JP6811443B2 - シュワン細胞及びその調製方法 - Google Patents
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Description
マウス線維芽細胞→軟骨細胞(SOX9 +Klf4 +c‐Myc遺伝子を導入)
マウス線維芽細胞→心筋細胞(GATA4 +Mef2c +Tbx5遺伝子を導入)
マウス線維芽細胞→肝細胞(Hnf4α+(Foxa1またはFoxa2またはFoxa3)遺伝子を導入)
マウス線維芽細胞→神経幹細胞(Sox2 +FoxG1遺伝子を導入など)、
マウス、ヒト細胞→造血幹細胞など。
シュワン細胞は、末梢神経系におけるグリア細胞である。生理条件下では、神経組織の支持、ミエリン(髄鞘)を形成して跳躍伝導の実現などに寄与する。末梢神経での損傷に際しては、神経栄養因子の産出及び放出、再生軸索に対する足場、ミエリン形成などの末梢神経再生における多くの重要な役割を果たす。
体細胞は、哺乳動物由来であればよい。特に、哺乳動物由来であって、シュワン細胞そのもの及び生体内でシュワン細胞へと分化する能力を有する細胞でない細胞が好ましい。シュワン細胞を生体に移植する場合には、移植される被験体由来の体細胞(自家細胞)を用いることが、感染や拒絶応答等の危険を低減させるために好ましい。しかしながら、突然の神経の損傷などに対して移植するなどの目的の場合、自家細胞でなく、他人や他の動物の体細胞からあらかじめ準備しておいたシュワン細胞を移植に用いることができる。またはあらかじめ準備しておいた他人や他の動物の体細胞からシュワン細胞を作り、移植に用いることができる。すなわち、シュワン細胞バンクのバンク(シュワン細胞前駆細胞のバンクを含む。)を作っておき移植目的に供することができる。このような場合、拒絶応答等の危険を低減させるために、あらかじめMHCをタイピングしておくことができる。また、あらかじめシュワン細胞の細胞特性や造腫瘍性などを確認しておくことができる。
本発明の方法では、体細胞にSOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子又はその発現産物を導入する。ここで、「発現産物」としては、SOX10遺伝子及び/又はKROX20遺伝子のmRNA又はタンパク質が挙げられる。
ヒトSOX10遺伝子cDNA配列:NM_006941(例えば、NM_006941.3)、
ヒトSOX10タンパク質アミノ酸配位列:NP_008872(例えば、NP_008872.1);
マウスSox10遺伝子cDNA配列:NM_011437(例えば、NM_011437.1)、
マウスSOX10タンパク質アミノ酸配位列:NP_035567(例えば、NP_035567.1);
ヒトKROX20遺伝子cDNA配列:NM_000399、NM_001136177、NM_001136178、NM_001136179(例えば、NM_000399.3、NM_001136177.1、NM_001136178.1、NM_001136179.1)、
ヒトKROX20タンパク質アミノ酸配位列:NP_000390、NP_001129649、NP_001129650、NP_001129651(例えば、NP_000390.2、NP_001129649.1、NP_001129650.1、NP_001129651.1);
マウスKrox20遺伝子cDNA配列:NM_010118(例えば、NM_010118.3)
マウスKROX20タンパク質アミノ酸配位列:NP_034248(例えば、NP_034248.2)。
本発明の方法は、特定の遺伝子を選択することと、シュワン細胞に適した培地を用いること以外は、公知のダイレクト・リプログラミングの手法に準じて行うことができ、例えば以下のいずれかの文献の方法に準じて行うことができる:
1: Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytesby Defined Factors; Masaki Ieda, Ji-Dong Fu, Paul Delgado-Olguin, Vasanth Vedantham, Yohei Hayashi, Benoit G. Bruneau, and Deepak Srivastava Cell 142: 375-386, 2010.
2: Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Thomas Vierbuchen, Austin Ostermeier, Zhiping P. Pang, Yuko Kokubu, Thomas C. Sudhof& Marius Wernig. Nature 463: 1035-1041, 2010
3: Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Pang ZP, Yang N, Vierbuchen T, Ostermeier A, Fuentes DR, Yang TQ, Citri A, Sebastiano V, Marro S, Sudhof TC, Wernig M. Nature 476: 220-223, 2011.
4: Generation of hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermal fibroblast culture by defined factors Kunihiko Hiramatsu, Satoru Sasagawa, Hidetatsu Outan
i, Kanako Nakagawa, Hideki Yoshikawa, and Noriyuki Tsumaki, Journal of Clinical Investigation, 121: 640-657, 2011.
5: Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Pengyu Huang, Zhiying He, Shuyi Ji, Huawang Sun, Dao Xiang, Changcheng Liu, Yiping Hu, XinWang & Lijian Hui, . Nature 475:386-389, 2011.
