JP6864287B2

JP6864287B2 - Cytoplasm exchange method, cell production method, and equipment

Info

Publication number: JP6864287B2
Application number: JP2016220953A
Authority: JP
Inventors: 雅弘岡野定; 志津武田; ケネディオモンディオケヨ; 鷲津　正夫; 正夫鷲津
Original assignee: Hitachi Ltd; University of Tokyo NUC
Current assignee: Hitachi Ltd; University of Tokyo NUC
Priority date: 2016-11-11
Filing date: 2016-11-11
Publication date: 2021-04-28
Anticipated expiration: 2036-11-11
Also published as: JP2018074982A

Description

本発明は、細胞質の交換方法、細胞の製造方法、及び装置に関する。 The present invention relates to a method for exchanging cytoplasm, a method for producing cells, and an apparatus.

ある細胞の細胞核を別の細胞の細胞質内へ移植したり、元の細胞核と交換したりすることで、細胞の性質を変える方法は、医療や産業に重要な役割を果たしている。 Methods of altering cell properties by transplanting the cell nucleus of one cell into the cytoplasm of another cell or exchanging it with the original cell nucleus play an important role in medicine and industry.

例えば、細胞核を除去した受精卵に、別個体の体細胞由来の核を移植した後、子宮に戻すことでクローン個体を産出する方法や、子宮に戻さず体外で胚盤胞へ発生させて胚性幹細胞 (Embryonic Stem cells: ES細胞) を樹立する体細胞由来胚性幹細胞(nuclear transfer Embryonic stem cells: NtES細胞) 樹立方法などがある。こうして得られたクローン個体やNtES細胞は、畜産や再生医療に発展する基礎研究に寄与している。 For example, a method of transplanting a nucleus derived from a separate somatic cell into a fertilized egg from which the cell nucleus has been removed and then returning it to the uterus to produce a cloned individual, or a method of developing it into a blastocyst in vitro without returning it to the uterus There are methods for establishing somatic cell-derived embryonic stem cells (NtES cells) that establish sexual stem cells (ES cells). The cloned individuals and NtES cells thus obtained contribute to basic research that develops into livestock and regenerative medicine.

細胞の性質を変える技術には、核移植以外にも、センダイウイルス法やプロトプラスト-ポリエチレングリコール法、電気的細胞融合法、電界集中細胞融合法などの細胞融合技
術がある。これは、２つ以上の細胞を融合させ、１つの細胞を形成する技術である。この方法では、細胞融合後の１つの細胞内には２つ以上の細胞に由来する細胞核と細胞質が存在する。 In addition to nuclear transplantation, there are cell fusion techniques such as Sendai virus method, protoplast-polyethylene glycol method, electrical cell fusion method, and electric field concentration cell fusion method as techniques for changing the properties of cells. This is a technique for fusing two or more cells to form one cell. In this method, there are cell nuclei and cytoplasms derived from two or more cells in one cell after cell fusion.

特に、電界集中細胞融合法は、２つの細胞を、細胞核の直径以下の幅や径のスリットや孔 (オリフィス) を介して接触させ、スリットやオリフィスでパルス的に電界を集中させることで、２つの細胞膜の接点で電気的に細胞膜が部分的に破壊され、復元する過程で細胞を融合する方法である（例えば、特許文献１、２参照）。この方法では、オリフィスや流路の最大径や最大幅が細胞核径より小さいことにより、細胞核の混合を防ぐことが可能である（例えば、特許文献１、２参照）。近年、Polydimethyl siloxane (PDMS)を使用して作製された様々な流路を用いて細胞融合法が検討されている。例えば、PDMSで製造された２つの平行流路間をオリフィスのみで繋ぎ、各流路末端に細胞供給口と吸引口をそれぞれ設けた流路を用い、オリフィスで細胞対を形成後、細胞融合させる方法がある。例えば、細胞供給口にJurkat細胞または樹状細胞を導入し、吸引口方向へ流路上で細胞を移動させ、オリフィスでJurkat細胞と樹状細胞を融合させ、Jurkat細胞の細胞質を樹状細胞へ移動させた後、界面活性剤を添加し、Jurkat細胞側の流路に流れを生じさせて両細胞を切り離すことで、細胞質が移動できるようになった（例えば、非特許文献１参照）。 In particular, in the field-concentrated cell fusion method, two cells are brought into contact with each other through a slit or hole (orifice) having a width or diameter smaller than the diameter of the cell nucleus, and the electric field is concentrated in a pulsed manner at the slit or orifice. This is a method in which cells are fused in the process of partially destroying and restoring the cell membrane at the contact point of the cell membrane (see, for example, Patent Documents 1 and 2). In this method, it is possible to prevent mixing of cell nuclei by making the maximum diameter and maximum width of the orifice and the flow path smaller than the cell nucleus diameter (see, for example, Patent Documents 1 and 2). In recent years, cell fusion methods have been studied using various channels made using Polydimethyl isomer (PDMS). For example, two parallel flow paths manufactured by PDMS are connected only by an orifice, and a flow path having a cell supply port and a suction port at the end of each flow path is used to form a cell pair at the orifice and then cell fusion is performed. There is a way. For example, Jurkat cells or dendritic cells are introduced into the cell supply port, the cells are moved in the flow path toward the suction port, the Jurkat cells and dendritic cells are fused at the orifice, and the cytoplasm of the Jurkat cells is transferred to the dendritic cells. After that, a surfactant was added to generate a flow in the flow path on the Jurkat cell side to separate both cells, so that the cytoplasm could move (see, for example, Non-Patent Document 1).

特開2009-178105号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2009-178105 特開2007-174901号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2007-174901

Cytoplasmic transfer without nuclei mixing between dendritic cells and tumor cells achieved by one to-one electrofusion via micro-orifices in a microfluidic device. 18th International Conference on Miniaturized. Systems for Chemistry and Life Sciences. October 26-30, 2014, San Antonio, Texas, USACytoplasmic transfer without nuclei mixing between dendritic cells and tumor cells achieved by one to-one electrofusion via micro-orifices in a microfluidic device. 18th International Conference on Miniaturized. Systems for Chemistry and Life Sciences. October 26-30, 2014, San Antonio, Texas, USA

本発明は、細胞質の交換方法、細胞の製造方法、及び細胞質を交換するための装置を提
供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for exchanging cytoplasm, a method for producing cells, and an apparatus for exchanging cytoplasm.

本発明の一実施態様は、第１の細胞の細胞核を有し、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞の製造方法であって、第１の細胞の細胞質を除去する第１の工程と、第２の細胞の細胞質を、前記第１の細胞へ導入する第２の工程を含む、製造方法である。第１の工程の後で第２の工程が行われてもよい。その場合、第１の工程において、第１の細胞の細胞質が９０％以上除去され、第２の工程において、第２の細胞の細胞質が、９０％以上の細胞質が除去された前記第１の細胞へ導入されてもよい。また、第１の工程と第２の工程が同時に行われてもよい。その場合、第１の細胞の細胞質の４０％〜６０％と、第２の細胞の細胞質の４０％〜６０％とが交換される細胞質交換工程によって、第１の工程と第２の工程が同時に行われてもよく、前記細胞質交換工程が２回以上繰り返されてもよい。前記いずれかの細胞の製造方法において、前記製造された細胞が、９０％以上の第１の細胞の細胞膜と、９０％以上の第２の細胞の細胞質を含んでもよく、前記製造された細胞が、９５％以上の第１の細胞の細胞膜と、９５％以上の第２の細胞の細胞質を含んでもよい。 One embodiment of the present invention is a method for producing a cell having a cell nucleus of a first cell and containing a cell membrane of the first cell and a cytoplasm of a second cell, wherein the cytoplasm of the first cell is removed. This is a production method including a first step of introducing the cytoplasm of the second cell into the first cell and a second step of introducing the cytoplasm of the second cell into the first cell. A second step may be performed after the first step. In that case, 90% or more of the cytoplasm of the first cell was removed in the first step, and 90% or more of the cytoplasm of the second cell was removed in the second step. May be introduced into. Further, the first step and the second step may be performed at the same time. In that case, the first step and the second step are simultaneously performed by the cytoplasm exchange step in which 40% to 60% of the cytoplasm of the first cell and 40% to 60% of the cytoplasm of the second cell are exchanged. It may be carried out, and the cytoplasmic exchange step may be repeated twice or more. In the method for producing any of the cells, the produced cell may contain 90% or more of the cell membrane of the first cell and 90% or more of the cytoplasm of the second cell. , 95% or more of the cell membrane of the first cell and 95% or more of the cytoplasm of the second cell may be included.

