JP6864287B2 - 細胞質の交換方法、細胞の製造方法、及び装置 - Google Patents

Description

本発明は、細胞質の交換方法、細胞の製造方法、及び装置に関する。

ある細胞の細胞核を別の細胞の細胞質内へ移植したり、元の細胞核と交換したりすることで、細胞の性質を変える方法は、医療や産業に重要な役割を果たしている。

例えば、細胞核を除去した受精卵に、別個体の体細胞由来の核を移植した後、子宮に戻すことでクローン個体を産出する方法や、子宮に戻さず体外で胚盤胞へ発生させて胚性幹細胞 (Embryonic Stem cells: ES細胞) を樹立する体細胞由来胚性幹細胞(nuclear transfer Embryonic stem cells: NtES細胞) 樹立方法などがある。こうして得られたクローン個体やNtES細胞は、畜産や再生医療に発展する基礎研究に寄与している。

細胞の性質を変える技術には、核移植以外にも、センダイウイルス法やプロトプラスト-ポリエチレングリコール法、電気的細胞融合法、電界集中細胞融合法などの細胞融合技
術がある。これは、２つ以上の細胞を融合させ、１つの細胞を形成する技術である。この方法では、細胞融合後の１つの細胞内には２つ以上の細胞に由来する細胞核と細胞質が存在する。

特に、電界集中細胞融合法は、２つの細胞を、細胞核の直径以下の幅や径のスリットや孔 (オリフィス) を介して接触させ、スリットやオリフィスでパルス的に電界を集中させることで、２つの細胞膜の接点で電気的に細胞膜が部分的に破壊され、復元する過程で細胞を融合する方法である（例えば、特許文献１、２参照）。この方法では、オリフィスや流路の最大径や最大幅が細胞核径より小さいことにより、細胞核の混合を防ぐことが可能である（例えば、特許文献１、２参照）。近年、Polydimethyl siloxane (PDMS)を使用して作製された様々な流路を用いて細胞融合法が検討されている。例えば、PDMSで製造された２つの平行流路間をオリフィスのみで繋ぎ、各流路末端に細胞供給口と吸引口をそれぞれ設けた流路を用い、オリフィスで細胞対を形成後、細胞融合させる方法がある。例えば、細胞供給口にJurkat細胞または樹状細胞を導入し、吸引口方向へ流路上で細胞を移動させ、オリフィスでJurkat細胞と樹状細胞を融合させ、Jurkat細胞の細胞質を樹状細胞へ移動させた後、界面活性剤を添加し、Jurkat細胞側の流路に流れを生じさせて両細胞を切り離すことで、細胞質が移動できるようになった（例えば、非特許文献１参照）。

特開2009-178105号公報 特開2007-174901号公報

Cytoplasmic transfer without nuclei mixing between dendritic cells and tumor cells achieved by one to-one electrofusion via micro-orifices in a microfluidic device. 18th International Conference on Miniaturized. Systems for Chemistry and Life Sciences. October 26-30, 2014, San Antonio, Texas, USA

本発明は、細胞質の交換方法、細胞の製造方法、及び細胞質を交換するための装置を提
供することを目的とする。

本発明の一実施態様は、第１の細胞の細胞核を有し、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞の製造方法であって、第１の細胞の細胞質を除去する第１の工程と、第２の細胞の細胞質を、前記第１の細胞へ導入する第２の工程を含む、製造方法である。第１の工程の後で第２の工程が行われてもよい。その場合、第１の工程において、第１の細胞の細胞質が９０％以上除去され、第２の工程において、第２の細胞の細胞質が、９０％以上の細胞質が除去された前記第１の細胞へ導入されてもよい。また、第１の工程と第２の工程が同時に行われてもよい。その場合、第１の細胞の細胞質の４０％〜６０％と、第２の細胞の細胞質の４０％〜６０％とが交換される細胞質交換工程によって、第１の工程と第２の工程が同時に行われてもよく、前記細胞質交換工程が２回以上繰り返されてもよい。前記いずれかの細胞の製造方法において、前記製造された細胞が、９０％以上の第１の細胞の細胞膜と、９０％以上の第２の細胞の細胞質を含んでもよく、前記製造された細胞が、９５％以上の第１の細胞の細胞膜と、９５％以上の第２の細胞の細胞質を含んでもよい。

本発明のさらなる一実施態様は、第１の流路と第２の流路を備え、第１の流路の壁と第２の流路の壁は孔で連通している流路を用いて、第１の細胞の細胞核を有し、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞の製造方法であって、第１の流路において第１の細胞を、第２の流路において中間体を、前記孔に誘導する第１の工程と、誘電泳動力により、前記孔を介して、第１の細胞と中間体との第１の対を形成させる第２の工程と、第１の細胞と中間体とを融合する第３の工程と、第１の細胞の細胞質を中間体へ移動させる第４の工程と、第１の細胞と中間体とを切り離す第５の工程と、第２の流路において第２の細胞を前記孔に誘導する第６の工程と、誘電泳動力により、前記孔を介して、第１の細胞と第２の細胞の第２の対を形成させる第７の工程と、第１の細胞と第２の細胞とを融合する第８の工程と、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ移動させる第９の工程と、第１の細胞と第２の細胞とを切り離す第１０の工程と、を含む細胞の製造方法である。第４の工程と、第９の工程とにおいて、第１の流路と第２の流路の流速差を利用して細胞質を移動させてもよい。第５の工程と、第１０の工程とにおいて、第１の流路と第２の流路の流速差を利用して細胞を切り離してもよい。第１の工程及び第６の工程において、第１の吸引口からポンプで吸引することによって細胞を前記孔へ誘導してもよい。第２の工程と第７の工程において、交流電界中の誘電泳動力により前記対を形成させてもよい。第３の工程と第８の工程において、前記対に電圧を印加することで融合させてもよい。

