JP6845013B2 - 遺伝子改変動物を作製するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年11月7日に出願された、豪州仮特許出願第2013904307号“Compositions and Methods for Producing Genetically Modified Animals”および、2014年6月6日に出願された、豪州仮特許出願第2014902162号“Compositions and Methods for Producing Genetically Modified Animals”に基づく優先権を主張し、これらは、それぞれ、引用により本明細書にその全体が包含される。
第一の繁殖パートナーは、第一の破壊可能な導入遺伝子および第一の破壊導入遺伝子についてホモ接合型であり、かつ/または、第二の繁殖パートナーは、第二の破壊可能な導入遺伝子および第二の破壊導入遺伝子についてホモ接合型であるのが適当である。
例えば、該発現調節配列は、第一の条件下で、破壊ヌクレオチド配列の転写を阻害し得、第二の条件下において、該発現調節エレメントの破壊により、破壊ヌクレオチド配列の転写が可能になるか、または増大し得る。いくつかの態様において、該発現調節エレメントは、該破壊ヌクレオチド配列の発現を阻害し、リコンビナーゼ認識部位に作動可能に連結した、阻害ヌクレオチド配列(例えば、転写終結配列)を含み、ここで、該リコンビナーゼ認識部位は、リコンビナーゼの存在下において、阻害ヌクレオチド配列の破壊を媒介する。この種の具体的な例において、第一の繁殖パートナーは、プロモーターに作動可能に結合した該リコンビナーゼのコード配列を含む、活性化導入遺伝子を含む。第二の繁殖パートナーの破壊可能な妊孕性遺伝子は、野生型の遺伝子であるのが適当である。いくつかの態様において、第一の繁殖パートナーは雌であり、第二の繁殖パートナーは雄である。
これらの方法は、一般的に:
(a) 本明細書に広く定義する、非ヒト動物つがいの第一の繁殖パートナーを、該つがいの第二の繁殖パートナーを交配させること; および
(b) 該つがいの雌のメンバーから、着床前の非ヒト胚を得ることを含むか、または本質的にこれらのことからなり、ここで、該胚は、生殖系列中に、妊孕性遺伝子の破壊を含む。いくつかの態様において、該方法はさらに、着床前の非ヒト胚の形成を可能にする条件下において、非ヒトホスト胚を培養することを含む。いくつかの態様において、第一の繁殖パートナーは雌であり、第二の繁殖パートナーは雄である。いくつかの態様において、該方法は、例えば本明細書に記載するドナー多能性細胞を、着床前の非ヒト胚に導入することをさらに含む。該多能性細胞は、遺伝子改変を含むのが適当である。特定の態様において、該多能性細胞は雄の多能性細胞である。
とくにことわらない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験においては、本明細書に記載の方法および物質と類似したまたは同等の任意の方法および材料を用いてよいが、ここには好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、次の用語を以下のように定義する。
異種性ポリヌクレオチドは、導入されるポリヌクレオチドが、天然起源のポリヌクレオチドと比較して何らかの改変(例えば点変異、選択マーカー遺伝子の存在、loxP部位の存在等)を含む限り、導入されている、または導入しようとする生物体で見られる遺伝子配列を含んでいてよい。異種性ポリヌクレオチドは、RNAに転写されることができ、かつ、場合によって、適当な条件下において、翻訳され、および/または発現することのできる核酸配列を含んでいてよい。いくつかの態様において、異種性ポリヌクレオチドは、転写または翻訳に干渉する分子(例えばアンチセンス分子)か、またはRNA干渉を媒介する分子(例えばsiRNAまたはshRNA)に転写される。いくつかの態様において、該異種性ポリヌクレオチドは、ペプチドまたはポリペプチドのコード配列を含む。いくつかの態様において、該異種性ポリヌクレオチドは、遺伝子改変をゲノムに導入するためのターゲティングカセットを含む。