本発明のさらなる一実施態様は、第１の流路と第２の流路を備え、第１の流路の壁と第２の流路の壁は孔で連通している流路を用いて、第１の細胞の細胞核を有し、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞の製造方法であって、第１の流路において第１の細胞を、第２の流路において中間体を、前記孔に誘導する第１の工程と、誘電泳動力により、前記孔を介して、第１の細胞と中間体との第１の対を形成させる第２の工程と、第１の細胞と中間体とを融合する第３の工程と、第１の細胞の細胞質を中間体へ移動させる第４の工程と、第１の細胞と中間体とを切り離す第５の工程と、第２の流路において第２の細胞を前記孔に誘導する第６の工程と、誘電泳動力により、前記孔を介して、第１の細胞と第２の細胞の第２の対を形成させる第７の工程と、第１の細胞と第２の細胞とを融合する第８の工程と、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ移動させる第９の工程と、第１の細胞と第２の細胞とを切り離す第１０の工程と、を含む細胞の製造方法である。第４の工程と、第９の工程とにおいて、第１の流路と第２の流路の流速差を利用して細胞質を移動させてもよい。第５の工程と、第１０の工程とにおいて、第１の流路と第２の流路の流速差を利用して細胞を切り離してもよい。第１の工程及び第６の工程において、第１の吸引口からポンプで吸引することによって細胞を前記孔へ誘導してもよい。第２の工程と第７の工程において、交流電界中の誘電泳動力により前記対を形成させてもよい。第３の工程と第８の工程において、前記対に電圧を印加することで融合させてもよい。 A further embodiment of the present invention uses a flow path comprising a first flow path and a second flow path, the wall of the first flow path and the wall of the second flow path communicating with a hole. , A method for producing a cell having the cell nucleus of the first cell and containing the cell membrane of the first cell and the cytoplasm of the second cell, wherein the first cell is used in the first flow path and the second cell is used. A first step of guiding the intermediate to the pore in the flow path and a second step of forming a first pair of the first cell and the intermediate through the pore by a dielectricing force. , A third step of fusing the first cell and the intermediate, a fourth step of moving the cytoplasm of the first cell to the intermediate, and a fifth step of separating the first cell and the intermediate. And the sixth step of inducing the second cell to the pore in the second flow path, and the second pair of the first cell and the second cell through the pore by the dielectric migration force. The seventh step of forming, the eighth step of fusing the first cell and the second cell, the ninth step of moving the cytoplasm of the second cell to the first cell, and the first step. It is a method for producing a cell including a tenth step of separating a cell from a second cell. In the fourth step and the ninth step, the cytoplasm may be moved by utilizing the flow velocity difference between the first flow path and the second flow path. In the fifth step and the tenth step, the cells may be separated by utilizing the flow velocity difference between the first flow path and the second flow path. In the first step and the sixth step, cells may be guided to the pores by sucking from the first suction port with a pump. In the second step and the seventh step, the pair may be formed by the dielectrophoretic force in the AC electric field. In the third step and the eighth step, the pair may be fused by applying a voltage to the pair.

本発明のさらなる一実施態様は、第１の流路と第２の流路を備え、第１の流路の壁と第２の流路の壁は孔で連通している流路を用いて、第１の細胞の細胞核を有し、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞の製造方法であって、第１の流路において第１の細胞を、第２の流路において中間細胞を、前記孔に誘導する第１の工程と、誘電泳動力により、前記孔を介して、第１の細胞と中間細胞との第１の細胞対を形成させる第２の工程と、第１の細胞と中間細胞とを細胞融合する第３の工程と、第１の細胞と中間細胞とを切り離す第５の工程と、第２の流路において新たな中間細胞を、前記孔に誘導する第１１の工程と、誘電泳動力により、前記孔を介して、第１の細胞と新たな中間細胞との新たな第１の細胞対を形成させる第１２の工程と、第１の細胞と新たな中間細胞とを細胞融合する第１３の工程と、第１の細胞と新たな中間細胞とを切り離す第１４の工程と、を含み、前記中間細胞として第２の細胞を用いる、細胞の製造方法である。第１１の工程から第１４の工程までがさらに１回以上繰り返されてもよい。前記いずれかの細胞の製造方法において、第４の工程及び第９の工程において、それぞれ第３の吸引口及び第２の吸引口から、ポンプで流速差発生部を経由して吸引することによって細胞質を移動させてもよい。第５の工程において、第１の細胞を誘電泳動力によって前記孔で保持しながら、第３の吸引口から、ポンプで流速差発生部を経由して吸引することによって第１の細胞から中間細胞が切り離されてもよい。前記孔の最大幅または最大径は第１の細胞の核の径及び第２の細胞の核の径より小さくてもよい。前記孔の最大幅または最大径は６μｍ以下であってもよい。前記流速差は、細胞質が流入する側の細胞側の流路内の流速が、細胞質が流出する細胞側の流路内の流速より速くてもよい。第１の流路及び第２の流路が実質的に平行であってもよい。前記第１の細胞は体細胞であり、前記第２の細胞は幹細胞であってもよい。前記幹細胞は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、肝幹細胞、生殖幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、骨格筋幹細胞からなる群から選択されてもよく、前記体性細胞は、線維芽細胞または血球細胞であってもよい。 A further embodiment of the present invention uses a flow path comprising a first flow path and a second flow path, the wall of the first flow path and the wall of the second flow path communicating with a hole. , A method for producing a cell having the cell nucleus of the first cell and containing the cell membrane of the first cell and the cytoplasm of the second cell, wherein the first cell is used in the first flow path and the second cell is used. A first step of inducing an intermediate cell into the pore in the flow path and a second step of forming a first cell pair between the first cell and the intermediate cell through the pore by a dielectric migration force. In the third step of fusing the first cell and the intermediate cell, the fifth step of separating the first cell and the intermediate cell, and the new intermediate cell in the second flow path, the pores are formed. The eleventh step of inducing to the cell, the twelfth step of forming a new first cell pair of the first cell and the new intermediate cell through the pore by the dielectric dynamic force, and the first step. A cell comprising a thirteenth step of fusing a cell and a new intermediate cell and a fourteenth step of separating the first cell from the new intermediate cell, and using the second cell as the intermediate cell. It is a manufacturing method of. The eleventh step to the fourteenth step may be repeated one or more times. In any of the above cell production methods, in the fourth step and the ninth step, the cytoplasm is sucked from the third suction port and the second suction port, respectively, via the flow velocity difference generating portion with a pump. May be moved. In the fifth step, the first cells are held in the pores by the dielectrophoretic force, and the cells are sucked from the third suction port through the flow velocity difference generating portion by a pump, so that the cells are sucked from the first cells to the intermediate cells. May be separated. The maximum width or maximum diameter of the pores may be smaller than the diameter of the nucleus of the first cell and the diameter of the nucleus of the second cell. The maximum width or maximum diameter of the hole may be 6 μm or less. The flow velocity difference may be such that the flow velocity in the cell-side flow path on the side where the cytoplasm flows in is faster than the flow velocity in the cell-side flow path on the cell side outflow. The first flow path and the second flow path may be substantially parallel. The first cell may be a somatic cell and the second cell may be a stem cell. The stem cells may be selected from the group consisting of iPS cells, ES cells, nerve stem cells, epithelial stem cells, hepatic stem cells, germ stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and skeletal muscle stem cells, and the somatic cells are fibroblasts. It may be a cell or a blood cell.

本発明のさらなる一実施態様は、細胞の細胞質を交換するための装置であって、第１の流路及び第２の流路と、第１の流路及び第２の流路のそれぞれに接続する細胞供給部と、第１の流路の壁と第２の流路の壁との間に設けられた孔と、孔を挟んで設けられた電極と、第１の流路及び第２の流路の流速を調節する流速調節部と、前記流速調節部に設けられた吸引口と、各吸引口に設けられたポンプと、直流交流信号発生装置と、を備えた装置である。前記孔の最大幅または最大径は、前記細胞の細胞核の径よりも小さくてもよい。前記孔の最大幅または最大径は６μｍ以下であってもよい。前記孔と前記吸引口間に圧力緩衝部が設けられてもよい。画像認識装置が設けられた顕微鏡を備え、前記画像認識装置と前記ポンプに、流速制御装置が設けられてもよい。第１の流路及び第２の流路が実質的に平行であってもよい。 A further embodiment of the present invention is a device for exchanging the cytoplasm of cells, which is connected to the first flow path and the second flow path, and the first flow path and the second flow path, respectively. A cell supply unit, a hole provided between the wall of the first flow path and the wall of the second flow path, an electrode provided across the hole, the first flow path, and the second flow path. It is a device including a flow velocity adjusting unit for adjusting the flow velocity of the flow path, a suction port provided in the flow velocity adjusting unit, a pump provided in each suction port, and a DC AC signal generator. The maximum width or diameter of the pore may be smaller than the diameter of the cell nucleus of the cell. The maximum width or maximum diameter of the hole may be 6 μm or less. A pressure buffer may be provided between the hole and the suction port. A microscope provided with an image recognition device may be provided, and a flow velocity control device may be provided in the image recognition device and the pump. The first flow path and the second flow path may be substantially parallel.

本発明のさらなる一実施態様は、第１の細胞の細胞質を除去する第１の工程と、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入する第２の工程を含む、細胞質の交換方法であって、第１の工程の後で第２の工程が行われる、第１の細胞の細胞質の交換方法である。 A further embodiment of the present invention is a method of exchanging cytoplasm, which comprises a first step of removing the cytoplasm of the first cell and a second step of introducing the cytoplasm of the second cell into the first cell. Therefore, it is a method of exchanging the cytoplasm of the first cell, in which the second step is performed after the first step.

本発明のさらなる一実施態様は、第１の細胞の細胞質を除去する第１の工程と、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入する第２の工程を含む、細胞質の交換方法であって、第１の細胞の細胞質の４０％〜６０％と、第２の細胞の細胞質の４０％〜６０％とが交換される第１の細胞質交換工程によって、第１の工程と第２の工程が同時に行われ、細胞質交換工程後の第１の細胞の細胞質の４０％〜６０％と、新たな第２の細胞の細胞質の４０％〜６０％とが交換される第２の細胞質交換工程がさらに行われる、第１の細胞の細胞質の交換方法である。第２の細胞質交換工程がさらに１回以上行われてもよい。 A further embodiment of the present invention is a method of exchanging the cytoplasm, which comprises a first step of removing the cytoplasm of the first cell and a second step of introducing the cytoplasm of the second cell into the first cell. There are first and second steps by the first cytoplasmic exchange step, where 40% to 60% of the cytoplasm of the first cell and 40% to 60% of the cytoplasm of the second cell are exchanged. A second cytoplasmic exchange step in which the steps are performed simultaneously and 40% to 60% of the cytoplasm of the first cell after the cytoplasmic exchange step is exchanged with 40% to 60% of the cytoplasm of the new second cell. Is a method of exchanging the cytoplasm of the first cell, which is further carried out. The second cytoplasmic exchange step may be performed one or more more times.

本発明によって、細胞質の交換方法、細胞の製造方法、及び細胞質を交換するための装置を提供することができるようになった。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it has become possible to provide a method for exchanging cytoplasm, a method for producing cells, and an apparatus for exchanging cytoplasm.