本発明のさらなる一実施態様は、第１の流路と第２の流路を備え、第１の流路の壁と第２の流路の壁は孔で連通している流路を用いて、第１の細胞の細胞核を有し、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞の製造方法であって、第１の流路において第１の細胞を、第２の流路において中間細胞を、前記孔に誘導する第１の工程と、誘電泳動力により、前記孔を介して、第１の細胞と中間細胞との第１の細胞対を形成させる第２の工程と、第１の細胞と中間細胞とを細胞融合する第３の工程と、第１の細胞と中間細胞とを切り離す第５の工程と、第２の流路において新たな中間細胞を、前記孔に誘導する第１１の工程と、誘電泳動力により、前記孔を介して、第１の細胞と新たな中間細胞との新たな第１の細胞対を形成させる第１２の工程と、第１の細胞と新たな中間細胞とを細胞融合する第１３の工程と、第１の細胞と新たな中間細胞とを切り離す第１４の工程と、を含み、前記中間細胞として第２の細胞を用いる、細胞の製造方法である。第１１の工程から第１４の工程までがさらに１回以上繰り返されてもよい。前記いずれかの細胞の製造方法において、第４の工程及び第９の工程において、それぞれ第３の吸引口及び第２の吸引口から、ポンプで流速差発生部を経由して吸引することによって細胞質を移動させてもよい。第５の工程において、第１の細胞を誘電泳動力によって前記孔で保持しながら、第３の吸引口から、ポンプで流速差発生部を経由して吸引することによって第１の細胞から中間細胞が切り離されてもよい。前記孔の最大幅または最大径は第１の細胞の核の径及び第２の細胞の核の径より小さくてもよい。前記孔の最大幅または最大径は６μｍ以下であってもよい。前記流速差は、細胞質が流入する側の細胞側の流路内の流速が、細胞質が流出する細胞側の流路内の流速より速くてもよい。第１の流路及び第２の流路が実質的に平行であってもよい。前記第１の細胞は体細胞であり、前記第２の細胞は幹細胞であってもよい。前記幹細胞は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、肝幹細胞、生殖幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、骨格筋幹細胞からなる群から選択されてもよく、前記体性細胞は、線維芽細胞または血球細胞であってもよい。

本発明のさらなる一実施態様は、細胞の細胞質を交換するための装置であって、第１の流路及び第２の流路と、第１の流路及び第２の流路のそれぞれに接続する細胞供給部と、第１の流路の壁と第２の流路の壁との間に設けられた孔と、孔を挟んで設けられた電極と、第１の流路及び第２の流路の流速を調節する流速調節部と、前記流速調節部に設けられた吸引口と、各吸引口に設けられたポンプと、直流交流信号発生装置と、を備えた装置である。前記孔の最大幅または最大径は、前記細胞の細胞核の径よりも小さくてもよい。前記孔の最大幅または最大径は６μｍ以下であってもよい。前記孔と前記吸引口間に圧力緩衝部が設けられてもよい。画像認識装置が設けられた顕微鏡を備え、前記画像認識装置と前記ポンプに、流速制御装置が設けられてもよい。第１の流路及び第２の流路が実質的に平行であってもよい。

本発明のさらなる一実施態様は、第１の細胞の細胞質を除去する第１の工程と、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入する第２の工程を含む、細胞質の交換方法であって、第１の工程の後で第２の工程が行われる、第１の細胞の細胞質の交換方法である。

本発明のさらなる一実施態様は、第１の細胞の細胞質を除去する第１の工程と、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入する第２の工程を含む、細胞質の交換方法であって、第１の細胞の細胞質の４０％〜６０％と、第２の細胞の細胞質の４０％〜６０％とが交換される第１の細胞質交換工程によって、第１の工程と第２の工程が同時に行われ、細胞質交換工程後の第１の細胞の細胞質の４０％〜６０％と、新たな第２の細胞の細胞質の４０％〜６０％とが交換される第２の細胞質交換工程がさらに行われる、第１の細胞の細胞質の交換方法である。第２の細胞質交換工程がさらに１回以上行われてもよい。

本発明によって、細胞質の交換方法、細胞の製造方法、及び細胞質を交換するための装置を提供することができるようになった。

本発明の一実施形態に係る細胞の製造方法を示した模式図である。 本発明の一実施形態に係る細胞質を交換するための装置を示した模式図である。 本発明の一実施形態に係る細胞質を交換するための装置を示した模式図である。 本発明の一実施例において、細胞質を交換する工程の顕微鏡写真である。

