CN103210089A - 微泡和相关的微小rna的治疗用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗各种疾病、疾患和病症的基于微泡的改良的方法和组合物。具体地，本发明涵盖以下发现：微泡含有特定的微小RNA，所述微小RNA可以发挥参与细胞或组织再生、重塑、重建、重编程或转分化的细胞间调节子的功能。因此，特别地，本发明提供了基于微泡和/或相关的微小RNA的方法和组合物，提供了更可预测且有效的治疗结果。

Description

微泡和相关的微小RNA的治疗用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年8月13日提交的美国临时专利申请号61/373,715和2010年9月8日提交的美国临时专利申请号61/380,766的优先权，其每一个的全部内容通过引用并入本文。

本申请涉及同日提交的名称为“细胞和分子疗法”（“Cellular and Molecular Therapies”）的美国申请，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

微泡过去被认为是没有明显功能的细胞碎片。然而最近，越来越多的实验数据表明，微泡具有许多生物活性。例如，研究表明血小板衍生的微泡通过微泡上的表面蛋白（例如，CD154、RANTES和/或PF-4；参见Thromb.Haemost.（1999），82:794，或J.Biol.Chem.（1999），274:7545）而刺激选定的细胞。在其他实例中，报道了某些靶细胞上血小板微泡中生物活性脂质（例如，神经鞘氨醇-1-磷酸酯、HETE或花生四烯酸）的特定效应（参见例如，J.Biol.Chem.（2001），276:19672；或Cardiovasc.Res.（2001），49（5）:88）。而且，血小板微泡通过将某些微泡表面组分转移至被动员的细胞，从而增加被动员的CD34+内皮细胞的粘附（参见例如，Blood（2001），89:3143）。

已经有微泡的各种临床用途的提议。虽然这些提议的用途至少提供了一些有前景的观点，但依然存在几个很大程度上未解释的问题。例如，微泡的生物活性经常难以预测。而且，目前考虑的治疗用途通常需要灭菌和抗病毒处理以预防接受含有微泡制剂的人被感染，这是耗时且没有效率的。因此，依然需要基于微泡的改进的组合物和使用方法。

发明概述

本发明提供了基于微泡的改进的方法和组合物，以用于治疗疾病、疾患或病症。具体地，本发明涵盖以下发现：微泡含有特定的微小RNA，所述微小RNA可以发挥参与细胞或组织再生、重塑、重建、重编程或转分化的细胞间调节子的功能。因此，本发明提供了基于微泡和/或相关的微小RNA的方法和组合物，提供了更可预测且有效的治疗结果。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗疾病、疾患或病症的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的微泡。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法可用于治疗选自糖尿病、心肌梗死、肾病、创伤愈合、瘘管再生、神经再生（例如，CNS再生或外周神经***再生）、***切除术之后的隆胸、与美容外科手术相关的病症及其组合的疾病、疾患或病症：。

在一些实施方案中，本发明提供了在体内诱导组织修复、重塑、分化或转分化的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的微泡。在一些实施方案中，适合的微泡来源于与患病组织（即，靶组织）相同的组织。在一些实施方案中，适合的微泡来源于与患病组织（即，靶组织）不同的组织。在一些实施方案中，适合的微泡来源于胰脏细胞、肾细胞、肝细胞、脾细胞、***、子宫肌层细胞、外周血细胞、脐带血细胞、骨髓细胞、血清或其组合。在一些实施方案中，适合的微泡来源于胰腺衍生的探路者细胞。在一些实施方案中，适合的微泡来源于自体细胞。在一些实施方案中，适合的微泡来源于非自体细胞。

在一些实施方案中，适合的微泡来源于非织造基底上生长的细胞。在一些实施方案中，非织造基底含有脂肪族聚酯纤维。在一些实施方案中，适合本发明的脂肪族聚酯纤维选自丙交酯（其包括乳酸D-、L-和内消旋丙交酯）、乙交酯（包括乙醇酸）、ε-己内酯、对二氧环己酮（1,4-二氧杂环己烷-2-酮）、三亚甲基碳酸酯（1,3-二氧杂环己烷-2-酮）的同聚物或共聚物及其组合。

在一些实施方案中，适合的微泡来源于在氧压小于或等于5%的培养条件下生长的细胞。在一些实施方案中，适合的微泡来源于在室内空气氧条件下生长的细胞。在一些实施方案中，适合的微泡来源于生长至大约80-99%汇合的细胞。

在一些实施方案中，适合的微泡来源于在血清饥饿条件下生长的细胞。在一些实施方案中，适合的微泡来源于在血清饥饿条件下生长约24小时的细胞。在一些实施方案中，适合的微泡来源于在血清充足条件下生长的细胞。

在一些实施方案中，适合的微泡通过差速超速离心分离或纯化。在一些实施方案中，适合的微泡通过沉淀分离或纯化。

在一些实施方案中，适合的微泡包含选自表1和表7-13所列的一种或多种微小RNA。

在一些实施方案中，适合的微泡包含一种或多种微小RNA，所述一种或多种微小RNA选自miRNA-122、miRNA-127、miRNA-133b、miRNA-323、miRNA-433、miRNA-451、miRNA-466h、miRNA-467c、miRNA-467e、miRNA-468、miRNA-491、miRNA-495、miRNA-546、miRNA-666、miRNA-680、miRNA-346、miRNA-136、miRNA-202、miRNA-369、miRNA-370、miRNA-375、miRNA-376b、miRNA-381、miRNA-434、miRNA-452、miRNA-465a、miRNA-465b、miRNA-470、miRNA-487b、miRNA-543、miRNA-547、miRNA-590、miRNA-741、miRNA-881、miRNA-206、miRNA-224、miRNA-327、miRNA-347及其组合。

在一些实施方案中，适合的微泡包含一种或多种微小RNA，所述一种或多种微小RNA选自miRNA-122、miRNA-127、miRNA-133b、miRNA-323、miRNA-433、miRNA-451、miRNA-466h、miRNA-467c、miRNA-467e、miRNA-468、miRNA-491、miRNA-495、miRNA-546、miRNA-666、miRNA-680、miRNA-346及其组合。

在一些实施方案中，适合的微泡不含有miRNA-129-5p、miRNA-190、miRNA-203、miRNA-32、miRNA-34c、miRNA-376c、miRNA-384-3p、miRNA-499b、miRNA-455、miRNA-582-5p、miRNA-615-3p、miRNA-615-5p、miRNA-7b、miRNA-17-3p、miRNA-381和miRNA-505。

在一些实施方案中，治疗有效量的微泡的范围是1fg-1mg/kg体重（例如，10fg-1mg/kg、100fg-1mg/kg、1pg-1mg/kg、10pg-1mg/kg、100pg-1mg/kg体重）。在一些实施方案中，微泡通过静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮、皮内、颅内、鞘内、胸膜内、眼窝内、鼻内、口服、消化道内、结肠直肠和/或脑脊髓内施用。

在一些实施方案中，微泡每天施用。在一些实施方案中，微泡每周施用。在一些实施方案中，微泡每两周施用。在一些实施方案中，微泡每月施用。

在一些实施方案中，本发明提供了通过施用从微泡获得、分离或纯化的一种或多种微小RNA来治疗疾病、疾患或病症的方法。在一些实施方案中，微泡来源于在血清饥饿条件下生长的细胞。在一些实施方案中，微泡来源于在血清饥饿条件下生长约24小时的细胞。在一些实施方案中，微泡来源于在血清充足条件下生长的细胞。在一些实施方案中，从微泡获得、分离或纯化的微小RNA在细胞和/或微泡中差异表达，所述细胞和/或微泡来源于在应激条件（例如，氧压、细胞培养汇合、培养基中的血清量，等）下生长的细胞。在一些实施方案中，本发明提供了治疗疾病、疾患或病症的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的一种或多种微小RNA，所述一种或多种微小RNA具有与SEQ IDNO:1-72（例如，SEQ ID NO:1-29）的任何一个至少70%（例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%）相同的序列。在一些实施方案中，一种或多种微小RNA具有与SEQ IDNO:1-72（例如，SEQ ID NO:1-29）的任何一个相同的序列。在一些实施方案中，本发明提供了治疗疾病、疾患或病症的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的一种或多种微小RNA，所述一种或多种微小RNA具有与表7-13中的序列的任何一个至少70%（例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%）相同的序列。

在一些实施方案中，本发明提供了在体内诱导组织修复、重塑、分化或转分化的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的一种或多种微小RNA，所述一种或多种微小RNA具有与SEQ ID NO:1-72（例如，SEQ ID NO:1-29）的任何一个至少70%（例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%）相同的序列。在一些实施方案中，一种或多种微小RNA具有与SEQ ID NO:1-72（例如，SEQ ID NO:1-29）的任何一个相同的序列。在一些实施方案中，本发明提供了在体内诱导组织修复、重塑、分化或转分化的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的一种或多种微小RNA，所述微小RNA具有与表7-13中的序列的任何一个至少70%（例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%）相同的序列。

在一些实施方案中，根据本发明的发明方法可用于治疗选自糖尿病、心肌梗死、肾病、创伤愈合、瘘管再生、神经再生（例如，CNS再生或外周神经***再生）、***切除术之后的隆胸、与美容外科手术相关的病症及其组合的疾病、疾患或病症。

在一些实施方案中，一种或多种miRNA的治疗有效量的范围是1fg-1mg/kg体重（例如，10fg-1mg/kg、100fg-1mg/kg、1pg-1mg/kg、10pg-1mg/kg、100pg-1mg/kg体重）。在一些实施方案中，一种或多种miRNA通过静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮、皮内、颅内、鞘内、胸膜内、眼窝内、鼻内、口服、消化道内、结肠直肠和/或脑脊髓内施用。在一些实施方案中，一种或多种miRNA通过静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮、皮内、颅内、鞘内、胸膜内、眼窝内、鼻内、口服、消化道内、结肠直肠和/或脑脊髓内施用。在一些实施方案中，一种或多种miRNA每天、每周、每两周或每月施用。

在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含用于治疗各种疾病、疾患或病症的治疗有效量的微泡。在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含用于治疗糖尿病、心肌梗死、肾病、创伤愈合、瘘管再生、神经再生（例如，CNS再生或外周神经***再生）、***切除术之后的隆胸和/或与美容外科手术有关的病症及其组合的治疗有效量的微泡。

