そして、この固体粒子の動き（溶液の流れ）を観察することにより、凸レンズ１２ａの最下点を同定することができる。また、凸レンズ１２ａが容器の底面に近接したときに観察されるニュートンリング様の像を指標として、凸レンズ１２ａを位置合わせしてもよい。
　分散アーム１２は、手動及び電動のいずれの方法でも凸レンズ１２ａの位置を調整できるように構成されている。なお、電動で分散アーム１２を駆動するために、分散アーム１２は、複数のモータ（図示せず）を備えている。電動で分散アーム１２を駆動する場合、分散アーム１２は、試料調製システム１００の制御部３０が備えているアーム制御部３１により制御される。なお、複数のモータの態様は限定されるものではなく、例えば、ステッピングモータであってもよいし、サーボモータであってもよい。
　凸レンズ１２ａは、細胞群Ｍを押し付ける方向に突出する凸部を有するものであればよく、レンズとして機能するものでなくてもよく、また、凸状の曲面を有していれば、その形状、大きさ及び材質は特に限定されない。凸レンズ１２ａの替わりに、ガラス基板や樹脂基板を用いることもできる。凸レンズ１２ａは、顕微鏡２０からの観察光に対して透光性を有する（本実施形態においては透明な）ガラス製、樹脂製等であればよい。凸レンズ１２ａのｘ軸方向及びｙ軸方向の大きさは、細胞群Ｍの全体をカバーする大きさである（細胞群Ｍよりも大きい）ことが好ましいが、凸レンズ１２ａをｘ軸方向及びｙ軸方向に移動させて押し付けることもできるため、細胞群Ｍより小さくてもよい。
　凸レンズ１２ａの形状は、細胞群Ｍに押し付けた場合に、細胞群Ｍが平行移動しないような形状であることが好ましい。凸レンズ１２ａを細胞群Ｍに押し付けた場合に細胞群Ｍが平行移動してしまうと、細胞群Ｍが顕微鏡２０の視野から外れて追跡（トラッキング）できなくなったり、細胞群Ｍを適切に分散させることができなくなったりし、好ましくない。
　凸レンズ１２ａは、細胞群Ｍを適切に分散させることができるように、シャーレ１４の底面に平行な状態でｚ軸方向に移動し、細胞群Ｍに押し付けることが好ましいが、凸レンズ１２ａが適切な形状であれば、平行度からのずれが許容される。すなわち、凸レンズ１２ａは、平行ではない状態で細胞群Ｍに押し付けた場合でも、細胞群Ｍが顕微鏡２０の視野から外れず、適切に細胞群Ｍを分散可能なように構成されていることが好ましい。このような凸レンズ１２ａの形状を検討すると、以下の通りである。
　シャーレ１４の底面からの凸レンズ１２ａの平行度のずれ（θ）を許容可能な凸レンズ１２ａの曲率半径Ｒは、凸レンズ１２ａの半径ｒとしたとき、
　　Ｒ≦ｒ／ｓｉｎθ・・・（式１）
を満たすことが好ましい。なお、凸レンズ１２ａの半径ｒの上限は、凸レンズ１２ａの周囲の空間（シャーレ１４の大きさ等）に依存する。
　凸レンズ１２ａの半径ｒは、細胞群Ｍの長軸半径Ｌ１よりも大きいことが好ましく、したがって、
　　Ｌ１≦ｒ≦Ｒ・・・（式２）
を満たすことが好ましい。そして、凸レンズ１２ａを細胞群Ｍに押し付けた場合に細胞群Ｍが平行移動することを防ぐためには、半径ｒが一定の値Ｌ２（≧Ｌ１）よりも大きい必要がある（Ｌ２の値は、細胞群Ｍの変形や、細胞群Ｍと凸レンズ１２ａ又はシャーレ１４の底面との摩擦等の影響により変化する）。そのため、半径ｒは、
　　Ｌ１≦Ｌ２≦ｒ≦Ｒ・・・（式３）
を満たすことが好ましい。
　また、凸レンズ１２ａを細胞群Ｍの端部にも適切に押し付け可能な凸レンズ１２ａの形状について検討する。凸レンズ１２ａを細胞群Ｍに押し付けた場合の細胞群Ｍの長軸半径Ｌ３とした場合、曲率半径Ｒの凸レンズ１２ａの最下点と、最下点から長軸半径Ｌ３分だけずれた位置のレンズ表面との間の距離ｄは、
　　ｄ＝Ｒ－ｓｑｒｔ（Ｒ＾２－Ｌ３＾２）・・・（式４）
を満たすことが好ましい。ここで、細胞１個分の高さをｄ０と仮定すると、凸レンズ１２ａの端部であっても細胞に押し付け可能とするためには、ｄはｄ０より小さくすることが好ましい。したがって、式４において、例えば、Ｌ３＝０．１ｍｍ、ｄ０＝０．０１ｍｍのとき、曲率半径Ｒは０．５ｍｍより大きければよい。
　＜分離アーム１３＞
　分離アーム１３は、シャーレ１４内に分散した細胞群Ｍにおいて、細胞間接着を分離するために用いられる。分離アーム１３は、シャーレ１４内の二次元平面上、すなわち、シャーレ１４の底面上に分散した細胞群Ｍにおいて、細胞間接着を分離する。
　分離アーム１３の先端には、ニードル１３ａが取り付けられている。分離アーム１３は、図１のｘ軸方向に回転可能に構成されている。また、分離アーム１３は複数のジョイントを有しており、ジョイントの動きを制御することにより、ニードル１３ａの先端の位置を、ｘ軸方向、ｙ軸方向及びｚ軸方向の各方向に調節可能に構成されている。特に、ニードルの先端の位置をｚ軸方向に上下動させることによって、顕微鏡ステージ２２を動かすことなく、ニードル１３ａの先端をシャーレ１４内に挿入させたり、退避させたりすることができる。
　分離アーム１３は、手動及び電動のいずれの方法でもニードル１３ａの位置を調整できるように構成されている。手動で分離アーム１３を駆動する場合、一例として、油圧マニピュレータを用いる。電動で分離アーム１３を駆動するために、分離アーム１３は、複数のモータ（図示せず）を備えている。電動で分離アーム１３を駆動する場合、分離アーム１３は、試料調製システム１００の制御部３０が備えているアーム制御部３１により制御される。なお、複数のモータの態様は限定されるものではなく、例えば、ステッピングモータであってもよいし、サーボモータであってもよい。
　ニードル１３ａは、先端に向かって先細りするテーパ形状であり、その先端の外径は細胞間に挿入して細胞間接着を分離させることが可能な大きさであればよく、対象となる細胞群の接着状態に応じて適宜設定され得る。ニードル１３ａは、顕微鏡２０からの観察光に対して透光性を有する（本実施形態においては透明な）ガラス製、樹脂製等であればよい。
　（顕微鏡２０）