以下、実施例を挙げながら、本発明の実施形態を詳細に述べる。

本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下
に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

＝＝細胞質の交換方法＝＝
＜実施形態Ｉ＞
本発明の一実施形態に係る第１の細胞の細胞質の交換方法は、第１の細胞の細胞質を除去する第１の工程と、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入する第２の工程を含む、細胞質の交換方法であって、
（１）第１の工程の後で第２の工程が行われる、または
（２）第１の細胞の細胞質の４０％〜６０％と、第２の細胞の細胞質の４０％〜６０％とが交換される第１の細胞質交換工程によって、第１の工程と第２の工程が同時に行われる、方法である。

（２）の場合、細胞質交換工程後の第１の細胞の細胞質の４０％〜６０％と、新たな第２の細胞の細胞質の４０％〜６０％とが交換される第２の細胞質交換工程がさらに行われてもよく、この第２の細胞質交換工程がさらに１回以上行われてもよい。この工程を繰り返すことによって、第１の細胞の細胞質が第２の細胞の細胞質に交換される割合が高くなる。本発明の一実施形態に係る細胞質の交換方法を用いて、第１の細胞の細胞核を有し、第２の細胞の細胞核を有さず、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞を製造することができる。こうして製造された細胞において、第１の細胞の細胞膜の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。また、第２の細胞の細胞質の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。

以下、上記交換方法を用いて、細胞を製造する一実施態様を詳細に説明する。

＝＝細胞の製造方法＝＝
ここでは、図１を用いて、上記交換方法（１）を用いて行われる、本発明の一実施形態に係る細胞の製造方法を具体的に説明するが、本発明は本実施形態に限定されない。本実施形態では、第１の流路と第２の流路を備え、第１の流路の壁と第２の流路の壁は孔で連通している流路を用い、第１の細胞の細胞核を有し、第２の細胞の細胞核を有さず、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞を製造する。

第１の工程として、まず、第１の流路にあって、残したい細胞核１０１０と、除去したい細胞質１０２０と、細胞膜１０２５と、を有する第１の細胞１０３０と、第２の流路にある中間体１０４０を、流路中の溶液の流れ１０５０によって、両方の流路の壁を貫通して設けられた孔１０８０の入り口を構成するそれぞれの孔近傍に誘導する（図１−１）。必要に応じて交流１０６０電界を発生させ、その中で細胞を誘導してもよい。流路の壁は絶縁体１０７０で構成されるのが好ましい。第１の流路内の流れ１０５０と第２の流路内の流れ１０５０の方向は特に限定されないが、実質的に平行であることが好ましい。溶液は、細胞を生きた状態で操作できるものであれば特に限定されず、例えば生理食塩水や細胞培養用培地などを例示できる。中間体は特に限定されず、対になった細胞と融合して細胞の細胞質を受け入れられるものであればよいが、具体的な例としては、細胞やリポソームが例示できる。細胞である場合、第１の細胞または第２の細胞と同じ種類であっても異
なる種類であってもよい。孔１０８０の形状は特に限定されず、スリット上、円状、長円上であってもよく、壁の厚みと同じ深さを有するため、厚い壁の場合は流路状であってもよい。

第２の工程として、誘電泳動力により、孔１０８０を挟んで第１の細胞１０３０と中間体１０４０の第１の対を形成させる（図１−２）。誘電泳動力は、交流１０６０印加による電界集中により流路の壁で生じる。

第３の工程として、第１の対に電圧を印加１０９０することで、第１の細胞１０３０と中間体１０４０とを融合して第１の融合細胞１１００を作製する (図１−３)。この時印
加する電圧は、従来細胞融合に用いられることが知られている強さとすることができるが、０．１〜５０Ｖであることが好ましく、０．５Ｖ〜２０Ｖであることがより好ましく、１〜１０Ｖであることがさらに好ましく、１〜３Ｖであることがさらに好ましく、約２Ｖであることがさらに好ましい。また印加する時間は、特に限定されないが、１μｓｅｃ〜１ｍｓｅｃであることが好ましく、１μｓｅｃ〜５００μｓｅｃであることがより好ましく、１μｓｅｃ〜１００μｓｅｃであることがさらに好ましいが、可能な限り短い時間であることがより好ましい。中間体１０４０が細胞である場合、本工程では、細胞融合後、第１の細胞１０３０と中間体１０４０の細胞質がお互いに混入する。

第４の工程として、第１の細胞１０３０の細胞質１０２０を中間体１０４０へ移動させる（図１−４）。この細胞質１０２０の移動は、例えば、第２の流路内の流れ１１２０の速度を、第１の流路内の流れ１１１０の速度より大きくし、その流速差を利用することにより行うことができる。このとき、第１の流路内の流れ１１１０の流速は０、つまり第１の流路内に流れのない状態であってもよい。第１の流路内の流れ１１１０と第２の流路内の流れ１１２０の方向は特に限定されないが、実質的に平行であることが好ましい。ここで、孔１０８０の最大幅または最大径を、第１の細胞の核の径より小さくしておくことにより、第１の細胞１０３０の細胞核１０１０は、孔１０８０を通過できずに第１の流路内に残る。具体的には、孔１０８０の最大幅または最大径は、第１の細胞１０３０の種類によって適宜調整すればよいが、２０μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以下であることがより好ましく、６μｍ以下であることがさらに好ましい。なお、移動させる細胞質の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。