在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含一种或多种微小RNA以及药学可接受的载体，所述一种或多种微小RNA具有与SEQ ID NO:1-72（例如，SEQ IDNO:1-29）的任何一个至少70%（例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%）相同的序列。在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含一种或多种微小RNA以及药学可接受的载体，所述一种或多种微小RNA具有与SEQ ID NO:1-72（例如，SEQ IDNO:1-29）的任何一个相同的序列。在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含一种或多种微小RNA和药学可接受的载体，所述一种或多种微小RNA具有与表7-13中的序列的任何一个至少70%（例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%）相同的序列。在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含一种或多种微小RNA和药学可接受的载体，所述一种或多种微小RNA具有与表7-13中的序列的任何一个相同的序列。在一些实施方案中，一种或多种miRNA以治疗有效量存在，所述治疗有效量可治疗糖尿病、心肌梗死、肾病、创伤愈合、瘘管再生、神经再生（例如，CNS再生或外周神经***再生）、***切除术之后的隆胸、与美容外科手术相关的病症或其组合。

在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定诱导细胞生长和/或再生的miRNA的方法，该方法包括提供细胞，所述细胞在除去微泡的培养基中生长；向所述培养基添加miRNA；确定与对照相比，所述miRNA的添加是否增加了细胞增殖速率，从而鉴定所述miRNA是否诱导细胞生长和/或再生。在一些实施方案中，所述细胞是胰腺衍生的探路者细胞。在一些实施方案中，所述细胞增殖速率通过倍增时间来确定。某些实施方案中，所述miRNA分离自微泡。

在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定诱导细胞生长和/或再生的miRNA的方法，该方法包括：在生长至汇合的细胞中产生创伤区；用miRNA治疗所述细胞；确定与对照相比，在所述创伤区的被治疗的细胞的再生速率，从而鉴定所述miRNA是否诱导细胞生长和/或再生。在一些实施方案中，所述细胞是成纤维细胞或心肌细胞。在一些实施方案中，所述再生速率被定量确定。

在一些实施方案中，所述对照是未经治疗、但在相同条件下生长的细胞。在一些实施方案中，所述miRNA分离自微泡。

在一些实施方案中，本发明提供了使用本文描述的方法鉴定的、诱导细胞生长和/或再生的miRNA。

在本申请中，除非另外说明，“或”的使用表示“和/或”。如本申请使用的，术语“包括”以及该术语的变化形式，例如“包括”和“包括”，不是要排除其他添加物、组分、整数或步骤。如本申请使用的，术语“约”和“大约”等同地使用。本申请中使用的、带有或不带有约/大约的任何数字表示涵盖相关领域普通技术人员所理解的任何正常波动。在某些实施方案中，除非另外说明或者与上下文明显矛盾，术语“大约”或“约”指落入所述参考值任一方向（大于或小于）的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小的值的范围（除了这些数字会超过可能值的100%的情况）。

本发明的其他特征、目的和优势在随后的发明详述、附图和权利要求中将是明显的。然而，应该理解，在本发明中说明实施方案的发明详述、附图和权利要求仅作为示例给出，而非限制。本发明范围内的各种变化和修饰对于本领域技术人员而言将是明显的。

附图简述

附图仅用于举例说明的目的，而不是为了限制。

图1A和1B显示了亚汇合的大鼠PDPC细胞的示例性扫描电子显微镜照片，所述细胞适于在含有去除牛微泡的胎牛血清（FBS）的培养基中生长。两张图片的细胞表面都可以观察到正在形成的微泡。

图2A和2B显示了微泡（MV）对大鼠PDPC细胞生长速率的示例性影响。图2A描绘了牛MV的去除对大鼠PDPC细胞倍增时间的影响。（绘制在y轴上的是电阻抗；负值指示细胞死亡和由此导致的负增长）。在43小时进行MV去除。观察到对倍增时间的负影响，稍后恢复。图2B显示了添加衍生自大鼠PDPC细胞的MV后，大鼠PDPC倍增时间的剂量依赖性恢复。在48小时去除培养物的MV，然后在10小时后添加外源性MV。与正常恢复时间相比，接受外源性MV的细胞的倍增时间的快速恢复明显提前。

图3显示了含有微泡的细胞培养基的示例性差速离心分级分离。

图4显示了对比大鼠PC、MV级分和外体（exosome）级分的miRNA表达谱的示例性图表。图表显示了与血清充足条件下生长相比，在血清饥饿条件下生长24小时后，表达发生了改变的miRNA的数目。被分析的大鼠miRNA基因总数=584。被分析的人miRNA基因总数=761。展示的数据来自N=1，在TLDA卡上的单基因表达分析的实验。

图5显示了针对大鼠PC、MV级分和外体级分绘制的miRNA表达的示例性图表的对比。图表显示了与血清充足条件下生长相比，在血清饥饿条件下生长24小时后基因表达增加的miRNA。被分析的大鼠miRNA基因总数=584。展示的数据来自N=1，在TLDA卡上的单基因表达分析的实验。

图6显示了对比大鼠PC、大鼠MSC和人PC的miRNA表达谱的示例性图表。图表显示了与血清充足条件下生长相比，在血清饥饿条件下生长24小时后，表达发生了改变的miRNA的数目。被分析的大鼠miRNA基因总数=584。被分析的人miRNA基因总数=761。展示的数据来自N=1，在TLDA卡上的单基因表达分析的实验。

图7显示了对比人PC和获自人PC的微泡（MV）的miRNA表达谱的示例性图表。图表显示了与血清充足条件下生长相比，在血清饥饿条件下生长24小时后，表达发生了改变的miRNA的数目。被分析的人miRNA基因总数=761。展示的数据来自N=1，在TLDA卡上的单基因表达分析的实验。

图8显示了对比获自大鼠PC的MV和获自人PC的MV的miRNA表达谱的示例性图表。图表显示了与血清充足条件下生长相比，在血清饥饿条件下生长24小时后，表达发生了改变的miRNA的数目。被分析的大鼠和小鼠miRNA基因总数=584。被分析的人miRNA基因总数=761。展示的数据来自N=1，在TLDA卡上的单基因表达分析的实验。

图9显示了获自大鼠PC的MV和获自人PC的MV的miRNA表达谱的示例性图表对比。图表显示了与血清充足条件下生长相比，在血清饥饿条件下生长24小时之后基因表达增加或减少的miRNA。被分析的大鼠和小鼠miRNA基因总数=584。展示的数据来自N=1，在TLDA卡上的单基因表达分析的实验。

定义

为了使本发明更容易被理解，下文首先定义了一些术语。在说明书通篇都对以下术语和其他术语的其他定义进行了说明。

动物:如本文使用的，术语“动物”指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”指处于发育任何阶段的人。在一些实施方案中，“动物”指处于发育任何阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物（例如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪）。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程动物和/或克隆。

大约:如本文使用的，术语“大约”或“约”用于一个或多个所描述的值时，指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，除非另外说明或者与上下文明显矛盾，术语“大约”或“约”指落入所述参考值任一方向（大于或小于）的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小内的值的范围（除了这种数字会超过可能值的100%的情况）。

自身免疫疾患：如本文使用的，术语“自身免疫疾患”指由其免疫***对机体自身组织的攻击导致的疾患。在一些实施方案中，自身免疫疾病是糖尿病、多发性硬化、卵巢早衰、硬皮病、干燥病、狼疮、脱毛病（秃病）、多腺体衰竭、格雷夫斯（Grave’s）病、甲状腺机能减退、多发性肌炎、乳糜泻、克罗恩病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体机能减退、格林-巴利（Guillain-Barre）综合征、心肌炎、艾迪生（Addison）病、自身免疫性皮肤病（例如，牛皮鲜）、葡萄膜炎（uveititis）、恶性贫血、风湿性多肌痛、古德帕斯丘（Goodpasture）综合征、甲状旁腺机能减退、桥本氏（Hashimoto）甲状腺炎、雷诺氏现象、风湿性多肌痛和类风湿性关节炎。

自体的和非自体的：如本文使用的，术语“自体的”表示来自相同生物体。在本申请上下文中，该术语用于表示，相互称为“自体的”细胞和/或微泡的群体不含有可以被视为同种异体或异种的任何材料，也就是说衍生自“外来”细胞源。如本文使用的，术语“非自体的”表示不来自同一生物体。

糖尿病：如本文使用的，术语“糖尿病”指由遗传性的不能产生胰岛素（1型）或获得性的胰岛素抵抗（2型）引起的、以血液中异常高水平葡萄糖为特征的代谢疾病。1型糖尿病是由胰岛素生成不足引起，并导致糖、脂肪和蛋白质异常代谢的严重的慢性糖尿病形式。通常出现在儿童或***的疾病特征为血液和尿液中糖水平升高、烦渴、尿频、酸中毒和消瘦。1型糖尿病还称为胰岛素依赖型糖尿病。2型糖尿病是通常首先出现在成年期的较轻的糖尿病形式，并会因肥胖和怠惰的生活方式而加重。该疾病通常没有症状，通常由指示葡萄糖耐受不良的测试所诊断，并且通过饮食改变和运动养生来治疗。2型糖尿病还称为非胰岛素依赖性糖尿病。

对照：如本文使用的，术语“对照”的含义是对比结果的标准，这在其领域可被理解。通常，在通过隔离变量以确定这些是变量的实验中，使用对照用于增加实验的完整性。在一些实施方案中，对照是与测试反应或测定同时进行的反应或测定，以提供对比物。在一个实验中，应用“测试”（即，测试了变量）。在另一个实验中，没有应用被测试的变量，“对照”。在一些实施方案中，对照是历史对照（即，之前进行的测试或测定的对照，或者之前已知的量或结果）。在一些实施方案中，对照是或包括印刷或以其他方式储存的记录。对照可以是阳性对照或阴性对照。在一些实施方案中，对照还被称为参考。

美容外科手术：如本文使用的，术语“美容外科手术”指不涉及疾病疗法、但是涉及个体美容外观、特别是个体的皮肤或头发外观的改善的手术。美容外科手术的例子包括导致皮肤皱纹减少、皮肤紧实度增加、头发生长或光泽增加、灰发减少、秃病（特别是男性秃病）情况下的头发再生、头发生长（特别是面部毛发生长）的减少、***大小或形状的美容提高和脂肪团减少。

未加工的：如本文使用的，当术语“未加工的”与生物样品一起使用时，指基本上未精制状态的样品。例如，未加工的样品可以是细胞裂解物或活检组织样品。未加工的样品可以溶液或作为干制品存在。

其衍生物：如本文使用的，术语“其衍生物”当与微泡或细胞一起使用时，指保留原始的至少一些生物活性（特别是诱导分化的能力和/或提供治疗益处的能力）的原始微泡或细胞群的级分或提取物（特别是含有RNA和/或DNA和/或蛋白质的那些）。该术语还包括复合的、包封的或配制的微泡或细胞（例如，已经被包封、复合或配制以促进施用的微泡）。衍生物的例子包括裂解物、冻干物（lyophilates）和匀浆。