6: Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors. Sayaka Sekiya & Atsushi Suzuki. Nature 475:390-393, 2011.
7: 国際公開公報WO2014/010746号
上記の文献1〜7の内容は本明細書に参考として援用される。
かくして、体細胞からシュワン細胞が誘導され、シュワン細胞が調製される。
ことができる。
本発明により得られるシュワン細胞は、種々の疾患を治療するために用いることができる。この場合、シュワン細胞は移植材料の形態で提供されうる。
1: Hadlock T, Sundback C, Hunter D, Cheney M, Vacanti JP. A polymer foam conduit seeded with Schwann cells promotes guided peripheral nerve regeneration. Tissue Eng 2000;6:119-127.
2: Jesuraj NJ, Santosa KB, Macewan MR, Moore AM, Kasukurthi R, Ray WZ, Flagg ER, Hunter DA, Borschel GH, Johnson PJ, Mackinnon SE, Sakiyama-Elbert SE. Schwann cells seeded in acellular nerve grafts improve functional recovery. Muscle Nerve.2014 Feb;49(2):267-76.
3: Tabesh H, Amoabediny G, Nik NS, Heydari M, Yosefifard M, Siadat SO, Mottaghy K. The role of biodegradable engineered scaffolds seeded with Schwann cells for spinal cord regeneration. Neurochem Int. 2009 Feb;54(2):73-83.
4: Novikova LN, Pettersson J, Brohlin M, Wiberg M, Novikov LN. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 2008 Mar;29(9):1198-206.
5: Guest J, Santamaria AJ, Benavides FD. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 2013 Dec;18(6):682-9.
6: Brook GA, Lawrence JM, Shah B, Raisman G. Extrusion transplantation of Schwann cells into the adult rat thalamus induces directional host axon growth. Exp Neurol. 1994 Mar;126(1):31-43.
7: Vaudano E, Campbell G, Hunt SP. Change in the molecular phenotype of Schwann cells upon transplantation into the central nervous system: down-regulation of c-jun. Neuroscience. 1996 Sep;74(2):553-65.
8: Keirstead HS, Ben-Hur T, Rogister B, O'Leary MT, Dubois-Dalcq M, Blakemore WF. Polysialylated neural cell adhesion molecule-positive CNS precursors generate both oligodendrocytes and Schwann cells to remyelinate the CNS after transplantation. J Neurosci. 1999 Sep 1;19(17):7529-36.
9: Wan H, An YH, Sun MZ, Zhang YZ, Wang ZC. Schwann cells transplantation promoted and the repair of brain stem injury in rats. Biomed Environ Sci. 2003 Sep;16(3):212-8.
10: Chen L, Fan X, Jin G, Wan X, Qiu R, Yi G, You Y, Xu Q. Treatment of rat with traumatic brain injury and MR tracing in vivo via combined transplantation of bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic iron oxide and Schwann cells. J Biomed Nanotechnol. 2014 Feb;10(2):205-15.
11: Shields SA, Blakemore WF, Franklin RJ. Schwann cell remyelination is restricted to astrocyte-deficient areas after transplantation into demyelinated adult rat brain. J Neurosci Res. 2000 Jun 1;60(5):571-8.。
前述するように、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子又はその発現産物を体細胞に導入することにより、シュワン細胞を調製できる。従って、本発明は、さらに、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子又はその発現産物を含む、シュワン細胞を調製するための組成物を提供する。当該シュワン細胞を調製するための組成物は、体細胞からシュワン細胞を誘導するために使用される因子を含むものであり、上記遺伝子又はその発現産物が体細胞に導入可能な形態で含まれていることが望ましい。上記遺伝子が体細胞に導入可能な形態として、具体的には、上記遺伝子が組み込まれたベクターが例示される。ここで、上記遺伝子は、各々別のベクターに組み込まれていてもよく、1つのベクターに2種以上の遺伝子が同時に組み込まれていてもよい。
前述するように、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子又はその発現産物を体細胞に導入することにより、シュワン細胞を調製できる。
1: Ieda M. Heart regeneration using reprogramming technology. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2013;89(3):118-28. Review.
2: Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P, Vedantham V, Hayashi Y, Bruneau BG,Srivastava D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 2010 Aug 6;142(3):375-86.
3: Qian L, Huang Y, Spencer CI, Foley A, Vedantham V, Liu L, Conway SJ, Fu JD, Srivastava D. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 2012 May 31;485(7400):593-8.