　顕微鏡２０は、撮像素子２１、顕微鏡ステージ２２、ステージ機構２３、光源２４、及びレンズ２５を備えている。顕微鏡２０は、除振台（図示せず）上に載置されている。
　撮像素子２１は、レンズ２５により結像されたシャーレ１４内の画像を撮像し、該画像を表す画像データを生成する。顕微鏡２０は、細胞の詳細な観察及び解析に好適なスペックを有する顕微鏡であることが好ましい。撮像素子２１により生成された画像データは、記憶装置３００に送られ、格納される。
　撮像素子２１は、細胞群Ｍを分散させるときから、細胞を吸引するまで、シャーレ１４内の画像（顕微鏡画像）を撮像する。撮像素子２１は、細胞群Ｍの分散前、又は、分散を開始すると同時に、シャーレ１４内の画像を撮像してもよい。撮像素子２１は、シャーレ１４内の画像を所定の時間間隔でタイムラプス撮像する。タイムラプス撮像の時間間隔は、シャーレ１４内の細胞群Ｍの位置や状態の変化を追跡可能な値とすればよい。また、撮像素子２１は、シャーレ１４内を動画撮影してもよい。動画のフレームレートは、シャーレ１４内の細胞群Ｍの位置や状態の変化を追跡可能な値とすればよい。撮像素子２１は、シャーレ１４内の画像の二次元画像データ又は三次元画像データを生成する。
　顕微鏡ステージ２２は、シャーレ１４を載置するためのステージである。顕微鏡ステージ２２は、プレート２２ａ及び外枠２２ｂを備えている。また、顕微鏡ステージ２２には、顕微鏡ステージ２２の位置を調整するためのステージ機構２３が設けられている。
　プレート２２ａは、シャーレ１４を載置するための板状部材であり、光源２４からの観察光に対して透光性を有するガラス製であり得る。
　外枠２２ｂは、プレート２２ａを支持するための枠状部材であって、プレート２２ａの外縁を取り囲む形状に整形されている。外枠２２ｂは、図１に模式的に示したステージ機構２３により支持されている。外枠２２ｂの位置は、ステージ機構２３を用いることにより調整することができる。
　ステージ機構２３は、外枠２２ｂをｘ軸方向、ｙ軸方向、及びｚ軸方向の各々に並進させることができ、かつ、外枠２２ｂの主面（プレート２２ａの主面）をｘｙ平面に対して傾斜させることができるように構成されている。
　ステージ機構２３は、手動及び電動のいずれの方法でも外枠２２ｂの位置を調整できるように構成されている。なお、電動でステージ機構２３を駆動するために、ステージ機構２３は、複数のモータを備えている。電動でステージ機構２３を駆動する場合、ステージ機構２３は、試料調製システム１００の制御部３０が備えているステージ制御部３２により制御される。なお、複数のモータの態様は限定されるものではなく、例えば、ステッピングモータであってもよいし、サーボモータであってもよい。
　顕微鏡ステージ２２が上述したように構成されていることによって、顕微鏡ステージ２２上のシャーレ１４内にフォーカスが合うように顕微鏡２０を調整した状態において、シャーレ１４内と顕微鏡２０との相対関係を変化させることなく（すなわちフォーカスが合った状態のまま）、シャーレ１４内の細胞群Ｍから対象となる細胞を採取することができる。また、試料調製ロボット１０を用いて所望の細胞を採取する間、シャーレ１４内にフォーカスがあった状態のまま、所望の細胞をトラッキングすることができる。
　光源２４は、シャーレ１４に対して観察光（照明光、励起光等）を照射する光源である。シャーレ１４内の明視野像を得るためには、対物レンズ２６及び撮像素子２１が顕微鏡ステージ２２の下方に配置されていることに伴い、光源２４は顕微鏡ステージ２２の上方に配置される。この場合、顕微鏡ステージ２２、シャーレ１４、ニードル１１ａ、凸レンズ１２ａ、及びニードル１３ａは、光源２４からの光に対して透光性を有することが好ましい。なお、上述した構成とは反対に、光源２４を顕微鏡ステージ２２の下方に配置し、対物レンズ２６及び撮像素子２１を顕微鏡ステージ２２の上方に配置してもよい。
　シャーレ１４内の蛍光画像を得る場合、一例として、対物レンズ２６及び撮像素子２１を顕微鏡ステージ２２の下方に配置し、光源２４からの励起光をシャーレ１４内の細胞群Ｍの下方又は側方から照射するように構成し得る。また、他の例として、対物レンズ２６及び撮像素子２１を顕微鏡ステージ２２の上方に配置し、光源２４からの励起光をシャーレ１４内の細胞群Ｍの上方又は側方から照射するように構成してもよい。なお、光源２４、対物レンズ２６、及び撮像素子２１を含む光学系の構成はこれらの構成に限定されない。すなわち、上述した励起光の照射方向を実現できる限り、光源２４の位置は限定されない。また、対物レンズ２６が通過した光が撮像素子２１に入射するようになっていれば、撮像素子２１の位置は限定されない。
　レンズ２５は、複数のレンズにより構成されており、そのうち一部のレンズは対物レンズ２６を構成する。レンズ２５は、シャーレ１４内の画像を撮像素子２１の受光面に結像する。
　（制御部３０）
　制御部３０は、アーム制御部（調節機構）３１、ステージ制御部３２、画像データ取得部３３、及び位置同定部（追跡部）３４を備えている。
　アーム制御部３１は、試料調製ロボット１０が備える３つのアームの駆動を制御し、各アームの先端の位置を調整する。特に、アーム制御部３１は、分散アーム１２の凸レンズ１２ａの最下点が、細胞群Ｍの中心近傍に対向する位置になるように、分散アーム１２を駆動して凸レンズ１２ａの位置合わせをしてもよい。また、アーム制御部３１は、凸レンズ１２ａの最下点がシャーレ１４の底面に接触する位置（レンズ高さ０）を表す情報（基準位置）に基づき、凸レンズ１２ａのｚ軸方向の移動を制御してもよい。
　アーム制御部３１は、凸レンズ１２ａをｚ軸方向に移動させて細胞群Ｍに押し付けた後、凸レンズ１２ａをｘ軸方向及びｙ軸方向に移動させてもよい。また、アーム制御部３１は、凸レンズ１２ａをｚ軸方向に振動させてもよいし、ｘ軸方向又はｙ軸方向に振動させてもよい。細胞群Ｍが三次元構造体である場合、アーム制御部３１は、細胞群Ｍがシャーレ１４内の二次元平面上に分散するまで、凸レンズ１２ａを細胞群Ｍに押し付けるように制御することが好ましい。