功能障碍：如本文使用的，术语“功能障碍”指异常功能。分子（例如，蛋白）的功能障碍可以由与此类分子相关的活性增加或减少引起。分子的功能障碍可以由于分子本身或者直接或间接地与分子相互作用或调解分子的其他分子相关的缺陷引起。

功能的：如本文使用的，“功能的”生物分子是分子表现出其特征的性质和/或活性形式的生物分子。

功能衍生物：如本文使用的，在核苷酸序列（例如，微小RNA）的功能衍生物的上下文中，术语“功能衍生物”指保留了与原始序列基本类似的生物活性（功能或结构）的分子。功能衍生物或等同物可以是天然衍生物或者合成制备。示例性的功能衍生物包括具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加的核苷酸序列，但条件是保留了核酸的生物活性（例如，微小RNA）。

炎症：如本文使用的，术语“炎症”包括许多疾患中存在的炎性病症，其包括但不限于：***炎症反应（SIRS）；阿尔茨海默病（和相关病症和症状，包括：慢性神经炎症、胶质激活；增加的小神经胶质；神经炎斑块形成；和对疗法的响应）；肌萎缩性侧索硬化（ALS）、关节炎（和相关病症和症状，包括但不限于：急性关节炎、抗原诱导的关节炎、与慢性淋巴细胞性甲状腺炎相关的关节炎、胶原诱导的关节炎、幼年型关节炎；类风湿性关节炎、骨关节炎、预后和链球菌诱导的关节炎、脊柱关节病、痛风性关节炎）、哮喘（和相关病症和症状，包括：支气管哮喘；慢性阻塞性气道疾病；慢性阻塞性肺病、青少年哮喘和职业性哮喘）；心脑血管疾病（和相关病症和症状，包括粥样硬化；自身免疫性心肌炎、慢性心脏缺氧、充血性心脏衰竭、冠状动脉病、心肌病和心肌细胞功能障碍，包括：主动脉平滑肌细胞的活化；心肌细胞凋亡；和心肌细胞功能的免疫调节；糖尿病和相关病症和症状，包括自身免疫性糖尿病、胰岛素依赖性（1型）糖尿病、糖尿病性牙周炎、糖尿病性视网膜病和糖尿病性肾病）；胃肠道炎症（和相关病症和症状，包括乳糜泻、相关骨质疏松、慢性结肠炎、克罗恩病、炎性肠病和溃疡性结肠炎）；胃溃疡；肝炎，例如病毒性和其他类型的肝炎、胆固醇结石和肝纤维化、HIV感染（和相关病症和症状，包括变性反应、神经变性反应和HIV相关的霍奇金疾病）、川崎（Kawasaki）综合征（和相关疾病和病症，包括皮肤粘膜***综合征、颈部淋巴节肿大、冠状动脉损伤、水肿、发热、白细胞增多、轻度贫血、脱皮、疹、结膜发红、血小板增多；多发性硬化、肾病变（和相关疾病和病症、包括糖尿病性肾病、终末期肾病、急性和慢性肾小球肾炎、急性和慢性间质性肾炎、狼疮肾炎、古德帕斯丘（Goodpasture）综合征、血液透析生存和肾缺血再灌注损伤）、神经变性疾病（和相关疾病和病症，包括急性神经变性、IL-1在衰老和神经变性疾病中的诱导、IL-1诱导的下丘脑神经元的塑性和慢性应激性高反应性）、眼病变（和相关疾病和病症、包括糖尿病性视网膜病、格雷夫斯（Graves）眼病和葡萄膜炎、骨质疏松（和相关疾病和病症，包括肺泡、股骨、桡骨、椎骨或腕骨骨质流失或骨折发生、绝经后骨质流失、积聚、骨折发生率或骨质流失率）、中耳炎（成人或儿童）、胰腺炎或胰腺泡炎、牙周疾病（和相关疾病和病症，包括成人、早期发作和糖尿病）；肺病，包括慢性肺病、慢性鼻窦炎、透明膜病、婴儿猝死综合综（SIDS）中的缺氧和肺病；冠状血管或其他血管移植物的再狭窄；风湿病，包括类风湿性关节炎、风湿性阿少夫（Aschoff）体、风湿性疾病和风湿性心肌炎；甲状腺炎，包括慢性淋巴细胞性甲状腺炎；尿道感染，包括慢性***炎、慢性骨盆疼痛综合征和尿石病。免疫疾患，包括自身免疫疾病，例如斑秃、自身免疫性心肌炎、格雷夫斯病、格雷夫斯眼病、硬化性苔藓、多发性硬化、牛皮鲜、***性红斑狼疮、***性硬化症、甲状腺疾病（例如，甲状腺肿和淋巴瘤性甲状腺肿（桥本氏甲状腺炎、***样甲状腺肿）、睡眠障碍和慢性疲劳综合征和肥胖症（非糖尿病性或者与糖尿病相关的）。对感染性疾病的抗性，例如利什曼原虫病、麻风、莱姆病、莱姆心炎、疟疾、脑型疟疾、脑膜炎、与疟疾相关的肾小管间质肾炎），其由细菌、病毒（例如巨细胞病毒、脑炎、EB病毒、人类免疫缺陷病毒、流感病毒）或原生病毒（例如，恶性疟原虫、锥虫）所引起。对创伤的反应，包括脑外伤（包括中风和缺血、脑炎、脑病、癫痫、围产期脑损伤、延长的热性惊厥、SIDS和蛛网膜下出血）、低出生体重（例如脑性麻痹）、肺损伤（急性出血性肺损伤、古德帕斯丘综合征、急性缺血再灌注损伤）、职业和环境污染物（例如对毒性油综合征矽肺病的敏感性）引起的心肌功能障碍、辐射创伤，和创伤愈合反应（例如烧伤或热创伤、慢性创伤、手术创伤和脊髓损伤）的效率。激素调节，包括生育力/繁殖力、怀孕可能性、早产发生率、产前和产后并发症，包括早产低出生体重、脑性麻痹、败血病、甲状腺机能减退、氧依赖、颅异常、早发性停经。患者对移植的反应（排斥或接受）、急性期反应（例如发热反应）、一般的炎症反应、急性呼吸窘迫反应、急性全身性炎症反应、创伤愈合、粘合、免疫炎症反应、神经内分泌反应、发热发展和抵抗、急性期反应、应激反应、疾病易感性、重复运动应激、网球肘和疼痛管理和反应。

诱导物：如本文使用的，术语“诱导物”指应用至细胞时能够诱导所述细胞的分化命运改变的任何分子或其他物质。

体外：如本文使用的，术语“体外”指在人工环境下发生的事件，例如在试管或反应容器中、在细胞培养中、等，而不是在多细胞生物体内。

体内：如本文使用的，术语“体内”指在多细胞生物体例如非人动物内发生的事件。

分离的：如本文使用的，术语“分离的”指：（1）已经与其最初生成时伴随它的组分（无论是天然和/或实验环境中）的至少一些分离，和/或（2）已经通过人工生成、制备和/或生产的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与最初伴随其的其他组分的至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约98%、约99%、基本上100%或100%分离。在一些实施方案中，分离的物质是超过约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%、基本上100%或100%纯的。如本文使用的，如果物质基本上不含其他组分，则是“纯的”。如本文使用的，术语“分离的细胞”指不包含于多细胞生物体中的细胞。

微小RNA：如本文使用的，术语“微小RNA（miRNA）”指转录后调节子，其通常结合靶信使RNA转录物（mRNA）的三个初始未翻译区（3’UTR）中的互补序列，所述结合通常导致基因沉默。通常，miRNA是短的核糖核酸（RNA）分子，例如21或22个核苷酸长。术语“微小RNA”和“miRNA”可互换地使用。

微泡：如本文使用的，术语“微泡”指包含从各种类型的细胞衍生的质膜片段的膜颗粒。通常，微泡具有约10nm至约5000nm（例如，约50nm至1500nm、约75nm至1500nm、约75nm至1250nm、约50nm至1250nm、约30nm至1000nm、约50nm至1000nm、约100nm至1000nm、约50nm至750nm等）的直径（或当颗粒不是球形时的最大尺寸）。通常，微泡的膜的至少一部分直接获自细胞（还称为供体细胞）。适合用于本发明的微泡可以通过膜反转、胞吐、脱落、气泡和/或出芽而起源于细胞。根据产生方式（例如，膜反转、胞吐、脱落或出芽），本文包含的微泡可以表现出不同的表面/脂质特征。微泡的可选名称包括但不限于外体、核外体、膜颗粒、外体样颗粒和凋亡小泡。如本文使用的，有时使用的缩写形式的“MV”是指微泡。

探路者（Pathfinder）细胞：如本文使用的，术语“探路者细胞”指具有诱导或刺激组织修复、再生、重塑或分化能力的细胞。通常，探路者细胞诱导或刺激组织修复、再生、重塑或分化，而不是作为新组织自身的来源。在一些实施方案中，探路者细胞还称为“祖细胞”。如本文使用的，有时使用缩写形式“PC”是指探路者细胞。

受试者：如本文使用的，术语“受试者”指人或任何非人动物（例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物）。人包括产前和产后形式。在许多实施方案中，受试者是人。受试者可以是患者，其指疾病诊断或治疗的医疗提供者所面对的人。术语“受试者”在本文可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可以罹患或易感于疾病或疾患，但是可以或可以不表现出疾病或疾患的症状。

基本上：如本文使用的，术语“基本上”指表现出所关注的特征或性质的总的或接近总的范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象几乎不会彻底完成和/或反应完全，或实现或避开绝对的结果，即使有也非常罕见。因此，术语“基本上”在本文用于记录许多生物和化学现象中固有的缺乏完全的可能性。

罹患：“罹患”疾病、疾患和/或病症的个体已经被诊断或者表现出疾病、疾患和/或病症的一种或多种症状。

易感于：“易感于”疾病、疾患和/或病症的个体还未被诊断出疾病、疾患和/或病症。在一些实施方案中，易感于疾病、疾患和/或病症的个体可能不表现出疾病、疾患和/或病症的症状。在一些实施方案中，易感于疾病、疾患和/或病症的个体将发展疾病、疾患和/或病症。在一些实施方案中，易感于疾病、疾患和/或病症的个体将不发展疾病、疾患和/或病症。

治疗有效量：如本文使用的，术语“治疗有效量”的治疗剂表示当施用给罹患或易感于疾病、疾患和/或病症的个体时，足以治疗、诊断、预防和/或延迟疾病、疾患和/或病症的症状发作的量。本领域普通技术人员将理解，治疗有效量通常通过包括至少一个单位剂量的给药方案来施用。