本発明の一実施形態に係る細胞の製造方法を示した模式図である。It is a schematic diagram which showed the manufacturing method of the cell which concerns on one Embodiment of this invention. 本発明の一実施形態に係る細胞質を交換するための装置を示した模式図である。It is a schematic diagram which showed the apparatus for exchanging the cytoplasm which concerns on one Embodiment of this invention. 本発明の一実施形態に係る細胞質を交換するための装置を示した模式図である。It is a schematic diagram which showed the apparatus for exchanging the cytoplasm which concerns on one Embodiment of this invention. 本発明の一実施例において、細胞質を交換する工程の顕微鏡写真である。FIG. 5 is a photomicrograph of a step of exchanging cytoplasm in one embodiment of the present invention.

以下、実施例を挙げながら、本発明の実施形態を詳細に述べる。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to examples.

本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下
に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。 The objects, features, advantages, and ideas thereof of the present invention will be apparent to those skilled in the art by the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. The embodiments and specific examples of the invention described below indicate preferred embodiments of the present invention and are shown for illustration or explanation purposes, and the present invention is described in them. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and modifications can be made based on the description herein within the intent and scope of the invention disclosed herein.

＝＝細胞質の交換方法＝＝
＜実施形態Ｉ＞
本発明の一実施形態に係る第１の細胞の細胞質の交換方法は、第１の細胞の細胞質を除去する第１の工程と、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入する第２の工程を含む、細胞質の交換方法であって、
（１）第１の工程の後で第２の工程が行われる、または
（２）第１の細胞の細胞質の４０％〜６０％と、第２の細胞の細胞質の４０％〜６０％とが交換される第１の細胞質交換工程によって、第１の工程と第２の工程が同時に行われる、方法である。 == How to exchange cytoplasm ==
<Embodiment I>
The method for exchanging the cytoplasm of the first cell according to the embodiment of the present invention includes a first step of removing the cytoplasm of the first cell and a second step of introducing the cytoplasm of the second cell into the first cell. It is a method of exchanging cytoplasm including the step of
(1) A second step is performed after the first step, or (2) 40% to 60% of the cytoplasm of the first cell and 40% to 60% of the cytoplasm of the second cell. It is a method in which the first step and the second step are carried out at the same time by the first cytoplasmic exchange step to be exchanged.

（２）の場合、細胞質交換工程後の第１の細胞の細胞質の４０％〜６０％と、新たな第２の細胞の細胞質の４０％〜６０％とが交換される第２の細胞質交換工程がさらに行われてもよく、この第２の細胞質交換工程がさらに１回以上行われてもよい。この工程を繰り返すことによって、第１の細胞の細胞質が第２の細胞の細胞質に交換される割合が高くなる。本発明の一実施形態に係る細胞質の交換方法を用いて、第１の細胞の細胞核を有し、第２の細胞の細胞核を有さず、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞を製造することができる。こうして製造された細胞において、第１の細胞の細胞膜の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。また、第２の細胞の細胞質の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。 In the case of (2), a second cytoplasmic exchange step in which 40% to 60% of the cytoplasm of the first cell after the cytoplasmic exchange step is exchanged with 40% to 60% of the cytoplasm of the new second cell. May be further performed, and this second cytoplasmic exchange step may be performed one or more times more. By repeating this step, the rate at which the cytoplasm of the first cell is exchanged for the cytoplasm of the second cell increases. Using the cytoplasmic exchange method according to one embodiment of the present invention, it has a cell nucleus of a first cell, does not have a cell nucleus of a second cell, and has a cell membrane of a first cell and a cytoplasm of a second cell. Cells containing and can be produced. In the cells thus produced, the proportion of the cell membrane of the first cell is not particularly limited, but is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more. It is more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, and further preferably 95% or more. The proportion of the cytoplasm of the second cell is not particularly limited, but is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 70% or more, and even more preferably 80% or more. More preferably, it is more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.

以下、上記交換方法を用いて、細胞を製造する一実施態様を詳細に説明する。 Hereinafter, one embodiment of producing cells using the above exchange method will be described in detail.

＝＝細胞の製造方法＝＝
ここでは、図１を用いて、上記交換方法（１）を用いて行われる、本発明の一実施形態に係る細胞の製造方法を具体的に説明するが、本発明は本実施形態に限定されない。本実施形態では、第１の流路と第２の流路を備え、第１の流路の壁と第２の流路の壁は孔で連通している流路を用い、第１の細胞の細胞核を有し、第２の細胞の細胞核を有さず、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞を製造する。 == Cell manufacturing method ==
Here, the method for producing cells according to one embodiment of the present invention, which is carried out using the above exchange method (1), will be specifically described with reference to FIG. 1, but the present invention is not limited to the present embodiment. .. In the present embodiment, the first cell is provided with a first flow path and a second flow path, and the wall of the first flow path and the wall of the second flow path use a flow path communicating with a hole, and the first cell. Produces a cell that has a cell nucleus of a second cell, does not have a cell nucleus of a second cell, and contains the cell membrane of the first cell and the cytoplasm of the second cell.

第１の工程として、まず、第１の流路にあって、残したい細胞核１０１０と、除去したい細胞質１０２０と、細胞膜１０２５と、を有する第１の細胞１０３０と、第２の流路にある中間体１０４０を、流路中の溶液の流れ１０５０によって、両方の流路の壁を貫通して設けられた孔１０８０の入り口を構成するそれぞれの孔近傍に誘導する（図１−１）。必要に応じて交流１０６０電界を発生させ、その中で細胞を誘導してもよい。流路の壁は絶縁体１０７０で構成されるのが好ましい。第１の流路内の流れ１０５０と第２の流路内の流れ１０５０の方向は特に限定されないが、実質的に平行であることが好ましい。溶液は、細胞を生きた状態で操作できるものであれば特に限定されず、例えば生理食塩水や細胞培養用培地などを例示できる。中間体は特に限定されず、対になった細胞と融合して細胞の細胞質を受け入れられるものであればよいが、具体的な例としては、細胞やリポソームが例示できる。細胞である場合、第１の細胞または第２の細胞と同じ種類であっても異
なる種類であってもよい。孔１０８０の形状は特に限定されず、スリット上、円状、長円上であってもよく、壁の厚みと同じ深さを有するため、厚い壁の場合は流路状であってもよい。 As a first step, first, in the first flow path, the first cell 1030 having the cell nucleus 1010 to be retained, the cytoplasm 1020 to be removed, and the cell membrane 1025, and an intermediate in the second flow path. Body 1040 is guided by the flow of solution 1050 through the channels to the vicinity of each of the holes constituting the inlets of the holes 1080 provided through the walls of both channels (FIG. 1-1). If necessary, an alternating current 1060 electric field may be generated and cells may be induced in the electric field. The wall of the flow path is preferably made of insulator 1070. The directions of the flow 1050 in the first flow path and the flow 1050 in the second flow path are not particularly limited, but are preferably substantially parallel. The solution is not particularly limited as long as the cells can be manipulated in a living state, and examples thereof include physiological saline and a medium for cell culture. The intermediate is not particularly limited as long as it can fuse with the paired cells and accept the cytoplasm of the cells, and specific examples thereof include cells and liposomes. When it is a cell, it may be the same type as or different from the first cell or the second cell. The shape of the hole 1080 is not particularly limited, and may be on a slit, a circle, or an oval, and since it has the same depth as the wall thickness, it may be a flow path in the case of a thick wall.

第２の工程として、誘電泳動力により、孔１０８０を挟んで第１の細胞１０３０と中間体１０４０の第１の対を形成させる（図１−２）。誘電泳動力は、交流１０６０印加による電界集中により流路の壁で生じる。 As a second step, the dielectrophoretic force is used to form a first pair of the first cell 1030 and the intermediate 1040 across the pore 1080 (FIG. 1-2). The dielectrophoretic force is generated at the wall of the flow path by the electric field concentration due to the application of AC 1060.

第３の工程として、第１の対に電圧を印加１０９０することで、第１の細胞１０３０と中間体１０４０とを融合して第１の融合細胞１１００を作製する (図１−３)。この時印
加する電圧は、従来細胞融合に用いられることが知られている強さとすることができるが、０．１〜５０Ｖであることが好ましく、０．５Ｖ〜２０Ｖであることがより好ましく、１〜１０Ｖであることがさらに好ましく、１〜３Ｖであることがさらに好ましく、約２Ｖであることがさらに好ましい。また印加する時間は、特に限定されないが、１μｓｅｃ〜１ｍｓｅｃであることが好ましく、１μｓｅｃ〜５００μｓｅｃであることがより好ましく、１μｓｅｃ〜１００μｓｅｃであることがさらに好ましいが、可能な限り短い時間であることがより好ましい。中間体１０４０が細胞である場合、本工程では、細胞融合後、第１の細胞１０３０と中間体１０４０の細胞質がお互いに混入する。 As a third step, by applying a voltage to the first pair 1090, the first cells 1030 and the intermediate 1040 are fused to prepare a first fused cell 1100 (FIG. 1-3). The voltage applied at this time can be a strength known to be conventionally used for cell fusion, but is preferably 0.1 to 50 V, more preferably 0.5 V to 20 V. It is more preferably 1 to 10 V, further preferably 1 to 3 V, and even more preferably about 2 V. The application time is not particularly limited, but is preferably 1 μsec to 1 msec, more preferably 1 μsec to 500 μsec, further preferably 1 μsec to 100 μsec, but the time is as short as possible. More preferred. When the intermediate 1040 is a cell, in this step, after cell fusion, the cytoplasms of the first cell 1030 and the intermediate 1040 are mixed with each other.