　アーム制御部３１は、凸レンズ１２ａを細胞群Ｍに押し付けて、細胞群Ｍを分散させた後、凸レンズ１２ａをｚ軸方向に細胞群Ｍから離れる方向に移動させる。このとき、アーム制御部３１は、凸レンズ１２ａをｘ軸方向又はｙ軸方向に細胞群Ｍから離れる方向に移動した後、ｚ軸方向に細胞群Ｍから離れる方向に移動させてもよい。その後、アーム制御部３１は、分離アーム１３を駆動して細胞間接着を分離し、吸引アーム１１を駆動して対象の細胞を吸引する。また、アーム制御部３１は、凸レンズ１２ａを細胞群Ｍに押し付けて、細胞群Ｍを分散させた後、分散した細胞群Ｍにさらに凸レンズ１２ａを押し付け、細胞群Ｍをより細胞数の小さいクラスタに分割するように制御してもよい。
　アーム制御部３１は、凸レンズ１２ａを細胞群Ｍに押し付けた場合や凸レンズ１２ａを細胞群Ｍから離れる方向に移動させた場合に、凸レンズ１２ａの移動に伴い細胞群Ｍが平行移動し、顕微鏡２０の視野から外れてしまわないように制御することが好ましい。すなわち、アーム制御部３１は、細胞群Ｍが平行移動して顕微鏡２０の視野から外れてしまわないような速度で、凸レンズ１２ａを移動させることが好ましい。
　なお、撮像素子２１により細胞群Ｍ中の細胞の追跡画像を取得する観点から、凸レンズ１２ａの移動速度は、撮像素子２１のタイムラプス撮像の間隔又は動画のフレームレートより遅くすることが好ましい。アーム制御部３１は、一例として、凸レンズ１２ａをｚ軸方向に、１秒間に数１μｍ程度移動させる。
　ステージ制御部３２は、顕微鏡ステージ２２のステージ機構２３を制御することによって、プレート２２ａ及び外枠２２ｂの位置、すなわち、シャーレ１４の位置を調整する。ステージ制御部３２は、ステージ機構２３を制御することにより、撮像素子２１に対するシャーレ１４の位置を調整することが可能であると共に、試料調製ロボット１０が備える３つのアームに対するシャーレ１４の位置を調整してもよい。
　なお、試料調製ロボット１０が備える３つのアームの先端と、シャーレ１４との相対位置は、アーム制御部３１及びステージ制御部３２のいずれかにより調整してもよいし、両方により調整してもよい。すなわち、アーム制御部３１が各アームを駆動してシャーレ１４に対する位置を調整してもよいし、ステージ制御部３２が顕微鏡ステージ２２を駆動してシャーレ１４の各アームに対する位置を調整してもよいし、その両方であってもよい。したがって、アーム制御部３１及びステージ制御部３２の両方が、試料調製システム１００の調整機構として機能し得る。
　画像データ取得部３３は、撮像素子２１が生成した画像データを取得し、位置同定部３４及び記憶装置３００へ送る。画像データ取得部３３は、撮像素子２１が画像データを生成する度毎に画像データを取得してもよいし、所定のタイミングで画像データを取得してもよい。
　位置同定部３４は、分散のプロセスにおいて、細胞群Ｍをなす個々の細胞と、隣接する細胞間の接着の少なくとも一部が切り離された細胞群をなす個々の細胞との対応付けを行う。一例として、位置同定部３４は、画像データ取得部３３が取得した画像データを参照して、細胞群Ｍを分散させる前から細胞が採取されるまでの、細胞群Ｍ中の各細胞の位置を同定する。位置同定部３４は、吸引アーム１１により採取された細胞について、細胞群Ｍ中の元の位置を同定し得る。位置同定部３４は、取得した画像データから、細胞群Ｍを分散させるときから細胞群の少なくとも一部を吸引するまでの時系列画像を生成し、画像間において各細胞を対応付け、各時点における各細胞の位置を追跡する。一例として、位置同定部３４は、共焦点顕微鏡から得られる各ピクセル（ｘ、ｙ、ｚ）をスキャンした結果を三次元画像として再構成することにより、各時点における各細胞の位置を追跡する。これにより、各細胞の細胞群Ｍにおける元の位置を同定してもよい。位置同定部３４は、同定した各細胞の位置を表す位置データを記憶装置３００へ送る。
　なお、位置同定部３４は、上述したように分散のプロセス中に撮影された画像を参照する態様以外にも、各細胞の位置を検出するためのシグナルを取得する装置により、分散のプロセス前後の各細胞の位置を対応付けしてもよい。一例として、位置同定部３４は、共焦点顕微鏡から得られる各ピクセルの情報を画像化するのではなく、各ピクセルの情報から各時点における各細胞の位置を算出する。
　（記憶装置３００）
　記憶装置３００は、撮像素子２１により撮像した画像を記憶する。記憶装置３００は、撮像素子２１により生成した、細胞群Ｍを分散させる前から細胞群の少なくとも一部を吸引するまで撮像したシャーレ１４内の画像データを格納する。また、記憶装置３００は、位置同定部３４が同定した位置データを格納してもよい。さらに、記憶装置３００は、アーム制御部３１による調整前の各アームの先端の位置、各アームの先端の移動距離や移動速度等の各アームを制御するための情報を格納してもよい。
　（試料調製方法）
　試料調製方法について説明する。試料調製方法は、一例として、試料調製システム１００を用いた試料調製処理である。図３に示すように、試料調製方法においては、（１）細胞ラベリング、（２）細胞分散酵素処理（分散させる工程）、（３）細胞分散（分散させる工程）、及び（４）一細胞の分離及び採取（採取する工程）を、実行する。試料調製方法においては、上記（２）から（４）までの処理の間、処理を行うシャーレ１４内の画像を取得し（撮像する工程）、取得した画像を参照して、上記（２）から（４）までの、各細胞の位置を同定する。
　（１）細胞ラベリング
　処理の対象となる細胞群Ｍの画像撮影及び追跡を可能とするために、細胞をラベリングする。細胞のラベリング方法としては、細胞の核、細胞膜、細胞内小器官、核膜、細胞質、ＤＮＡ等を染色する方法、細胞質内の酵素の機能を利用して発光させる方法、細胞の自家蛍光を利用する方法、蛍光レポーター遺伝子を導入する方法等が挙げられる。
　図３に示す例では、培地中の細胞群Ｍを取り出し、染色液が入った容器中に移して核及び細胞膜を染色し、洗浄用の培地が入った容器に移して洗浄する。これにより、細胞をラベリングする。