上記の文献1〜3の内容は本明細書に参考として援用される。
図1に、本発明のシュワン細胞(図中、「directly reprogrammed Schwann cell: dSC」)を調製するための方法の概略を示す。
ヒト正常皮膚線維芽細胞(aHDF)を、12 wellプレートに培養し、実施例1に記載の操作を行った。第14日に各ウェルから培養液を吸引除去し、PBSで1回洗浄を行った後、4%PFAで固定。ブロッキング溶液を加え、37℃で15分間静置した。抗S100β抗体(1次抗体)とAlexaFluor566標識抗ウサギIgG抗体(2次抗体)で染色した細胞である。プレートの各ウェルには異なる遺伝子の組み合わせが導入されており、どのナンバーのウェルにどの遺伝子の組み合わせが導入されたかは、表1に記載する(表中で、各遺伝子の欄に「1」と記載があるものは、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させたことを、空欄は、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させていないことを表す)。導入した遺伝子候補は、シュワン細胞関連遺伝子としてSOX10、Krox20、Oct6を、リプログラミング関連遺伝子としてSOX2、C-myc、KLF4、Oct3/4の7因子である。たとえば、表1のNo. 43は、SOX10、Krox20、Oct6、KLF4の遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させた細胞である。
図2と同じ実験において、その他の組み合わせの染色性を確認するために、プレートを蛍光顕微鏡(オリンパス製)で観察し、S100βの染色性を4段階で評価した(S100β陽性細胞が多いものから順に、+++、++、+、−)。
実施例1において、Sox10とKrox20の2因子の遺伝子を導入した細胞について、ヒト正常皮膚線維芽細胞からシュワン細胞へのコンバージョンにおける細胞形態変化をシュワン細胞に特徴的なバイポーラ型の細胞長の増加を細胞長/細胞幅比で評価した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞aHDFを、12wellプレートに培養し、実施例1の操作を行った。SOX10及びKrox20の2つの遺伝子を導入した群の結果を示す。遺伝子導入から12日後、免疫染色を行った。
A. ヒト正常皮膚線維芽細胞からシュワン細胞へのコンバージョン、S100βとp75NTR遺伝子のmRNA発現量の測定(図6)
ヒト正常皮膚線維芽細胞(aHDF)を、12wellプレートに培養し、実施例1の操作をした。ウェルNo. 1〜6の細胞にはSox10とKrox20の2因子の遺伝子を導入し、ウェルNo. 7〜12の細胞にはコントロールとして遺伝子は導入しなかった。遺伝子導入12日後、各ウェルからISOGEN IIにてtotal RNAを回収し、ReverTra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。UCP1とβアクチン遺伝子のmRNAレベルを定量する目的で、Real-time PCR Master Mix、Taqman probe、Specific PrimerおよびcDNAを混和し、AB7300 Real-time PCR systemを用いてReal-time RT-PCRを行った。各細胞のβアクチンmRNAレベルに対する目的遺伝子のmRNAレベルの値を計算した。
Aで得られたReal-time RT-PCR産物をアガロースゲルを用いた電気泳動を行った。結果、SOX10とKrox20の2因子の遺伝子を導入した細胞群において、S100βとp75NTR遺伝子のmRNAの強い発現が確認された。
NG108-15を12時間培養し、その後36時間、HDF、cSC、または、dSC (Sox10とKrox20の2因子の遺伝子を導入して誘導したdSC)と、共培養を行った。コントロールとして、NG108-15を1% FBS 添加DMEMのみで培養した。I.神経突起を有する細胞(neurite-bearing cell)の割合(percent of neurite-bearing-cells)、II.細胞体から直接伸長する一次神経突起数(number of primary neurites)、III.最長神経突起の長さ(Longest neurite length)を文献:Tomita K, Madura T, Sakai Y, et al: Glialdifferentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy. Neuroscience.2013; 236:55-65.の方法により比較検討した。NG108-15のみを抗Tuj-1抗体(1次抗体)と2次抗体はAlexaFluor566標識抗ウサギIgG抗体を用いて蛍光染色した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞aHDFを、12wellプレートに培養し、実施例1の操作を行った。SOX10及びKrox20の2つの遺伝子を導入した群の結果を示す。遺伝子導入から14日後、免疫染色を行った。
脂肪由来間質細胞からdSCへのコンバージョンを検証した。
ヒト正常脂肪由来間質細胞(ADSC: adipose rerived stromal cell)を、12wellプレートに培養し、実施例1の操作を行った。SOX10及びKrox20の2つの遺伝子を導入した群の結果を示す。遺伝子導入から14日後、免疫染色を行った。
結果を図9に示す。抗S100β抗体(1次抗体)、抗p75NTR抗体(1次抗体)、抗GAP43抗体(1次抗体)、抗Protein Zero抗体(1次抗体)は宿主がウサギであり、2次抗体は、AlexaFluor566標識抗ウサギIgG抗体を使用した。S100βによる染色では、約40%の細胞が陽性を示した。他のシュワン細胞マーカーについてもS100βに比べて陽性率は下がるもののそれぞれの発現が確認される。ミエリンマーカーであるProtein Zeroも陽性を示した。