特定の態様において、非ヒト動物はマウスである。
「比較ウインドウ」は、少なくとも6個、通常約50個〜約100個、より一般的には、約100個〜約150個の、2つの配列を最適に整列させた後に、配列を、同じ数の近接した位置の参照配列と比較する、近接した位置の概念的なセグメントを指す。該比較ウインドウは、2つの配列の最適な比較のために、(付加または欠失を含まない)参照配列と比較して、約20%以下の、付加または欠失(すなわちギャップ)を含んでいてよい。比較ウインドウの整列のための最適な配列比較は、アルゴリズムをコンピューターにより実行すること(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0(Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA)中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTEASTA)または、調査および、選択する種々の方法のうちの任意の方法により作製した最適な(すなわち、比較ウインドウで最も高い相同性のパーセンテージを生じる)整列により行い得る。例えば、Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389に記載されているBLASTファミリーのプログラムを参照してもよい。配列比較の詳細な議論については、Ausubel et al.,“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15, Unit 19.3に見ることができる。
本明細書を通じて、次の略語を用いる:
dpc=***後の日数
ES細胞=胚性幹細胞
エピ幹細胞=エピブラスト幹細胞
EG細胞=胚性生殖細胞
iPS細胞=人工多能性幹細胞
d=日
h=時間
d=秒
本発明は、遺伝子改変を有するものを含む、ドナー多能性細胞の生殖系列の伝達を増大させるための組成物および方法を提供する。非ヒトホスト胚を起源とする生殖細胞は、妊孕性に寄与する少なくとも1つの遺伝子(すなわち妊孕性遺伝子)が破壊されるように改変される。該改変非ヒトホスト胚を、次いで、機能性妊孕性遺伝子 (すなわち、破壊されていない妊孕性遺伝子)を有する、導入されるドナー多能性細胞の「ホスト」に使用する。得られた非ヒトホスト胚を、代理親(surrogate)または里親(foster)に移植し、懐胎させることにより、2種類:通常非ヒトホスト胚由来である、破壊された妊孕性遺伝子を有する内在性の生殖細胞または配偶子を有するものおよび、通常ドナー多能性細胞由来である、機能性の妊孕性遺伝子を有する生殖細胞または配偶子を含むものの、キメラの出生仔(offspring)を含む同腹仔が通常得られる。機能性の妊孕性遺伝子を含む、同族非ヒト動物と繁殖させたとき、破壊された妊孕性遺伝子を有する内在性の生殖細胞または配偶子を含むキメラ非ヒト動物は、妊孕性が損なわれているかまたは阻害されている。対照的に、ドナー多能性細胞由来の生殖細胞または配偶子を含むキメラ非ヒト動物は、妊孕性が正常であるかまたは損なわれていないため、ドナー多能性細胞由来の生殖細胞または配偶子を含む、最初に出生する仔(first litter offspring)の作製が増進される。