　（２）細胞分散酵素処理
　細胞群Ｍにおける細胞間の接着を弱めるために、細胞分散酵素により細胞群を処理する。細胞分散酵素処理に用いられる酵素として、従来公知の細胞分散酵素を用いることが可能であり、一例として、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、パパイン、ヒアルロニダーゼ、プロテアーゼ、プロナーゼ、アキュターゼ等が挙げられる。また、細胞分散酵素に替えて、キレート剤、細胞間結合を阻害するなどの抗体や低分子化合物等を用いてもよい。キレート剤の例として、Ｃａ２＋に選択的に結合するＥＤＴＡが挙げられる。
　なお、元の細胞群Ｍにおける細胞間接着が弱い場合には、（２）の細胞分散酵素処理は行わず、（３）の細胞分散処理に進んでもよい。また、（２）の細胞分散酵素処理と（３）の細胞分散処理との順を入れ替えて、細胞分散処理された後の細胞群Ｍを細胞分散酵素により処理してもよい。
　図３に示す例では、分散酵素を含む溶液が入ったシャーレ１４内に、染色された細胞群Ｍを移し、所定時間放置して酵素処理する。細胞分散酵素処理中のシャーレ１４内を、撮像素子２１により撮像し、酵素処理中の細胞群Ｍの画像データを取得する。なお、撮像素子２１は、酵素処理の前から細胞群Ｍを撮像することが好ましい。
　（３）細胞分散
　細胞分散酵素により処理した細胞群Ｍを、分散アーム１２の凸レンズ１２ａを用いて分散させる。凸レンズ１２ａを細胞群Ｍの上部に移動させ、シャーレ１４の底面の方向に移動させて、細胞群Ｍに押し付ける。
　図３に示す例では、細胞群Ｍがオルガノイドのような三次元構造体であるため、当該細胞群Ｍが二次元平面上に分散するまで凸レンズ１２ａを押し付ける。細胞群Ｍが二次元平面上に分散した後、凸レンズ１２ａをシャーレ１４の底面に平行な方向にずらしてから、当該底面から離れる方向に移動させる。細胞分散処理中のシャーレ１４内を、撮像素子２１により撮像し、分散処理中の細胞群Ｍの画像データを取得する。
　（４）一細胞の分離及び採取
　分散した細胞群Ｍから、対象となる一細胞を分離し、分離した細胞を採取する。図３に示す例では、二次元平面上に分散した細胞群Ｍから、分離アーム１３のニードル１３ａにより対象となる一つの細胞を切り離して分離する。そして、分離した細胞を吸引アーム１１のニードル１１ａにより吸引することで、対象となる細胞を採取する。一細胞の分離及び採取処理中のシャーレ１４内を、撮像素子２１により撮像し、一細胞の分離及び採取処理中の細胞群Ｍの画像データを取得する。
　試料調製方法によれば、上記（１）～（４）の工程のうち、（２）細胞分散酵素処理、（３）細胞分散、及び（４）一細胞の分離及び採取の処理の間、処理を行うシャーレ１４内の画像を取得し、シャーレ１４内の細胞を追跡する。試料調製方法においては、取得した画像に基づき、細胞群Ｍを分散させるときから一細胞を吸引するまでの時系列画像を生成し、各時点における各細胞の位置を抽出及び追跡することで、各細胞の位置を同定することができる。また、シャーレ１４内の細胞を上記（２）～（４）の処理の間追跡することにより、細胞の形態や時間変化に関する情報を取得することもできる。
　（他の細胞分散処理の例）
　試料調製方法において、細胞分散処理は、分散アーム１２を用いる方法に限定されず、他の細胞分散方法を用いてもよい。他の細胞分散方法としては、従来公知の細胞分散方法を用いることが可能であり、一例として、細胞に振動を与える方法、細胞を加温する方法、分散酵素溶液中に細胞を放置する方法、せん断応力のような溶液の流れを発生させる方法、電場や超音波を発生させる方法等が挙げられる。
　細胞に振動を与える方法の例として、超音波を利用する方法が挙げられる。細胞を加温する方法の例として、細胞膜に熱吸収しやすい材料（金粒子等）を付着させ、電磁波を照射する方法が挙げられる。分散酵素溶液中に細胞を放置する方法について、分散酵素処理した細胞は、時間の経過に伴って酵素反応が進行して細胞の分散が進むため、所望の状態に分散するまで細胞を放置することによって、細胞分散処理することができる。その結果、細胞毎の解析だけでなく、隣接する細胞と組織的に機能するような細胞の解析や、隣接細胞間の相互作用の解析等を行うことができる。
　〔解析装置２００〕
　解析装置２００は、試料調製システム１００において採取した試料を解析する装置である。解析装置２００としては、従来公知の細胞解析装置を用いることができる。解析装置２００における試料解析は、一例として、ＲＮＡ解析、ゲノム解析、タンパク質解析、代謝物解析、増殖能のような機能解析等が挙げられる。試料調製システム１００は、細胞を壊すことなく採取することも可能であるため、解析装置２００において細胞単位の機能解析を行うこともできる。また、試料調製システム１００は、細胞のトラッキングに蛍光タンパク質を用いなくてもよいので、解析装置２００においてヒトの検体の解析も可能である。また、解析装置２００を用いた解析には、細胞群Ｍを分散させた溶液中において、細胞や細胞塊をそのまま継続して観察することが含まれ得る。このような解析には、一例として、細胞や細胞塊の***能、成長スピード、運動能、浸潤能等の解析や、ELISpot assay及びcomet assayが含まれる。さらに、解析装置２００においては、細胞単位の解析だけではなく、膵島のような細胞塊で１つの機能単位とされている試料の解析（細胞塊単位の解析）も行う。
　図１に示す例では、顕微鏡ステージ２０１上に設けられたプレート２０２の各ウエルに、試料調製システム１００の吸引アーム１１により吸引した細胞を吐出することによって、細胞を解析装置２００に搬送する。そして、解析装置２００は、搬送された細胞を各種試料解析に供する。吸引アーム１１からプレート２０２への細胞の搬送は、対物レンズ２０３を有する顕微鏡により観察しながら実行することができる。