第５の工程として、第１の細胞１０３０と中間体１０４を切り離す（図１−５）。第１の細胞１０３５を孔１０８０の入り口で保持しながら、細胞質１０２０を受け取った中間体１０４５を切り離すのが好ましい。この切り離しは、例えば、第２の流路内の流れ１１２０の速度を、第１の流路内の流れ１１１０の速度より大きくし、その流速差を利用することにより行うことができる。第１の流路内の流れ１１１０の流速は０、つまり第１の流路内に流れのない状態であってもよい。

このように、本実施形態では、第１の工程から第５の工程までの工程において、中間体を用いることにより、第１の細胞の細胞質を除去することができる。

第６の工程として、第１の細胞１０３０に移植したい細胞質１１３０と、必要のない細胞核１１４０を有する第２の細胞１１５０を、流れ１０５０により、孔１０８０の入り口を構成する、第２の流路側の孔近傍に誘導する (図１−６)。必要に応じて交流１０６０
電界を発生させ、その中で細胞を誘導してもよい。

第７の工程として、誘電泳動力により、孔１０８０を挟んで第１の細胞１０３０と第２の細胞１１５０の第２の対を形成させる (図１−７)。誘電泳動力は、交流１０６０印加
による電界集中により流路の壁で生じる。

第８の工程として、第２の対に電圧を印加１０９０することで第１の細胞１０３０と第２の細胞１１５０を融合して第２の融合細胞１１６０を作製する (図１−８)。この時印
加する電圧は、従来細胞融合に用いられることが知られている強さであればよいが、１〜１０Ｖであることが好ましく、２Ｖであることがさらに好ましい。また印加する時間は、１００μｓｅｃであることが好ましく、１００μｓｅｃ以下で可能な限り短い時間であることがさらに好ましい。

第９の工程として、第２の細胞１１５０の細胞質１１３０を第１の細胞１０３５へ移動させる (図１−９)。この移動は、例えば、第１の流路内の流れ１１１０の速度を、第２
の流路内の流れ１１２０の速度より大きくし、その流速差を利用することにより行うことができる。第１の流路内の流れ１１２０の流速は０、つまり第２の流路内に流れのない状態であってもよい。ここで、孔１０８０の最大幅または最大径を、第２の細胞の核の径より小さくしておくことにより、第２の細胞１１５０の細胞核１１４０は、孔１０８０を通過できずに第２の流路内に残る。具体的には、孔１０８０の最大幅または最大径は、第２の細胞１１５０の種類によって適宜調整すればよいが、２０μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以下であることがより好ましく、６μｍ以下であることがさらに好ましい。なお、移動させる細胞質の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。

第１０の工程として、第１の細胞１０３０を、第２の細胞１１５０から切り離す (図１−１０)。こうして、第１の細胞１０３０の細胞質１０２０を、第２の細胞１１５０の細
胞質１１３０に交換することによって、第１の細胞１０３０の細胞核１０１０を有し、第２の細胞１１５０の細胞核１１４０を有さず、第１の細胞１０３０の細胞膜と第２の細胞１１５０の細胞質１１３０とを含む細胞１１７０の製造が完了する。

このように、第６の工程から第１０の工程までの工程によって、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入することができる。

本方法において、第１の細胞１０３０と第２の細胞１１５０の細胞種は特に限定されないが、第１の細胞１０３０は体細胞であることが好ましく、線維芽細胞または血球細胞であることがさらに好ましい。また、第２の細胞１１５０は幹細胞であることが好ましく、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、肝幹細胞、生殖幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、骨格筋幹細胞からなる群から選択されるのがさらに好ましい。第１の細胞１０３０は体細胞とし、第２の細胞１１５０を幹細胞とすることにより、例えば、幹細胞の細胞核を体細胞の細胞核に交換したことと同様の効果が得られる。

＜実施形態ＩＩ＞
ここでは、上記交換方法（２）を用いて行われる、本発明の一実施形態に係る細胞の製造方法を具体的に説明するが、本発明は本実施形態に限定されない。本実施形態では、第１の流路と第２の流路を備え、第１の流路の壁と第２の流路の壁は孔で連通している流路を用い、第１の細胞の細胞核を有し、第２の細胞の細胞核を有さず、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞を製造する。第１の工程から第３の工程は、実施形態Ｉに準じるが、中間体として、第２の細胞を用いる。第３の工程終了後、第１の細胞と第２の細胞の細胞質がお互いに混入する。このように、本実施形態では、第１の細胞の細胞
質を除去する第１の工程と、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入する第２の工程が同時に行われる。この際に、第１の対を融合させたままで、長時間放置すると、第１の細胞と第２の細胞の間で細胞質が均一になるが、交換される細胞質の割合は特に限定されず、第１の細胞の細胞質の１０％〜２５％と、第２の細胞の細胞質の１０％〜２５％とが交換されることが好ましく、第１の細胞の細胞質の２５％〜４０％と、第２の細胞の細胞質の２５％〜４０％とが交換されることがより好ましく、第１の細胞の細胞質の４０％〜６０％と、第２の細胞の細胞質の４０％〜６０％とが交換されることがさらに好ましい。そして、その後、第１の細胞と中間体とを切り離す第５の工程を行う。第５の工程の詳細は、実施形態ＩＩに準じる。