非ヒトホスト胚ならびに、本発明による非ヒト動物および子孫を得るために、任意の適当な妊孕性遺伝子または妊孕性遺伝子の組み合わせを破壊してよい。妊孕性遺伝子の非限定的な例を表2に、妊孕性遺伝子破壊を引き起こし、不妊(例えば雄性不妊)を引き起こす、例示的な変異(上付き文字)およびアレルの組成とともに記載する。また、表2には、これらの妊孕性遺伝子の破壊により不妊(例えば雄性不妊)が引き起こされる、例示的な遺伝的バックグラウンドも示す。
5’-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAG TTAT-3’[配列番号1]である。
FRT標的部位配列の具体的な例は、
5’-GAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGTAAGTATAGGAACTTC-3’[配列番号2]である。
本発明によれば、破壊された妊孕性遺伝子を有する非ヒトホスト胚を作製するための系を用いる。例えば、破壊された妊孕性遺伝子を含む非ヒト胚は: 1)破壊可能な妊孕性遺伝子を保有する第一の動物系統(「条件的不妊系統」)を; 2)破壊可能な妊孕性遺伝子を破壊する妊孕性遺伝子破壊分子をコードする破壊ヌクレオチド配列を含む、不妊活性化導入遺伝子を保有する第二の動物系統(「不妊活性化系統」)と交雑させ、それにより、破壊された妊孕性遺伝子を有する生殖細胞を含む、遺伝子導入非ヒトホスト胚を作製することにより、作製し得る。いくつかの態様において、第一の動物系統の雌のメンバーを、第二の動物系統の雄のメンバーと交雑させる。本明細書において、第一および第二の動物系統のそれぞれは、非ヒト動物のつがいの繁殖パートナーである。
ドナー多能性細胞は、一般的に、生殖細胞に分化することができ、例えばES細胞、エピ幹細胞、EG細胞およびiPS細胞が挙げられる。特定の態様において、該多能性細胞はES細胞である。ドナー多能性細胞を遺伝子改変してよく、この種の具体的な例において、ドナー多能性細胞は導入遺伝子を含む。該導入遺伝子を、多能性細胞のゲノムへの導入遺伝子の導入を促進するベクターを用いて、(例えばランダム組み込みまたは相同組み換えによって)多能性細胞に導入してよく、その具体的な方法は、Transgenic Mouse: Methods and Protocols (Hofker, MH., 2003. Methods Mol Biol. 209:1-8), Advanced Protocols for Animal Transgenesis (2011, edited by S. Pease and T. L. Saunders, Springer Protocols Handbooks)およびTransgenic Animals, Generation and Use (1997, edited by L. M. Houdebine, Hardwood Academic Publishers)に記載されている。
多能性細胞の導入に使用し得る非ヒトホスト胚としては、任意の非ヒド動物種の胚、例えば非ヒト霊長類および齧歯類のような非ヒト哺乳類が挙げられる。本発明のいくつかの態様によれば、該非ヒトホスト胚は、齧歯類の胚であり、特にマウスまたはラットの胚である。一般的に、非ヒトホスト胚は、多能性細胞と同じ種由来である。しかし、いくつかの態様において、該非ヒトホスト胚は、該多能性細胞と異なる動物種 (例えば異なる哺乳類種)由来である。多能性細胞を導入する非ヒトホスト胚は、一般的に、着床前の非ヒトホスト胚、例えば2細胞期、4細胞期、8細胞期、16細胞期、32細胞期、64細胞期の胚、桑実胚または胚盤胞である。いくつかの態様において、着床前の非ヒトホスト胚は、前桑実胚期(pre-morula stage)、桑実胚期、非小型化(uncompacted)桑実胚期、小型化桑実胚期および胚盤胞期の胚から選択される。