JP6862347B2 - 膵内分泌細胞の製造方法、及び分化転換剤 - Google Patents

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Description

本発明は、体細胞から膵内分泌細胞を製造する膵内分泌細胞の製造方法、及び体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤に関する。
膵内分泌細胞は、糖尿病の再生医療の材料として、また、糖尿病治療薬のスクリーニングに用いる材料などとして用いることが期待されている。前記再生医療の観点からは、例えば、インスリンが不足しているＩ型糖尿病の患者に対し、膵内分泌細胞の１つであり、インスリンを産生するβ細胞を投与することが期待されている。
そのため、膵内分泌細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで大量に調製する方法の開発が強く求められている。
これまでに、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、以下、「ＥＳ細胞」と称することがある）、又は人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、以下、「ｉＰＳ細胞」と称することがある）を用いてβ細胞を製造する方法が提案されている。しかしながら、前記方法では、細胞培養用の培地に様々な発生分化に関わる阻害剤を加えるなど培養環境を整える必要があり、煩雑であるという問題があり、また、再現性が得られない場合があるという問題もある。また、前記方法では、β細胞以外の細胞も製造されることから、効率面での問題もある。更に、β細胞を得るまでに、最低でも２１日〜３０日を要し、短期間で製造することができないという問題もある。
したがって、簡便で再現が容易であり、生産効率に優れ、かつ短期間で製造することができる膵内分泌細胞の製造方法の速やかな提供が強く求められているのが現状である。
なお、ＧＬＩＳ１（ＧＬＩＳ ｆａｍｉｌｙ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ １）は、ｉＰＳ細胞の樹立改善効率を改善することが知られている（例えば、特許文献１参照）。
しかしながら、ＧＬＩＳ１が、幹細胞を経ずに、体細胞を直接膵内分泌細胞に変換することに関与することは、全く知られていない。
特表２０１３−５１９３７１号公報
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、簡便で再現が容易であり、生産効率に優れ、かつ短期間で製造することができる膵内分泌細胞の製造方法、及び体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤を提供することを目的とする。
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入する導入工程を含むことを特徴とする膵内分泌細胞の製造方法である。
（Ａ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
（Ｂ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物。
（Ｃ）ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
（Ｄ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
＜２＞ 体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤であって、
下記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物を含むことを特徴とする分化転換剤である。
（Ａ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
（Ｂ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物。
（Ｃ）ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
（Ｄ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、簡便で再現が容易であり、生産効率に優れ、かつ短期間で製造することができる膵内分泌細胞の製造方法、及び体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤を提供することができる。
図１Ａは、試験例１−１において、ＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を測定した結果を示す図である。 図１Ｂは、試験例１−１において、インスリン遺伝子の相対発現量を測定した結果を示す図である。 図１Ｃは、試験例１−２において、インスリン遺伝子の相対発現量を測定した結果を示す図である。 図２Ａは、試験例２−１において、ＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を測定した結果を示す図である。 図２Ｂは、試験例２−１において、インスリン遺伝子の相対発現量を測定した結果を示す図である。 図２Ｃは、試験例２−２において、インスリン遺伝子の相対発現量を測定した結果を示す図である。 図３Ａは、試験例３−１において、ＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を測定した結果を示す図である。 図３Ｂは、試験例３−１において、インスリン遺伝子の相対発現量を測定した結果を示す図である。 図３Ｃは、試験例３−２において、インスリン遺伝子の相対発現量を測定した結果を示す図である。 図４は、試験例４のグルコース応答性インスリン分泌試験の結果を示すグラフである。 図５は、試験例５のグルコース応答性インスリン分泌試験の結果を示すグラフである。 図６は、試験例６のインスリン遺伝子の相対発現量を測定した結果を示す図である。 図７は、試験例７のインスリン遺伝子の相対発現量を測定した結果を示す図である。 図８は、試験例８のインスリン遺伝子の相対発現量を測定した結果を示す図である。
（膵内分泌細胞の製造方法）
本発明の膵内分泌細胞の製造方法は、導入工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
＜導入工程＞
前記導入工程は、下記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入する工程である。
（Ａ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物（以下、「遺伝子乃至その遺伝子産物（Ａ）」と称することがある）。
（Ｂ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物（以下、「遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｂ）」と称することがある）。
（Ｃ）ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物（以下、「遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｃ）」と称することがある）。
（Ｄ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物（以下、「遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｄ）」と称することがある）。
前記遺伝子産物とは、前記遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、前記ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質をいう。
＜＜遺伝子乃至その遺伝子産物＞＞
−態様−
前記導入工程で体細胞に導入する遺伝子乃至その遺伝子産物の態様としては、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ａ）、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｂ）、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｃ）、及び前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｄ）のいずれかを含む限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、膵内分泌細胞の生産効率に優れる点で、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ａ）、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｂ）、及び前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｄ）のいずれかを含む態様が好ましく、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ａ）及び前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｄ）のいずれかを含む態様がより好ましい。
前記導入工程で体細胞に導入する遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ａ）、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｂ）、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｃ）、及び前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｄ）のいずれかのみの態様であってもよいし、その他の遺伝子乃至その遺伝子産物を含む態様であってもよい。
−ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物−
前記ＧＬＩＳ１遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウスなどが挙げられる。
前記ＧＬＩＳ１遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿１４７１９３（ヒト）、ＮＭ＿１４７２２１（マウス）で入手することができる。
−変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物−
前記変異ＧＬＩＳ１遺伝子とは、配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する遺伝子である。
前記配列番号：１で表される塩基配列は、マウスＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端の３６０アミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードする遺伝子の配列である。
前記配列番号：２で表される塩基配列は、ヒトＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端の１９０アミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードする遺伝子の配列である。
前記配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列との配列同一性としては、８５％以上であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上が更に好ましく、９９％以上が特に好ましい。
前記配列同一性の決定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ． ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． （１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７： ２２６４−２２６８、Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ． ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０： ５８７３）を用いて決定することができる。
−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物−
前記Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウスなどが挙げられる。
前記Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿００９７１９（マウス）、ＮＭ＿０２０９９９（ヒト）で入手することができる。
−Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物−
前記Ｐｄｘ１遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウスなどが挙げられる。
前記Ｐｄｘ１遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿０００２０９（ヒト）、ＮＭ＿００８８１４（マウス）で入手することができる。
−ＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物−