第４の工程として、第１の細胞１０３０の細胞質１０２０を中間体１０４０へ移動させる（図１−４）。この細胞質１０２０の移動は、例えば、第２の流路内の流れ１１２０の速度を、第１の流路内の流れ１１１０の速度より大きくし、その流速差を利用することにより行うことができる。このとき、第１の流路内の流れ１１１０の流速は０、つまり第１の流路内に流れのない状態であってもよい。第１の流路内の流れ１１１０と第２の流路内の流れ１１２０の方向は特に限定されないが、実質的に平行であることが好ましい。ここで、孔１０８０の最大幅または最大径を、第１の細胞の核の径より小さくしておくことにより、第１の細胞１０３０の細胞核１０１０は、孔１０８０を通過できずに第１の流路内に残る。具体的には、孔１０８０の最大幅または最大径は、第１の細胞１０３０の種類によって適宜調整すればよいが、２０μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以下であることがより好ましく、６μｍ以下であることがさらに好ましい。なお、移動させる細胞質の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。 As a fourth step, the cytoplasm 1020 of the first cell 1030 is transferred to the intermediate 1040 (Fig. 1-4). This movement of the cytoplasm 1020 can be performed, for example, by making the velocity of the flow 1120 in the second flow path larger than the velocity of the flow 1110 in the first flow path and utilizing the flow velocity difference. At this time, the flow velocity of the flow 1110 in the first flow path may be 0, that is, there may be no flow in the first flow path. The directions of the flow 1110 in the first flow path and the flow 1120 in the second flow path are not particularly limited, but are preferably substantially parallel. Here, by making the maximum width or the maximum diameter of the hole 1080 smaller than the diameter of the nucleus of the first cell, the cell nucleus 1010 of the first cell 1030 cannot pass through the hole 1080 and the first flow. Remain in the road. Specifically, the maximum width or maximum diameter of the pore 1080 may be appropriately adjusted depending on the type of the first cell 1030, but is preferably 20 μm or less, more preferably 10 μm or less, and 6 μm or less. It is more preferable to have. The proportion of cytoplasm to be transferred is not particularly limited, but is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 70% or more, and further preferably 80% or more. It is preferably 90% or more, more preferably 95% or more.

第５の工程として、第１の細胞１０３０と中間体１０４を切り離す（図１−５）。第１の細胞１０３５を孔１０８０の入り口で保持しながら、細胞質１０２０を受け取った中間体１０４５を切り離すのが好ましい。この切り離しは、例えば、第２の流路内の流れ１１２０の速度を、第１の流路内の流れ１１１０の速度より大きくし、その流速差を利用することにより行うことができる。第１の流路内の流れ１１１０の流速は０、つまり第１の流路内に流れのない状態であってもよい。 As a fifth step, the first cell 1030 and the intermediate 104 are separated (FIG. 1-5). It is preferable to cleave the intermediate 1045 that has received the cytoplasm 1020 while retaining the first cell 1035 at the entrance of the pore 1080. This disconnection can be performed, for example, by making the velocity of the flow 1120 in the second flow path larger than the velocity of the flow 1110 in the first flow path and utilizing the flow velocity difference. The flow velocity of the flow 1110 in the first flow path may be 0, that is, there may be no flow in the first flow path.

このように、本実施形態では、第１の工程から第５の工程までの工程において、中間体を用いることにより、第１の細胞の細胞質を除去することができる。 As described above, in the present embodiment, the cytoplasm of the first cell can be removed by using the intermediate in the steps from the first step to the fifth step.

第６の工程として、第１の細胞１０３０に移植したい細胞質１１３０と、必要のない細胞核１１４０を有する第２の細胞１１５０を、流れ１０５０により、孔１０８０の入り口を構成する、第２の流路側の孔近傍に誘導する (図１−６)。必要に応じて交流１０６０
電界を発生させ、その中で細胞を誘導してもよい。 As a sixth step, the cytoplasm 1130 to be transplanted into the first cell 1030 and the second cell 1150 having unnecessary cell nuclei 1140 are passed through the flow 1050 to form the entrance of the pore 1080 on the side of the second flow path. It guides to the vicinity of the hole (Fig. 1-6). Exchange 1060 as needed
An electric field may be generated and cells may be induced in the electric field.

第７の工程として、誘電泳動力により、孔１０８０を挟んで第１の細胞１０３０と第２の細胞１１５０の第２の対を形成させる (図１−７)。誘電泳動力は、交流１０６０印加
による電界集中により流路の壁で生じる。 As a seventh step, a dielectrophoretic force is used to form a second pair of the first cell 1030 and the second cell 1150 across the pore 1080 (Fig. 1-7). The dielectrophoretic force is generated at the wall of the flow path by the electric field concentration due to the application of AC 1060.

第８の工程として、第２の対に電圧を印加１０９０することで第１の細胞１０３０と第２の細胞１１５０を融合して第２の融合細胞１１６０を作製する (図１−８)。この時印
加する電圧は、従来細胞融合に用いられることが知られている強さであればよいが、１〜１０Ｖであることが好ましく、２Ｖであることがさらに好ましい。また印加する時間は、１００μｓｅｃであることが好ましく、１００μｓｅｃ以下で可能な限り短い時間であることがさらに好ましい。 As an eighth step, a voltage is applied to the second pair at 1090 to fuse the first cell 1030 and the second cell 1150 to prepare a second fused cell 1160 (FIG. 1-8). The voltage applied at this time may be any strength that is conventionally known to be used for cell fusion, but is preferably 1 to 10 V, and more preferably 2 V. The application time is preferably 100 μsec, and more preferably 100 μsec or less, which is as short as possible.

第９の工程として、第２の細胞１１５０の細胞質１１３０を第１の細胞１０３５へ移動させる (図１−９)。この移動は、例えば、第１の流路内の流れ１１１０の速度を、第２
の流路内の流れ１１２０の速度より大きくし、その流速差を利用することにより行うことができる。第１の流路内の流れ１１２０の流速は０、つまり第２の流路内に流れのない状態であってもよい。ここで、孔１０８０の最大幅または最大径を、第２の細胞の核の径より小さくしておくことにより、第２の細胞１１５０の細胞核１１４０は、孔１０８０を通過できずに第２の流路内に残る。具体的には、孔１０８０の最大幅または最大径は、第２の細胞１１５０の種類によって適宜調整すればよいが、２０μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以下であることがより好ましく、６μｍ以下であることがさらに好ましい。なお、移動させる細胞質の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。 As a ninth step, the cytoplasm 1130 of the second cell 1150 is transferred to the first cell 1035 (Fig. 1-9). This movement is, for example, the velocity of the flow 1110 in the first flow path, the second
This can be done by increasing the velocity of the flow 1120 in the flow path of the above and using the difference in the flow velocity. The flow velocity of the flow 1120 in the first flow path may be 0, that is, there may be no flow in the second flow path. Here, by making the maximum width or the maximum diameter of the hole 1080 smaller than the diameter of the nucleus of the second cell, the cell nucleus 1140 of the second cell 1150 cannot pass through the hole 1080 and the second flow. Remain in the road. Specifically, the maximum width or maximum diameter of the pore 1080 may be appropriately adjusted depending on the type of the second cell 1150, but is preferably 20 μm or less, more preferably 10 μm or less, and 6 μm or less. It is more preferable to have. The proportion of cytoplasm to be transferred is not particularly limited, but is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 70% or more, and further preferably 80% or more. It is preferably 90% or more, more preferably 95% or more.

第１０の工程として、第１の細胞１０３０を、第２の細胞１１５０から切り離す (図１−１０)。こうして、第１の細胞１０３０の細胞質１０２０を、第２の細胞１１５０の細
胞質１１３０に交換することによって、第１の細胞１０３０の細胞核１０１０を有し、第２の細胞１１５０の細胞核１１４０を有さず、第１の細胞１０３０の細胞膜と第２の細胞１１５０の細胞質１１３０とを含む細胞１１７０の製造が完了する。 As a tenth step, the first cell 1030 is separated from the second cell 1150 (Fig. 1-10). Thus, by exchanging the cell membrane 1020 of the first cell 1030 with the cell membrane 1130 of the second cell 1150, it has the cell nucleus 1010 of the first cell 1030 and does not have the cell nucleus 1140 of the second cell 1150. , The production of the cell 1170 containing the cell membrane of the first cell 1030 and the cytoplasm 1130 of the second cell 1150 is completed.

このように、第６の工程から第１０の工程までの工程によって、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入することができる。 In this way, the cytoplasm of the second cell can be introduced into the first cell by the steps from the sixth step to the tenth step.

本方法において、第１の細胞１０３０と第２の細胞１１５０の細胞種は特に限定されないが、第１の細胞１０３０は体細胞であることが好ましく、線維芽細胞または血球細胞であることがさらに好ましい。また、第２の細胞１１５０は幹細胞であることが好ましく、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、肝幹細胞、生殖幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、骨格筋幹細胞からなる群から選択されるのがさらに好ましい。第１の細胞１０３０は体細胞とし、第２の細胞１１５０を幹細胞とすることにより、例えば、幹細胞の細胞核を体細胞の細胞核に交換したことと同様の効果が得られる。 In the present method, the cell types of the first cell 1030 and the second cell 1150 are not particularly limited, but the first cell 1030 is preferably a somatic cell, more preferably a fibroblast or a blood cell. .. The second cell 1150 is preferably a stem cell, and is selected from the group consisting of iPS cells, ES cells, neural stem cells, epithelial stem cells, hepatic stem cells, germ stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and skeletal muscle stem cells. Is even more preferable. By using the first cell 1030 as a somatic cell and the second cell 1150 as a stem cell, for example, the same effect as exchanging the cell nucleus of the stem cell with the cell nucleus of the somatic cell can be obtained.