いくつかの態様において、着床前の非ヒトホスト胚は、マウス胚について、発生齢ステージ(embryological age stage) E1、E1.5、E2、E2.5、E3およびE3.5から選択される。適当には、該着床前非ホスト胚は、Theiler (1989) The House Mouse: Atlas of Mouse Development,(Theilerによる) Springer-Verlag, NYに記載されているタイラー(Theiler)ステージを基準に、タイラーステージ2 (TS2)、TS3、TS4、TS5およびTS6から選択される発生段階のホスト胚から選択される。特定の態様において、着床前の非ヒトホスト胚は、タイラーステージ、TS3、TS4およびTS5から選択される。他の特定の態様において、着床前の非ヒトホスト胚は、桑実胚である。さらに他の特定の態様において、着床前の非ヒトホスト胚は、胚盤胞である。
ドナー多能性細胞の、着床前の非ヒトホスト胚への導入には、任意の適当な方法を用いてよい。例えば、単一のドナー多能性細胞の群を、精密に引き抜いたガラス針 (内径20〜25μm)を用いて選択し、初期胚については、該胚の透明帯を通して導入し、胚盤胞については、マイクロマニピュレーターを備えた倒立顕微鏡を用いて、胚盤胞の空洞(割腔)に導入する。胚盤胞、または8細胞期の胚あたり約9〜10個の幹細胞(ESまたはiPSまたはエピ幹細胞)、4細胞期胚については胚1個あたり6〜9個の幹細胞および、2細胞期胚については胚1個あたり約6個の幹細胞を導入する。幹細胞注入は、レーザーまたは、圧力パルス穿孔による透明帯の開口により補助してよい (Kraus et al., 2010, Genesis 48:394-499参照)。あるいは、幹細胞を、桑実胚と凝集させるか、または、透明帯を持つか、または持たない初期胚(例えば2細胞、4細胞、8細胞、前桑実胚または桑実胚)に導入してもよい。
胚発生に適当な条件下において、標準的な方法にしたがって、胚を懐胎させる。ドナー多能性細胞を含む非ヒト胚を、当該分野で知られているように、偽妊娠状態の雌に移植する (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition (A. Nagy et al. 2002, CSHL Press, ISBN-10: 0879695919; Nagy et al., 1990, Development 110, 815-821; 米国特許第7,576,259号明細書、米国特許第7,659,442号明細書、米国特許第7,294,754号明細書、Kraus et al. 2010, Genesis 48, 394-399)参照)。
端的にいえば、特定の齧歯類の態様において、6〜8週齢の、繁殖性の雌の齧歯類動物を、精管切除した、または繁殖不能な雄の齧歯類動物と交配させ、人工的に導入した齧歯類胚を維持ための受容性のホルモン状態を引き起こす。かかる雌を、偽妊娠と称する。2.5 dpcに、15個までの、胚盤胞を含む該幹細胞を、子宮角に導入(移植)する。初期胚および桑実胚については、該胚は、試験管内で胚盤胞まで培養するか、または0.5 dpcまたは1.5 dpcの偽妊娠雌に、胚のステージによって、卵管に移植する。
条件的GILZ (Tsc22d3)ノックアウトマウスの作製
相同組換えによって、マウスTsc22d3 (ENSMUSG00000031431)遺伝子のエクソン4(ENSMUSE00000815383)に、loxP部位を隣接させるためのターゲティングベクターを構築した。loxP部位の、Creリコンビナーゼを介した組換えにより、エクソン4 (例えば、Vegaアクセス番号OTTMUST00000045354のTsc22d3-006転写物)の欠失が引き起こされる。エクソン4のCDSは、TSC22(斜体) (PF01166) ドメインの完全な配列をコードする。ターゲティングベクターの模式的な概要を図1に示す。