前記ＭａｆＡ遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウスなどが挙げられる。
前記ＭａｆＡ遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿２０１５８９（ヒト）、ＮＭ＿１９４３５０（マウス）で入手することができる。
−その他の遺伝子乃至その遺伝子産物−
前記その他の遺伝子乃至その遺伝子産物としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ＧＬＩＳ１遺伝子、変異ＧＬＩＳ１遺伝子、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子、Ｐｄｘ１遺伝子、ＭａｆＡ遺伝子、及びその他の遺伝子の配列は、前記各遺伝子の配列のうち、タンパク質をコードする部分のみの配列からなる態様であってもよいし、タンパク質をコードする部分以外の配列を含む態様であってもよい。
また、前記ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、ＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びその他の遺伝子乃至その遺伝子産物は、本発明の効果を損なわない限り、変異が含まれていてもよい。
前記変異としては、例えば、前記各遺伝子のタンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない変異、前記各遺伝子のタンパク質のアミノ酸配列において、１個又は数個（２個〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加される変異などが挙げられる。
前記ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、ＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びその他の遺伝子乃至その遺伝子産物が変異を有する場合の野生型との配列同一性としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、タンパク質に翻訳される部分の塩基配列において、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が特に好ましい。
＜＜体細胞＞＞
前記体細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記体細胞は未分化な前駆細胞であってもよいし、最終分化した成熟細胞であってもよい。
前記体細胞は、ＥＳ細胞由来、又はｉＰＳ細胞由来のものであってもよい。
前記体細胞の具体例としては、脂肪組織由来間質（幹）細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、線維芽細胞、肝細胞、上皮細胞、腎細胞、マクロファージ、リンパ球、筋肉細胞、神経細胞、神経膠細胞などが挙げられる。これらの中でも、線維芽細胞、間葉系幹細胞、肝細胞、上皮細胞、腎細胞が好ましく、線維芽細胞、間葉系幹細胞がより好ましい。
前記体細胞を採取する個体の種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウスなどが挙げられる。
前記体細胞を採取する個体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、得られる膵内分泌細胞を再生医療用途に用いる場合には、拒絶反応の観点から、個体自身、又はＭＨＣの型が同一若しくは実質的に同一の他個体が好ましい。ここで、前記ＭＨＣの型が実質的に同一とは、免疫抑制剤などの使用により、前記体細胞由来の膵内分泌細胞を個体に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にＭＨＣの型が一致していることをいう。
前記体細胞を採取する個体の時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記体細胞の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養温度は約３７℃、ＣＯ２濃度は約２％〜５％などが挙げられる。
前記体細胞の培養に用いる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５質量％〜２０質量％の血清を含む、最小必須培地（以下、「ＭＥＭ」と称することがある）、ダルベッコ変法イーグル培地（以下、「ＤＭＥＭ」と称することがある）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地などが挙げられる。
＜＜導入方法＞＞
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ベクターを用いる方法、合成したｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）を用いる方法、組換えタンパク質を用いる方法などが挙げられる。
−ベクター−
前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクターなどが挙げられる。
前記ウイルスベクターの具体例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。
前記非ウイルスベクターの具体例としては、プラスミドベクター、エピゾーマルベクターなどが挙げられる。
前記ベクターを前記体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法を適宜選択することができる。
前記レトロウイルスベクターを用いる場合の方法は、例えば、国際公開第２００７／６９６６６号、Ｃｅｌｌ， １２６， ６６３−６７６ （２００６）、Ｃｅｌｌ， １３１， ８６１−８７２（２００７）などに記載の方法を用いることができ、前記レンチウイルスベクターを用いる場合の方法は、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３１８， １９１７−１９２０（２００７）などに記載の方法を用いることができる。
また、前記プラスミドベクターを用いる場合の方法は、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３２２， ９４９−９５３（２００８）などに記載の方法を用いることができ、前記エピゾーマルベクターを用いる場合の方法は、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３２４： ７９７−８０１（２００９）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ４２６： １４１−１４７ （２０１２）などに記載の方法を用いることができる。
前記ウイルスベクターを用いる場合には、パッケージング細胞を用いて得られたウイルス粒子を用いてもよい。
前記パッケージング細胞は、ウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞であり、該細胞に目的遺伝子を組み込んだ組換えウイルスベクターを導入すると、該目的遺伝子を組み込んだ組換えウイルス粒子を産生する。
前記パッケージング細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞やマウス線維芽細胞由来のＮＩＨ３Ｔ３細胞をベースとしたパッケージング細胞、長期にわたって高力価のウイルスを産生できるウイルス構造タンパク質ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖをＭｏＭｕＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ） ＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）のコントロール下で発現させているパッケージング細胞Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ（以下、「Ｐｌａｔ−Ｅ細胞」と称することがある）、Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ｖｉｒｕｓ由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰＬＡＴ−Ａ細胞、水疱性口内炎ウイルス由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰＬＡＴ−ＧＰ細胞などが挙げられる。
前記パッケージング細胞へのウイルスベクターの導入方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。
前記得られたウイルス粒子を前記体細胞へ感染させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリブレン法が挙げられる。
前記ベクターは、前記各遺伝子の導入を確認するためのマーカー遺伝子を含んでいてもよい。
前記マーカー遺伝子とは、該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子をいう。前記マーカー遺伝子の具体例としては、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記薬剤耐性遺伝子の具体例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
前記蛍光タンパク質遺伝子の具体例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子などが挙げられる。
前記発光酵素遺伝子の具体例としては、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
前記発色酵素遺伝子の具体例としては、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子などが挙げられる。
前記ベクターを用いて前記各遺伝子を体細胞に導入する方法では、１つのベクターに１つの遺伝子を組み込んでもよいし、２つ以上の遺伝子を組み込んでもよい。前記１つのベクターに２つ以上の遺伝子を組み込むことにより、該２つ以上の遺伝子を同時に発現（以下、「共発現」と称することがある）させることができる。
前記１つのベクターに２つ以上の遺伝子を組み込む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記２つ以上の遺伝子を、連結配列を通じて組み込むことが好ましい。
前記連結配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、***ウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ）由来２Ａペプチドをコードする遺伝子配列、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅｓ）などが挙げられる。
前記ｍＲＮＡを前記体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。
前記組換えタンパク質を前記体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の体細胞への導入回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１回であってもよいし、２回以上であってもよい。
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の体細胞への導入時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の全てを同時期に導入してもよいし、異なる時期に導入してもよい。
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の体細胞への導入量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、全ての遺伝子乃至その遺伝子産物の導入量を等量としてもよいし、それぞれ異なる量としてもよい。
前記遺伝子乃至その遺伝子産物は、同一の遺伝子乃至その遺伝子産物において、遺伝子のみを用いる態様であってもよいし、遺伝子産物のみを用いる態様であってもよいし、両者を用いる態様であってもよい。
また、前記遺伝子乃至その遺伝子産物は、異なる遺伝子乃至その遺伝子産物との組合せにおいて、全ての遺伝子乃至その遺伝子産物が遺伝子のみの組合せとしてもよいし、全ての遺伝子乃至その遺伝子産物が遺伝子産物のみの組合せとしてもよいし、いずれかの遺伝子乃至遺伝子産物は遺伝子とし、他の遺伝子乃至遺伝子産物は遺伝子産物とする組合せとしてもよい。
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入工程では、本発明の効果を損なわない限り、前記遺伝子乃至その遺伝子産物以外の物を導入してもよい。
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物が導入された体細胞を培養する遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞培養工程などが挙げられる。
−遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞培養工程−
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞培養工程は、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物が導入された体細胞を培養する工程である。