治疗剂：如本文使用的，短语“治疗剂”指当施用给受试者时具有治疗效应和/或引发期望的生物和/或药理学效应的任何物质。在一些实施方案中，本发明的治疗剂指如本发明所述的肽抑制剂或其衍生物。

转分化：如本文使用的，术语“转分化”指非干细胞转化成不同类型细胞的过程，或者已经分化的干细胞在其已经确定的分化途径之外产生细胞的过程。通常，转分化包括成熟细胞类型（或分化的细胞类型）的去分化和然后再分化。

治疗：如本文使用的，术语“治疗”、“治疗”或“治疗”指用于部分或完全减轻、缓解、缓和、抑制、预防特定疾病、疾患和/或病症的一种或多种症状或特征，或者延迟其发作、减少其严重度和/或减少其发生的任何方法。治疗可以施用给不表现出疾病征兆和/或仅表现出疾病早期征兆的受试者，目的是减少发生与疾病相关的病变的风险。

某些实施方案的详述

本发明特别提供了，在其他方面，基于微泡或微泡相关的微小RNA的改进的组合物和方法，其用于诱导组织修复、重塑、重建、分化或转分化和/或用于治疗相关疾病、疾患和病症。

以下章节详细描述了本发明的各个方面。章节的使用不是要限制本发明。每个章节可以应用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外说明，“或”的使用表示“和/或”。

I.微泡

如本文使用的，术语“微泡”指包含来自各种类型的细胞的质膜片段的膜颗粒。通常，微泡是具有约10nm至约5000nm（例如，约50nm至1500nm、约75nm至1500nm、约75nm至1250nm、约50nm至1250nm、约30nm至1000nm、约50nm至1000nm、约100nm至1000nm、约50nm至750nm等）直径（或当颗粒不是球形时的最大尺寸）的小颗粒。通常，微泡的膜的至少一部分直接获自细胞（还称为供体细胞）。适合用于本发明的微泡可以通过膜反转、胞吐、脱落、气泡和/或出芽而从细胞起源。根据产生方式（例如，膜反转、胞吐、脱落或出芽），本文包含的微泡可以表现出不同的表面/脂质特征。微泡的可选名称包括但不限于外体、核外体、膜颗粒、外体样颗粒和凋亡小泡。

设想微泡可以用作RNA和蛋白分子能够穿行于细胞之间的手段。不希望受任何特定理论束缚，设想来源于胰腺衍生的探路者细胞（PDPC）的微泡可以通过特定mRNA、miRNA和/或蛋白的转移而刺激修复过程。然而，在本发明之前，还没有对与微泡相关的特定微小RNA进行过表征。如微小RNA和实施例章节中所讨论的，本发明的发明人已经开发了有效的体外测定来分析和鉴定微小RNA。令人意外地，本发明人发现某些微小RNA特异性地存在于微泡（即，仅存在于微泡中而不存在于细胞中）。该发现首次证明，微泡不只包含随机取样的胞质或内体内容物。本发明设想，特异性地存在于微泡中的那些微小RNA可以是对于诱导组织修复、重塑、重建、分化或转分化而言重要的细胞内调节子。

供体细胞

在本发明中使用的微泡可以获自任何类型的细胞。如本文使用的，产生微泡的细胞也称为供体细胞。适合的供体细胞可以包括原核细胞、古细菌细胞、真菌细胞以及单细胞和多细胞真核细胞。在一些实施方案中，微泡获自真核细胞（例如，来自多细胞生物体和特别是脊椎动物细胞（例如，哺乳动物）的真核细胞）。而且，应该发现，供体细胞可以是具有核的或者没有核的。因此，适合的供体细胞包括淋巴细胞（例如，多核的、多形核淋巴细胞等）、成纤维细胞、肝细胞以及红细胞和血小板。

适合的供体细胞可以来自就其细胞系而言任何所需的发育阶段。例如，适合的供体细胞可以包括干细胞（其可以或可以不发育成特定细胞系）、部分分化的干细胞和完全分化的细胞。在一些实施方案中，适合的供体细胞可以是人类胚胎干细胞衍生的间充质干细胞。在一些实施方案中，适合的供体细胞是探路者细胞。如本文使用的，术语“探路者细胞”涵盖具有诱导或刺激组织修复、再生、重塑或分化的能力的多能细胞。探路者细胞可以获自许多类型的组织的任何一种，包括但不限于胰腺、肾、***、肝、脾、子宫肌层、血细胞（包括来自外周血和脐带血）和骨髓。

适合的供体细胞还可以处于其个体细胞年龄的任何阶段，范围从刚从其祖细胞分离到衰老或甚至死亡的细胞。在一些实施方案中，微泡的脱落可以伴随凋亡性起泡（其可以来自质膜和/或核）。因此，供体细胞可以包括凋亡前的供体细胞或注定凋亡的细胞。

而且，设想，适合的供体细胞还包括非患病细胞和患病细胞，其中患病细胞可能受一种或多种病原体和/或病症影响。例如，患病供体细胞可以被病毒、细胞内颗粒或细菌感染。在其他实例中，患病细胞可以是代谢病变细胞（例如，由于遗传缺陷、由于酶、受体和/或转运体功能障碍、或者由于代谢损伤）、赘生性细胞、或者具有一个或多个突变的细胞，所述突变使细胞易感于不受控制的细胞生长。类似地，供体细胞可以是天然的（例如，获自活检）、培养的（例如天然或永生的）或被治疗的。例如，供体细胞可以是被化学和/或机械治疗的，从而表现出细胞特异性应激反应的供体细胞。在一些实施方案中，适合的供体细胞可以用天然或合成配体治疗，细胞具有针对所述配体的受体或其他互补结构。在一些实施方案中，供体细胞还可以用改变代谢、细胞生长、细胞分化、细胞结构和/或分泌的至少一种的药物或化合物治疗。

在一些实施方案中，适合的供体细胞是重组细胞。例如，重组供体细胞可以包含通过重组DNA技术引入的一种或多种核酸分子。所有已知的引入核酸的方式被认为适合本发明所述用途（例如，病毒转染、化学转染、电穿孔、弹道转染等）。当核酸是DNA时，设想DNA可以被整合入供体细胞的基因组，或者DNA可以作为染色体外单位驻留在细胞内。这种DNA可以用作RNA生成的模板，RNA生成可以具有调节和/或蛋白编码功能。类似地，当核酸是RNA时，这种RNA可以用作调节实体（例如，通过反义或干扰）和/或用作蛋白编码实体。如本文使用的，核酸涵盖所有已知的核酸类似物（例如，硫代磷酸酯类似物、肽核酸类似物等）。

适合的供体细胞可以有任何所需的来源，包括内皮、间皮和外皮来源。因此，适合的供体细胞包括腺体、器官、肌肉、结构组织等中存在的那些。适合的供体细胞相对于受体而言可以是异源的（或非自体的）或自体的。例如，适合的供体细胞可以来源于与受体组织（例如，待治疗的疾病组织）相同或不同的组织。作为非限制性实例，获自供体细胞，例如成纤维细胞的微泡可用于治疗受体的患病胰腺组织。在一些实施方案中，供体细胞可来源于不同的生物体（即，非自体的）。例如，供体细胞可以是猪胰腺细胞，而受体是人胰腺的。

在一些实施方案中，微泡获自全血、血清、血浆或者任何其他生物流体，包括尿液、腹水、乳奶、泪液、脊髓液、羊水等，其可以获自活的哺乳动物。可选地，微泡还可以获自储存的材料（例如，生物流体、组织、器官等）。这种储存可以包括在降低的温度（例如，4°C）下储存或者甚至以冷冻形式储存。类似地，微泡还可以获自体外来源，并且最为通常地是获自细胞或组织培养物（参见下文的组织培养条件章节）或者甚至器官培养物。

细胞培养条件

在一些实施方案中，微泡获自培养的供体细胞。例如，适合的供体细胞可以在含有细胞营养素的液体培养基中培养，并且在其中控制温度和/或气体组成的环境下孵育。如本领域普通技术人员所理解的，特定的细胞培养条件可以根据使用的细胞类型而变化。例如，已经描述了探路者细胞的细胞培养条件。参见，例如，国际专利公布WO2006120476，其全部内容在此通过引用并入。适合探路者细胞培养的示例性培养基是补充了胎牛血清（例如，10%）的CMRL1066培养基（Invitrogen）。在一些实施方案中，培养基中补充了谷氨酰胺或含谷氨酰胺的混合物，例如GLUTAMAX^TM（Invitrogen）和/或抗生素（例如，两性霉素、青霉素和/或链霉素）。

在一些实施方案中，细胞被培养以使得它们附着在表面上。在一些这样的实施方案中，细胞在表面上单层生长。在一些实施方案中，细胞生长至它们汇合，即，直至它们覆盖它们在上面生长的整个表面，并且表面上没有其他地方供细胞生长。在一些实施方案中，细胞生长至它们接近但还未汇合，即，直至它们覆盖它们在上面生长的表面的大部分，但是依然还有一定的细胞生长的空间。在一些实施方案中，细胞生长至大约或超过50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或更多汇合，其中x%汇合被定义为生长表面大约x%的覆盖率。在一些实施方案中，细胞生长至它们大约50-99%（例如，60-99%、70-99%、75-99%、80-99%、85-99%、90-99%或95-99%）汇合。

在一些实施方案中，细胞在可能影响细胞的一种或多种性质的基底上生长，所述性质例如微泡生成速率、细胞增殖速率或miRNA表达模式。在一些实施方案中，细胞在非织造基底上生长，所述非织造基底例如由纤维构成的非织造织物。如本文使用的，术语“非织造织物”包括，但不限于通过不同于纺织或编织的方法生产的粘合织物、成型织物或工程化织物。在一些实施方案中，术语“非织造织物”指通常为平板形式的多孔纺织样材料，主要或完全由纤维构成，所述纤维例如以网、片或毛毡组装的人造纤维。非织造织物的结构基于例如通常或多或少随机排列的人造纤维的排列。非织造织物可以通过纺织工业已知的许多技术产生。各种方法可以产生卡片、湿法成网、熔喷、纺粘或气流成网的无纺物。示例性的方法和基底描述于美国专利申请公布号20100151575，其教导通过引用并入本文。非织造织物的密度可以根据加工条件而变化。在一个实施方案中，非织造织物具有约60mg/mL至约350mg/mL的密度。