胚盤胞ドナーとして、雌のTsc22d3条件的ノックアウトマウスを用いた、ターゲティングしたマウスの作製
C57BL/6をバックグラウンドとする、21〜25日齢のTsc22d3条件的ノックアウト雌マウスに、妊馬血清を注射する。2日後、該マウスにヒト絨毛性ゴナドトロピンを注射し、24時間、C57BL/6 Cre-リコンビナーゼ 雄と交配させる。1回目の注射の6日後に、該Tsc22d3条件的ノックアウト 雌から、胚盤胞を取り出す。これらの胚盤胞を、ターゲットBALB/c ES細胞の微量注入のレシピエントとして用い、微量注入した胚盤胞を、偽妊娠CBB6F里親の雌に移す。得られたキメラをBALB/c雌と交雑させる。胚盤胞細胞由来の精巣を持つ雄キメラは、不妊であると期待される。
胚盤胞ドナーとしての、条件的ノックアウトマウスの作製
妊孕性遺伝子 ROSA26 アレルバリアントAの条件的ノックアウトは、破壊分子をコードするヌクレオチド配列 (例えば、標的として妊孕性遺伝子の転写物を有するshRNA、妊孕性遺伝子にコードされる蛋白質に対する抗体等)を含む。loxPが導入されたStopカセットは、破壊分子の発現を阻害する。ターゲットROSA26アレルAの作製用の例示的なターゲティングベクターを図2に示す。
多能性細胞の標的妊孕性遺伝子を有する胚への導入および最初の出生仔の作製
材料および方法
C57BL/6 Tsc22d3 conKO/conKO 雌マウスまたは、雌野生型対照マウス (ターゲットがBruce4 C57BL/6 ES細胞の場合は、BALB/c x C57BL/6albino,agoutiであり、ターゲットがBALB/c ES細胞の場合は、C57BL/6)に、21〜25日齢で、妊馬血清 (PMS) を注射した。続けて、2日後に、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)を適用した。同じ日に、C57BL/6 Tsc22d3 conKO/conKO 雌マウスまたはwt BALB/c x C57BL/6albino,agoutiマウス(対照) を、ROSA26遺伝子座にCreリコンビナーゼをノックイン(KI)した雄マウス (cre/cre)またはwt雄マウス (対照)とそれぞれ交配させた(ターゲットがBALB/c ES細胞の場合は、雄対照マウスのバックグラウンドはC57BL/6であり、ターゲットがBruce4 C57BL/6 ES細胞の場合は、BALB/c)。次の日に、交配パートナーを分けた。交配により得られた胚盤胞を、分けた3日後に回収し、ターゲットBALB/cおよびBruce4 C57BL/6 ES細胞の注入に用いた。改変した胚盤胞をCBB6F1レシピエントに移した。約9週間後に、雄のキメラの出生仔を、ターゲットがBALB/c細胞の場合には、雌のBALB/cマウスと、ターゲットがBruce4 C57BL/6細胞の場合は、雌のC57BL/6マウスと交配させた。産まれた仔を10日齢において毛色について評価し、21日齢において、サザンブロット解析により遺伝子型を決定した。
ターゲットBALB/c ES細胞株の注入
注入したTsc22d3 KO/KO胚盤胞を、3匹のレシピエントに移し、その結果、全部で16匹のキメラを得、そのうちの11匹が雄であり、これをさらなる繁殖に用いた。5匹というパーセンテージの低いキメラからは、子孫が得られなかった。残りの6匹のキメラから、全部で181匹の仔を得た。この動物のうち146匹を毛色について評価し、35匹については決定しなかった。評価した146匹は全て (100%)、毛色が、ターゲットBALB/cES細胞由来の動物について期待される、白であった(図5参照)。