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養温度は約３７℃、ＣＯ２濃度は約２％〜５％などが挙げられる。
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞の培養に用いる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５質量％〜２０質量％の血清を含む、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地などが挙げられる。
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞を培養する期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記培地の交換頻度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２日間〜３日間毎に交換するなどが挙げられる。
＜膵内分泌細胞＞
前記膵内分泌細胞の製造方法により、膵内分泌細胞が製造されたか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、膵内分泌細胞が発現するタンパク質の発現を確認する方法、膵内分泌細胞が発現する遺伝子の発現を確認する方法などが挙げられる。
例えば、膵内分泌細胞のα細胞が製造されたか否かは、グルカゴンの発現の有無により確認することができ、β細胞が製造されたか否かは、インスリンの発現の有無により確認することができ、δ細胞が製造されたか否かは、ソマトスタチンの発現の有無により確認することができる。
前記タンパク質の発現を確認する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、免疫染色により確認することができる。
前記遺伝子の発現を確認する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、定量ＰＣＲにより確認することができる。
本発明の膵内分泌細胞の製造方法によれば、分化転換により、体細胞から膵内分泌細胞を製造することができるため、腫瘍形成のリスクを有するｉＰＳ細胞を経ずに膵内分泌細胞を製造することができる点で、有利である。
なお、前記分化転換とは、ある細胞型から他の細胞型へ、幹細胞を経ずに直接変換することをいう。
また、本発明の膵内分泌細胞の製造方法は、体細胞に遺伝子乃至その遺伝子産物を導入するという簡便で、且つ再現が容易な方法でありながら、膵内分泌細胞を短期間で、効率良く生産することができる。また、本発明の膵内分泌細胞の製造方法によれば、培地中に発生阻害剤等を添加するなどの培養環境を整える処理を行うなどの特殊な培地を用いることなく、膵内分泌細胞を製造することができる点でも、有利である。
前記膵内分泌細胞は、α細胞であってもよいし、β細胞であってもよいし、δ細胞であってもよいし、これらの混合物であってもよい。これらの中でも、糖尿病患者に対する再生医療の観点からは、β細胞が好ましい。
本発明の膵内分泌細胞は、例えば、再生医療や糖尿病治療薬のスクリーニングに用いる膵内分泌細胞などとして好適に利用可能である。
（分化転換剤）
本発明の分化転換剤は、体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤であって、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ａ）、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｂ）、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｃ）、及び前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｄ）のいずれかを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
＜体細胞＞
前記分化転換剤が対象とする体細胞は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
＜膵内分泌細胞＞
前記分化転換剤により得られる膵内分泌細胞は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
＜遺伝子乃至その遺伝子産物＞
−態様−
前記分化転換剤における遺伝子乃至その遺伝子産物の態様としては、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ａ）、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｂ）、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｃ）、及び前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｄ）のいずれかを含む限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、膵内分泌細胞の生産効率に優れる点で、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ａ）、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｂ）、及び前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｄ）のいずれかを含む態様が好ましく、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ａ）及び前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｄ）のいずれかを含む態様がより好ましい。
前記分化転換剤における遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ａ）、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｂ）、前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｃ）、及び前記遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｄ）のいずれかのみの態様であってもよいし、その他の遺伝子乃至その遺伝子産物を含む態様であってもよい。
−ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物−
前記ＧＬＩＳ１遺伝子は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様である。また、前記ＧＬＩＳ１遺伝子の配列の態様は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様である。また、前記ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様の変異が含まれていてもよい。
−変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物−
前記変異ＧＬＩＳ１遺伝子は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様である。また、前記変異ＧＬＩＳ１遺伝子の配列の態様は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様である。
−Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物−
前記Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様である。また、前記Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子の配列の態様は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様である。また、前記Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様の変異が含まれていてもよい。
−Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物−
前記Ｐｄｘ１遺伝子は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様である。また、前記Ｐｄｘ１遺伝子の配列の態様は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様である。また、前記Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様の変異が含まれていてもよい。
−ＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物−
前記ＭａｆＡ遺伝子は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様である。また、前記ＭａｆＡ遺伝子の配列の態様は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様である。また、前記ＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様の変異が含まれていてもよい。
−その他の遺伝子乃至その遺伝子産物−
前記その他の遺伝子は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様である。また、前記その他の遺伝子の配列の態様は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様である。また、前記その他の遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様の変異が含まれていてもよい。
前記分化転換剤における前記各遺伝子乃至その遺伝子産物は、該遺伝子をベクターに組み込んだ態様としたものであってもよいし、合成ｍＲＮＡとした態様であってもよいし、組換えタンパク質とした態様であってもよい。
前記ベクターとしては、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記合成ｍＲＮＡ、前記組換えタンパク質は、公知の方法により製造することができる。
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記分化転換剤は、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物が、個別の容器に分けられている態様であってもよいし、１つの容器にまとめられている態様であってもよいし、任意の数ごとに容器にまとめられている態様であってもよい。
前記分化転換剤における前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の量としては、特に制限はなく、全ての遺伝子乃至その遺伝子産物を等量としてもよいし、異なる量としてもよい。
前記分化転換剤は、膵内分泌細胞製造用キットの構成として、好適に用いることができる。
前記膵内分泌細胞製造用キットは、前記分化転換剤を少なくとも含み、更に必要に応じてその他の構成を含む。
前記膵内分泌細胞製造用キットにおけるその他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パッケージング細胞、培地などが挙げられる。
前記パッケージング細胞、培地としては、前記膵内分泌細胞の製造方法の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
以下、試験例を挙げて、本発明を説明するが、本発明は、以下の試験例に何ら限定されるものではない。
（試験例１−１：膵内分泌細胞の製造−１−１）
＜細胞の調製＞
以下のようにして、体細胞の１種である２重蛍光標識されたマウス胎児線維芽細胞（ｄｕａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ−ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、以下、「ｄＭＥＦ」と称することがある）を調製した。
−膵内分泌前駆細胞をＧＦＰで蛍光標識した遺伝子改変マウスの作製−
膵内分泌前駆細胞をＧＦＰで蛍光標識した遺伝子改変マウス（Ｎｇｎ３遺伝子のプロモーター制御下にＥＧＦＰを発現するマウス（Ｎｇｎ３−ｅＧＦＰ））を以下のようにして作製した。
ＢＡＣクローンから単離したＮｇｎ３遺伝子のプロモーター（５ｋｂ）の下流に、ＧＦＰと核移行シグナル（以下、「ｎｌｓ」と称することがある）との融合タンパク質遺伝子を繋げたコンストラクトを約４００個の受精卵へマイクロインジェクションし、膵内分泌前駆細胞をＧＦＰで蛍光標識した遺伝子改変マウスを作製した。
−膵β細胞をＤｓＲｅｄ２で蛍光標識した遺伝子改変マウスの作製−
膵β細胞をＤｓＲｅｄ２で蛍光標識した遺伝子改変マウス（ラットインスリンプロモーター制御下にＤｓＲｅｄ２を発現するマウス（Ｉｎｓ−ＤｓＲ））を以下のようにして作製した。
ラットインスリン遺伝子のプロモーター（８００ｂｐ）の下流に、ＤｓＲｅｄ２遺伝子を繋げたコンストラクトを約４００個の受精卵へマイクロインジェクションし、膵β細胞をＤｓＲｅｄ２で蛍光標識した遺伝子改変マウスを作製した。
−２重蛍光標識マウス胎児線維芽細胞の作製−