さらに、第２の流路において新たな第２の細胞を、前記孔に誘導する第１１の工程と、誘電泳動力により、前記孔を介して、第１の細胞と第２の細胞との新たな第１の対を形成させる第１２の工程と、第１の細胞と第２の細胞とを融合する第１３の工程と、第１の細胞と第２の細胞とを切り離す第１４の工程と、を行ってもよい。第１１〜１４の工程の詳細は、実施形態Ｉの第１〜３、５の工程に準じる。

この後、第１１〜１４の工程をさらに１回以上、繰り返してもよいが、１回繰り返すことが好ましく、２回以上繰り返すことがより好ましく、５回以上繰り返すことがさらに好ましい。それによって、交換される細胞質の割合を高めることができるようになる。

＝＝細胞質を交換するための装置＝＝
以下、上記の方法を実行することができる本発明の装置の一実施態様を、図２（１）を用いて詳細に説明する。本発明の装置は、細胞の細胞質を交換するための装置であって、第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０と、第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０のそれぞれ接続する第１の細胞供給部２０１０と第２の細胞供給部２０２０と、第１の流路の壁と第２の流路の壁との間に設けられた孔２０５０と、孔２０５０を挟んで設けられた電極２０８０と、第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０の流速を調節する流速調節部２０６０と、流速調節部２０６０に設けられた吸引路２０７０と、各吸引口２０７１，２０７２，２０７３に設けられたポンプ２２１１，２２１２，２２１３と、直流交流信号発生装置２０９０と、顕微鏡２１００とを備える。第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０は、実質的に平行に走っていることが好ましい。

＜流路内を流れる溶液の流速の調節＞
図２（２）（３）に、流速調節部２０６０の拡大図を示し、第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０内の溶液の流速の調節方法を以下で説明する。

流路内を流れる溶液は、流速調節部２０６０によって、各吸引口２０７１，２０７２，２０７３への接続が調節される。そして、各吸引口２０７１，２０７２，２０７３に設けられたポンプ２２１１，２２１２，２２１３によって、独立に吸引される。吸引口２０７２，２０７３への溶液の流れを止め、吸引口２０７１で吸引すると、第１の流路２０３０と第２の流路２０４０の流れの方向と流速は同じになる。吸引口２０７１，２０７３への溶液の流れを止め、吸引口２０７２から吸引すると、流れの方向は同じだが、第２の流路２０４０の流れは流路壁とぶつかる事でわずかに流速は減少し、第１の流路２０３０の流れと比較して、流速差が生じる。逆に、吸引口２０７１，２０７２への溶液の流れを止め、吸引口２０７３から吸引すると、流れの方向は同じだが、第１の流路２０３０の流れは流路壁とぶつかる事でわずかに流速は減少し、第２の流路２０４０の流れと比較して、流速差が生じる。ここで、流速調節部２０６０に弁（例えば電磁弁など）を設けることによって、さらに流速の細かな制御が可能になる。

＜追加の実施形態 弁の構成＞
弁の構成例を図２（１）を参照しながら、以下に説明する。

まず、弁を流速調節部２０６０内で、各吸引口２０７１、２０７２、２０７３に繋がる吸引路２０７０に設置することができる。それによって、各吸引口２０７１、２０７２、２０７３に向かう溶液の流れを独立に調節できるようになる。

また、他の実施形態として、吸引路２０７０を流速調節部２０６０の下流で第１の吸引口２０７１の上流の吸引路２０７０に接続させた、新たな吸引路２０７４（２０７０）（図２（１）では点線で示した。）を設け、ポンプ２２１２，２２１３を除去する。この場合この実施例では、吸引口２０７１に接続されたポンプ２２１１のみで、第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０内の溶液の流速を制御することが可能となる。

＜追加の実施形態 その他＞
孔２０５０は、図１で詳細に説明した物に準じる。

図３（１）に示すように、孔２０５０と吸引口２０７１、２０７２、２０７３間に圧力緩衝部２１１０を設けてもよい。これによって、吸引による急激な流速変化を緩和することができ、安定的に細胞質の移動と細胞の分離が可能になる。

図３（２）に示すように、顕微鏡２１００に画像認識部２２００を設け、画像認識部２２００とポンプ２２１０に、流速制御装置２２２０を設けてもよい。これによって、効率的に細胞質の移動と細胞の分離が可能になる。この流速制御装置２２２０は、上述した弁（電磁弁）弁を調節してもよい。