　解析装置２００は、試料調製システム１００から解析の対象となる細胞を取得する共に、試料調製システム１００において同定された、細胞群Ｍにおける対象細胞の元の位置に関する情報を取得して、試料解析に利用することができる。そのため、細胞毎の解析だけでなく、隣接する細胞と組織的に機能するような細胞の解析や、隣接細胞間の相互作用の解析等を行うことができる。
　（ソフトウェアによる実現例）
　試料調製システム１００の制御部３０の制御ブロックは、集積回路（ＩＣチップ）等に形成された論理回路（ハードウェア）によって実現してもよいし、ソフトウェアによって実現してもよい。
　後者の場合、試料調製システム１００の制御部３０は、各機能を実現するソフトウェアであるプログラムの命令を実行するコンピュータを備えている。このコンピュータは、例えば１つ以上のプロセッサを備えていると共に、上記プログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を備えている。そして、上記コンピュータにおいて、上記プロセッサが上記プログラムを上記記録媒体から読み取って実行することにより、本発明の目的が達成される。上記プロセッサとしては、例えばＣＰＵ（Central Processing Unit）を用いることができる。上記記録媒体としては、「一時的でない有形の媒体」、例えば、ＲＯＭ（Read Only Memory）等の他、テープ、ディスク、カード、半導体メモリ、プログラマブルな論理回路などを用いることができる。また、上記プログラムを展開するＲＡＭ（Random Access Memory）などをさらに備えていてもよい。また、上記プログラムは、該プログラムを伝送可能な任意の伝送媒体（通信ネットワークや放送波等）を介して上記コンピュータに供給されてもよい。なお、本発明の一態様は、上記プログラムが電子的な伝送によって具現化された、搬送波に埋め込まれたデータ信号の形態でも実現され得る。
　〔まとめ〕
　試料調製システム１００は、複数の細胞が互いに接着した細胞群Ｍを収容し、当該細胞群Ｍを分散させるシャーレ（容器）１４が載置された顕微鏡ステージ２２と、分散した細胞群Ｍから試料を採取する吸引アーム（採取アーム）１１と、細胞群Ｍを分散させるときから試料を採取するまで、シャーレ１４内の顕微鏡画像を撮像する撮像素子２１と、顕微鏡画像を参照して、細胞群Ｍを分散させる前から試料を採取するまでの、前記試料の位置を同定する位置同定部３４を備えている。
　上記の構成によれば、細胞群Ｍを分散させるときから細胞群Ｍから試料を採取するまで、シャーレ１４内の画像を撮像するので、当該画像に基づき細胞群Ｍを分散させるときから試料を採取するまでの時系列画像を生成することができる。そして、生成した時系列画像により、各時点における試料の位置を抽出及び追跡することで、細胞群Ｍにおける試料の元の位置を同定することができる。したがって、細胞群Ｍに含まれる試料の位置情報を取得すると共に、試料を採取することができる。
　また、試料調製システム１００において、細胞群Ｍは三次元構造体であり、吸引アーム１１は、シャーレ１４内の二次元平面上に分散した細胞群Ｍから試料を採取することが好ましい。
　上記の構成によれば、三次元構造体である細胞群Ｍをシャーレ１４内の二次元平面上に分散させて、細胞を採取するので、対象となる細胞を容易に採取することができる。また、三次元構造体の細胞群Ｍを二次元平面上に分散させる間の画像も取得するので、細胞群Ｍの三次元構造における対象細胞の三次元位置情報を取得することができる。
　また、試料調製システム１００は、細胞群Ｍの上部からシャーレ１４の底面の方向に細胞群Ｍを押し付ける面を、その先端に有する分散アーム１２をさらに備えていることが好ましい。
　上記の構成によれば、分散アーム１２の先端の凸レンズ１２ａを細胞群Ｍに押し付けることで、細胞群Ｍをシャーレ１４内に分散させることができる。また、細胞群Ｍが三次元構造体であっても、凸レンズ１２ａを押し付けることで、シャーレ１４内の二次元平面上に分散させることができる。
　また、試料調製システム１００において、分散アーム１２は、その先端に、細胞群Ｍを押し付ける方向に突出する凸部を有していることが好ましい。
　上記の構成によれば、分散アーム１２の先端の凸レンズ１２ａは、凸部を有することにより、適切に細胞群Ｍを押し付けることが可能であり、また、細胞群Ｍに対する位置合わせが容易である。
　また、試料調製システム１００は、細胞群Ｍに対する分散アーム１２の先端の凸レンズ１２ａの位置を調整するアーム制御部（調整機構）３１をさらに備えていることが好ましい。
　上記の構成によれば、アーム制御部３１により細胞群Ｍに対する凸レンズ１２ａの位置を調整することにより、細胞群Ｍに対する凸レンズ１２ａの位置の調整が容易であり、凸レンズ１２ａを適切に細胞群Ｍに押し付けることができる。これにより、細胞群Ｍを適切に分散させることができる。
　また、試料調製システム１００において、細胞群Ｍは、ビーズ状の固体粒子と共にシャーレ１４内に収容されることが好ましい。
　上記の構成によれば、固体粒子の動きによりシャーレ１４内の溶液の流れを観察することができ、溶液の流れを参照することで凸レンズ１２ａを適切に位置合わせすることができる。
　また、試料調製システム１００は、撮像素子２１により撮像した画像を記憶する記憶装置３００をさらに備えていることが好ましい。
　上記の構成によれば、記憶装置３００に格納された画像データから時系列画像を生成して、各時点における各細胞の位置を抽出及び追跡することで、各細胞の位置を同定するために用いることができる。
　また、試料調製システム１００は、分散した細胞群Ｍから試料を分離する分離アーム１３をさらに備え、吸引アーム１１は、分離アーム１３により分離した試料を吸引することが好ましい。
　上記の構成によれば、シャーレ１４内に分散させた細胞群Ｍの細胞間接着が強い場合であっても、分離アーム１３により切り離された細胞を吸引アーム１１により吸引するので、対象となる細胞の採取が容易である。