前記膵内分泌前駆細胞をＧＦＰで蛍光標識した遺伝子改変マウスと、前記膵β細胞をＤｓＲｅｄ２で蛍光標識した遺伝子改変マウスとを交配させた後、産仔マウス（ヘテロ）の雌と雄とを交配し、ゲノミックサザン法によってホモ化された２重蛍光標識遺伝子改変マウス（Ｎｇｎ３−ｅＧＦＰ／Ｉｎｓ−ＤｓＲ）を作出した。前記ホモ化された２重蛍光標識遺伝子改変マウスの雌と雄とを交配（２ペア）し、胎生期１４．５日目の胎児１６匹をピンセットで子宮より摘出し、クリーンベンチ内にて１０ｍＬのリン酸緩衝食塩水（カナマイシン １０ｍｇ／ｍＬ含有）入り１０ｃｍペトリ皿で血液を洗浄後、１０ｍＬのＤＭＥＭ（シグマ社製、＃Ｄ５７９６；ペニシリン、ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ含有）入り１０ｃｍ細胞培養ディッシュ（ＴＰＰ社製、＃９３１５０）内にて胎児をハサミで細切した。細切した胎児組織を１５ｍＬチューブへ移し、１．４ｋｒｐｍで４分間、室温で遠心し、上清を捨て、ペレットに０．２５％トリプシン含有ＥＤＴＡ溶液（和光純薬工業株式会社製、＃２０１−１６９４５） １ｍＬ（０．２５％ＤＮａｓｅ Ｉ含有）を加えて懸濁後、３７℃のウォーターバスでインキュベートした。１０分間おきに手で攪拌した。５ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を１５ｍＬチューブへ入れ、１匹分の胎児組織断片をよく懸濁し、５ｍＬのＤＭＥＭ入り１０ｃｍ細胞培養皿へ移して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し、翌日１０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を入れ替え、以降は２日間に一度培地を交換した。約４日間後から５日間後、１０ｃｍ培養皿いっぱいに増えたｄＭＥＦを６ｍＬのリン酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」と称することがある）で洗浄後、１ｍＬの０．２５％トリプシン含有ＥＤＴＡ溶液を入れ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で２分間後、細胞が剥がれたことを確認した後、１０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を入れよく懸濁し、培養皿１枚分のｄＭＥＦを新たな１０ｃｍ培養皿５枚に播種し、更に培養した。５日間から６日間後、ｄＭＥＦがコンフルエントに増殖したことを確認し、６ｍＬのＰＢＳで洗浄後、１ｍＬの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を入れ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で２分間後、細胞が剥がれたことを確認した後、６ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を入れ、よく懸濁し、５０ｍＬチューブに入れ、１．４ｋｒｐｍで４分間、室温で遠心後に上清を捨て、細胞ペレットに１０ｍＬのセルバンカー（タカラバイオ株式会社製、＃ＣＢ０１１）を加えて、懸濁後、０．５ｍＬずつバイアルチューブへ分注し、−１４５℃の超低温フリーザー内にて保管した。
＜レトロウイルスの作製＞
長期にわたって高力価のウイルスを産生できるウイルス構造タンパク質ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖをＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのコントロール下で発現させているＰｌａｔ−Ｅ細胞と、プラスミドＤＮＡ（ｐＭＸベクター又はｐＭＸ−ｐｕｒｏベクター）とを用い、以下のようにしてレトロウイルスを作製した（Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４，３２４−３２９，１９９６）。
−プラスミドＤＮＡの調製−
［ｐＭＸ−ＧＦＰベクター］
ｐＭＸ−ＧＦＰベクターは、ＧＦＰタンパク質の全長をコードする遺伝子をｐＭＸベクター及びｐＭＸｐｕｒｏべクター（東京大学医学研究所より入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記ＧＦＰタンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号Ｌ２９３４５で登録されている。
［ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター］
ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクターは、マウスＧＬＩＳ１タンパク質の全長をコードする遺伝子をｐＭＸベクター（Ａｄｄｇｅｎｅより入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記マウスＧＬＩＳ１タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿１４７２２１で登録されている。
［ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター］
ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクターは、マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３タンパク質の全長をコードする遺伝子をｐＭＸベクター（東京大学医学研究所より入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿００９７１９で登録されている。
［ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター］
ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクターは、マウスＰｄｘ１タンパク質の全長をコードする遺伝子をｐＭＸベクター（東京大学医学研究所より入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記マウスＰｄｘ１タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿００８８１４で登録されている。
［ｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター］
ｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクターは、マウスＭａｆＡタンパク質の全長をコードする遺伝子をｐＭＸベクター（東京大学医学研究所より入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記マウスＭａｆＡタンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿１９４３５０で登録されている。
−レトロウイルスの作製−
ＰＢＳで１０倍希釈したＰｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ（シグマ社製、Ｐ８９２０）で、コート処理（３７℃、５％ＣＯ２で１時間）した６ウェルプレート（ＴＰＰ社製、９２４０６）に、Ｐｌａｔ−Ｅ細胞を１ウェルあたり８×１０５細胞数播種し、一晩培養した。
翌日、前記プラスミドＤＮＡ ４μｇを２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社製、１１０５８０２１）が入った１．５ｍＬチューブへ入れ、タッピングで混和して室温で５分間放置した（以下、「プラスミド／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液」と称することがある）。一方、２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ入りの別の１．５ｍＬチューブへ、リポフェクタミン（登録商標） ２０００（ＬＰ２０００）（ライフテクノロジーズ社製、１１６６８５００）を１０μＬ入れ、混和して室温５分間放置した（以下、「ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液」と称することがある）。前記プラスミド／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液と、前記ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液とをよく混和し、室温で２０分間静置した（以下、「プラスミド／ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液」と称することがある）。
リポソームＤＮＡ複合体を形成させた前記プラスミド／ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液を前日播種したＰｌａｔ−Ｅ細胞を培養する６ウェルプレートの１ウェルへ添加（トランスフェクション）した。混和後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で一晩培養した。２４時間後、培地交換を行い、新たに１．５ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を添加し、さらに２４時間培養した。
トランスフェクション後４８時間でウイルス粒子を含む培養上清を２．５ｍＬシリンジ（テルモ株式会社製、ＳＳ−０２ＳＺ）で回収し、０．４５フィルター（ワットマン社製、プラディスクＦＰ３０（ＣＡ−Ｓ０．４５μｍ）、１０４６２１００）でＰｌａｔ−Ｅ細胞を除去し、ウイルス粒子を含む培養上清を２．０ｍＬチューブへ移した。
以上により、ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を得た。
＜導入＞
前記ｄＭＥＦへ前記レトロウイルスを感染させることにより、遺伝子を細胞に導入した。感染は、以下のようにして行った。
前記ｄＭＥＦを、２４ウェルプレートへ、１ウェルあたり２．５×１０４細胞数で播種した。
翌日、前記ウイルス溶液に、８ｍｇ／ｍＬポリブレン溶液（シグマ社製、１０７６８９）を最終濃度８μｇ／ｍＬになるよう添加した。前記ｄＭＥＦの培養上清を吸引して除去後、下記のウイルス溶液をそれぞれ、２４ウェルプレートの１ウェルあたり２００μＬ加えた。なお、各々のウェルのウイルス溶液の量が均一になるように、ポリブレン８μｇ／ｍＬを含むＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）溶液で調整した。ウイルス溶液添加後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。培養中は、２日間又は３日間毎に培地交換を行った。
［ウイルス溶液］
（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）
（２）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液
（３）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
（４）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
＜ｄＭＥＦ由来インスリン産生細胞数の決定＞
前記導入を行い、培養２２日間後にＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞を蛍光顕微鏡装置（カールツァイスＡｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ）で撮影した。
統計解析は、以下のようにして行った。
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ライフテクノロジーズ社製、Ｈ１３９９）を最終濃度０．１μｇ／ｍｌになるようにウェルに添加後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で３０分間以上培養した細胞培養マルチウェルプレートを、ハイエンド細胞イメージング装置（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＸＴＩ）を用いて、各ウェルに対して対物レンズ１０倍設定にて１００視野を撮影し、１００視野中の全細胞数中のＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を測定した。結果を、図１Ａに示す。
図１Ａ中、「ＣＴＬ」は、（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＰ」は、（２）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＭ」は、（３）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＰＭ」は、（４）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示す。
図１Ａの結果から、本発明の製造方法の態様の１つであるＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、Ｐｄｘ１、及びＭａｆＡの４因子を用いた場合に、膵内分泌細胞の生産効率が非常に高まることが示された。
＜定量ＰＣＲ解析＞
前記導入を行い、培養２４日間後の細胞を用い、以下のようにして定量ＰＣＲ解析を行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するインスリン遺伝子の相対発現量を調べた。