＜実施形態ＩＩ＞
ここでは、上記交換方法（２）を用いて行われる、本発明の一実施形態に係る細胞の製造方法を具体的に説明するが、本発明は本実施形態に限定されない。本実施形態では、第１の流路と第２の流路を備え、第１の流路の壁と第２の流路の壁は孔で連通している流路を用い、第１の細胞の細胞核を有し、第２の細胞の細胞核を有さず、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞を製造する。第１の工程から第３の工程は、実施形態Ｉに準じるが、中間体として、第２の細胞を用いる。第３の工程終了後、第１の細胞と第２の細胞の細胞質がお互いに混入する。このように、本実施形態では、第１の細胞の細胞
質を除去する第１の工程と、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入する第２の工程が同時に行われる。この際に、第１の対を融合させたままで、長時間放置すると、第１の細胞と第２の細胞の間で細胞質が均一になるが、交換される細胞質の割合は特に限定されず、第１の細胞の細胞質の１０％〜２５％と、第２の細胞の細胞質の１０％〜２５％とが交換されることが好ましく、第１の細胞の細胞質の２５％〜４０％と、第２の細胞の細胞質の２５％〜４０％とが交換されることがより好ましく、第１の細胞の細胞質の４０％〜６０％と、第２の細胞の細胞質の４０％〜６０％とが交換されることがさらに好ましい。そして、その後、第１の細胞と中間体とを切り離す第５の工程を行う。第５の工程の詳細は、実施形態ＩＩに準じる。 <Embodiment II>
Here, a method for producing cells according to an embodiment of the present invention, which is carried out using the above exchange method (2), will be specifically described, but the present invention is not limited to the present embodiment. In the present embodiment, the first cell is provided with a first flow path and a second flow path, and the wall of the first flow path and the wall of the second flow path use a flow path communicating with a hole, and the first cell. Produces a cell that has a cell nucleus of a second cell, does not have a cell nucleus of a second cell, and contains the cell membrane of the first cell and the cytoplasm of the second cell. The first to third steps conform to the first embodiment, but use a second cell as an intermediate. After the completion of the third step, the cytoplasms of the first cell and the second cell are mixed with each other. As described above, in the present embodiment, the first step of removing the cytoplasm of the first cell and the second step of introducing the cytoplasm of the second cell into the first cell are performed at the same time. At this time, if the first pair is left fused for a long time, the cytoplasm becomes uniform between the first cell and the second cell, but the ratio of the exchanged cytoplasm is not particularly limited. It is preferable that 10% to 25% of the cytoplasm of the first cell and 10% to 25% of the cytoplasm of the second cell are exchanged, and 25% to 40% of the cytoplasm of the first cell and the first. It is more preferable that 25% to 40% of the cytoplasm of the second cell is exchanged, and 40% to 60% of the cytoplasm of the first cell is exchanged with 40% to 60% of the cytoplasm of the second cell. It is more preferable to be done. Then, a fifth step of separating the first cell and the intermediate is performed. The details of the fifth step are according to the second embodiment.

さらに、第２の流路において新たな第２の細胞を、前記孔に誘導する第１１の工程と、誘電泳動力により、前記孔を介して、第１の細胞と第２の細胞との新たな第１の対を形成させる第１２の工程と、第１の細胞と第２の細胞とを融合する第１３の工程と、第１の細胞と第２の細胞とを切り離す第１４の工程と、を行ってもよい。第１１〜１４の工程の詳細は、実施形態Ｉの第１〜３、５の工程に準じる。 Further, in the eleventh step of inducing a new second cell into the pore in the second flow path, and by the dielectrophoretic force, the first cell and the second cell are newly introduced through the pore. The twelfth step of forming the first pair, the thirteenth step of fusing the first cell and the second cell, and the fourteenth step of separating the first cell and the second cell. , May be done. The details of the steps 11 to 14 are based on the steps 1 to 5 of the first embodiment I.

この後、第１１〜１４の工程をさらに１回以上、繰り返してもよいが、１回繰り返すことが好ましく、２回以上繰り返すことがより好ましく、５回以上繰り返すことがさらに好ましい。それによって、交換される細胞質の割合を高めることができるようになる。 After that, the steps 11 to 14 may be repeated once or more, but it is preferably repeated once, more preferably twice or more, and further preferably five or more times. This makes it possible to increase the proportion of cytoplasm exchanged.

＝＝細胞質を交換するための装置＝＝
以下、上記の方法を実行することができる本発明の装置の一実施態様を、図２（１）を用いて詳細に説明する。本発明の装置は、細胞の細胞質を交換するための装置であって、第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０と、第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０のそれぞれ接続する第１の細胞供給部２０１０と第２の細胞供給部２０２０と、第１の流路の壁と第２の流路の壁との間に設けられた孔２０５０と、孔２０５０を挟んで設けられた電極２０８０と、第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０の流速を調節する流速調節部２０６０と、流速調節部２０６０に設けられた吸引路２０７０と、各吸引口２０７１，２０７２，２０７３に設けられたポンプ２２１１，２２１２，２２１３と、直流交流信号発生装置２０９０と、顕微鏡２１００とを備える。第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０は、実質的に平行に走っていることが好ましい。 == Device for exchanging cytoplasm ==
Hereinafter, an embodiment of the apparatus of the present invention capable of carrying out the above method will be described in detail with reference to FIG. 2 (1). The device of the present invention is a device for exchanging the cytoplasm of cells, and connects the first flow path 2030 and the second flow path 2040 and the first flow path 2030 and the second flow path 2040, respectively. The first cell supply unit 2010 and the second cell supply unit 2020, the hole 2050 provided between the wall of the first flow path and the wall of the second flow path, and the hole 2050 are provided so as to sandwich the hole 2050. The electrode 2080, the flow velocity adjusting section 2060 for adjusting the flow velocity of the first flow path 2030 and the second flow path 2040, the suction path 2070 provided in the flow velocity adjusting section 2060, and the suction ports 2071 and 2072, respectively. It includes pumps 2211, 212, 2213 provided in 2073, a DC AC signal generator 2090, and a microscope 2100. It is preferable that the first flow path 2030 and the second flow path 2040 run substantially in parallel.

＜流路内を流れる溶液の流速の調節＞
図２（２）（３）に、流速調節部２０６０の拡大図を示し、第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０内の溶液の流速の調節方法を以下で説明する。 <Adjustment of the flow velocity of the solution flowing in the flow path>
2 (2) and (3) show an enlarged view of the flow velocity adjusting unit 2060, and a method of adjusting the flow velocity of the solution in the first flow path 2030 and the second flow path 2040 will be described below.

流路内を流れる溶液は、流速調節部２０６０によって、各吸引口２０７１，２０７２，２０７３への接続が調節される。そして、各吸引口２０７１，２０７２，２０７３に設けられたポンプ２２１１，２２１２，２２１３によって、独立に吸引される。吸引口２０７２，２０７３への溶液の流れを止め、吸引口２０７１で吸引すると、第１の流路２０３０と第２の流路２０４０の流れの方向と流速は同じになる。吸引口２０７１，２０７３への溶液の流れを止め、吸引口２０７２から吸引すると、流れの方向は同じだが、第２の流路２０４０の流れは流路壁とぶつかる事でわずかに流速は減少し、第１の流路２０３０の流れと比較して、流速差が生じる。逆に、吸引口２０７１，２０７２への溶液の流れを止め、吸引口２０７３から吸引すると、流れの方向は同じだが、第１の流路２０３０の流れは流路壁とぶつかる事でわずかに流速は減少し、第２の流路２０４０の流れと比較して、流速差が生じる。ここで、流速調節部２０６０に弁（例えば電磁弁など）を設けることによって、さらに流速の細かな制御が可能になる。 The connection of the solution flowing in the flow path to each suction port 2071, 2072, 2073 is adjusted by the flow velocity adjusting unit 2060. Then, the pumps 2211, 212, 2213 provided at each suction port 2071, 2072, 2073 suck independently. When the flow of the solution to the suction ports 2072 and 2073 is stopped and suction is performed through the suction port 2071, the flow direction and the flow velocity of the first flow path 2030 and the second flow path 2040 become the same. When the flow of the solution to the suction ports 2071 and 2073 is stopped and suction is performed from the suction port 2072, the flow direction is the same, but the flow velocity of the second flow path 2040 is slightly reduced by colliding with the flow path wall. A flow velocity difference occurs as compared with the flow of the first flow path 2030. On the contrary, when the flow of the solution to the suction ports 2071 and 2072 is stopped and suction is performed from the suction port 2073, the flow direction is the same, but the flow velocity of the first flow path 2030 collides with the flow path wall and the flow velocity is slightly increased. It decreases and a flow velocity difference occurs as compared to the flow of the second flow path 2040. Here, by providing a valve (for example, a solenoid valve) in the flow velocity adjusting unit 2060, finer control of the flow velocity becomes possible.

＜追加の実施形態弁の構成＞
弁の構成例を図２（１）を参照しながら、以下に説明する。 <Additional Embodiment Valve Configuration>
A configuration example of the valve will be described below with reference to FIG. 2 (1).

まず、弁を流速調節部２０６０内で、各吸引口２０７１、２０７２、２０７３に繋がる吸引路２０７０に設置することができる。それによって、各吸引口２０７１、２０７２、２０７３に向かう溶液の流れを独立に調節できるようになる。 First, the valve can be installed in the flow velocity adjusting unit 2060 in the suction passage 2070 connected to each suction port 2071, 2072, 2073. This allows the flow of solution towards each suction port 2071, 2072, 2073 to be independently regulated.

また、他の実施形態として、吸引路２０７０を流速調節部２０６０の下流で第１の吸引口２０７１の上流の吸引路２０７０に接続させた、新たな吸引路２０７４（２０７０）（図２（１）では点線で示した。）を設け、ポンプ２２１２，２２１３を除去する。この場合この実施例では、吸引口２０７１に接続されたポンプ２２１１のみで、第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０内の溶液の流速を制御することが可能となる。 Further, as another embodiment, a new suction path 2074 (2070) (FIG. 2 (1)) in which the suction path 2070 is connected to the suction path 2070 upstream of the first suction port 2071 downstream of the flow velocity adjusting unit 2060. The pumps 2212 and 2213 are removed by providing (shown by dotted lines). In this case, in this embodiment, the flow velocity of the solution in the first flow path 2030 and the second flow path 2040 can be controlled only by the pump 2211 connected to the suction port 2071.

＜追加の実施形態その他＞
孔２０５０は、図１で詳細に説明した物に準じる。 <Additional embodiments and others>
The holes 2050 conform to those described in detail in FIG.