　試料解析システム１は、上述した何れかの試料調製システム１００と、試料調製システム１００により採取した試料を解析する解析装置２００とを備えている。
　試料解析システム１は、試料調製システム１００において採取した試料を解析装置２００において解析することで、ＲＮＡ解析等の細胞から得られる成分の解析だけでなく、壊すことなく採取された細胞を用いて細胞単位の機能解析も可能である。また、試料調製システム１００において同定された、細胞群Ｍにおける対象細胞の元の位置に関する情報を、解析装置２００における試料解析において参照することもできる。
　試料調製方法は、複数の細胞が互いに接着した細胞群Ｍを分散させる工程と、分散した細胞群Ｍから試料を採取する工程と、分散させる工程から試料を採取する工程までの間の画像を撮像する工程と、撮像した画像を参照して、分散させる工程から試料を採取する工程までの、試料の位置を同定する工程とを包含する。これにより、上述した試料調製システム１００と同様の効果を奏する。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　〔付記事項〕
　本発明を以下のように表現することもできる。
　（付記１）
　本発明の一態様にかかる複数の細胞が互いに接着した細胞群において、隣接する細胞間の接着の少なくとも一部を切り離して分散する、分散のプロセスにおいて、前記細胞群をなす個々の細胞と、前記隣接する細胞間の接着の少なくとも一部が切り離された細胞群をなす個々の細胞との対応付けを行う追跡部を備えた、試料調製システム。
　（付記２）
　前記細胞群は三次元構造体である、付記１に記載の試料調製システム。
　（付記３）
　前記細胞群に押し付ける面を有する先端部が設けられた分散アームを備えている、付記１又は２に記載の試料調製システム。
　（付記４）
　前記分散アームは、前記細胞に押し付ける面に凸部を有する、付記３に記載の試料調製システム。
　（付記５）
　前記細胞群に対する前記分散アームの先端部の位置を調整する調整機構をさらに備えた、付記３又は４に記載の試料調製システム。
　（付記６）
　前記分散のプロセスにおける前記細胞群を観察する顕微鏡をさらに備えた、付記１から５の何れか１項に記載の試料調製システム。
　（付記７）
　前記隣接する細胞間の接着の少なくとも一部が切り離された細胞群から、その一部を採取する採取アームをさらに備えた、付記１から６の何れかに記載の試料調製システム。
　（付記８）
　前記隣接する細胞間の接着の少なくとも一部が切り離された細胞群から、その一部を分離する分離アームをさらに備えた、付記１から７の何れかに記載の試料調製システム。
　（付記９）
　付記１から８の何れかに記載の試料調製システムと、前記試料調製システムにより調製した試料を解析する解析装置とを備えた、試料解析システム。
　（付記１０）
　複数の細胞が互いに接着した細胞群において、隣接する細胞間の接着の少なくとも一部を切り離して分散する工程であって、前記細胞群をなす個々の細胞と、前記隣接する細胞間の接着の少なくとも一部が切り離された細胞群をなす個々の細胞との対応付けを行いながら、前記細胞群を分散する工程を包含する、試料調製方法。
　〔実施例１〕
　三次元サンプル（オルガノイド）の各細胞の位置情報を記録しながら、細胞を分散、追跡、及び採取した。
　（１－１．サンプルの操作に使用する３つのアーム）
　顕微鏡ステージ周囲に３軸（ｘ軸、ｙ軸、及びｚ軸）方向に移動制御可能なアームを３組設置した（吸引アーム、分散アーム、及び分離アーム）。各アームの先端には、（ｉ）吸引・吐出用ポンプ付きガラス管（内径１５０μｍ、ヨダカ技研株式会社、Ａ１５０Ｓ７５２２－６）、（ｉｉ）直径２ｍｍ、曲率半径１ｍｍの凸レンズ（アズワン株式会社、３－６９３２－０１）、及び（ｉｉｉ）細胞分離用ガラスニードル（外径１０μｍ、ヨダカ技研株式会社、Ａ０６Ｓ７５２２－６）を取り付けた。
　（１－２．溶液の準備）
　表１に示す各溶液（サンプル液、染色液、洗浄液、細胞分散液）の入った容器（松浪硝子、Ｄ１１１４０Ｈ）をそれぞれ、顕微鏡ステージ上に配置した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（１－３．凸レンズの基準位置決め）
　顕微鏡ステージを動かして、細胞分散液の入った容器の中心を視野中心に移動し、凸レンズを細胞分散液に浸した。溶液内で凸レンズを上又は下に動かすと、溶液内ポリスチレンビーズが、容器の底面近くのｘｙ平面においてレンズの最下点を中心として求心的又は遠心的な方向に動く。このことから、このビーズの動き（溶液の流れ）の観察により凸レンズの最下点を同定し、凸レンズの最下点が顕微鏡視野の中心にくるようにｘ軸方向及びｙ軸方向の位置を調整した。その後、凸レンズが容器の底に（近）接したときに観察されるニュートンリング様の像を指標とし、凸レンズのｘ軸方向、ｙ軸方向、及びｚ軸方向の位置を微調整した。
　具体的には、溶液中で凸レンズの高さを少しずつ下げていき、ニュートンリング様の像が初めて明瞭に観察される位置（凸レンズの最下点が容器の底に接して、凸レンズの振動等がおさまる位置）を決めた。さらに、観察された像の中心が顕微鏡視野中心にくるように微調整して、凸レンズのｘ軸方向及びｙ軸方向の位置を決めた。このときの凸レンズのｘ軸方向、ｙ軸方向、及びｚ軸方向の位置を凸レンズの基準位置とした。基準位置の決定後に凸レンズを容器外に動かし、サンプルの吸引及び吐出操作や、顕微鏡ステージ移動の妨げにならない待機位置に保持した。
　（１－４．サンプルの染色）
　顕微鏡ステージを動かし、サンプル液内を観察しながら、ガラス管を用いて目的のサンプルを吸引し、染色液の入った容器にサンプルを吐出した後、１５分間室温で染色した。染色後、再度ガラス管を用いてサンプルを吸引し、洗浄液の入った容器にサンプルを吐出して余剰染色液を除いた。その後、共焦点レーザー顕微鏡システム（倒立顕微鏡ＥＣＬＩＰＳＥ　Ｔｉ２－Ｅ、共焦点ユニットＡ１Ｒ　ＨＤ２５、Ｎｉｋｏｎ）を用いて、染色したサンプルの三次元蛍光画像を取得した。取得した、染色直後の細胞核の三次元蛍光画像（ｚ軸間隔：５μｍ、スライス枚数：２０枚）を図４に示す。