注入したTsc22d3 KO/KO胚盤胞を2匹のレシピエントに移し、全部で3匹のキメラを得、そのうち3匹が雄であった。該キメラから、全部で10匹の仔が得られた。 (キメラの作製に用いた)Tsc22d3 KO/KO胚盤胞のバックグラウンドがC57BL/6xBALB/c F1であり、注入したES細胞は、Bruce4 C57BL/6をバックグラウンドとするため、毛色に基づく表現型の決定は不可能であった。その代わりに、8匹のマウスについて、サザンブロット解析により遺伝子型を決定し、そのうちの4匹 (50%)は、wt/ターゲットおよび4匹(50%)はwt/wtマウスであると決定した。これは、キメラの仔が、ターゲットES細胞からのみ得られる場合に期待されるwt/ターゲットマウスvs wt/wtマウスの比率と正確に相関している。
Claims (22)
- 妊孕性遺伝子の破壊および生殖細胞に分化することのできるドナー多能性細胞を含む、着床前の雄性齧歯類ホスト胚であって、ここで前記ドナー多能性細胞が前記妊孕性遺伝子の破壊を欠き、前記妊孕性遺伝子がX染色体上に位置し、破壊された妊孕性遺伝子が雄性の妊孕性を阻害する、着床前の雄性齧歯類ホスト胚。
- ドナー多能性細胞がゲノム中に遺伝子改変をさらに含む、請求項1に記載の着床前の雄性齧歯類ホスト胚。
- 多能性細胞が雄の多能性細胞である、請求項1または2に記載の着床前の雄性齧歯類ホスト胚。
- 妊孕性遺伝子が***形成を調節する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の着床前の雄性齧歯類ホスト胚。
- 妊孕性遺伝子がGILZである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の着床前の雄性齧歯類ホスト胚。
- 多能性細胞が幹細胞である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の着床前の雄性齧歯類ホスト胚。
- 幹細胞が胚性幹(ES)細胞である、請求項6に記載の着床前の雄性齧歯類ホスト胚。
- 雄性齧歯類ホスト胚を懐胎している、代理親(surrogate)または里親(foster)である、齧歯類動物であって、
ここで、前記雄性齧歯類ホスト胚が:
(a)妊孕性遺伝子の破壊を含む着床前の雄性齧歯類ホスト胚に、生殖細胞に分化することができ、かつ前記妊孕性遺伝子の破壊を欠くドナー多能性細胞を導入する工程、ここで前記妊孕性遺伝子がX染色体上に位置し、かつ破壊された妊孕性遺伝子が雄性の妊孕性を阻害する、および
(b)前記代理親または里親齧歯類動物に工程(a)で得られる雄性齧歯類ホスト胚を移植する工程により作製される、齧歯類動物。 - 妊孕性遺伝子の破壊を含む雄性齧歯類ホスト胚の作製方法であって、ここで前記雄性齧歯類ホスト胚が生殖細胞に分化することのできるドナー多能性細胞を含み、ここで前記ドナー多能性細胞が前記妊孕性遺伝子の破壊を欠き、
該方法が:
(A)
1)プロモーターおよび、リコンビナーゼの存在下において、前記妊孕性遺伝子の破壊を媒介するリコンビナーゼ認識部位に作動可能に連結している妊孕性遺伝子を含む破壊可能な導入遺伝子を保有する第一の齧歯類繁殖パートナーであって、ここで、妊孕性遺伝子がX染色体上に位置し、妊孕性遺伝子の破壊が雄性の妊孕性を阻害し、かつ第一の齧歯類繁殖パートナーが、前記破壊可能な導入遺伝子についてホモ接合型であり、ここで、第一の齧歯類繁殖パートナーが雌である、第一の齧歯類繁殖パートナーを;
2)プロモーターに作動可能に連結し、かつ前記破壊可能な導入遺伝子の前記妊孕性遺伝子の破壊を媒介するリコンビナーゼをコードする破壊ヌクレオチド配列を含む破壊導入遺伝子を保有する第二の齧歯類繁殖パートナーであって、ここで第二の齧歯類繁殖パートナーが破壊導入遺伝子についてホモ接合型であり、ここで第二の齧歯類繁殖パートナーが雄である、
と交雑させることにより、妊孕性遺伝子が破壊された生殖細胞を含む、雄性齧歯類ホスト胚を作製し、かつ