前記細胞を細胞溶解液に懸濁し、ＳｕｐｅｒＰｒｅｐＴＭ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ＆ ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（東洋紡株式会社製、＃ＳＣＱ−１０１）、又はＳＶ ９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、＃Ｚ３５０５）、ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡株式会社製、＃ＦＳＱ−３０１）にてＲＮＡ調製及びｃＤＮＡ合成を行った後、ＧｅｎｅＡｃｅ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘα（日本ジーン株式会社製）を用い、ロッシュ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０にて定量ＰＣＲを行った。
なお、定量ＰＣＲに用いたプライマーは、以下のとおりである。
−マウスＧＡＰＤＨ遺伝子−
フォワード： ５’−ｔｇｇａｇａａａｃｃｔｇｃｃａａｇｔａｔｇ−３’（配列番号３）
リバース： ５’−ｇｇａｇａｃａａｃｃｔｇｇｔｃｃｔｃａｇ−３’（配列番号４）
−マウスインスリン２遺伝子−
フォワード： ５’−ｔｔｔｇｔｃａａｇｃａｇｃａｃｃｔｔｔｇ−３’（配列番号５）
リバース： ５’−ｇｇｔｃｔｇａａｇｇｔｃａｃｃｔｇｃｔｃ−３’（配列番号６）
定量ＰＣＲ解析の結果を図１Ｂに示す。図１Ｂ中、「ＣＴＬ」は、（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＰ」は、（２）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＭ」は、（３）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＰＭ」は、（４）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示す。
図１Ｂの結果から、本発明の製造方法の態様の１つであるＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、Ｐｄｘ１、及びＭａｆＡの４因子を用いた場合に、インスリン遺伝子の発現量も増加しており、この点からも、膵内分泌細胞の生産効率が非常に高まることが示された。
（試験例１−２：膵内分泌細胞の製造−１−２）
＜細胞の調製＞
前記試験例１−１と同様にして、ｄＭＥＦを調製した。
＜レトロウイルスの作製＞
長期にわたって高力価のウイルスを産生できるウイルス構造タンパク質ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖをＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのコントロール下で発現させているＰｌａｔ−ＧＰ細胞と、プラスミドＤＮＡ（ｐＭＸベクター又はｐＭＸ−ｐｕｒｏベクター、ＶＳＶＧベクター）とを用い、以下のようにしてレトロウイルスを作製した（Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４，３２４−３２９，１９９６）。
−プラスミドＤＮＡの調製−
［ｐＭＸ−ＧＦＰベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−ＧＦＰベクターを調製した。
［ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター］
ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクターは、ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１タンパク質の全長をコードする遺伝子をｐＭＸベクター（Ａｄｄｇｅｎｅより入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿１４７１９３で登録されている。
［ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター］
ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクターは、ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３タンパク質の全長をコードする遺伝子をｐＭＸベクター（東京大学医学研究所より入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿０２０９９９で登録されている。
［ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター］
ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクターは、ヒトＰｄｘ１タンパク質の全長をコードする遺伝子をｐＭＸベクター（東京大学医学研究所より入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記ヒトＰｄｘ１タンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿０００２０９で登録されている。
［ｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター］
ｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクターは、ヒトＭａｆＡタンパク質の全長をコードする遺伝子をｐＭＸベクター（東京大学医学研究所より入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。なお、前記ヒトＭａｆＡタンパク質の全長をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿２０１５８９で登録されている。
−レトロウイルスの作製−
ＰＢＳで１０倍希釈したＰｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ（シグマ社製、Ｐ８９２０）で、コート処理（３７℃、５％ＣＯ２で１時間）した６ウェルプレート（ＴＰＰ社製、９２４０６）に、Ｐｌａｔ−ＧＰ細胞を１ウェルあたり８×１０５細胞数播種し、一晩培養した。
翌日、前記プラスミドＤＮＡ ４μｇ（ｐＭＸベクターを２μｇ、ＶＳＶＧベクターを２μｇ）を２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社製、１１０５８０２１）が入った１．５ｍＬチューブへ入れ、タッピングで混和して室温で５分間放置した（以下、「プラスミド／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液」と称することがある）。一方、２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ入りの別の１．５ｍＬチューブへ、リポフェクタミン（登録商標） ２０００（ＬＰ２０００）（ライフテクノロジーズ社製、１１６６８５００）を１０μＬ入れ、混和して室温で５分間放置した（以下、「ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液」と称することがある）。前記プラスミド／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液と、前記ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液とをよく混和し、室温で２０分間静置した（以下、「プラスミド／ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液」と称することがある）。
リポソームＤＮＡ複合体を形成させた前記プラスミド／ＬＰ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液を前日播種したＰｌａｔ−ＧＰ細胞を培養する６ウェルプレートの１ウェルへ添加（トランスフェクション）した。混和後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で一晩培養した。２４時間後、培地交換を行い、新たに１．５ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を添加し、さらに２４時間培養した。
トランスフェクション後４８時間でウイルス粒子を含む培養上清を２．５ｍＬシリンジ（テルモ株式会社製、ＳＳ−０２ＳＺ）で回収し、０．４５フィルター（ワットマン社製、プラディスクＦＰ３０（ＣＡ−Ｓ０．４５μｍ）、１０４６２１００）でＰｌａｔ−ＧＰ細胞を除去し、ウイルス粒子を含む培養上清を２．０ｍＬチューブへ移した。
以上により、ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を得た。
＜導入＞
前記ｄＭＥＦへ前記レトロウイルスを感染させることにより、遺伝子を細胞に導入した。感染は、以下のようにして行った。
前記ｄＭＥＦを、２４ウェルプレートへ、１ウェルあたり２．５×１０４細胞数で播種した。
翌日、前記ウイルス溶液に、８ｍｇ／ｍＬポリブレン溶液（シグマ社製、１０７６８９）を最終濃度８μｇ／ｍＬになるよう添加した。前記ｄＭＥＦの培養上清を吸引して除去後、下記のウイルス溶液をそれぞれ、２４ウェルプレートの１ウェルあたり２００μＬ加えた。なお、各々のウェルのウイルス溶液の量が均一になるように、ポリブレン８μｇ／ｍＬを含むＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）溶液で調整した。ウイルス溶液添加後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。培養中は、２日間又は３日間毎に培地交換を行った。
［ウイルス溶液］
（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）
（２）ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液
（３）ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
（４）ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
＜定量ＰＣＲ解析＞
前記試験例１−１と同様にして、定量ＰＣＲ解析を行った。
定量ＰＣＲ解析の結果を図１Ｃに示す。図１Ｃ中、「ＣＴＬ」は、（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＰ」は、（２）ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＭ」は、（３）ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＰＭ」は、（４）ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示す。
図１Ｃの結果から、本発明の製造方法の態様の１つであるＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、Ｐｄｘ１、及びＭａｆＡの４因子を用いた場合は、ヒト遺伝子を用いた場合でも、インスリン遺伝子の発現量が増加しており、膵内分泌細胞の生産効率が非常に高まることが示された。
（試験例２−１：膵内分泌細胞の製造−２−１）
＜細胞の調製＞
前記試験例１−１と同様にして、ｄＭＥＦを調製した。
＜レトロウイルスの作製＞
長期にわたって高力価のウイルスを産生できるウイルス構造タンパク質ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖをＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのコントロール下で発現させているＰｌａｔ−Ｅ細胞と、プラスミドＤＮＡ（ｐＭＸベクター又はｐＭＸ−ｐｕｒｏベクター）とを用い、以下のようにしてレトロウイルスを作製した（Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４，３２４−３２９，１９９６）。
−プラスミドＤＮＡの調製−
［ｐＭＸ−ＧＦＰベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−ＧＦＰベクターを調製した。
［ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−マウス変異ＧＬＩＳ１ベクター］
ｐＭＸ−マウス変異ＧＬＩＳ１ベクターは、マウスＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端の３６０アミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードする遺伝子をｐＭＸベクター（Ａｄｄｇｅｎｅより入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。
前記マウスＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端の３６０アミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードする遺伝子の配列は、配列番号：１で表されるとおりであり、以下のようにして調製した。
前記ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクターを鋳型ＤＮＡとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＭＡＸ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）を用いたＰＣＲ法により、マウスＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端の３６０アミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅した。次いで、アガロース電気泳動により、前記ＤＮＡ断片を精製し、ｐＭＸベクターのＢａｍＨＩサイトとＸｈｏＩサイトとの間に挿入した。前記挿入断片の塩基配列は、シーケンス反応によって確認した。
［ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクターを調製した。
−レトロウイルスの作製−
前記試験例１−１において使用していたプラスミドＤＮＡを、本試験例のプラスミドＤＮＡに代えた以外は同様にして、ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウス変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を得た。
＜導入＞
前記試験例１−１において使用していたウイルス溶液を下記ウイルス溶液に代えた以外は同様にして、遺伝子を細胞に導入した。
［ウイルス溶液］
（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）
（２）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液
（３）ｐＭＸ−マウス変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液
＜ｄＭＥＦ由来インスリン産生細胞数の決定＞
前記導入を行い、培養１７日間後にＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞を蛍光顕微鏡装置で撮影した以外は試験例１−１と同様にして、ＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を測定した。結果を、図２Ａに示す。
図２Ａ中、「ＣＴＬ」は、（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＰ」は、（２）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ｄＧＮＰ」は、（３）ｐＭＸ−マウス変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示す。
図２Ａの結果から、本発明の製造方法の態様の１つである変異ＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、及びＰｄｘ１の３因子を用いた場合は、ＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、及びＰｄｘ１の３因子を用いた場合よりも、膵内分泌細胞の生産効率が非常に高まることが示された。
＜定量ＰＣＲ解析＞
前記試験例１−１と同様にして、定量ＰＣＲ解析を行った。
結果を図２Ｂに示す。図２Ｂ中、「ＣＴＬ」は、（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＰ」は、（２）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ｄＧＮＰ」は、（３）ｐＭＸ−マウス変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示す。
図２Ｂの結果から、本発明の製造方法の態様の１つである変異ＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、及びＰｄｘ１の３因子を用いた場合は、ＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、及びＰｄｘ１の３因子を用いた場合よりも、インスリン遺伝子の発現量も増加しており、この点からも、膵内分泌細胞の生産効率が非常に高まることが示された。
（試験例２−２：膵内分泌細胞の製造−２−２）
＜細胞の調製＞
前記試験例１−１と同様にして、ｄＭＥＦを調製した。
＜レトロウイルスの作製＞
長期にわたって高力価のウイルスを産生できるウイルス構造タンパク質ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖをＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのコントロール下で発現させているＰｌａｔ−ＧＰ細胞と、プラスミドＤＮＡ（ｐＭＸベクター又はｐＭＸ−ｐｕｒｏベクター、ＶＳＶＧベクター）とを用い、以下のようにしてレトロウイルスを作製した（Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４，３２４−３２９，１９９６）。
−プラスミドＤＮＡの調製−
［ｐＭＸ−ＧＦＰベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−ＧＦＰベクターを調製した。
［ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター］
前記試験例１−２と同様にして、ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター］
ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクターは、ヒトＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端の１９０アミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードする遺伝子をｐＭＸベクター（Ａｄｄｇｅｎｅより入手）のマルチクローニングサイトに組み込んだものである。
前記ヒトＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端の１９０アミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードする遺伝子の配列は、配列番号：２で表されるとおりであり、以下のようにして調製した。
前記ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクターを鋳型ＤＮＡとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＭＡＸ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）を用いたＰＣＲ法により、ヒトＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端の１９０アミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅した。次いで、アガロース電気泳動により、前記ＤＮＡ断片を精製し、ｐＭＸベクターのＢａｍＨＩサイトとＸｈｏＩサイトとの間に挿入した。前記挿入断片の塩基配列は、シーケンス反応によって確認した。
［ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター］
前記試験例１−２と同様にして、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター］
前記試験例１−２と同様にして、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクターを調製した。
−レトロウイルスの作製−
前記試験例１−２において使用していたプラスミドＤＮＡを、本試験例のプラスミドＤＮＡに代えた以外は同様にして、ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を得た。
＜導入＞
前記試験例１−２において使用していたウイルス溶液を下記ウイルス溶液に代えた以外は同様にして、遺伝子を細胞に導入した。
［ウイルス溶液］
（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）
（２）ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液
（３）ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液
＜定量ＰＣＲ解析＞
前記試験例１−１と同様にして、定量ＰＣＲ解析を行った。
結果を図２Ｃに示す。図２Ｃ中、「ＣＴＬ」は、（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＰ」は、（２）ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ｄＧＮＰ」は、（３）ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示す。
図２Ｃの結果から、本発明の製造方法の態様の１つである変異ＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、及びＰｄｘ１の３因子を用いた場合は、ヒト遺伝子を用いた場合でも、ＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、及びＰｄｘ１の３因子を用いた場合よりもインスリン遺伝子の発現量が増加しており、膵内分泌細胞の生産効率が非常に高まることが示された。
（試験例３−１：膵内分泌細胞の製造−３−１）
＜細胞の調製＞
前記試験例１−１と同様にして、ｄＭＥＦを調製した。
＜レトロウイルスの作製＞
長期にわたって高力価のウイルスを産生できるウイルス構造タンパク質ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖをＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのコントロール下で発現させているＰｌａｔ−Ｅ細胞と、プラスミドＤＮＡ（ｐＭＸベクター又はｐＭＸ−ｐｕｒｏベクター）とを用い、以下のようにしてレトロウイルスを作製した（Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４，３２４−３２９，１９９６）。
−プラスミドＤＮＡの調製−
［ｐＭＸ−ＧＦＰベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−ＧＦＰベクターを調製した。
［ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−マウス変異ＧＬＩＳ１ベクター］
前記試験例２−１と同様にして、ｐＭＸ−マウス変異ＧＬＩＳ１ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクターを調製した。
−レトロウイルスの作製−
前記試験例１−１において使用していたプラスミドＤＮＡを、本試験例のプラスミドＤＮＡに代えた以外は同様にして、ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウス変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を得た。
＜導入＞
前記試験例１−１において使用していたウイルス溶液を下記ウイルス溶液に代えた以外は同様にして、遺伝子を細胞に導入した。
［ウイルス溶液］
（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）
（２）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
（３）ｐＭＸ−マウス変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
＜ｄＭＥＦ由来インスリン産生細胞数の決定＞
前記導入を行い、培養２１日間後にＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞を蛍光顕微鏡装置で撮影した以外は試験例１−１と同様にして、ＤｓＲｅｄ２陽性インスリン産生細胞数を測定した。結果を、図３Ａに示す。
図３Ａ中、「ＣＴＬ」は、（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＰＭ」は、（２）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ｄＧＮＰＭ」は、（３）ｐＭＸ−マウス変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示す。
図３Ａの結果から、本発明の製造方法の態様の１つである変異ＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、Ｐｄｘ１、及びＭａｆＡの４因子を用いた場合は、本発明の製造方法の態様の１つであるＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、Ｐｄｘ１、及びＭａｆＡの４因子を用いた場合よりも、膵内分泌細胞の生産効率がより高まることが示された。
＜定量ＰＣＲ解析＞
前記試験例１−１と同様にして、定量ＰＣＲ解析を行った。
結果を図３Ｂに示す。図３Ｂ中、「ＣＴＬ」は、（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＰＭ」は、（２）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ｄＧＮＰＭ」は、（３）ｐＭＸ−マウス変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示す。
図３Ｂの結果から、本発明の製造方法の態様の１つである変異ＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、Ｐｄｘ１、及びＭａｆＡの４因子を用いた場合は、本発明の製造方法の態様の１つであるＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、Ｐｄｘ１、及びＭａｆＡの４因子を用いた場合よりも、インスリン遺伝子の発現量も増加しており、この点からも、膵内分泌細胞の生産効率がより高まることが示された。