　（１－５．細胞分散酵素処理）
　染色したサンプルをガラス管により吸引し、細胞分散液を入れた容器にサンプルを吐出した後、サンプルが視野中心にくるように顕微鏡ステージを移動した。同時に凸レンズを待機位置から動かし、上記１－３．において決定した基準位置から高さ２００μｍの点に静置した。凸レンズの移動完了後すぐに、三次元蛍光タイムラプス撮影を開始し、最初の５分間は１分おきに画像を取得した。その後、さらに２８分後及び４２分後に画像を取得した。取得した、細胞分散酵素処理時間の経過に伴う細胞核の位置変化を図５に示す。
　（１－６．凸レンズによる細胞分散）
　細胞分散酵素処理後、サンプルを明視野観察しながら凸レンズを少しずつ下げ、凸レンズがサンプルに近づき、サンプルの形が変わり始めた位置（高さ６０μｍ）で三次元蛍光画像を取得した。その後、電動マニピュレータのプログラム機能を用いて、「速度１０μｍ／ｓｅｃでｚ方向に＋２μｍ移動し、－３μｍ移動する上下運動を計５回繰り返すことで、元の位置より５μｍ下方に移動させる」操作を繰り返してレンズ位置を少しずつ下げた。このとき、高さ５０、４０、３０、２５、及び２０μｍの位置において、それぞれ三次元蛍光画像を取得した。これにより、三次元サンプル（オルガノイド）を構成する各細胞が、凸レンズの動きにより分散し、二次元平面上に配置されていく様子を記録した。凸レンズによる細胞分散の過程における細胞の位置変化を図６に示す。
　（１－７．凸レンズの移動及び除去）
　分散したサンプル上にある凸レンズを溶液外へ移動した。凸レンズの移動中は、ＣＭＯＳカメラ（Ｚｙｌａ、Ａｎｄｏｒ）により明視野観察像を動画として撮影し、凸レンズの移動に伴う細胞の移動を記録した。このとき、細胞の移動（距離、速度等）が動画で追跡可能な範囲にとどまるよう、凸レンズの移動方向及び移動速度を制御した。具体的には、レンズをｚ軸方向に０．４μｍ／ｓｅｃで１００μｍ上方移動させた後、ｙ軸方向に２０μｍ／ｓｅｃで約２ｍｍ平行移動させ、その後再度ｚ軸方向に２０μｍ／ｓｅｃで上方移動させて液面から引きあげた。レンズの移動に伴う細胞位置の変化を図７に示す。
　（１－８．一細胞の分離及び採取）
　細胞分離用ガラスニードルを操作し、二次元平面に分散したサンプルの細胞塊において、細胞間接着を切断し、各細胞を分離した（図８）。分離した細胞をガラス管により吸引し、ＰＣＲチューブに吐出及び回収した。細胞の分離及び回収の様子は、ＣＭＯＳカメラ（Ｚｙｌａ、Ａｎｄｏｒ）により明視野観察像を動画として撮影及び記録した。細胞分離用ガラスニードルを用いて、サンプルの細胞塊から一細胞を分離する様子を図８に示す。
　（１－９．細胞の追跡）
　上記１－５．～１－８．で取得した時系列画像（動画）の解析を行った。画像統合ソフトウェアＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　Ｃ（Ｎｉｋｏｎ）を使用して、画像処理（Ｄｅｎｏｉｓｅ．ＡＩによるノイズ除去）を行った後、三次元再構成した時系列画像を生成した。生成した時系列画像を逆再生しながら、回収した細胞の各時点における位置を抽出及び追跡し、分散前のサンプルにおける三次元位置を同定した。単離及び採取した細胞の分散過程における三次元位置及び移動軌跡を、図９に示す。図９においては、上記１－５．及び１－６．において記録された各細胞の細胞核（中心付近）のピクセル座標（ｘ、ｙ）及び撮影時のｚ軸方向のスライス番号（ｚ）を、三次元プロットで示した。図９中の各マーカーは、同じと思われる細胞（１２個）の移動点を示し、例として３つの細胞の移動軌跡を実線で示した。
　図９に示すように、サンプルである細胞集団における各細胞について、細胞分散、分離、及び採取する間の各時点の位置情報を取得し、細胞の移動軌跡を追跡可能であることが示された。また、三次元サンプルにおける各細胞の三次元位置についても、好適に同定及び追跡可能であった。
　〔実施例２〕
　三次元サンプル（オルガノイド）の各細胞の位置情報を記録しながら、細胞を分散し、二次元平面上に配置した。本実施例においては、後述するように、吸引アーム及び分散アームを用いて、細胞分散までの処理を実行した。
　（２－１．サンプルの操作に使用する２つのアーム）
　顕微鏡ステージ周囲に３軸（ｘ軸、ｙ軸、及びｚ軸）方向に移動制御可能なアームを２組設置した（吸引アーム、分散アーム）。各アームの先端には、（ｉ）吸引・吐出用ポンプ付きガラス管（内径１５０μｍ、ヨダカ技研株式会社、Ａ１５０Ｓ７５２２－６）、（ｉｉ）直径２ｍｍ、曲率半径１ｍｍの凸レンズ（アズワン株式会社、３－６９３２－０１）を取り付けた。
　（２－２．容器の準備）
　本実施例においては、サンプルの染色用容器及び分散用容器（松浪硝子、Ｄ１４１４００）を、それぞれ、ポリ-Ｌ-リシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ, Ｐ８９２０）でコーティングして用いた。サンプル用容器（松浪硝子、Ｄ１１１４０Ｈ）と合わせて、３つの容器を顕微鏡ステージ上に配置した。
　（２－３．凸レンズの基準位置決め）
　顕微鏡ステージを動かして、分散用容器のウエル中心部を視野中心に移動した。本実施例においては。分散アームを動かし、凸レンズの最下点が顕微鏡視野の中心にくるようにｘ軸方向及びｙ軸方向の位置を調整した。その後、凸レンズが容器の底に（近）接したときに観察されるニュートンリング様の像を指標とし、凸レンズのｘ軸方向、ｙ軸方向、及びｚ軸方向の位置を微調整した。具体的には、分散用容器中に分散液を入れずに凸レンズの位置合わせを行う点以外は、実施例１と同様に凸レンズの位置合わせを行い、基準位置を決定した。
　（２－４．溶液の準備）