在一些实施方案中，非织造基底是生物相容的和/或生物可吸收的。可以使用的适合的生物相容性、生物可吸收的聚合物的实例包括聚合物，所述聚合物选自：脂肪族聚酯、聚（氨基酸）、共聚（醚-酯）、聚亚烷基草酸酯、聚酰胺、聚（亚氨基碳酸酯）、聚原酸酯、聚氧酯、聚酰胺酯、含胺基的聚氧酯、聚（酸酐）、聚磷腈及其混合物。

在一些实施方案中，脂肪族聚酯是单体的同聚物和/或共聚物及其聚合物混合物，所述单体选自丙交酯（其包括乳酸、D-、L-和内消旋丙交酯）、乙交酯（包括乙醇酸）、ε-己内酯、对二氧环己酮（1,4-二氧杂环己烷-2-酮）、三亚甲基碳酸酯（1,3-二氧杂环己烷-2-酮）、三亚甲基碳酸酯的烷基衍生物、δ-戊内酯、β-丁内酯、γ-丁内酯、ε-癸内酯、羟基丁酸酯（重复单元）、羟基戊酸酯（重复单元）、1,4-二氧杂环庚烷-2-酮（包括其二聚体1,5,8,12-四氧杂环十四烷-7,14-二酮）、1,5-二氧杂环庚烷-2-酮、6,6-二甲基-1,4-二氧杂环己烷-2-酮。在另一个实施方案中，脂肪族聚酯包括但不限于丙交酯（其包括乳酸、D-、L-和内消旋丙交酯）、乙交酯（包括乙醇酸）、ε-己内酯、对二氧环己酮（1,4-二氧杂环己烷-2-酮）、三亚甲基碳酸酯（1,3-二氧杂环己烷-2-酮）的同聚物或共聚物及其组合。

在一些实施方案中，脂肪族聚酯是单体的同聚物和/或共聚物及其组合，所述单体选自丙交酯（其包括乳酸、D-、L-和内消旋丙交酯）、乙交酯（包括乙醇酸）、ε-己内酯、对二氧环己酮（1,4-二氧杂环己烷-2-酮）、三亚甲基碳酸酯（1,3-二氧杂环己烷-2-酮）。而在另一实施方案中，脂肪族聚酯是单体的同聚物和/或共聚物及其组合，所述单体选自丙交酯（其包括乳酸、D-、L-和内消旋丙交酯）、乙交酯（包括乙醇酸）和对二氧环己酮（1,4-二氧杂环己烷-2-酮）。适合的织物的非限制性实例包括含有脂肪族聚酯纤维的那些，例如包含丙交酯（例如，乳酸、D-、L-和内消旋丙交酯）、乙交酯（例如，乙醇酸）、ε-己内酯、对二氧环己酮（1,4-二氧杂环己烷-2-酮）、三亚甲基碳酸酯（1,3-二氧杂环己烷-2-酮）及其组合。例如，适合的织物可以含有乙交酯-丙交酯共聚物（PGA/PLA）；丙交酯-乙交酯共聚物（PLA/PGA）；1,3丙二醇（PDO）和/或其混合物。

在一些实施方案中，细胞在已经以特定方式构造以赋予表面特殊的性质（例如，某些物质的排斥或吸引、减少的蛋白吸附、等）的固体表面上生长，其反过来可以影响此类表面上细胞的行为。例如，细胞可以在纳米构造的表面（纳米表面）上生长。参见例如US7,597,950；Sun等（2009）“Combining nanosurface chemistry and microfluidics for molecularanalysis and cell biology,”Analytica Chimica Acta，650（1）:98-105；其每一个的全部内容在此通过引用并入。可以例如通过本领域已知的许多方法的任何一种来产生纳米结构和其他构造的表面，所述方法包括砂磨、化学蚀刻、喷砂和/或去湿。

在一些实施方案中，细胞在悬液中生长。

可以使用各种生长培养基来培养供体细胞。生长培养基一般指用于培养活细胞的任何物质或制品。在一些实施方案中，生长培养基是肾生长培养基。在一些实施方案中，生长培养基是DMEM培养基。在一些实施方案中，细胞在不含血清的培养基中生长。在一些实施方案中，细胞在已经从培养基组分去除微泡的培养基中生长至少一段时间。例如，含有胎牛血清的培养基可以去除了牛微泡。可选地或此外，使用去除了微泡（例如，牛微泡）的商业上可获得的培养基。

在一些实施方案中，细胞在37°C或大约37°C下生长。在一些实施方案中，细胞在5%CO₂或大约5%CO₂存在下生长。在一些实施方案中，细胞在室内空气氧条件下生长。在一些实施方案中，细胞在其中氧压小于或等于5%O₂的条件下生长。在一些实施方案中，细胞在正常氧（例如，约5%O₂）条件下生长。在一些实施方案中，细胞在缺氧条件（例如，低氧例如<5%、<4%、<3%、<2%或<1%O₂）下生长。

在一些实施方案中，供体细胞在血清饥饿条件下生长。如本文使用的，术语“血清饥饿”包括但不限于血清充足、无血清培养基或条件。各种血清饥饿条件是本领域已知的并且可用于实施本发明。在一些实施方案中，细胞可以在血清饥饿条件下生长约6、约12、约18、约24、约30、约36、约42、约48小时或更长。在一些实施方案中，细胞可以在其中血清浓度小于或等于10%、小于或等于9%、小于或等于8%、小于或等于7%、小于或等于6%、小于或等于5%、小于或等于4%、小于或等于3%、小于或等于2%、小于或等于1.5%、小于或等于1%或小于或等于0.5%的条件下生长。在一些实施方案中，细胞可以在血清浓度是0%（即，血清不存在）的条件下生长。在一些实施方案中，细胞可以在血清浓度随时间逐步减少的条件下生长。例如，在一些实施方案中，细胞可以在血清浓度为约2%至约11%（例如，约2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或11%）并且随后在一个或多个步骤内减少至血清浓度约0%至约5%（例如，约0%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%或5%）的条件下生长。

微泡的制备

可以使用本领域已知的分离或富集微泡的各种方法来实施本发明。如本文使用的，与微泡配合使用的术语“分离”或“分离”与术语“富集”或“富集”可互换使用，并且指与获得的生物样品中微泡级分相比，使得样品中微泡级分增加的一个或多个过程步骤。因此，可以将微泡纯化至均匀，纯化为至少90%（针对非微泡颗粒物质）、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%或至少20%（或甚至更少）。例如，可以利用微泡的物理性质来使它们与培养基或其他来源材料分离。例如，微泡可以基于电荷（例如，电泳分离）、大小（例如，过滤、分子筛等）、密度（例如，规则或梯度离心）、斯维德贝格（Svedberg）常数（例如，有或没有外力的沉降，等）而被分离。

在一些实施方案中，通过离心（例如，超速离心）分离或纯化微泡。可以理解的是，可以使用各种离心条件（例如，速度、离心力、离心时间等）来获得分离或纯化的微泡的所需级分。例如，在一些实施方案中，可以在足以沉淀较大微泡（例如，大约1000nm或更大）的相当低的离心力（例如，大约16,000x g）下离心样品。在一些实施方案中，可以在足以沉淀较小尺寸（例如，小于1000nm）的较大离心力（例如，大约120,000x g）下离心样品（例如，通过最初低速旋转得到的上清液）。在一些实施方案中，使用该方法制备的微泡制品可以含有非常小的颗粒，例如尺寸范围从约10nm至1000nm（例如，约50-1000nm、75-1000nm、100-1000nm、10-750nm、50-750nm、100-750nm、100-500nm）的颗粒。示例性的微泡分级分离示意图描述于图3。在一些实施方案中，这种小的颗粒还称为外体、外体样囊泡和/或膜颗粒。在一些实施方案中，这种级分被称为外体级分。

在一些实施方案中，通过沉淀分离或纯化微泡。要理解，可以使用各种沉淀条件以获得分离或纯化的微泡的所需级分。例如，各种试剂盒可用于外体沉淀，例如ExoQuick^TM和Exo-Quick-TC^TM（可获自System Biosciences，山景城，加利福尼亚州）并且可根据本发明使用。

可选地或此外，分离可基于一种或多种生物性质，并且可以采用表面标志物（例如，表面标志物可用于沉淀、与固相的可逆结合、FACS分离、特异性配体结合、非特异性配体结合，例如膜联蛋白V，等）。在进一步设想的方法中，微泡还可以使用化学和/或物理方法融合，包括PEG诱导的融合和/或超声融合。

在一些实施方案中，微泡获自条件培养基，所述培养基来自产生微泡的细胞培养物。

合成微泡

在一些实施方案中，适合本发明的微泡可以是合成产生的。合成的微泡通常包括获自供体细胞的一种或多种膜组分。在一些实施方案中，合成微泡包括至少一种本文描述的微小RNA。例如，合成微泡可以通过供体细胞的分解（例如，通过去污剂、超声、剪切力、等）和使用未加工品或者至少部分富集的膜级分，以重构一个或多个微泡来制备。在一些实施方案中，外源的微小RNA可以被添加至微泡。

II.微小RNA

在一些实施方案中，微泡包含一种或多种特定的微小RNA。如本文使用的，微泡特异性微小RNA包括仅存在于微泡中而不存在于细胞中的那些微小RNA，和与细胞相比基本上富集在微泡中的那些微小RNA。微泡特异性微小RNA包括从微泡分离或纯化的，或者使用重组或化学技术合成的微小RNA。例如，可以通过编码相关分子的DNA序列的体外转录产生微小RNA分子。可以使用适合的RNA聚合酶启动子例如T7、T3或SP6将这种DNA序列并入许多载体。如本文使用的，术语“微小RNA（miRNA）”指转录后调节子，其通常结合至靶信使RNA转录物（mRNA）的三个主要的未翻译区（3’UTR）中的互补序列，通常导致基因沉默。通常，miRNA是短的核糖核酸（RNA）分子。例如，微小RNA长度可以是大约18-25个核苷酸（例如，大约18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的长度）。

设想，例如，除了其他功能外，可以单独或组合使用微泡特异性微小RNA来诱导或刺激组织或细胞生长、重塑、重建、分化和/或转分化。因此，例如，本发明提供了，除了其他方面以外，鉴定微泡特异性微小RNA或可以诱导或刺激组织或细胞生长、重塑、重建、分化和/或转分化的任何微小RNA的方法。

在一些实施方案中，根据本发明的发明方法可以包括以下步骤的一个或多个：提供细胞，所述细胞在去除了微泡的培养基中生长，向培养基添加miRNA，并确定与对照相比，miRNA的添加是否增加了细胞增殖速率，从而鉴定miRNA是否诱导细胞生长和/或再生。在一些实施方案中，使用倍增时间（例如，例如使细胞培养容器中的细胞群倍增所花费的时间）作为细胞增殖速率的指示。