(B)雄性齧歯類ホスト胚に、生殖細胞に分化することができ、かつ前記妊孕性遺伝子の破壊を欠くドナー多能性細胞を導入することを含む、方法。 - ドナー多能性細胞の生殖系列伝達を改善するための系であって、該系は、以下を含む:
(A)以下
(1)プロモーターおよび、リコンビナーゼの存在下において、妊孕性遺伝子の破壊を媒介するリコンビナーゼ認識部位に作動可能に連結している妊孕性遺伝子を含む破壊可能な導入遺伝子を含む第一の齧歯類繁殖パートナーであって、妊孕性遺伝子がX染色体上に位置し、妊孕性遺伝子の破壊が雄性の妊孕性を阻害し、第一の齧歯類繁殖パートナーが破壊可能な導入遺伝子についてホモ接合型であり、ここで、第一の齧歯類繁殖パートナーが雌である、第一の齧歯類繁殖パートナーおよび
(2)プロモーターに作動可能に連結し、かつ前記破壊可能な導入遺伝子の前記妊孕性遺伝子の破壊を媒介するリコンビナーゼをコードする破壊ヌクレオチド配列を含む破壊導入遺伝子を含む第二の齧歯類繁殖パートナーであって、第二の齧歯類繁殖パートナーが破壊導入遺伝子についてホモ接合型であり、ここで、第二の齧歯類繁殖パートナーが雄である、第二の繁殖パートナー、
を含む、齧歯類動物のつがいであって、
ここで、第一の齧歯類繁殖パートナーおよび第二の齧歯類繁殖パートナーを交雑させることが、破壊された妊孕性遺伝子を有する生殖細胞を含みかつ生殖細胞に分化することができ、前記妊孕性遺伝子の破壊を欠くドナー齧歯類多能性細胞が導入可能である雄性齧歯類ホスト胚を作製し、それによりドナー多能性細胞の生殖系列伝達を改善する;ならびに
(B)生殖細胞に分化することができ、前記妊孕性遺伝子の破壊を欠くドナー多能性細胞
、を含む、系。 - 該破壊ヌクレオチド配列が条件的に発現可能である、請求項10に記載の系。
- 該破壊導入遺伝子が、破壊ヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現調節エレメントを含み、該発現調節エレメントが、該破壊ヌクレオチド配列の発現を条件的に阻害する、請求項11に記載の系。
- 該発現調節エレメントが第一の条件下で、破壊ヌクレオチド配列の転写を阻害し、第二の条件下において、該発現調節エレメントの破壊により、破壊ヌクレオチド配列の転写が可能になるか、または増大する、請求項12に記載の系。
- 該発現調節エレメントが、破壊ヌクレオチド配列の発現を阻害しかつ第二のリコンビナーゼ認識部位に作動可能に連結している阻害ヌクレオチド配列を含み、該第二のリコンビナーゼ認識部位が、第二のリコンビナーゼの存在下において、該阻害ヌクレオチド配列の破壊を媒介し、第一の齧歯類繁殖パートナーが、プロモーターに作動可能に結合した、第二のリコンビナーゼのコード配列を含む活性化導入遺伝子を含む、請求項12または13に記載の系。
- キメラ齧歯類動物の作製方法であって、
(1)雄性齧歯類ホスト胚を代理親または里親齧歯類動物に移植する工程、
ここで、前記雄性齧歯類ホスト胚は、妊孕性遺伝子の破壊を含む着床前の雄性齧歯類ホスト胚に、生殖細胞に分化することができ、かつ前記妊孕性遺伝子の破壊を欠くドナー多能性細胞を導入することにより作製され、
ここで前記妊孕性遺伝子はX染色体上に位置し、かつ破壊された妊孕性遺伝子は雄性の妊孕性を阻害し、
ここで、ドナー多能性細胞が遺伝子改変を含む;および
(2)(1)の前記雄性齧歯類ホスト胚を、胚の発生に適当な条件下で前記代理親または里親齧歯類動物において懐胎させることにより、破壊された妊孕性遺伝子および遺伝子改変を生殖系列中に有する雄のキメラ齧歯類動物を作製することを含む、方法。 - ゲノム中に遺伝子改変を含む齧歯類動物の作製方法であって、請求項15に記載の方法により作製される雄のキメラ齧歯類動物を、ゲノム中に破壊されていない妊孕性遺伝子を含む、同族の雌の齧歯類動物と繁殖させ、該雄キメラ齧歯類動物が、ドナー多能性細胞由来の生殖細胞または配偶子を含む場合に、該遺伝子改変を含む齧歯類動物を得ることを含む、方法。
