JP6799861B2 - 核酸分子 - Google Patents
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Description
を含む。
AGCUACAUCUGGCUACUGGGUCUC (配列番号2)
本出願は、2015年9月16日付で出願した日本国特許出願2015−183339に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本発明にかかる膵臓ランゲルハンス島β細胞の増殖促進剤、インスリン分泌増強剤、及び糖尿病治療薬は、配列番号1の配列を有する核酸分子及び配列番号2の配列を有する核酸分子のいずれかまたは両方を含有する。
miR-222-3p:AGCUACAUCUGGCUACUGGGUCUC (配列番号2)
核酸分子は、天然型ヌクレオチド(塩基としてアデニン、グアニン、ウラシル、シトシンを有するRNA型リボヌクレオチド、あるいはアデニン、グアニン、チミン、シトシンを有するDNA型デオキシリボヌクレオチド)または非天然型ヌクレオチド(例えば、イノシンを有するヌクレオチド、天然型ヌクレオチドのα-エナンチオマー型など)から構成されてもよく、両方から構成されたキメラ分子であってもよいが、リボヌクレオチドからなるRNAであることが好ましい。
本発明にかかる膵臓ランゲルハンス島β細胞の増殖促進剤は、配列番号1の配列を有する核酸分子及び配列番号2の配列を有する核酸分子のいずれかまたは両方、またはその発現構築物を含有する。この増殖促進剤の用途は特に限定されず、試薬にも医薬にも用いることができる。
本発明にかかる糖尿病治療薬は、配列番号1の配列を有する核酸分子及び配列番号2の配列を有する核酸分子のいずれかまたは両方を含有する。
<実施例>
C57BL/6Jマウス(6週令)に対し、50mg/kg体重のスロレプトゾトシン(STZ)(シグマ社)を腹腔内に5日間、連日投与して、高血糖症を誘導した(以下、STZマウスと称する)。なお、STZは、0.05Mのクエン酸バッファー(pH4.5)に溶解させた溶液を用いた。
STZマウスに対し、STZ投与日を1日目とし、5日目、8日目、11日目に、200μlのマイクロRNA/アテロコラーゲン混合溶液(図ではmiRNAsと記載)を尾静脈から注入した(以下、STZ-miRNAsマウスと称する)。STZ投与後1、5、15、20、30、40、50日目に空腹時血糖を測定した。すなわち、昼間の9時間食餌させず、その後、0、15、30、60、120分で尾静脈から採血し、Glutest Mint(三和化学社)を用いて血糖値を測定した。なお、比較例としては、上記マイクロRNAの代わりに、遺伝子発現に影響のないマイクロRNAであるmirVana miRNA mimic Negative Control #1(Ambion社(図ではNTと記載))を用いた(以下、STZ-NTマウスと称する)。またコントロールマウス(健常マウス)には、STZ及びマイクロRNAを含有しない200μlの0.05Mのクエン酸バッファー(pH4.5)を、STZの代わりとして最初の5日間だけ注入した。
(2)で作製したマウスにおいて、STZ投与後45日目にブドウ糖負荷試験を行ったところ、(2)と同様にSTZ-miRNAsマウスでは耐糖性が改善されていた。これらのマウスの血清中のインスリン濃度を、ELISA kit(森永生化学研究所)と用いて測定したところ、図3に示すように、STZ-miRNAsマウスでは、STZ-NTマウスに比べ、血中インスリン濃度が増加していた。
(3)で用いたのと同じ膵臓組織の一部を用いてパラフィン切片を作製し、HRP結合抗インスリンモノクローナル抗体(シグマ社)(2000倍希釈)及びDABと用いてインスリン発現細胞を検出したところ、図5Aに示すように、STZ-miRNAsマウスでは、STZ-NTマウスに比べ、インスリン陽性細胞数が増加していた。
STZ-miRNAsマウス及びSTZ-NTマウスに対し、STZ投与後50日目で、体重を測定し、その後、精巣上体白色脂肪組織を摘出し、重量を測定した。その結果、図6に示すように、
STZ-NTマウスでは体重及び脂肪蓄積が減少するが、STZ-miRNAsマウスでは、体重及び脂肪蓄積の減少は改善した。この効果は、miR-106bおよびmiR-222投与による糖尿病改善の結果であると考えられる。
(1)に記載のmiR-106bとmiR-222の混合溶液(各0.025重量%)の代わりに、0.050重量%のmir222(コスモバイオ社)溶液をマウスに注射し(以下、STZ- mir222RNAマウスと記載する)、(2)と同様に空腹時血糖を測定した。
本実施例では、in vitroにおけるランゲルハンス島β細胞の増殖に対するmiR-106b/222の効果を調べた。
コラゲナーゼ灌流法を用いてマウスの膵臓から単離した40個の膵島を、トリプシン処置することで分散させ、in vitroでプレートに播種した後、LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagentを用いてtotal 20pmolのmiR-106b/miR-222 (各々10pmol)をトランスフェクトした。72時間培養後、細胞を回収し、細胞増殖のマーカーであるKi-67のmRNAレベルでの発現を、リアルタイムPCR法により測定した。
図8に示すように、miR-106b/222を導入した細胞では、有意にKi-67発現レベルが亢進していた。