细胞增殖测定是本领域已知的，并且可以采用许多这种测定的任何一种来测定细胞增殖速率。例如，可以使用本领域已知的标准细胞计数技术来计数细胞数目（例如，每体积培养基；或者对于整个细胞培养容器，等）。在一些这种细胞技术方法中，用染料标记细胞以易于检测。在评估细胞增殖的一些方法中，使细胞形成已知体积的悬液，并且使用标准分光光度技术测量至少一份细胞悬液的密度（例如，光学密度）。

一些细胞增殖测定测量DNA合成。例如，标记的核苷酸或核苷酸类似物（例如，BrdU（溴脱氧尿苷）、氚标记的胸苷等的加入可用于细胞增殖测定。一些细胞增殖测定测量代谢酶对底物的转化。例如，“MTT”测定测量四唑盐WST-1被细胞线粒体脱氢酶裂解成甲臜。

在一些实施方案中，还测量并考察了细胞活力，从而仅计数有活力的细胞。例如，排除台盼蓝染料的能力被视为膜完整性的标志，并由此可作为细胞活力的标志，并且细胞计数方法通常包括使用台盼蓝。

在一些实施方案中，用于鉴定如本发明所述微小RNA的发明方法可以包括以下步骤的一个或多个：在生长至汇合的细胞中产生创伤区；用miRNA治疗所述细胞；和确定与对照相比，在所述创伤区的被治疗的细胞的再生速率，从而鉴定所述miRNA是否诱导细胞生长和/或再生。

可以通过本领域已知的方法测量汇合细胞培养物中创伤区的再生。在一些实施方案中，定量测量再生。例如，可以使用例如XCELLIGENCE^TM***（Roche Applied Science）定量测量再生。

在一些实施方案中，方法以高通量方式进行，例如平行测试许多miRNA。多孔板（例如，24-孔、48-孔、96-孔、324-孔、等）可以促进这种平行测试，因为每个miRNA可以在单个孔中测试。

可以在培养物中生长的任何类型的细胞可用于本发明方法。例如，可以使用本文描述的各种供体细胞。在一些实施方案中，适合的细胞包括胰腺衍生的探路者细胞、成纤维细胞和心肌细胞。

可以使用本文描述的发明方法测试各种候选miRNA。例如，可以使用分离自微泡的miRNA。可选地或此外，已经在文献或其他实验中鉴定miRNA为潜在目标（例如，鉴定为与疾病、转分化、潜在治疗应用等相关）的miRNA可用于本发明方法以确定这种miRNA诱导细胞生长和/或再生。在一些实施方案中，使用miRNA文库。例如，可根据本发明方法使用从表达文库收集克隆的miRNA，以鉴定诱导细胞生长和/或再生的一种或多种miRNA。在一些实施方案中，使用来自所关注类型的细胞的miRNA表达文库。

在测定步骤中的适当对照包括，但不限于在相同的条件下生长的未治疗的细胞（例如，没有添加miRNA的细胞），和/或除添加了“对照”miRNA外，其他条件都相同的条件下生长的细胞。如果使用“对照”miRNA，所述“对照”miRNA一般对细胞生长和/或再生具有已知作用。在一些实施方案中，使用了超过一种对照。在一些实施方案中，使用了阴性对照（预期不会诱导细胞生长和/或再生的miRNA）。在一些实施方案中，使用了阳性对照（预期能诱导细胞生长和/或再生的miRNA）。在一些实施方案中，使用了阳性对照和阴性对照。

表1显示了特异性地存在于微泡中的示例性微小RNA。在一些实施方案中，发现miRNA-122、miRNA-127、miRNA-133b、miRNA-323、miRNA-433、miRNA-451、miRNA-466h、miRNA-467c、miRNA-467e、miRNA-468、miRNA-491、miRNA-495、miRNA-546、miRNA-666、miRNA-680和miRNA-346（SEQ ID NO:1-29）以相对较高的浓度存在于微泡中。根据本发明鉴定的其他微小RNA列于表3-13。表1列出了每一个所关注的miRNA的示例性miRNA序列；其他物种中相应的miRNA序列已公开并可获得（例如，参见http://diana.cslab.ece.ntua.gr/mirgen/），所述物种包括但不限于智人（Homo sapiens）、褐鼠（Rattus norvegicus）、小鼠（Mus musculus）、斑马鱼（Danio rerio）和原鸡（Gallus gallus）。如表1和表7-13所示，一些miRNA序列在物种间是非常保守的，并且一些miRNA序列变体甚至在相同物种中存在。表7-13显示了可根据本发明使用的示例性微小RNA。

表1：微小RNA序列

设想，根据本发明鉴定的一种或多种微小RNA（例如，SEQ ID NO1-72和表7-13中列出的那些）可用于诱导或刺激组织或细胞生长、重塑、重建、分化和/或转分化，和/或治疗相关疾病、疾患或病症。在一些实施方案中，可以使用本文描述的微小RNA的功能变体。例如，适合的微小RNA可以包括具有与表1和表7-13中鉴定的微小RNA的任何一个至少70%（例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%）相同的序列的微小RNA。在一些实施方案中，适合的微小RNA是以相对较高的浓度存在于微泡中的微小RNA的功能变体。因此，在一些实施方案中，适合的微小RNA可以包括具有与SEQ ID NO:1至16的任何一个至少70%（例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%）同一的序列的微小RNA。

与本文鉴定的微小RNA序列的“核酸序列相同的百分比（%）”被定义为在比对序列并引入空位（如果必要）以实现最大百分比序列同一性之后，与参考序列中的核苷酸相同的候选序列中的核苷酸百分比。用于测定百分比核酸序列同一性的比对可以本领域技术内的各种方式实现，例如使用公开可获得的计算机软件，例如BLAST、ALIGN或Megalign（DNASTAR）软件。本领域技术人员能够确定用于测量比对的合适参数，包括在被比较序列全长内实现最大比对所需的任何算法。优选地，使用WU-BLAST-2软件来测定氨基酸序列同一性（Altschul等，Methods in Enzymology，266，460-480（1996）；http://blast.wustl/edu/blast/README.html）。WU-BLAST-2使用了若干检索参数，大部分被设定为缺省值。可调节的参数被设定为以下值：重叠跨度=1，重叠部分=0.125，世界阈值（T）=11。HSP分数（S）和HSP S2参数是动态值并且通过程序本身建立，取决于特定序列的组成，然而，最小值可以被调整并可如前所述来设定。

适合的微小RNA可以全部由天然RNA核苷酸构成，或者可以包括一个或多个核苷酸类似物和/或修饰。例如，可以通过在一个或多个游离链末端包括核苷酸类似物，以减少例如被外切核酸酶的消化来稳定微小RNA结构。适合的微小RNA可以含有修饰的核糖核苷酸，即，在未修饰的核苷酸碱基、糖和/或磷酸酯（或磷酸二酯键）的化学结构中包含修饰的核糖核苷酸。如本领域已知的，“未修饰的核糖核苷酸”具有与β-D-呋喃核糖的1’碳结合的碱基（腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶）。修饰的微小RNA分子还可以含有修饰的骨架或非天然的核苷酸间连接，例如修饰的含磷骨架和非磷骨架，例如吗啉代骨架；硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、磺酸酯、磺胺和氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；酰胺骨架等。

III.治疗应用

在一些实施方案中，本发明提供了使用微泡和/或微小RNA来诱导或刺激组织或细胞生长、重塑、重建、分化和/或转分化，或者治疗相关疾病、疾患或病症的方法。虽然不希望受特定理论或假设的束缚，设想通过提供调节基因表达的微小RNA和/或其他组分（例如，膜相关多肽、转录因子等），微泡可以诱导靶组织或细胞内的变化，以使它们转化成主动修复模式，所述基因与例如细胞运动性增加、组织重塑和重编程、生长、血管生成、细胞粘附和细胞信号传导等相关。还设想微泡通常不是新组织或细胞的一部分。因此，根据本发明，可以使用来自不同类型的组织、细胞或生物体的微泡或微小RNA。在一些实施方案中，可以使用微泡或微小RNA而不会诱导免疫反应。在一些实施方案中，可以使用微泡或微小RNA而无需免疫抑制剂。

因此，适合的微泡或微小RNA可以来源于自体细胞（即，来自于与患者相同的个体的细胞）或非自体细胞（即，来自与患者不同的个体的细胞）或两者。在一些实施方案中，微泡来源于与患病组织相同的组织。例如，在治疗肾病的方法中，微泡可以取自被治疗的相同或不同个体的健康肾细胞。在一些实施方案中，微泡来源于与患病组织不同的组织。

在一些实施方案中，治疗方法包括在体外或离体进行的一个或多个步骤，以诱导细胞（“受体细胞”）分化或转分化成所需类型的细胞。然后，这样的受体细胞可以被转移入患者。

在一些实施方案中，提供的方法包括在体外共培养供体细胞（即，产生微泡的细胞）和受体细胞（即，接受微泡和/或这种微泡内容物的细胞），然后将受体细胞转移入患者。在一些实施方案中，将受体细胞转移回获得受体细胞的相同个体。例如，可以在体外将探路者细胞与从患者获得的骨髓细胞共培养一段时间，以使微泡和/或其内容物转移，然后骨髓细胞可以被转移回所述个体。

在一些实施方案中，在与供体共培养之后、在转移入患者之前，测试受体细胞的特定生物标志物、例如某些微小RNA的表达。

在某些实施方案中，治疗方法包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的如本文描述的一种或多种微小RNA的步骤。miRNA可以在微泡或其衍生物不存在或存在下使用。

在一些实施方案中，根据本发明的方法和组合物（例如，微泡和/或微小RNA）可用于治疗各种组织中的疾病、疾患或病症，所述组织包括但不限于中枢神经***（CNS）、外周神经***、心血管***、呼吸***、胃肠道和相关腺体、外皮***、肌肉骨骼***和身体的其他***。在一些实施方案中，根据本发明的方法和组合物（例如，微泡和/或微小RNA）可用于治疗年龄相关的变性。在一些实施方案中，根据本发明的方法和组合物（例如，微泡和/或微小RNA）可用于治疗炎症。在一些实施方案中，根据本发明的微泡和/或微小RNA可适合美容用途或者用于治疗与美容外科手术相关的病症或疾患。