　下記の表２に示す各溶液（サンプル液、染色液、洗浄液、細胞分散液Ａ、細胞分散液Ｂ、希釈液）を準備した。サンプル液をサンプル用容器に、染色液と洗浄液を染色用容器のそれぞれ別のウエルに、細胞分散液Ａを分散用容器に入れた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（２－５．サンプルの染色）
　顕微鏡ステージを動かし、サンプル液内を観察しながら、ガラス管を用いて目的のサンプルを吸引し、染色用容器の染色液の入ったウエルにサンプルを吐出した後、２０分間室温で染色した。染色後、再度ガラス管を用いてサンプルを吸引し、洗浄液の入ったウエルにサンプルを吐出して余剰染色液を除いた。その後、共焦点レーザー顕微鏡システム（倒立顕微鏡ＥＣＬＩＰＳＥ　Ｔｉ２－Ｅ、共焦点ユニットＡ１Ｒ　ＨＤ２５、Ｎｉｋｏｎ）を用いて、染色したサンプルの三次元蛍光画像を取得した。取得した、染色直後の細胞核の三次元蛍光画像（ｚ軸間隔：2μｍ、スライス枚数：６０枚、Denoise.aiによるノイズ除去処理済）を図１０に示す。
　（２－６．細胞分散溶液処理）
　本実施例においては、細胞分散液Ｂ及び希釈液を分散用容器に追加しながら、細胞の分散液による処理中の画像を取得した。具体的には、染色したサンプルをガラス管により吸引し、細胞分散液Ａを入れた分散用容器にサンプルを吐出した後、サンプルが視野中心にくるように顕微鏡ステージを移動し、０、１０、及び２５分後に三次元蛍光画像を取得した。２５分後の画像取得の後すぐに、マイクロピペットを用いて、サンプルが動かないよう静かに細胞分散液Ｂを注ぎ入れた。細胞分散液Ｂの追加後、１０、２０、３０、及び４０分経過した時点で三次元蛍光画像を取得した。撮影完了後、マイクロピペットを用いて希釈液を静かに注ぎ入れ、３０分静置した。取得した、細胞分散溶液処理時間の経過に沿った細胞核の位置変化を図１１に示す。
　（２－７．凸レンズによる細胞分散）
　本実施例においては、細胞を二次元平面上に配置させた後、さらに凸レンズにより二次元平面上において細胞を分散させた。
　具体的には、希釈液を追加し静置した後、凸レンズを待機位置から動かし、上記２－３．において決定した基準位置から高さ２００μｍの点に移動させた。サンプルを明視野観察しながら凸レンズを少しずつ下げ、凸レンズがサンプルに近づき、サンプル上部に触れ始めた位置（高さ７５μｍ）で三次元蛍光画像を取得した。その後、電動マニピュレータのプログラム機能を用いて、「速度１０μｍ／ｓｅｃでｚ軸方向に＋２μｍ移動し、－３μｍ移動する上下運動を計５回繰り返すことで、元の位置より５μｍ下方に移動させる」操作を繰り返してレンズ位置を少しずつ下げた。このとき、高さ６０、５０、４０、及び３５μｍの位置において、それぞれ三次元蛍光画像を取得した。
　これにより、三次元サンプル（オルガノイド）を構成する各細胞が、凸レンズの動きにより分散し、二次元平面上に配置されていく様子を記録した。この記録により３次元空間内の位置から２次元平面内の位置に移動中の個々の細胞を追跡した。凸レンズによる細胞分散の過程における細胞の位置変化を図１２に示す。
　さらに、二次元平面内に配置された後における細胞の位置を明視野画像で記録しながら、電動マニピュレータのプログラム機能を用いて、「速度８μｍ／ｓｅｃでｚ軸方向に２μｍの幅で上下運動を繰り返す」操作を行った。この操作と同時に、顕微鏡ステージを動かして、細胞を二次元平面上でさらに分散させた。二次元平面上における分散前後の細胞位置の変化を図１３に示す。
　本発明は、細胞解析に用いることにより、医薬分野等に利用することができる。
　１　　　試料解析システム
　Ｍ　　　細胞群
　１０　　試料調製ロボット
　１１　　吸引アーム（採取アーム）
　１２　　分散アーム
　１２ａ　凸レンズ
　１３　　分離アーム
　１４　　シャーレ（容器）
　２１　　撮像素子
　２２　　顕微鏡ステージ
　３１　　アーム制御部（調節機構）
　３４　　位置同定部（追跡部）
　１００　試料調製システム
　２００　解析装置
　３００　記憶装置

 

Claims (10)

  1. 　複数の細胞が互いに接着した細胞群において、隣接する細胞間の接着の少なくとも一部を切り離して分散する、分散のプロセスにおいて、
    　前記細胞群をなす個々の細胞と、前記隣接する細胞間の接着の少なくとも一部が切り離された細胞群をなす個々の細胞との対応付けを行う追跡部
    を備えた、試料調製システム。
  2. 　前記細胞群は三次元構造体である、請求項１に記載の試料調製システム。
  3. 　前記細胞群に押し付ける面を有する先端部が設けられた分散アームを備えている、請求項１又は２に記載の試料調製システム。
  4. 　前記分散アームは、前記細胞に押し付ける面に凸部を有する、請求項３に記載の試料調製システム。
  5. 　前記細胞群に対する前記分散アームの先端部の位置を調整する調整機構をさらに備えた、請求項３に記載の試料調製システム。
  6. 　前記分散のプロセスにおける前記細胞群を観察する顕微鏡をさらに備えた、
    請求項１又は２に記載の試料調製システム。
  7. 　前記隣接する細胞間の接着の少なくとも一部が切り離された細胞群から、その一部を採取する採取アームをさらに備えた、請求項１又は２に記載の試料調製システム。
  8. 　前記隣接する細胞間の接着の少なくとも一部が切り離された細胞群から、その一部を分離する分離アームをさらに備えた、請求項１又は２に記載の試料調製システム。
  9. 　請求項１又は２に記載の試料調製システムと、
    　前記試料調製システムにより調製した試料を解析する解析装置と
    を備えた、試料解析システム。
  10. 　複数の細胞が互いに接着した細胞群において、隣接する細胞間の接着の少なくとも一部を切り離して分散する工程であって、
    　前記細胞群をなす個々の細胞と、前記隣接する細胞間の接着の少なくとも一部が切り離された細胞群をなす個々の細胞との対応付けを行いながら、前記細胞群を分散する工程
    を包含する、試料調製方法。
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