- 妊孕性遺伝子の破壊を含む齧歯類ホスト胚の作製方法であって、
該方法が:
1)プロモーターおよび、リコンビナーゼの存在下において、前記妊孕性遺伝子の破壊を媒介するリコンビナーゼ認識部位に作動可能に連結している妊孕性遺伝子を含む破壊可能な導入遺伝子を保有する第一の齧歯類繁殖パートナーであって、ここで、妊孕性遺伝子がX染色体上に位置し、妊孕性遺伝子の破壊が雄性の妊孕性を阻害し、第一の齧歯類繁殖パートナーが雌であり、かつ、前記破壊可能な導入遺伝子についてホモ接合型である、第一の齧歯類繁殖パートナーを:
2)プロモーターに作動可能に連結し、かつ前記破壊可能な導入遺伝子の前記妊孕性遺伝子の破壊を媒介するリコンビナーゼをコードする破壊ヌクレオチド配列を含む破壊導入遺伝子を保有する第二の齧歯類繁殖パートナーであって、第二の齧歯類繁殖パートナーが雄であり、前記破壊導入遺伝子についてホモ接合型である、第二の齧歯類繁殖パートナー、
と交雑させることにより、破壊された妊孕性遺伝子を有する生殖細胞を含む雄性齧歯類ホスト胚を作製すること、
を含む、方法。 - ドナー多能性細胞の生殖系列伝達を改善するための系であって、該系が:
1)プロモーターおよび、リコンビナーゼの存在下において、妊孕性遺伝子の破壊を媒介するリコンビナーゼ認識部位に作動可能に連結している妊孕性遺伝子を含む破壊可能な導入遺伝子を含む第一の齧歯類繁殖パートナーであって、ここで妊孕性遺伝子がX染色体上に位置し、妊孕性遺伝子の破壊が雄性の妊孕性を阻害し、かつ第一の齧歯類繁殖パートナーが雌であり、かつ破壊可能な導入遺伝子についてホモ接合型である、第一の齧歯類繁殖パートナーおよび
(2)プロモーターに作動可能に連結し、かつ前記破壊可能な導入遺伝子の前記妊孕性遺伝子の破壊を媒介するリコンビナーゼをコードする破壊ヌクレオチド配列を含む破壊導入遺伝子を含む第二の齧歯類繁殖パートナーであって、ここで第二の齧歯類繁殖パートナーが雄であり、前記破壊導入遺伝子についてホモ接合型である、第二の齧歯類繁殖パートナー、
を含む齧歯類動物のつがいを含み、
ここで、第一の齧歯類繁殖パートナーおよび第二の齧歯類繁殖パートナーを交雑させることが、破壊された妊孕性遺伝子を有する生殖細胞を含みかつ生殖細胞に分化することができ、前記妊孕性遺伝子の破壊を欠くドナー齧歯類多能性細胞が導入可能である、雄性齧歯類ホスト胚を作製し、それによりドナー多能性細胞の生殖系列伝達を改善する、
系。 - 該破壊ヌクレオチド配列が条件的に発現可能である、請求項18に記載の系。
- 該破壊導入遺伝子が、破壊ヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現調節エレメントを含み、該発現調節エレメントが、該破壊ヌクレオチド配列の発現を条件的に阻害する、請求項19に記載の系。
- 該発現調節エレメントが第一の条件下で、破壊ヌクレオチド配列の転写を阻害し、第二の条件下において、該発現調節エレメントの破壊により、破壊ヌクレオチド配列の転写が可能になるか、または増大する、請求項20に記載の系。
- 該発現調節エレメントが、破壊ヌクレオチド配列の発現を阻害しかつ第二のリコンビナーゼ認識部位に作動可能に連結している阻害ヌクレオチド配列を含み、該第二のリコンビナーゼ認識部位が、第二のリコンビナーゼの存在下において、該阻害ヌクレオチド配列の破壊を媒介し、第一の齧歯類繁殖パートナーが、プロモーターに作動可能に結合した、第二のリコンビナーゼのコード配列を含む活性化導入遺伝子を含む、請求項20または21に記載の系。
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