炎症

在一些实施方案中，本发明的方法和组合物用于治疗或缓解炎症。如本文使用的，术语“炎症”包括在许多疾患中出现的炎性病症，包括但不限于：***炎症反应（SIRS）；阿尔茨海默病（和相关病症和症状，包括：慢性神经炎症、胶质激活；增加的小神经胶质；神经炎斑块形成；和对疗法的响应）；肌萎缩性侧索硬化（ALS）、关节炎（和相关病症和症状，包括但不限于：急性关节炎、抗原诱导的关节炎、与慢性淋巴细胞性甲状腺炎相关的关节炎、胶原诱导的关节炎、幼年型关节炎；类风湿性关节炎、骨关节炎、预后和链球菌诱导的关节炎、脊柱关节病、痛风性关节炎）、哮喘（和相关病症和症状，包括：支气管哮喘；慢性阻塞性气道疾病；慢性阻塞性肺病、青少年哮喘和职业性哮喘）；心脑血管疾病（和相关病症和症状，包括粥样硬化；自身免疫性心肌炎、慢性心脏缺氧、充血性心脏衰竭、冠状动脉病、心肌病和心肌细胞功能障碍，包括：主动脉平滑肌细胞的活化；心肌细胞凋亡；和心肌细胞功能的免疫调节；糖尿病和相关病症和症状，包括自身免疫性糖尿病、胰岛素依赖性（1型）糖尿病、糖尿病性牙周炎、糖尿病性视网膜病和糖尿病性肾病）；胃肠道炎症（和相关病症和症状，包括乳糜泻、相关骨质疏松、慢性结肠炎、克罗恩病、炎性肠病和溃疡性结肠炎）；胃溃疡；肝炎，例如病毒性和其他类型的肝炎、胆固醇结石和肝纤维化、HIV感染（和相关病症和症状，包括变性反应、神经变性反应和HIV相关的霍奇金疾病）、川崎综合征（和相关疾病和病症，包括皮肤粘膜***综合征、颈部淋巴节肿大、冠状动脉损伤、水肿、发热、白细胞增多、轻度贫血、脱皮、疹、结膜发红、血小板增多；多发性硬化、肾病变（和相关疾病和病症、包括糖尿病性肾病、终末期肾病、急性和慢性肾小球肾炎、急性和慢性间质性肾炎、狼疮肾炎、古德帕斯丘综合征、血液透析生存和肾缺血再灌注损伤）、神经变性疾病（和相关疾病和病症，包括急性神经变性、IL-1在衰老和神经变性疾病中的诱导、IL-1诱导的下丘脑神经元的塑性和慢性应激性高反应性）、眼病变（和相关疾病和病症、包括糖尿病性视网膜病、格雷夫斯眼病和葡萄膜炎、骨质疏松（和相关疾病和病症，包括肺泡、股骨、桡骨、椎骨或腕骨骨质流失或骨折发生、绝经后骨质流失、积聚、骨折发生率或骨质流失率）、中耳炎（成人或儿童）、胰腺炎或胰腺泡炎、牙周疾病（和相关疾病和病症，包括成人、早期发作和糖尿病）；肺病，包括慢性肺病、慢性鼻窦炎、透明膜病、SIDS中的缺氧和肺病；冠状血管或其他血管移植物的再狭窄；风湿病，包括类风湿性关节炎、风湿性阿少夫体、风湿性疾病和风湿性心肌炎；甲状腺炎，包括慢性淋巴细胞性甲状腺炎；尿道感染，包括慢性***炎、慢性骨盆疼痛综合征和尿石病。免疫疾患，包括自身免疫疾病，例如斑秃、自身免疫性心肌炎、格雷夫斯病、格雷夫斯眼病、硬化性苔藓、多发性硬化、牛皮鲜、***性红斑狼疮、***性硬化症、甲状腺疾病（例如，甲状腺肿和淋巴瘤性甲状腺肿（桥本氏甲状腺炎、***样甲状腺肿）、睡眠障碍和慢性疲劳综合征和肥胖症（非糖尿病性或者与糖尿病相关的）。对感染性疾病的抗性，例如利什曼原虫病、麻风、莱姆病、莱姆心炎、疟疾、脑型疟疾、脑膜炎、与疟疾相关的肾小管间质肾炎），其由细菌、病毒（例如巨细胞病毒、脑炎、EB病毒、人类免疫缺陷病毒、流感病毒）或原生病毒（例如，恶性疟原虫、锥虫）所引起。对创伤的反应，包括脑外伤（包括中风和缺血、脑炎、脑病、癫痫、围产期脑损伤、延长的热性惊厥、SIDS和蛛网膜下出血）、低出生体重（例如脑性麻痹）、肺损伤（急性出血性肺损伤、古德帕斯丘综合征、急性缺血再灌注损伤）、职业和环境污染物（例如对毒性油综合征矽肺病的敏感性）引起的心肌功能障碍、辐射创伤，和创伤愈合反应（例如烧伤或热创伤、慢性创伤、手术创伤和脊髓损伤）的效率。激素调节，包括生育力/繁殖力、怀孕可能性、早产发生率、产前和产后并发症，包括早产低出生体重、脑性麻痹、败血病、甲状腺机能减退、氧依赖、颅异常、早发性停经。患者对移植的反应（排斥或接受）、急性期反应（例如发热反应）、一般的炎症反应、急性呼吸窘迫反应、急性全身性炎症反应、创伤愈合、粘合、免疫炎症反应、神经内分泌反应、发热发展和抵抗、急性期反应、应激反应、疾病易感性、重复运动应激、网球肘和疼痛管理和反应。

在特定实施方案中，本发明方法和组合物可用于治疗或缓解与免疫缺陷疾病、疾患或病症相关的炎症。可以以免疫缺陷为特征的疾病、疾患和病症的非限制性实例包括：低丙种球蛋白血症、无丙种球蛋白血症、共济失调毛细管扩张症、重度联合免疫缺陷病（SCID）、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）例如由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的、切东（Chediak-Higashi）综合征、联合免疫缺陷病、补体缺陷、狄乔治氏（diGeorge）综合征、约伯（Job）综合征、白细胞粘附缺陷、泛低丙种球蛋白血症（例如，先天性低丙种球蛋白血病、先天性无丙种球蛋白血病、IgA的选择性缺乏、威奥（Wiscott-Aldrich）综合征。在一些实施方案中，探路者细胞和/或从探路者细胞分化的细胞通过刺激一种或多种类型的血液细胞，即免疫***的细胞的重建来治疗或缓解免疫缺陷。设想，本文公开的探路者细胞相关的微小RNA将类似地用于治疗或缓解免疫缺陷。

在某些实施方案中，本发明方法和组合物用于治疗或缓解自身免疫疾病、疾患或病症。一般而言，自身免疫是生物体未能将其自身组成性部分识别为“自身”，而导致针对生物体自身组织和细胞的免疫反应。示例性的自身免疫疾病和/或疑似自身免疫疾病包括但不限于急性播散性脑脊髓炎（ADEM）、艾迪生（Addison）病、全身脱毛、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征（APS）、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病（AIED）、自身免疫性淋巴增生综合征（ALPS）、自身免疫性***、巴洛病、贝切特病、大疱性类天疱疮、心肌病、查加斯病、慢性疲劳免疫功能障碍综合征（CFIDS）、慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病、克罗恩病、疤痕性类天疱疮、腹腔交口疱疹性皮炎、冷凝集素病、CREST综合征、恶性萎缩性丘疹（Degos）病、糖尿病、盘状红斑、家族性自主神经机能异常、子宫内膜异位、基本混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、格林-巴利（Guillain-Barré）综合征（GBS）、桥本氏甲状腺炎、化脓性汗腺炎、自发性和/或急性血小板减少性紫癜、特发性肺纤维变性、IgA神经病变、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、川崎病、扁平苔藓、红斑狼疮、莱姆病、膜迷路积水病（Ménière）、混合性***病（MCTD）、多发性硬化、重症肌无力、神经性肌强直、斜视眼阵挛综合征（OMS）、视神经炎、萎缩性甲状腺炎、骨关节炎、寻常天疱疹、恶性贫血、多关节炎、多软骨炎、多肌炎和皮肤肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮鲜、结节性多动脉炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、原发性无丙种球蛋白血症、雷诺现象、莱特尔综合征、风湿热、肉样瘤病、精神***症、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、大动脉炎、颞动脉炎（还称为“巨细胞动脉炎”）、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白斑病、外阴痛（“外阴前庭炎”）和韦格纳肉芽肿病。

移植应激

在某些实施方案中，本发明方法和组合物用于缓解移植应激。设想，组织/器官移植可以引起急性组织损伤，并且本文公开的微泡可以被施用入器官/组织移植物受体，以刺激组织修复、再生、重建、重塑和/或诱导免疫耐受，从而缓解移植应激。设想，本发明可用于促进任何器官移植，包括但不限于心脏、肾、肝、肺、胰腺、肠、胸腺和皮肤移植。

在某些实施方案中，本发明方法和组合物用于治疗或缓解与移植物排斥相关的疾病、疾患或病症。一般而言，移植物排斥可以源自受体中功能性免疫细胞，其将供体器官或组织识别为外来实体并对供体器官或组织产生免疫攻击。在一些情况下，在供体器官或组织移植入受体之后的急性期内会出现移植排斥。在一些情况下，在供体器官或组织移植入受体之后的慢性期内出现移植排斥。应理解，本发明涵盖用于治疗急性和/或慢性移植物排斥的方法和组合物。

在某些实施方案中，本发明方法和组合物用于治疗或缓解移植物抗宿主疾病、疾患或病症。一般而言，移植物抗宿主疾病（GVHD）可以源自来自供体的移植组织或器官中的功能性免疫细胞，其将受体识别为外来实体并对受体细胞和/或组织产生免疫攻击。在一些情况下，在供体器官或组织移植入受体之后的急性期内发生GVHD。在一些情况下，在供体器官或组织移植入受体之后的慢性期内发生GVHD。需要理解的是，本发明涵盖用于治疗急性和/或慢性GVHD的方法和组合物。

免疫耐受

设想，探路者细胞或其细胞外分泌体（例如，微泡）诱导免疫耐受，并因此特别用于治疗炎症并压制、抑制或减少移植相关的应激。不希望受特定理论束缚，设想探路者细胞或其细胞外分泌体（例如，微泡）通过诱导增加的IL-2反应来诱导免疫耐受，导致调节性T细胞的扩增（例如，增加的T调节细胞水平和/或活性）、细胞毒性T细胞和/或辅助T细胞水平和/或活性下降、和/或T细胞或非T细胞淋巴细胞反应的抑制。在一些实施方案中，探路者细胞或其细胞外分泌体（例如，微泡）抑制促炎性和/或抗血管生成细胞因子或趋化因子反应。促炎性和/或抗血管生成细胞因子或趋化因子是本领域公知的。示例性的促炎性和/或抗血管生成细胞因子或趋化因子包括，但不限于，IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、GMCSF、TGF-β、TNF-α、IFN-γ、MCAF和MIP1。在一些实施方案中，细胞或其细胞外分泌体（例如，微泡）增加抗炎性和/或促血管生成细胞因子或趋化因子反应。抗炎性和/或促血管生成细胞因子或趋化因子是本领域已知的。示例性的抗炎性和/或促血管生成细胞因子或趋化因子包括，但不限于，IL-1β、GSCF和IL-8。