図３（１）に示すように、孔２０５０と吸引口２０７１、２０７２、２０７３間に圧力緩衝部２１１０を設けてもよい。これによって、吸引による急激な流速変化を緩和することができ、安定的に細胞質の移動と細胞の分離が可能になる。 As shown in FIG. 3 (1), the pressure buffer portion 2110 may be provided between the hole 2050 and the suction ports 2071, 2072, 2073. As a result, a rapid change in flow velocity due to suction can be alleviated, and stable cytoplasmic movement and cell separation become possible.

図３（２）に示すように、顕微鏡２１００に画像認識部２２００を設け、画像認識部２２００とポンプ２２１０に、流速制御装置２２２０を設けてもよい。これによって、効率的に細胞質の移動と細胞の分離が可能になる。この流速制御装置２２２０は、上述した弁（電磁弁）弁を調節してもよい。 As shown in FIG. 3 (2), the microscope 2100 may be provided with the image recognition unit 2200, and the image recognition unit 2200 and the pump 2210 may be provided with the flow velocity control device 2220. This enables efficient cytoplasmic migration and cell separation. The flow velocity control device 2220 may adjust the valve (solenoid valve) valve described above.

＝＝細胞質を交換するための装置の使用方法＝＝
以下、本発明の一実施態様にかかる上記装置を用い、細胞質を交換するための使用方法と、それによる新規細胞の製造方法を詳細に説明する。 == How to use the device for exchanging cytoplasm ==
Hereinafter, a method of using the above-mentioned apparatus according to one embodiment of the present invention for exchanging cytoplasm and a method for producing new cells by the method will be described in detail.

第１の工程として、第２の吸引口２０７２及び第３の吸引口２０７３を閉止し、第１の細胞供給部２０１０内の第１の細胞と、第２の細胞供給部２０２０内の中間体を、第１の吸引口２０７１からポンプ２２１１で吸引することで、細胞を孔２０５０の入り口を構成するそれぞれの孔近傍へ誘導する。 As a first step, the second suction port 2072 and the third suction port 2073 are closed, and the first cell in the first cell supply unit 2010 and the intermediate in the second cell supply unit 2020 are separated. , By sucking from the first suction port 2071 with the pump 2211, the cells are guided to the vicinity of each hole constituting the entrance of the hole 2050.

第２の工程として、直流交流信号発生制御装置２０９０で発生させた交流電界中の誘電泳動力により、孔２０５０を介して、第１の細胞と中間体との第１の対を形成させる。 As a second step, the dielectrophoretic force in the AC electric field generated by the DC AC signal generation control device 2090 forms a first pair of the first cell and the intermediate through the pore 2050.

第３の工程として、直流交流信号発生制御装置２０９０で、第１の対へ電圧を印加することで第１の細胞と中間体とを融合する。 As a third step, the DC AC signal generation control device 2090 fuses the first cell with the intermediate by applying a voltage to the first pair.

第４の工程として、細胞融合の完了後、第１の吸引口２０７１及び第２の吸引口２０７２を閉止し、ポンプ２２１３で第３の吸引口２０７３から吸引して、第１の細胞の細胞質を中間細胞へ移動させる。 As a fourth step, after the cell fusion is completed, the first suction port 2071 and the second suction port 2072 are closed, and the cytoplasm of the first cell is sucked by the pump 2213 from the third suction port 2073. Move to intermediate cells.

第５の工程として、直流交流信号発生制御装置２０９０で発生させた誘電泳動力で第１の細胞を孔２０５０で保持しながら、第１の吸引口２０７１及び第２の吸引口２０７２を閉止し、ポンプ２２１３で第３の吸引口２０７３から吸引して、第１の細胞から中間細胞を切り離す。 As a fifth step, the first suction port 2071 and the second suction port 2072 are closed while holding the first cell in the hole 2050 by the dielectrophoretic force generated by the DC AC signal generation control device 2090. The pump 2213 sucks from the third suction port 2073 to separate the intermediate cells from the first cells.

第６の工程として、第２の吸引口２０７２及び第３の吸引口２０７３を閉止し、第１の吸引口２０７１からポンプ２２１１で吸引することで、第２の細胞供給部２０２０内の第
２の細胞を孔２０５０の入り口を構成する孔近傍へ誘導する。ここで、第３の細胞供給部を設け、第２の細胞供給部２０２０を中間体用にし、第３の細胞供給部を第２の細胞用にしてもよい。 As a sixth step, the second suction port 2072 and the third suction port 2073 are closed, and suction is performed from the first suction port 2071 by the pump 2211 to obtain a second in the second cell supply unit 2020. The cell is guided to the vicinity of the pore that constitutes the entrance of the pore 2050. Here, a third cell supply unit may be provided, the second cell supply unit 2020 may be used for an intermediate, and the third cell supply unit may be used for a second cell.

第７の工程として、直流交流信号発生制御装置２０９０で発生させた交流電界中の誘電泳動力により、孔２０５０を介して、第１の細胞と第２の細胞の第２の対を形成させる。 As a seventh step, the dielectrophoretic force in the AC electric field generated by the DC AC signal generation control device 2090 forms a second pair of the first cell and the second cell through the pore 2050.

第８の工程として、直流交流信号発生制御装置２０９０で、第２の対へ電圧を印加することで、第１の細胞と第２の細胞を融合する。 As an eighth step, the DC AC signal generation control device 2090 fuses the first cell and the second cell by applying a voltage to the second pair.

第９の工程として、細胞融合の完了後、第１の吸引口２０７１及び第３の吸引口２０７３を閉止し、ポンプ２２１２で、第２の吸引口２０７２から吸引して、第１の細胞へ第２の細胞の細胞質を移動させる。 As a ninth step, after the cell fusion is completed, the first suction port 2071 and the third suction port 2073 are closed, and the pump 2212 sucks from the second suction port 2072 to the first cell. Move the cytoplasm of 2 cells.

第１０の工程として、第１の吸引口２０７１及び第３の吸引口２０７３を閉止し、ポンプ２２１２で、第２の吸引口２０７２から吸引して、第１の細胞を第２の細胞から切り離す。 As a tenth step, the first suction port 2071 and the third suction port 2073 are closed, and the pump 2212 sucks from the second suction port 2072 to separate the first cell from the second cell.

装置構成において述べたように、顕微鏡２１００に画像認識部２２００を設け、流速調節部２０６０に弁を設け、細胞を画像認識部２２００で分析しながら、流速制御装置２２２０によって弁及びポンプを調節することによって溶液の流速を調節することで、効率よく本法を実施することが可能になる。 As described in the device configuration, the microscope 2100 is provided with an image recognition unit 2200, the flow velocity control unit 2060 is provided with a valve, and the valve and pump are adjusted by the flow velocity control device 2220 while the cells are analyzed by the image recognition unit 2200. By adjusting the flow velocity of the solution, it becomes possible to carry out this method efficiently.

このように、本発明は、２つの流路における流速差を制御することで、細胞と中間体あるいは細胞同士の融合後の細胞質の移動方向を制御でき、かつ、界面活性剤を使わず細胞の分離・除去が可能となるため、従来の電界集中細胞融合法では達成されなかった細胞核移植が可能になる。 As described above, in the present invention, by controlling the difference in flow velocity between the two flow paths, the movement direction of the cytoplasm after fusion between the cell and the intermediate or between the cells can be controlled, and the cell can be controlled without using a surfactant. Since separation and removal are possible, cell nucleus transplantation, which was not achieved by the conventional electroconcentrated cell fusion method, becomes possible.

（実施例１）
本実施例では、Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞質を、細胞質を除去した別のＪｕｒｋａｔ細胞内へ移植する。用いた装置は、以下の通りである。 (Example 1)
In this example, the cytoplasm of a Jurkat cell is transplanted into another Jurkat cell from which the cytoplasm has been removed. The equipment used is as follows.

・ファンクションジェネレーター
交流印加条件：周波数１ＭＨｚ、電圧５Ｖ
パルス印加条件：時間１００ μｓ、電圧１０Ｖ
・デジタルオシロスコープ
・バイポーラ電力増幅装置
・位相差・蛍光顕微鏡・ Function generator AC application conditions: frequency 1 MHz, voltage 5 V
Pulse application conditions: time 100 μs, voltage 10 V
・ Digital oscilloscope ・ Bipolar power amplifier ・ Phase difference ・ Fluorescence microscope

また、蛍光染色試薬は、以下のものを用いた。 The following fluorescent staining reagents were used.

・使用蛍光染色試薬：
・Calcein, AM - Special Packaging (Excitation/Emission (nm): 494/514 C3100MP、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ・米国)、細胞質を緑色染
色する
・CellTrace^TM Calcein Red-Orange, AM - Special Packaging (Excitation/Emission (nm): 577/590、C34851、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)、細胞質を赤色染色する
・Cellstain^R Hoechst 33342 solution (Excitation/Emission (nm): 350/461、346-0795
1、(株)同仁化学研究所、東京・日本)、細胞核を青色染色する
Ｊｕｒｋａｔ細胞懸濁液（１ｘ１０^６個／ｍＬ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）１ｍＬずつ２本の１５ｍＬ遠心管に加え、一方の遠心管ＡにCalcein AM １μＬ、もう一方の遠心管ＢにはCalcein red-orange １１μＬを添加し、その後Hoechst33342 １μＬを両方の遠心管に加えて、３７℃で３分間インキュベーションして細胞質と細胞核を染色した。余分な染色試薬を除くため、遠心管を６００ｒｐｍで２分間遠心した後、上清を除去した。・ Fluorescent staining reagent used:
・ Calcein, AM --Special Packaging (Excitation / Emission (nm): 494/514 C3100MP, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA), stains the cytoplasm in green ・ CellTrace ^TM Calcein Red-Orange, AM --Special Packaging ( Excitation / Emission (nm): 577/590, C34851, Thermo Fisher Scientific), stains cytoplasm in red ・ Cellstain ^R Hoechst 33342 solution (Excitation / Emission (nm): 350/461, 346-0795)
1, Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd., Tokyo / Japan), Jurkat cell suspension (1x10 ⁶ cells / mL, DMEM + 10% FBS) that stains cell nuclei in blue Add 1 mL each to two 15 mL centrifuge tubes, and centrifuge one 1 μL of Calcein AM was added to tube A and 11 μL of Calcein red-orange was added to the other centrifuge tube B, and then 1 μL of Hoechst33342 was added to both centrifuge tubes and incubated at 37 ° C. for 3 minutes to stain the cytoplasm and cell nuclei. .. The supernatant was removed after centrifuging the centrifuge tube at 600 rpm for 2 minutes to remove excess staining reagents.