＝＝細胞質を交換するための装置の使用方法＝＝
以下、本発明の一実施態様にかかる上記装置を用い、細胞質を交換するための使用方法と、それによる新規細胞の製造方法を詳細に説明する。

第１の工程として、第２の吸引口２０７２及び第３の吸引口２０７３を閉止し、第１の細胞供給部２０１０内の第１の細胞と、第２の細胞供給部２０２０内の中間体を、第１の吸引口２０７１からポンプ２２１１で吸引することで、細胞を孔２０５０の入り口を構成するそれぞれの孔近傍へ誘導する。

第２の工程として、直流交流信号発生制御装置２０９０で発生させた交流電界中の誘電泳動力により、孔２０５０を介して、第１の細胞と中間体との第１の対を形成させる。

第３の工程として、直流交流信号発生制御装置２０９０で、第１の対へ電圧を印加することで第１の細胞と中間体とを融合する。

第４の工程として、細胞融合の完了後、第１の吸引口２０７１及び第２の吸引口２０７２を閉止し、ポンプ２２１３で第３の吸引口２０７３から吸引して、第１の細胞の細胞質を中間細胞へ移動させる。

第５の工程として、直流交流信号発生制御装置２０９０で発生させた誘電泳動力で第１の細胞を孔２０５０で保持しながら、第１の吸引口２０７１及び第２の吸引口２０７２を閉止し、ポンプ２２１３で第３の吸引口２０７３から吸引して、第１の細胞から中間細胞を切り離す。

第６の工程として、第２の吸引口２０７２及び第３の吸引口２０７３を閉止し、第１の吸引口２０７１からポンプ２２１１で吸引することで、第２の細胞供給部２０２０内の第
２の細胞を孔２０５０の入り口を構成する孔近傍へ誘導する。ここで、第３の細胞供給部を設け、第２の細胞供給部２０２０を中間体用にし、第３の細胞供給部を第２の細胞用にしてもよい。

第７の工程として、直流交流信号発生制御装置２０９０で発生させた交流電界中の誘電泳動力により、孔２０５０を介して、第１の細胞と第２の細胞の第２の対を形成させる。

第８の工程として、直流交流信号発生制御装置２０９０で、第２の対へ電圧を印加することで、第１の細胞と第２の細胞を融合する。

第９の工程として、細胞融合の完了後、第１の吸引口２０７１及び第３の吸引口２０７３を閉止し、ポンプ２２１２で、第２の吸引口２０７２から吸引して、第１の細胞へ第２の細胞の細胞質を移動させる。

第１０の工程として、第１の吸引口２０７１及び第３の吸引口２０７３を閉止し、ポンプ２２１２で、第２の吸引口２０７２から吸引して、第１の細胞を第２の細胞から切り離す。

装置構成において述べたように、顕微鏡２１００に画像認識部２２００を設け、流速調節部２０６０に弁を設け、細胞を画像認識部２２００で分析しながら、流速制御装置２２２０によって弁及びポンプを調節することによって溶液の流速を調節することで、効率よく本法を実施することが可能になる。

このように、本発明は、２つの流路における流速差を制御することで、細胞と中間体あるいは細胞同士の融合後の細胞質の移動方向を制御でき、かつ、界面活性剤を使わず細胞の分離・除去が可能となるため、従来の電界集中細胞融合法では達成されなかった細胞核移植が可能になる。

（実施例１）
本実施例では、Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞質を、細胞質を除去した別のＪｕｒｋａｔ細胞内へ移植する。用いた装置は、以下の通りである。

・ファンクションジェネレーター
交流印加条件：周波数１ ＭＨｚ、電圧５ Ｖ
パルス印加条件：時間１００ μｓ、電圧１０ Ｖ
・デジタルオシロスコープ
・バイポーラ電力増幅装置
・位相差・蛍光顕微鏡

また、蛍光染色試薬は、以下のものを用いた。

・使用蛍光染色試薬：
・Calcein, AM - Special Packaging (Excitation/Emission (nm): 494/514 C3100MP、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ・米国)、細胞質を緑色染
色する
・CellTrace^TM Calcein Red-Orange, AM - Special Packaging (Excitation/Emission (nm): 577/590、C34851、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)、細胞質を赤色染色する
・Cellstain^R Hoechst 33342 solution (Excitation/Emission (nm): 350/461、346-0795
1、(株)同仁化学研究所、東京・日本)、細胞核を青色染色する
Ｊｕｒｋａｔ細胞懸濁液（１ｘ１０^６個／ｍＬ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）１ｍＬずつ２本の１５ｍＬ遠心管に加え、一方の遠心管ＡにCalcein AM １μＬ、もう一方の遠心管ＢにはCalcein red-orange １１μＬを添加し、その後Hoechst33342 １μＬを両方の遠心管に加えて、３７℃で３分間インキュベーションして細胞質と細胞核を染色した。余分な染色試薬を除くため、遠心管を６００ｒｐｍで２分間遠心した後、上清を除去した。