血管内皮細胞からdSCへのコンバージョンを検証した。
臍帯血管内皮細胞(Huvec: Human Umbilical Vein Endothelial Cells)を、12wellプレートに培養し、実施例1の操作を行った。SOX10及びKrox20の2つの遺伝子を導入した群の結果を示す。遺伝子導入から14日後、免疫染色を行った。
結果を図10に示す。抗S100β抗体(1次抗体)、抗p75NTR抗体(1次抗体)、抗GAP43抗体(1次抗体)、抗Protein Zero抗体(1次抗体)は宿主がウサギであり、2次抗体は、566標識抗ウサギIgG抗体を使用した。S100βによる染色では、約30%の細胞が陽性を示した。他のシュワン細胞マーカーについてもS100βに比べて陽性率は下がるもののそれぞれの発現が確認される。ミエリンマーカーであるProtein Zeroも陽性を示した。
GFPでマーキングしたdSCとDRGnとの共培養によるdSCのin vitroでのミエリン化能を評価した。
dSCをレトロウィルスベクターを用いてGFPで細胞マーキングした。
DMEM containing N2 supplement (Invitrogen), 50 ng/ml ascorbic acid (Wako, Osaka, Japan), and 50 ng/ml recombinant rat b-nerve growth factor (NGF) (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA),0.5μM cAMP(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)。
結果を図11に示す。DRGの神経突起に沿ってミエリン化したシュワン細胞がみられるが、一部のミエリン化シュワン細胞とGFPでマーキングされたdSC細胞がOverlapしている。
dSCのin vivoでのミエリン化能の検討をした。
dSCをウィルスベクターを用いてGFPで細胞マーキングした。
結果を図12に示す。再生神経に沿うようにGFP+細胞が並んでおり、これらはミエリンマーカー+細胞とOverlapしている(図12B及びC)。
〈方法〉
培養シュワン細胞(SC:比較対照群)を坐骨神経より分離培養した。これらの細胞をあらかじめゼラチンチューブに播種させ、マウスの坐骨神経幹に約5mmのgapを作成した。得られたハイブリッド型チューブを神経欠損部に移植した。ShamマウスおよびPBSのみを含有させたチューブ移植群(Cont)をコントロールに、神経再生促進効果を評価した(図13A)。
架橋された神経のマクロ像では、cSC群とdSCの両者ともcontrolに比較して優れており、両者間で明らかな差異はみられなかった(図13B)。
表2に示す遺伝子の組み合わせについて、実施例2と同様の実験を行った。
HDF、cSC、及びdSCを4 x 104 cells/cm2の条件で細胞培養用ディッシュに播種し、80%コンフルエントを確認後、48時間細胞上清採取用培地で培養した。その後、各群の培養上清を40-μmフィルターに通した後、採取した。 Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF)、glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)、Nerve Growth Factor (NGF)について、それぞれの培養細胞の培養上清中に含まれる蛋白量をELISA kits human BDNF ,GDNF, NGF(Promega, Madison, WI)を用いて測定した。
Claims (6)
- SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子又はその発現産物を含む、哺乳動物の体細胞を、多能性幹細胞を経由することなくシュワン細胞にコンバートする為の剤であって、
前記遺伝子が、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子の組み合わせであり、
前記体細胞が線維芽細胞、血管内皮細胞又はヒト正常脂肪由来間質細胞である、剤。 - SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子又はその発現産物を含む、哺乳動物の体細胞を、多能性幹細胞を経由することなくシュワン細胞にコンバートする為のベクターであって、
前記遺伝子が、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子の組み合わせであり、
前記体細胞が線維芽細胞、血管内皮細胞又はヒト正常脂肪由来間質細胞である、ベクター。 - 哺乳動物の神経の欠損、又は、シュワン細胞の欠損、不足若しくは機能低下に基づく疾患を治療するためのベクターである、請求項2に記載のベクター。
- 哺乳動物(但し、ヒトを除く)の体細胞に、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子又はその発現産物を導入する工程を含む、多能性幹細胞を経由することなく体細胞からシュワン細胞を調製する方法であって、
前記遺伝子が、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子の組み合わせであり、
前記体細胞が線維芽細胞、血管内皮細胞又はヒト正常脂肪由来間質細胞である、方法。 - 遺伝子又はその発現産物を導入した哺乳動物の体細胞を3日間から2週間培養することを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子又はその発現産物を含む、多能性幹細胞を経由することなく体細胞からシュワン細胞を調製するための組成物であって、
前記遺伝子が、SOX10遺伝子及びKROX20遺伝子の組み合わせであり、
前記体細胞が線維芽細胞、血管内皮細胞又はヒト正常脂肪由来間質細胞である、組成物。
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