沈殿した細胞に対して、細胞融合用緩衝液（２００ｍＭソルビトール、１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン）１ｍＬを加えて混合した。再び遠心管を上記と同条件で遠心して、生細胞を沈殿させ、上清を１ｍＬ除去した。この細胞洗浄工程をさらに２回繰り返した。最後に、細胞融合緩衝液を１５０μＬ加えて混合して、細胞融合用細胞懸濁液とした。以下、図４の写真を参考にしながら、各工程を説明する。 To the precipitated cells, 1 mL of a cell fusion buffer (200 mM sorbitol, 1 mM calcium acetate, 0.5 mM magnesium acetate, 1 mg / mL bovine serum albumin) was added and mixed. The centrifuge tube was centrifuged again under the same conditions as above to precipitate live cells, and 1 mL of the supernatant was removed. This cell washing step was repeated twice more. Finally, 150 μL of cell fusion buffer was added and mixed to prepare a cell fusion cell suspension. Hereinafter, each process will be described with reference to the photograph of FIG.

＜細胞融合１回目＞
図２に示したようなＰＤＭＳデバイス上の細胞供給口Ａへ遠心管Ａの細胞懸濁液（細胞Ａ含有）を加え、細胞供給口であるサンプリングポートＢへ遠心管Ｂの細胞懸濁液（細胞Ｂ含有）を加えた。ピペットマン１で細胞懸濁液を吸引し、各細胞を細胞融合路上へ導いた（図４−１）。交流印加による誘電泳動力により細胞Ａと細胞Ｂを細胞融合路内へ導き、細胞融合路を挟んで細胞ＡとＢの対を形成させた（図４−２〜４、２：位相差；３〜４：蛍光視野）。パルスを１回以上印加しながら、パルス印加過程を位相差と蛍光視野で観察して、細胞融合による蛍光色素の移動を確認した（図４−５）。 <First cell fusion>
The cell suspension of the centrifuge tube A (containing cells A) is added to the cell supply port A on the PDMS device as shown in FIG. 2, and the cell suspension of the centrifuge tube B (containing the cells A) is added to the sampling port B which is the cell supply port. (Containing cell B) was added. The cell suspension was aspirated with Pipetman 1 and each cell was guided onto the cell fusion pathway (Fig. 4-1). Cell A and cell B were guided into the cell fusion pathway by the dielectrophoretic force generated by alternating current application, and a pair of cells A and B was formed across the cell fusion pathway (Fig. 4-2-4, 2: Phase difference; 3). ~ 4: Fluorescent field). While applying the pulse once or more, the pulse application process was observed in the phase difference and the fluorescent field, and the movement of the fluorescent dye due to cell fusion was confirmed (Fig. 4-5).

＜細胞核の回収＞
交流印加を停止して、ピペットマン２で吸引することで、細胞Ｂの細胞質を細胞Ａへ移動させた（図４−６〜７、６：蛍光視野；７：位相差）。引き続きピペットマン２で吸引することで、細胞Ｂから細胞Ａを分離した（図４−８〜９）。細胞Ｂを細胞融合路で保持するため再び交流を印加することで、細胞Ｂの核を孔に維持した（図４−１０）。 <Recovery of cell nuclei>
The cytoplasm of cell B was moved to cell A by stopping the application of alternating current and aspirating with Pipetman 2 (FIGS. 4-6 to 7, 6: fluorescent visual field; 7: phase difference). Cell A was separated from cell B by subsequent suction with Pipetman 2 (FIGS. 4-8-9). The nucleus of cell B was maintained in the pores by applying alternating current again to retain cell B in the cell fusion pathway (Fig. 4-10).

＜細胞融合２回目＞
再びピペットマン１で細胞懸濁液を吸引し、別の細胞Ａを細胞融合路上へ導いた（図４−１１〜１２）。交流印加による誘電泳動力により細胞Ａを細胞融合路内へ導いて、細胞融合路を挟んで細胞ＡとＢの対を形成させた（図４−１３〜１５、１３：位相差；１４〜１５：蛍光視野）。パルスを１回以上印加しながら、パルス印加過程を位相差と蛍光視野で観察し、細胞融合による蛍光色素の移動を確認した（図４−１６）。 <Second cell fusion>
The cell suspension was aspirated again with Pipetman 1 to guide another cell A onto the cell fusion pathway (FIGS. 4-11-12). Cell A was guided into the cell fusion pathway by the dielectrophoretic force due to the application of alternating current, and a pair of cells A and B was formed across the cell fusion pathway (FIGS. 4-13 to 15, 13: phase difference; 14 to 15). : Fluorescent field). While applying the pulse once or more, the pulse application process was observed in the phase difference and the fluorescent field, and the movement of the fluorescent dye due to cell fusion was confirmed (Fig. 4-16).

＜細胞質の移植＞
交流印加を停止して、ピペットマン３で吸引することで、細胞Ｂへ細胞Ａの細胞質を移動させた（図４−１７〜１８、１７：位相差；１８：蛍光視野）。引き続きピペットマン３で吸引することで、細胞Ｂを細胞Ａから分離した（図４−１９〜２０）。これにより、細胞Ｂの細胞核は、細胞質との関係において、細胞Ａの細胞質内へ移植したのと同様の効果が得られた。 <Cytoplasmic transplantation>
The cytoplasm of cell A was moved to cell B by stopping the application of alternating current and aspirating with Pipetman 3 (FIGS. 4-17 to 18, 17: phase difference; 18: fluorescent visual field). Cell B was separated from cell A by subsequent aspiration with Pipetman 3 (FIGS. 4-19-20). As a result, the cell nucleus of cell B had the same effect as transplanted into the cytoplasm of cell A in relation to the cytoplasm.

（実施例２）
本実施例２では、ｉＰＳ細胞の細胞質を、細胞質を除去した線維芽細胞へ移植した。すなわち、ｉＰＳ細胞(Calcein AMとHoechst33342で染色)を実施例１の細胞Ａの代わりに、線維芽細胞 (Calcein red-orangeとHoechs33342で染色)を実施例１の細胞Ｂの代わりに用い、同じ実験条件で、実験を行ったところ、実験１と同様に、ｉＰＳ細胞の細胞質を、細胞質を除去した線維芽細胞へ移植することができ、ｉＰＳ細胞の細胞核を線維芽細胞の細胞質に移植したのと同様の効果が得られた。 (Example 2)
In Example 2, the cytoplasm of iPS cells was transplanted into fibroblasts from which the cytoplasm had been removed. That is, iPS cells (stained with Calcein AM and Hoechs 33342) were used in place of cell A in Example 1, and fibroblasts (stained with Calcein red-orange and Hoechs 33342) were used in place of cell B in Example 1 in the same experiment. When the experiment was conducted under the conditions, the cytoplasm of the iPS cells could be transplanted into the fibroblasts from which the cytoplasm had been removed, and the cell nuclei of the iPS cells were transplanted into the cytoplasm of the fibroblasts, as in Experiment 1. A similar effect was obtained.

１０１０第１の細胞の細胞核
１０２０第１の細胞の細胞質
１０２５第１の細胞の細胞膜
１０３０第１の細胞
１０３５操作後の第１の細胞
１０４０中間体
１０４５操作後の中間体側
１０５０溶液の流れ（第１の流路と第２の流路で流速が同じ場合）
１０６０交流
１０７０絶縁体の壁
１０８０孔
１０９０電圧印加
１１００第１の融合細胞
１１１０第１の流路における溶液の流れ
１１２０第２の流路における溶液の流れ
１１３０第２の細胞の細胞質
１１４０第２の細胞の細胞核
１１５０第２の細胞
１１６０第２の融合細胞
１１７０細胞質を交換した細胞
２０１０第１の細胞の細胞供給部
２０２０第２の細胞及び中間体の細胞供給部
２０３０第１の流路
２０４０第２の流路
２０５０孔
２０６０流速調節部
２０７０吸引路
２０７１第１の吸引口
２０７２第２の吸引口
２０７３第３の吸引口
２０８０電極
２０９０直流交流信号発生制御装置
２１００顕微鏡
２１１０圧力緩衝部
２２００画像認識部
２２１０ポンプ
２２１１ポンプ
２２１２ポンプ
２２１３ポンプ
２２２０流速制御装置 1010 Cell nucleus of first cell 1020 Cytoplasm of first cell 1025 Cell membrane of first cell 1030 First cell 1035 First cell after operation 1040 Intermediate 1045 Intermediate side after operation 1050 Solution flow (1st) When the flow velocity is the same in the flow path of No. 1 and the flow path of the second flow path)
1060 AC 1070 Insulator wall 1080 Hole 1090 Voltage application 1100 First fusion cell 1110 Solution flow in first flow path 1120 Solution flow in second flow path 1130 Second cell cytology 1140 Second cell Cell Nucleus 1150 Second Cell 1160 Second Fusion Cell 1170 Cellaceous Exchanged Cell 2010 First Cell Cell Supply 2020 Second Cell and Intermediate Cell Supply 2030 First Channel 2040 Second Channel Flow path 2050 Hole 2060 Flow control unit 2070 Suction path 2071 First suction port 2072 Second suction port 2073 Third suction port 2080 Electrode 2090 DC AC signal generation control device 2100 Microscope 2110 Pressure buffer 2200 Image recognition unit 2210 Pump 2211 Pump 2212 Pump 2213 Pump 2220 Flow control device