このように、in vitroにおいても、miR-106b/222は、膵島細胞に対して、ランゲルハンス島β細胞の増殖を促進する。
本実施例では、miR-106b/miR-222の肝臓および腎臓に対する影響を調べた。
まず、図9Aに示すように、1〜5日目にSTZ(50mg/kg体重)を腹腔注射によって投与したSTZマウスに対し、5日目と9日目に、200μlのmiR-106b/miR-222マイクロRNA/アテロコラーゲン混合溶液(miRNAs/atelo)(マウス5匹)、または対照としてネガティブコントロールmiRNA/アテロコラーゲン混合溶液(NT/atelo)(マウス6匹)を尾静脈から注入した(各マウスをSTZ-miRNA(106b/222)及びSTZ-NTと称する)。9日目に肝臓および腎臓の重量を計測するとともに、パラフィン包埋組織切片を作製し、HE染色後、顕微鏡で観察した。それぞれの結果を図9B及び図9Cに示す。
肝重量および腎重量については、STZ-miRNA(106b/222)とSTZ-NTとでは、有意差がなかった(図9B)。また、組織像についても、STZ-miRNA(106b/222)とSTZ-NTとでは、違いが認められなかった(図9C)。
このように、miR-106b/miR-222の投与は、肝臓や腎臓には悪影響を与えない。
Claims (12)
- 膵臓ランゲルハンス島β細胞の増殖促進剤であって、
配列番号1または配列番号2を有する核酸分子のうち、少なくとも一方を含有する増殖促進剤。
UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU (配列番号1)
AGCUACAUCUGGCUACUGGGUCUC (配列番号2) - 前記核酸分子のヌクレオチドの一部または全部がDNA型ヌクレオチドに置換されている、請求項1に記載の増殖促進剤。
- 膵臓ランゲルハンス島β細胞の増殖促進剤であって、
請求項1または2に記載の核酸分子の発現構築物を含有する増殖促進剤。 - 骨髄移植後の膵臓ランゲルハンス島β細胞の増殖を促進するために用いられる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の増殖促進剤。
- 経静脈的に投与される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の増殖促進剤。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の増殖促進剤を含有する糖尿病治療薬。
- 1型糖尿および/または2型糖尿病の治療薬である、請求項6に記載の糖尿病治療薬。
- 膵臓ランゲルハンス島β細胞の増殖促進を調べる方法であって、
配列番号1または配列番号2において1〜6個の変異を有する塩基配列を有する核酸分子またはその発現構築物を合成する工程と、
前記核酸分子またはその発現構築物が膵臓ランゲルハンス島β細胞の増殖を促進するかどうか調べる工程と、
を含む、方法。
UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU (配列番号1)
AGCUACAUCUGGCUACUGGGUCUC (配列番号2) - 膵臓ランゲルハンス島β細胞の増殖を促進する核酸分子またはその発現構築物を得る方法であって、
配列番号1または配列番号2において1〜6個の変異を有する塩基配列を有する複数の核酸分子またはその発現構築物を合成する工程と、
前記複数の核酸分子またはその発現構築物が膵臓ランゲルハンス島β細胞の増殖を促進するかどうか調べる工程と、
膵臓ランゲルハンス島β細胞の増殖を促進する核酸分子またはその発現構築物を特定する工程と、
を含む、方法。
UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU (配列番号1)
AGCUACAUCUGGCUACUGGGUCUC (配列番号2) - 膵臓ランゲルハンス島β細胞のインスリン分泌促進を調べる方法であって、
配列番号1または配列番号2において1〜6個の変異を有する塩基配列を有する核酸分子またはその発現構築物を合成する工程と、
前記核酸分子またはその発現構築物が膵臓ランゲルハンス島β細胞のインスリン分泌を促進するかどうか調べる工程と、
を含む、方法。
UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU (配列番号1)
AGCUACAUCUGGCUACUGGGUCUC (配列番号2) - 膵臓ランゲルハンス島β細胞のインスリン分泌を促進する核酸分子またはその発現構築物を得る方法であって、
配列番号1または配列番号2において1〜6個の変異を有する塩基配列を有する複数の核酸分子またはその発現構築物を合成する工程と、
前記複数の核酸分子またはその発現構築物が膵臓ランゲルハンス島β細胞のインスリン分泌を促進するかどうか調べる工程と、
膵臓ランゲルハンス島β細胞のインスリン分泌を促進する核酸分子またはその発現構築物を特定する工程と、
を含む、方法。
UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU (配列番号1)
AGCUACAUCUGGCUACUGGGUCUC (配列番号2) - 前記核酸分子の塩基配列が、配列番号1または配列番号2において1〜3個の変異を有する配列である、請求項8〜11のいずれか1項に記載の方法。
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