沈殿した細胞に対して、細胞融合用緩衝液（２００ｍＭソルビトール、１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン）１ｍＬを加えて混合した。再び遠心管を上記と同条件で遠心して、生細胞を沈殿させ、上清を１ｍＬ除去した。この細胞洗浄工程をさらに２回繰り返した。最後に、細胞融合緩衝液を１５０μＬ加えて混合して、細胞融合用細胞懸濁液とした。以下、図４の写真を参考にしながら、各工程を説明する。

＜細胞融合１回目＞
図２に示したようなＰＤＭＳデバイス上の細胞供給口Ａへ遠心管Ａの細胞懸濁液（細胞Ａ含有）を加え、細胞供給口であるサンプリングポートＢへ遠心管Ｂの細胞懸濁液（細胞Ｂ含有）を加えた。ピペットマン１で細胞懸濁液を吸引し、各細胞を細胞融合路上へ導いた（図４−１）。交流印加による誘電泳動力により細胞Ａと細胞Ｂを細胞融合路内へ導き、細胞融合路を挟んで細胞ＡとＢの対を形成させた（図４−２〜４、２：位相差；３〜４：蛍光視野）。パルスを１回以上印加しながら、パルス印加過程を位相差と蛍光視野で観察して、細胞融合による蛍光色素の移動を確認した（図４−５）。

＜細胞核の回収＞
交流印加を停止して、ピペットマン２で吸引することで、細胞Ｂの細胞質を細胞Ａへ移動させた（図４−６〜７、６：蛍光視野；７：位相差）。引き続きピペットマン２で吸引することで、細胞Ｂから細胞Ａを分離した（図４−８〜９）。細胞Ｂを細胞融合路で保持するため再び交流を印加することで、細胞Ｂの核を孔に維持した（図４−１０）。

＜細胞融合２回目＞
再びピペットマン１で細胞懸濁液を吸引し、別の細胞Ａを細胞融合路上へ導いた（図４−１１〜１２）。交流印加による誘電泳動力により細胞Ａを細胞融合路内へ導いて、細胞融合路を挟んで細胞ＡとＢの対を形成させた（図４−１３〜１５、１３：位相差；１４〜１５：蛍光視野）。パルスを１回以上印加しながら、パルス印加過程を位相差と蛍光視野で観察し、細胞融合による蛍光色素の移動を確認した（図４−１６）。

＜細胞質の移植＞
交流印加を停止して、ピペットマン３で吸引することで、細胞Ｂへ細胞Ａの細胞質を移動させた（図４−１７〜１８、１７：位相差；１８：蛍光視野）。引き続きピペットマン３で吸引することで、細胞Ｂを細胞Ａから分離した（図４−１９〜２０）。これにより、細胞Ｂの細胞核は、細胞質との関係において、細胞Ａの細胞質内へ移植したのと同様の効果が得られた。

（実施例２）
本実施例２では、ｉＰＳ細胞の細胞質を、細胞質を除去した線維芽細胞へ移植した。すなわち、ｉＰＳ細胞(Calcein AMとHoechst33342で染色)を実施例１の細胞Ａの代わりに、線維芽細胞 (Calcein red-orangeとHoechs33342で染色)を実施例１の細胞Ｂの代わりに用い、同じ実験条件で、実験を行ったところ、実験１と同様に、ｉＰＳ細胞の細胞質を、細胞質を除去した線維芽細胞へ移植することができ、ｉＰＳ細胞の細胞核を線維芽細胞の細胞質に移植したのと同様の効果が得られた。

１０１０ 第１の細胞の細胞核
１０２０ 第１の細胞の細胞質
１０２５ 第１の細胞の細胞膜
１０３０ 第１の細胞
１０３５ 操作後の第１の細胞
１０４０ 中間体
１０４５ 操作後の中間体側
１０５０ 溶液の流れ（第１の流路と第２の流路で流速が同じ場合）
１０６０ 交流
１０７０ 絶縁体の壁
１０８０ 孔
１０９０ 電圧印加
１１００ 第１の融合細胞
１１１０ 第１の流路における溶液の流れ
１１２０ 第２の流路における溶液の流れ
１１３０ 第２の細胞の細胞質
１１４０ 第２の細胞の細胞核
１１５０ 第２の細胞
１１６０ 第２の融合細胞
１１７０ 細胞質を交換した細胞
２０１０ 第１の細胞の細胞供給部
２０２０ 第２の細胞及び中間体の細胞供給部
２０３０ 第１の流路
２０４０ 第２の流路
２０５０ 孔
２０６０ 流速調節部
２０７０ 吸引路
２０７１ 第１の吸引口
２０７２ 第２の吸引口
２０７３ 第３の吸引口
２０８０ 電極
２０９０ 直流交流信号発生制御装置
２１００ 顕微鏡
２１１０ 圧力緩衝部
２２００ 画像認識部
２２１０ ポンプ
２２１１ ポンプ
２２１２ ポンプ
２２１３ ポンプ
２２２０ 流速制御装置

Claims (16)