Claims

第１の流路及び第２の流路と、
第１の流路及び第２の流路のそれぞれの同じ側の一端に接続する細胞供給部と、
第１の流路の壁と第２の流路の壁との間に設けられた孔と、
孔を挟んで設けられた電極と、
前記電極に接続された直流交流信号発生装置と、
を備えた装置を用いて、
第１の細胞の細胞核を有し、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞を製造する製造方法であって、
第１の流路にある第１の細胞と、第２の流路にある中間細胞を、流路中の溶液の流れ及び／又は前記直流交流信号発生装置によって発生させた交流電界によって、前記孔に誘導する第１の工程と、
前記直流交流信号発生装置による交流電界中の誘電泳動力により、前記孔を挟んで第１の細胞と前記中間細胞の第１の細胞対を形成させる第２の工程と、
第１の細胞対に前記直流交流信号発生装置で電圧を印加することによって細胞融合させて、第１の融合細胞を作製する第３の工程と、
第２の流路内の流れの速度を、第１の流路内の流れの速度より大きくすることにより、第１の細胞の細胞質を前記中間細胞へ移動させる第４の工程と、ひきつづき第１の細胞と前記中間細胞を切り離す第５の工程と、
第２の細胞を、流路中の溶液の流れ及び／又は前記直流交流信号発生装置によって発生させた交流電界により、第２の流路の前記孔に誘導する第６の工程と、
前記直流交流信号発生装置による交流電界中の誘電泳動力により、前記孔を挟んで第１の細胞と第２の細胞の第２の細胞対を形成させる第７の工程と、
第２の細胞対に前記直流交流信号発生装置で電圧を印加することによって細胞融合させて第２の融合細胞を作製する第８の工程と、
第１の流路内の流れの速度を、第２の流路内の流れの速度より大きくすることにより、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ移動させる第９の工程と、ひきつづき第１の細胞を、第２の細胞から切り離す第１０の工程と、
を含み、
第４の工程において、第１の細胞の細胞質が９０％以上除去され、
第９の工程において、第２の細胞の細胞質が、９０％以上の細胞質が除去された前記第１の細胞へ導入される、製造方法。 The first flow path and the second flow path,
A cell supply unit connected to one end on the same side of each of the first flow path and the second flow path,
A hole provided between the wall of the first flow path and the wall of the second flow path,
Electrodes provided across the hole and
A DC AC signal generator connected to the electrode and
Using a device equipped with
A production method for producing a cell having the cell nucleus of the first cell and containing the cell membrane of the first cell and the cytoplasm of the second cell.
The pores of the first cells in the first flow path and the intermediate cells in the second flow path are caused by the flow of the solution in the flow path and / or the AC electric field generated by the DC AC signal generator. The first step to guide you to
A second step of forming a first cell pair of a first cell and an intermediate cell across the pore by a dielectrophoretic force in an AC electric field by the DC AC signal generator.
A third step of producing a first fused cell by fusing the first cell pair by applying a voltage to the first cell pair with the DC AC signal generator.
The fourth step of moving the cytoplasm of the first cell to the intermediate cell by making the velocity of the flow in the second channel higher than the velocity of the flow in the first channel, followed by the first step. And the fifth step of separating the cells from the intermediate cells,
The sixth step of inducing the second cell into the hole of the second flow path by the flow of the solution in the flow path and / or the AC electric field generated by the DC AC signal generator.
A seventh step of forming a second cell pair of a first cell and a second cell across the pore by a dielectrophoretic force in an AC electric field by the DC AC signal generator.
An eighth step of producing a second fused cell by fusing cells by applying a voltage to the second cell pair with the DC AC signal generator.
The ninth step of moving the cytoplasm of the second cell to the first cell by making the velocity of the flow in the first channel higher than the velocity of the flow in the second channel, and the continuation of the second step. In the tenth step of separating one cell from the second cell,
Including
In the fourth step, 90% or more of the cytoplasm of the first cell was removed.
A production method in which in the ninth step, the cytoplasm of the second cell is introduced into the first cell from which 90% or more of the cytoplasm has been removed.

前記製造された細胞が、９０％以上の第１の細胞の細胞膜と、９０％以上の第２の細胞の細胞質を含む、請求項１に記載の細胞の製造方法。 The method for producing a cell according to claim 1 , wherein the produced cell contains 90% or more of the cell membrane of the first cell and 90% or more of the cytoplasm of the second cell.

前記製造された細胞が、９５％以上の第１の細胞の細胞膜と、９５％以上の第２の細胞の細胞質を含む、請求項１に記載の細胞の製造方法。 The method for producing a cell according to claim 1 , wherein the produced cell contains 95% or more of the cell membrane of the first cell and 95% or more of the cytoplasm of the second cell.

第１の流路及び第２の流路は、前記細胞供給部と反対側の端に共通して第１の吸引口を有し、第１の吸引口にはポンプが設けられ、
第１の工程および／または第６の工程において、第１の吸引口からポンプで吸引することによって細胞を前記孔へ誘導する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。 The first flow path and the second flow path have a first suction port in common at the end opposite to the cell supply part, and the first suction port is provided with a pump.
The method for producing a cell according to any one of claims 1 to 3 , wherein in the first step and / or the sixth step , the cell is guided to the pore by sucking from the first suction port with a pump. ..

第１の流路及び第２の流路はそれぞれ、前記孔の第１の吸引口側で分岐し、分岐した第１の流路及び第２の流路のそれぞれの端に第２の吸引口及び第３の吸引口を有し、第２の吸引口及び第３の吸引口にはそれぞれポンプが設けられ、
第４の工程及び第９の工程において、それぞれ第３の吸引口及び第２の吸引口から、ポンプで吸引することによって細胞質を移動させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。 The first flow path and the second flow path are each branched on the side of the first suction port of the hole, and the second suction port is at each end of the branched first flow path and the second flow path. And has a third suction port, and a pump is provided in each of the second suction port and the third suction port.
The cell according to any one of claims 1 to 3, wherein in the fourth step and the ninth step, the cytoplasm is moved by sucking with a pump from the third suction port and the second suction port, respectively. Manufacturing method.

第１の流路及び第２の流路はそれぞれ、前記孔の第１の吸引口側で分岐し、分岐した第１の流路及び第２の流路のそれぞれの端に第２の吸引口及び第３の吸引口を有し、第２の吸引口及び第３の吸引口にはそれぞれポンプが設けられ、
第５の工程において、第１の細胞を誘電泳動力で前記孔で保持しながら、第３の吸引口から、ポンプで吸引することによって第１の細胞から中間細胞が切り離される、請求項１〜３に記載の細胞の製造方法。 The first flow path and the second flow path are each branched on the side of the first suction port of the hole, and the second suction port is at each end of the branched first flow path and the second flow path. And has a third suction port, and a pump is provided in each of the second suction port and the third suction port.
In the fifth step, the intermediate cells are separated from the first cells by sucking the first cells with a pump from the third suction port while holding the first cells in the pores by dielectrophoretic force , claims 1 to 1. 3. The method for producing cells according to 3.

第１の流路及び第２の流路はそれぞれ、前記孔の第１の吸引口側で分岐し、分岐した第１の流路及び第２の流路のそれぞれの端に第２の吸引口及び第３の吸引口を有し、第２の吸引口及び第３の吸引口にはそれぞれポンプが設けられ、 The first flow path and the second flow path are each branched on the side of the first suction port of the hole, and the second suction port is at each end of the branched first flow path and the second flow path. And has a third suction port, and a pump is provided in each of the second suction port and the third suction port.
第１０の工程において、第２の細胞を誘電泳動力で前記孔で保持しながら、第２の吸引口から、ポンプで吸引することによって第２の細胞から第１の細胞が切り離される、請求項１〜３に記載の細胞の製造方法。In the tenth step, the first cell is separated from the second cell by sucking the second cell from the second suction port with a pump while holding the second cell in the pore by dielectrophoretic force. The method for producing cells according to 1 to 3.

前記孔の最大幅または最大径は第１の細胞の核の径及び第２の細胞の核の径より小さい、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。 The method for producing a cell according to any one of claims 1 to 7, wherein the maximum width or maximum diameter of the pore is smaller than the diameter of the nucleus of the first cell and the diameter of the nucleus of the second cell.

前記孔の最大幅または最大径は６μｍ以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。 The method for producing a cell according to any one of claims 1 to 8 , wherein the maximum width or maximum diameter of the pore is 6 μm or less.

第１の流路及び第２の流路が平行である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。 The method for producing a cell according to any one of claims 1 to 8 , wherein the first flow path and the second flow path are parallel.

前記第１の細胞は体細胞であり、前記第２の細胞は幹細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。 The method for producing a cell according to any one of claims 1 to 10, wherein the first cell is a somatic cell and the second cell is a stem cell.

前記幹細胞は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、肝幹細胞、生殖幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、骨格筋幹細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の細胞の製造方法。 The method for producing cells according to claim 11 , wherein the stem cells are selected from the group consisting of iPS cells, ES cells, neural stem cells, epithelial stem cells, hepatic stem cells, germ stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and skeletal muscle stem cells. ..

前記体細胞は、線維芽細胞または血球細胞である、請求項１１に記載の細胞の製造方法。 The method for producing a cell according to claim 11 , wherein the somatic cell is a fibroblast or a blood cell.

前記装置が、前記孔と前記第１〜第３の吸引口のうち少なくとも１つの吸引口間に圧力緩衝部を備える、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。 The apparatus comprises a pressure buffering portion between at least one suction opening of said hole and the first to third suction port, the manufacturing method of the cell according to any one of claims 1 to 13.

前記装置において、
画像認識装置を備えた顕微鏡が設けられ、
前記画像認識装置と前記ポンプに、流速制御装置が設けられた、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。 In the device
A microscope equipped with an image recognition device is provided,
The method for producing cells according to any one of claims 1 to 14 , wherein a flow velocity control device is provided in the image recognition device and the pump.

前記中間細胞が第２の細胞と同じ種類の細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。The method for producing a cell according to any one of claims 1 to 15, wherein the intermediate cell is a cell of the same type as the second cell.