（試験例３−２：膵内分泌細胞の製造−３−２）
＜細胞の調製＞
前記試験例１−１と同様にして、ｄＭＥＦを調製した。
＜レトロウイルスの作製＞
長期にわたって高力価のウイルスを産生できるウイルス構造タンパク質ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖをＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのコントロール下で発現させているＰｌａｔ−ＧＰ細胞と、プラスミドＤＮＡ（ｐＭＸベクター又はｐＭＸ−ｐｕｒｏベクター、ＶＳＶＧベクター）とを用い、以下のようにしてレトロウイルスを作製した（Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４，３２４−３２９，１９９６）。
−プラスミドＤＮＡの調製−
［ｐＭＸ−ＧＦＰベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−ＧＦＰベクターを調製した。
［ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター］
前記試験例１−２と同様にして、ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター］
前記試験例２−２と同様にして、ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター］
前記試験例１−２と同様にして、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター］
前記試験例１−２と同様にして、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター］
前記試験例１−２と同様にして、ｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクターを調製した。
−レトロウイルスの作製−
前記試験例１−２において使用していたプラスミドＤＮＡを、本試験例のプラスミドＤＮＡに代えた以外は同様にして、ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を得た。
＜導入＞
前記試験例１−２において使用していたウイルス溶液を下記ウイルス溶液に代えた以外は同様にして、遺伝子を細胞に導入した。
［ウイルス溶液］
（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）
（２）ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
（３）ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
＜定量ＰＣＲ解析＞
前記試験例１−１と同様にして、定量ＰＣＲ解析を行った。
結果を図３Ｃに示す。図３Ｃ中、「ＣＴＬ」は、（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＰＭ」は、（２）ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ｄＧＮＰＭ」は、（３）ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示す。
図３Ｃの結果から、本発明の製造方法の態様の１つである変異ＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、Ｐｄｘ１、及びＭａｆＡの４因子を用いた場合には、ヒト遺伝子を用いた場合でも、本発明の製造方法の態様の１つであるＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、Ｐｄｘ１、及びＭａｆＡの４因子を用いた場合よりもインスリン遺伝子の発現量が増加しており、膵内分泌細胞の生産効率がより高まることが示された。
（試験例４：グルコース応答性インスリン分泌試験−１）
＜細胞の調製＞
前記試験例１−１と同様にして、ｄＭＥＦを調製した。
＜レトロウイルスの作製＞
長期にわたって高力価のウイルスを産生できるウイルス構造タンパク質ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖをＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのコントロール下で発現させているＰｌａｔ−Ｅ細胞と、プラスミドＤＮＡ（ｐＭＸベクター又はｐＭＸ−ｐｕｒｏベクター）とを用い、以下のようにしてレトロウイルスを作製した（Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４，３２４−３２９，１９９６）。
−プラスミドＤＮＡの調製−
［ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクターを調製した。
［ｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター］
前記試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクターを調製した。
−レトロウイルスの作製−
前記試験例１−１において使用していたプラスミドＤＮＡを、本試験例のプラスミドＤＮＡに代えた以外は同様にして、ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を得た。
＜導入＞
前記試験例１−１において使用していたウイルス溶液を下記ウイルス溶液に代えた以外は同様にして、遺伝子を細胞に導入した。
［ウイルス溶液］
（１）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
＜グルコース応答性インスリン分泌試験＞
前記導入の３４日間後に、膵島様塊全てをピペットでピックアップし、２４ウェルプレート（低接着プレート（ＥＺ−ＢｉｎｄＳｈｕｔ ＩＩ、イワキ社製））へ移し、以下のようにしてグルコース応答性インスリン分泌試験を実施した。
前記膵島様塊を１．４ｍＭ グルコース入りリンゲル溶液で３時間培養した後、培地を交換し、更に２．８ｍＭグルコース入りリンゲル溶液で１時間培養し、この培養上清を基礎とした（以下、「基礎培養上清」と称することがある）。
次いで、前記膵島様塊を１６．８ｍＭ グルコース入りリンゲル入り溶液で１時間培養し、その培養上清を１．５ｍＬチューブへ移した（以下、「高グルコース培養上清」と称することがある）。
前記各培養上清におけるインスリン濃度を、ＥＬＩＳＡ試験（ヒトインスリンＥＬＩＳＡキット、Ｍｅｒｃｏｄｉａ社製）により測定した。結果を図４に示す。
図４中、左側（「低」）は基礎培養上清の結果、右側（「高」）は高グルコース培養上清の結果を示す。
図４の結果から、グルコース濃度が低い場合はインスリンの量が少なく、グルコース濃度が高くなるとインスリンの量が上昇しており、本発明の製造方法により製造された前記膵島様塊が膵内分泌細胞に求められる機能を有していることが確認された。
（試験例５：グルコース応答性インスリン分泌試験−２）
＜細胞の調製＞
前記試験例１−１と同様にして、ｄＭＥＦを調製した。
＜レトロウイルスの作製＞
試験例４と同様にして、ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を得た。
＜導入＞
前記試験例４と同様にして、下記ウイルス溶液を用い、遺伝子を細胞に導入した。
［ウイルス溶液］
（１）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
＜グルコース応答性インスリン分泌試験＞
前記導入の２７日間後に、実体顕微鏡下で、直径１００μｍ〜３００μｍの均一な膵島様塊３０個をピペットでピックアップし、２４ウェルプレート（低接着プレート（ＥＺ−ＢｉｎｄＳｈｕｔ ＩＩ、イワキ社製））へ移し、以下のようにしてグルコース応答性インスリン分泌試験を実施した。
前記膵島様塊を２．８ｍＭ グルコース入りリンゲル溶液で３時間培養した後、培地を交換し、更に１時間培養し、この培養上清を基礎とした（以下、「基礎培養上清」と称することがある）。
次いで、前記膵島様塊を１６．８ｍＭ グルコース入りリンゲル入り溶液で１時間培養し、その培養上清を１．５ｍＬチューブへ移した（以下、「高グルコース培養上清」と称することがある）。
その後、ウェルに２．８ｍＭグルコース入りリンゲル溶液を入れ、前記膵島様塊を１時間培養後、その培養上清を１．５ｍＬチューブへ移した（以下、「低グルコース培養上清」と称することがある）。
前記各培養上清におけるインスリン濃度を、ＥＬＩＳＡ試験（株式会社シバヤギ製、Ｔタイプ）により測定した。結果を図５に示す。
図５中、左側（（１））は基礎培養上清の結果、中央（（２））は高グルコース培養上清の結果、右側（（３））は低グルコース培養上清の結果を示す。
図５の結果から、グルコース濃度が低い場合はインスリンの量が少なく（（１））、グルコース濃度が高くなるとインスリンの量が上昇し（（２））、グルコース濃度が低くなるとインスリンの濃度が減少する（（３））ことが確認された。したがって、本試験例からも、本発明の製造方法で得られた膵内分泌細胞が、膵内分泌細胞に求められる機能を有していることが確認された。
（試験例６：マウス間葉系幹細胞からの膵内分泌細胞の製造）
＜細胞の調製＞
細胞として、マウス間葉系幹細胞（Ｃｙａｇｅｎ カタログＮｏ．ＭＵＢＭＸ−０１００１）（以下、「マウスＭＳＣ」と称することがある）を用意した。前記マウスＭＳＣは、ＡＤＳＣ−ＢＭ培地（１０％ＦＢＳ，ペニシリンーストレプトマイシン添加）にて継代培養を行った。
＜レトロウイルスの作製＞
試験例１−１と同様にして、ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を得た。
＜導入＞
前記マウスＭＳＣへ前記レトロウイルスを感染させることにより、遺伝子を細胞に導入した。感染は、以下のようにして行った。
前記マウスＭＳＣを、２４ウェルプレートへは１ウェルあたり２．５×１０４細胞数で播種した。
翌日、前記ウイルス溶液に、８ｍｇ／ｍＬポリブレン溶液（シグマ社製、１０７６８９）を最終濃度８μｇ／ｍＬになるよう添加した。前記マウスＭＳＣの培養上清を吸引して除去後、下記のウイルス溶液をそれぞれ、２４ウェルプレートの１ウェルあたり２００μＬ加えた。なお、各々のウェルのウイルス溶液の量が均一になるように、ポリブレン８μｇ／ｍＬを含むＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）溶液で調整した。ウイルス溶液添加後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。培養中は、２日間又は３日間毎に培地交換を行った。
［ウイルス溶液］
（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）
（２）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
＜定量ＰＣＲ解析＞
前記試験例１−１と同様にして、定量ＰＣＲ解析を行った。
結果を図６に示す。図６中、「ＣＴＬ」は、（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＰＭ」は、（２）ｐＭＸ−マウスＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−マウスＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−マウスＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示す。
図６の結果から、細胞として、間葉系幹細胞を用いた場合でも、本発明の製造方法の態様の１つであるＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、Ｐｄｘ１、及びＭａｆＡの４因子を用いることで、膵内分泌細胞を効率良く生産できることが示された。
（試験例７：ヒト新生児線維芽細胞からの膵内分泌細胞の製造）
＜細胞の調製＞
ヒト細胞として、ヒト新生児線維芽細胞（Ｄ１００５１、宝酒造株式会社）を用意した。
＜レトロウイルスの作製＞
試験例１−２又は２−２と同様にして、ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を得た。
＜導入＞
前記試験例１−２において用いた細胞（ｄＭＥＦ）を、前記ヒト新生児線維芽細胞に代えた以外は、試験例１−２と同様にして、遺伝子を細胞に導入した。なお、用いたウイルス溶液は以下の通りである。
［ウイルス溶液］
（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）
（２）ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
＜定量ＰＣＲ解析＞
前記試験例１−１において用いたプライマーを以下のプライマーに代えた以外は同様にして、定量ＰＣＲ解析を行った。
−ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子−
フォワード： ５’−ａｔｇｔｔｃｇｔｃａｔｇｇｇｔｇｔｇａａ−３’（配列番号７）
リバース： ５’− ｔｇｔｇｇｔｃａｔｇａｇｔｃｃｔｔｃｃａ−３’（配列番号８）
−ヒトインスリン遺伝子−
フォワード： ５’−ｇｃｃａｔｃａａｇｃａｇａｔｃａｃｔｇｔ−３’（配列番号９）
リバース： ５’−ｃａｇｇｔｇｔｔｇｇｔｔｃａｃａａａｇｇ−３’（配列番号１０）