1. 第１の流路及び第２の流路と、
   第１の流路及び第２の流路のそれぞれの同じ側の一端に接続する細胞供給部と、
   第１の流路の壁と第２の流路の壁との間に設けられた孔と、
   孔を挟んで設けられた電極と、
   前記電極に接続された直流交流信号発生装置と、
   を備えた装置を用いて、
   第１の細胞の細胞核を有し、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞を製造する製造方法であって、
   第１の流路にある第１の細胞と、第２の流路にある中間細胞を、流路中の溶液の流れ及び／又は前記直流交流信号発生装置によって発生させた交流電界によって、前記孔に誘導する第１の工程と、
   前記直流交流信号発生装置による交流電界中の誘電泳動力により、前記孔を挟んで第１の細胞と前記中間細胞の第１の細胞対を形成させる第２の工程と、
   第１の細胞対に前記直流交流信号発生装置で電圧を印加することによって細胞融合させて、第１の融合細胞を作製する第３の工程と、
   第２の流路内の流れの速度を、第１の流路内の流れの速度より大きくすることにより、第１の細胞の細胞質を前記中間細胞へ移動させる第４の工程と、ひきつづき第１の細胞と前記中間細胞を切り離す第５の工程と、
   第２の細胞を、流路中の溶液の流れ及び／又は前記直流交流信号発生装置によって発生させた交流電界により、第２の流路の前記孔に誘導する第６の工程と、
   前記直流交流信号発生装置による交流電界中の誘電泳動力により、前記孔を挟んで第１の細胞と第２の細胞の第２の細胞対を形成させる第７の工程と、
   第２の細胞対に前記直流交流信号発生装置で電圧を印加することによって細胞融合させて第２の融合細胞を作製する第８の工程と、
   第１の流路内の流れの速度を、第２の流路内の流れの速度より大きくすることにより、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ移動させる第９の工程と、ひきつづき第１の細胞を、第２の細胞から切り離す第１０の工程と、
   を含み、
   第４の工程において、第１の細胞の細胞質が９０％以上除去され、
   第９の工程において、第２の細胞の細胞質が、９０％以上の細胞質が除去された前記第１の細胞へ導入される、製造方法。
2. 前記製造された細胞が、９０％以上の第１の細胞の細胞膜と、９０％以上の第２の細胞の細胞質を含む、請求項１に記載の細胞の製造方法。
3. 前記製造された細胞が、９５％以上の第１の細胞の細胞膜と、９５％以上の第２の細胞の細胞質を含む、請求項１に記載の細胞の製造方法。
4. 第１の流路及び第２の流路は、前記細胞供給部と反対側の端に共通して第１の吸引口を有し、第１の吸引口にはポンプが設けられ、
   第１の工程および／または第６の工程において、第１の吸引口からポンプで吸引することによって細胞を前記孔へ誘導する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
5. 第１の流路及び第２の流路はそれぞれ、前記孔の第１の吸引口側で分岐し、分岐した第１の流路及び第２の流路のそれぞれの端に第２の吸引口及び第３の吸引口を有し、第２の吸引口及び第３の吸引口にはそれぞれポンプが設けられ、
   第４の工程及び第９の工程において、それぞれ第３の吸引口及び第２の吸引口から、ポンプで吸引することによって細胞質を移動させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
6. 第１の流路及び第２の流路はそれぞれ、前記孔の第１の吸引口側で分岐し、分岐した第１の流路及び第２の流路のそれぞれの端に第２の吸引口及び第３の吸引口を有し、第２の吸引口及び第３の吸引口にはそれぞれポンプが設けられ、
   第５の工程において、第１の細胞を誘電泳動力で前記孔で保持しながら、第３の吸引口から、ポンプで吸引することによって第１の細胞から中間細胞が切り離される、請求項１〜３に記載の細胞の製造方法。
7. 第１の流路及び第２の流路はそれぞれ、前記孔の第１の吸引口側で分岐し、分岐した第１の流路及び第２の流路のそれぞれの端に第２の吸引口及び第３の吸引口を有し、第２の吸引口及び第３の吸引口にはそれぞれポンプが設けられ、
   第１０の工程において、第２の細胞を誘電泳動力で前記孔で保持しながら、第２の吸引口から、ポンプで吸引することによって第２の細胞から第１の細胞が切り離される、請求項１〜３に記載の細胞の製造方法。
8. 前記孔の最大幅または最大径は第１の細胞の核の径及び第２の細胞の核の径より小さい、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
9. 前記孔の最大幅または最大径は６μｍ以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
10. 第１の流路及び第２の流路が平行である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
11. 前記第１の細胞は体細胞であり、前記第２の細胞は幹細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
12. 前記幹細胞は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、肝幹細胞、生殖幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、骨格筋幹細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の細胞の製造方法。
13. 前記体細胞は、線維芽細胞または血球細胞である、請求項１１に記載の細胞の製造方法。
14. 前記装置が、前記孔と前記第１〜第３の吸引口のうち少なくとも１つの吸引口間に圧力緩衝部を備える、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
15. 前記装置において、
    画像認識装置を備えた顕微鏡が設けられ、
    前記画像認識装置と前記ポンプに、流速制御装置が設けられた、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
16. 前記中間細胞が第２の細胞と同じ種類の細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。

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