結果を図７に示す。図７中、「ＣＴＬ」は、（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）を用いた場合の結果を示し、「ｄＧＮＭ」は、（２）ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示す。
図７の結果から、本発明の製造方法の態様の１つである変異ＧＬＩＳ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、及びＭａｆＡの３因子を用いると、ヒト細胞を用いた場合でも、膵内分泌細胞を効率良く生産できることが示された。
（試験例８：ヒトグリオーマＴ９８Ｇ細胞株からの膵内分泌細胞の製造）
＜細胞の調製＞
ヒト細胞として、ヒトグリオーマＴ９８Ｇ細胞株（ＲＣＢ１９５４、ＲＩＫＥＮ）を用意した。
＜レトロウイルスの作製＞
試験例１−２又は２−２と同様にして、ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を得た。
＜導入＞
前記試験例１−２において用いた細胞（ｄＭＥＦ）を、前記ヒトグリオーマＴ９８Ｇ細胞株に代えた以外は、試験例１−２と同様にして、遺伝子を細胞に導入した。なお、用いたウイルス溶液は以下の通りである。
［ウイルス溶液］
（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）
（２）ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
（３）ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
（４）ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液
（５）ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液
＜定量ＰＣＲ解析＞
前記試験例７と同様にして、定量ＰＣＲ解析を行った。
結果を図８に示す。図８中、「ＣＴＬ」は、（１）ｐＭＸ−ＧＦＰベクター由来のウイルス溶液（コントロール）を用いた場合の結果を示し、「ＧＮＰＭ」は、（２）ｐＭＸ−ヒトＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ｄＧＮＰＭ」は、（３）ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ｄＧＮＭ」は、（４）ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＭａｆＡベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示し、「ｄＧＮＰ」は、（５）ｐＭＸ−ヒト変異ＧＬＩＳ１ベクター由来のウイルス溶液、ｐＭＸ−ヒトＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３ベクター由来のウイルス溶液、及びｐＭＸ−ヒトＰｄｘ１ベクター由来のウイルス溶液を用いた場合の結果を示す。
図８の結果から、本発明の製造方法のいずれの態様の因子を用いた場合でも、ヒト細胞を用いて膵内分泌細胞を効率良く生産できることが示された。
本発明の膵内分泌細胞の製造方法は、従来のＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を用い、培地中に発生阻害剤等を添加するなどの培養環境を整え、膵内分泌細胞を製造する方法と比較して、簡便で、且つ再現が容易な方法である。そして、本発明の製造方法によれば、膵内分泌細胞を非常に効率良く生産することができる。また、膵内分泌細胞の製造期間を大幅に短縮することもできる。
また、本発明の製造方法によれば、腫瘍形成のリスクを有するｉＰＳ細胞を経ずに膵内分泌細胞を製造することができる点でも有利である。
そのため、本発明の膵内分泌細胞の製造方法は、例えば、糖尿病に対する再生医療用途の膵内分泌細胞の製造などに好適に利用可能である。
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ 下記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入する導入工程を含むことを特徴とする膵内分泌細胞の製造方法である。
（Ａ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
（Ｂ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物。
（Ｃ）ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
（Ｄ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
＜２＞ 前記導入工程で体細胞に導入する前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ａ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物である前記＜１＞に記載の膵内分泌細胞の製造方法である。
＜３＞ 前記導入工程で体細胞に導入する前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ｂ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物である前記＜１＞に記載の膵内分泌細胞の製造方法である。
＜４＞ 前記導入工程で体細胞に導入する前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ｃ）ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物である前記＜１＞に記載の膵内分泌細胞の製造方法である。
＜５＞ 前記導入工程で体細胞に導入する前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ｄ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物である前記＜１＞に記載の膵内分泌細胞の製造方法である。
＜６＞ 前記体細胞が、線維芽細胞及び間葉系幹細胞のいずれかである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法である。
＜７＞ 膵内分泌細胞が、β細胞である前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法である。
＜８＞ 体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤であって、
下記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物を含むことを特徴とする分化転換剤である。
（Ａ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
（Ｂ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物。
（Ｃ）ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
（Ｄ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
＜９＞ 前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ａ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物である前記＜８＞に記載の分化転換剤である。
＜１０＞ 前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ｂ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物である前記＜８＞に記載の分化転換剤である。
＜１１＞ 前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ｃ）ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物である前記＜８＞に記載の分化転換剤である。
＜１２＞ 前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ｄ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物である前記＜８＞に記載の分化転換剤である。
＜１３＞ 前記体細胞が、線維芽細胞及び間葉系幹細胞のいずれかである前記＜８＞から＜１２＞のいずれかに記載の分化転換剤である。
＜１４＞ 膵内分泌細胞が、β細胞である前記＜８＞から＜１３＞のいずれかに記載の分化転換剤である。

Claims (14)

  1. 下記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入する導入工程を含むことを特徴とする膵内分泌細胞の製造方法。
    （Ａ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
    （Ｂ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物。
    （Ｃ）ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
    （Ｄ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
  2. 前記導入工程で体細胞に導入する前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ａ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物である請求項１に記載の膵内分泌細胞の製造方法。
  3. 前記導入工程で体細胞に導入する前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ｂ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物である請求項１に記載の膵内分泌細胞の製造方法。
  4. 前記導入工程で体細胞に導入する前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ｃ）ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物である請求項１に記載の膵内分泌細胞の製造方法。
  5. 前記導入工程で体細胞に導入する前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ｄ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物である請求項１に記載の膵内分泌細胞の製造方法。
  6. 前記体細胞が、線維芽細胞及び間葉系幹細胞のいずれかである請求項１から５のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
  7. 膵内分泌細胞が、β細胞である請求項１から６のいずれかに記載の膵内分泌細胞の製造方法。
  8. 体細胞を膵内分泌細胞へ分化転換する分化転換剤であって、
    下記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物を含むことを特徴とする分化転換剤。
    （Ａ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
    （Ｂ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物。
    （Ｃ）ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
    （Ｄ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物。
  9. 前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ａ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物である請求項８に記載の分化転換剤。
  10. 前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ｂ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＰｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物である請求項８に記載の分化転換剤。
  11. 前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ｃ）ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｄｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物である請求項８に記載の分化転換剤。
  12. 前記（Ａ）から（Ｄ）のいずれかの遺伝子乃至その遺伝子産物が、（Ｄ）配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する変異ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＭａｆＡ遺伝子乃至その遺伝子産物である請求項８に記載の分化転換剤。
  13. 前記体細胞が、線維芽細胞及び間葉系幹細胞のいずれかである請求項８から１２のいずれかに記載の分化転換剤。
  14. 膵内分泌細胞が、β細胞である請求項８から１３のいずれかに記載の分化転換剤。
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