因此，本发明的探路者细胞或其细胞外分泌体（例如，微泡）的施用不导致受试者的严重副作用。如本文使用的，严重副作用包括，但不限于，明显的免疫反应、毒性或死亡。如本文使用的，术语“明显的免疫反应”指重度或严重的免疫反应，例如获得性T细胞免疫反应。

因此，在许多实施方案中，本发明的发明方法不涉及同时发生的免疫抑制疗法（即，用作预先治疗/预先调节或与方法平行的任何免疫抑制疗法）。在一些实施方案中，本发明的发明方法不涉及被治疗的受试者中的免疫耐受诱导。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法不涉及使用T细胞免疫抑制剂预治疗或预调理受试者。

然而，在一些实施方案中，施用如本发明所述的探路者细胞或其细胞外分泌体（例如，微泡）能够产生针对这些物质的免疫反应。因此，在一些实施方案中，它可以用于使接受这些细胞或其细胞外分泌体（例如，微泡）的受试者耐受该疗法。可以使用本领域已知的各种方法诱导免疫耐受。熟练技术人员已知的任何免疫抑制剂可与本发明的组合疗法一起使用。这样的免疫抑制剂包括但不限于环孢素、FK506、雷帕霉素、CTLA4-Ig和抗TNF剂，例如依那西普（参见例如Moder，2000，Ann.Allergy Asthma Immunol.84，280-284；Nevins，2000，Curr.Opin.Pediatr.12，146-150；Kurlberg等，2000，Scand.J.Immunol.51，224-230；Ideguchi等，2000，Neuroscience95，217-226；Potteret等，1999，Ann.N.Y.Acad.Sci.875，159-174；Slavik等，1999，Immunol.Res.19，1-24；Gaziev等，1999，Bone MarrowTransplant.25，689-696；Henry，1999，Clin.Transplant.13，209-220；Gummert等，1999，J.Am.Soc.Nephrol.10，1366-1380；Qi等，2000，Transplantation69，1275-1283）。已经被证明在移植患者中有效的抗IL2受体（α亚基）的抗体达珠单抗（例如Zenapax.TM.）还可用作免疫抑制剂（参见例如Wiseman等，1999，Drugs58，1029-1042；Beniaminovitz等，2000，N.Engl J.Med.342，613-619；Ponticelli等，1999，Drugs R.D.1，55-60；Berard等，1999，Pharmacotherapy19，1127-1137；Eckhoff等，2000，Transplantation69，1867-1872；Ekberg等，2000，Transpl.Int.13，151-159）。其他的免疫抑制剂包括，但不限于，抗CD2（Branco等，1999，Transplantation68，1588-1596；Przepiorka等，1998，Blood92，4066-4071）、抗CD4（Marinova-Mutafchieva等，2000，关节炎Rheum.43，638-644；Fishwild等，1999，Clin.Immunol.92，138-152）和抗CD40配体（Hong等，2000，Semin.Nephrol.20，108-125；Chirmule等，2000，J.Virol.74，3345-3352；Ito等，2000，J.Immunol.164，1230-1235）。

此外根据本发明的方法和组合物（例如，探路者细胞、从探路者细胞分化的细胞、微泡和/或微小RNA）可用于治疗各种组织中的疾病、疾患或病症，所述组织包括，但不限于，中枢神经***（CNS）、外周神经***、心血管***、呼吸***、胃肠道和相关腺体、外皮***、肌肉骨骼***和机体的其他***。在一些实施方案中，根据本发明的方法和组合物可用于治疗年龄相关的变性以及早老。在一些实施方案中，根据本发明的方法和组合物可用于治疗炎症。在一些实施方案中，根据本发明的细胞和/或微小RNA可适合美容用途或用于治疗与美容外科手术相关的病症或疾患。

中枢神经***（CNS）

可以通过本发明方法和组合物治疗的CNS相关疾病、疾患或病症的实例包括：运动神经元疾病、多发性硬化、CNS变性疾病、痴呆疾病，例如阿尔茨海默病、CNS的年龄相关的功能障碍、帕金森病、脑血管意外、癫痫、暂时缺血性事故、情绪障碍、精神疾病、特定额叶功能障碍、压力相关损伤、认知功能障碍或损伤、耳聋、失明嗅觉丧失、特殊感觉疾病、运动缺陷、感觉缺陷、颅脑损伤和CNS创伤。本发明的方法和产品还可用于增强脑功能或缓解功能水平上的缺陷，或者促进CNS的手术后修复。

心血管***

可以通过本发明方法和组合物治疗的心血管***的疾病、疾患或病症的实例包括：心律不齐、心肌梗死和其他心脏病发作、心包炎、充血性心脏病、瓣膜相关疾病、心肌、心内膜和心包的功能障碍或变性、年龄相关的心血管疾患、功能障碍、变性或疾病、阀瓣硬化和增厚、心肌纤维化、心脏储备下降、心脏或循环***的先天性缺陷、心脏或循环***的发育缺陷、缺氧或坏死损伤的修复、血管损伤和心脑血管疾病或功能障碍（例如，咽峡炎、主动脉剥离病变、血栓性损伤、动脉瘤、粥样硬化、栓塞损伤和与血流、压力或障碍相关的其他问题）。本发明方法和组合物还可用于增强心血管功能或健康并使组织再血管化。而且，本发明的方法和组合物可用于修复、修饰、增强或再生对心脏或血管的创伤性损伤，并且作为增强完整器官或其部分的移植/植入的技术。该后一实施方案的实例包括心脏移植、瓣膜替换手术、假体装置的植入和新手术技术的发展。

呼吸***

可以通过本发明方法和组合物治疗的呼吸***疾病、疾患或病症的实例包括：鼻子和鼻窦、鼻咽、口咽、咽喉、喉、声韧带、声带、前庭襞、喉门、会厌、气管、粘膜、气管肌肉、主要支气管、肺叶支气管、肺段支气管、终末细支气管、呼吸区结构和复膜的损伤、病变、衰老和创伤。所述损伤的实例包括阻塞性肺病、限制性疾患、气肿、慢性支气管炎、肺部感染、哮喘、结核病、遗传疾患（例如，囊性纤维化）、气体交换问题、烧伤、气压性损伤和影响呼吸***血液供给的疾患。本发明方法和药物还可用于在损伤之后修复、修饰、增强或再生呼吸***。而且，本发明方法和组合物可用作增强整个呼吸结构或器官或其部分的移植/植入的技术。

胃肠道和相关腺体

可以通过本发明方法和药物治疗的胃肠道和相关腺体的疾病、疾患或病症的实例包括胃肠道和大附属腺体（肝和胰腺）、唾液腺、口、牙、食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠、直肠和肛管和管道的肠神经***的疾患、损伤和年龄相关的变化。在具体实施方案中，这些疾患、损伤和年龄相关的变化包括龋齿、牙周疾病、吞咽问题、溃疡、酶干扰/缺陷、运动性问题、麻痹、吸收或吸收性表面的功能障碍、憩室病、炎性肠问题、肝炎、肝硬化和门静脉高压。本发明的方法和药物还可用于在损伤后修复、修饰、增强或再生胃肠道，或者用作增强这些手术后过程的任何一个，所述手术例如胃切除术、回肠造口术和整形外科手术（例如回肠***接合）。所述后一个实施方案的实例包括涉及口，例如唇、前庭、固有口腔、红缘、唇系带、硬腭腭骨、软腭、腭垂、舌、舌的内在肌肉和舌的外在肌肉的特定解剖结构的整形外科手术。

皮肤***

可通过本发明方法和药物治疗的皮肤***的疾病、疾患或病症的实例包括皮肤和外皮***的疾患、损伤和年龄相关的变化，例如厚度或功能的年龄相关的下降、汗腺和皮脂腺的疾患、毛发直立功能障碍、卵泡问题、脱发、表皮疾病、真皮或皮下组织疾病、溃疡、疮和感染。本发明的方法和产品还可用于增强、再生或修复皮肤结构或功能，例如在塑料重构、美容修复、纹身去除、创伤愈合、皱纹调节中和在治疗擦痕、皮脂溢、红斑痤疮、葡萄酒色痣、皮肤颜色和皮肤供血改善中。而且，本发明方法和产品还可用于增强皮肤移植物、手术重构、美容外科手术、创伤愈合和美容外观。

肌肉骨骼***

可通过本发明方法和产品治疗的肌肉骨骼***的疾病、疾患或病症的实例包括肌肉骨骼***的疾病、损伤和年龄相关的改变。在一些实施方案中，这些可以是中轴骨骼的组分，包括颅骨、头骨、面、颅骨相关的骨、听小骨、舌骨、胸骨、肋骨、椎骨、骶骨和尾骨。在其他实施方案中，它们可以是附属骨骼的组分，包括锁骨、肩胛骨、肱骨、桡骨、尺骨、腕骨、掌骨、指骨（近、中、远）、骨盆带、股骨、膝盖骨、胫骨、腓骨、跗骨和拓骨。本发明的方法和组合物还可用于更正与骨化和成骨作用相关的问题，例如膜内骨化、软骨内骨化、骨重塑和修复、骨质疏松、骨软化症、软骨病、佩吉特病、风湿病和关节炎。而且，本发明方法和产品可用于治疗骨骼肌、弹性软骨、纤维软骨、长骨、短骨、扁骨和不规则骨的疾病、损伤和年龄相关的变化。

身体的其他***

身体的其他***的疾病、疾患或病症可以通过本发明的方法和产品治疗。例如，本发明可用于增强功能或治疗身体其他***的疾病、损伤和年龄相关变化，包括特殊感觉、内分泌***、淋巴***、泌尿***、生殖***和代谢和动力方面的改变。

一般年龄相关变性的治疗

本发明的方法和组合物可用于治疗、缓解、减轻或弥补一般年龄相关的变性。类似地，本发明方法和组合物可用于保持身体年轻的功能。而且，本发明方法和产品可用于治疗特定的年龄相关的***功能障碍，例如认知损伤、听力丧失、视力丧失、内分泌失调、骨骼变化和生殖功能丧失。

美容用途

在一些实施方案中，本发明方法和组合物可用于预防或减少损伤或感染部位的疤痕。例如，在其他情况下会生成疤痕或坏死的组织可以用微泡或微小RNA进行再生，所述组织包括治疗肝纤维化和/或肝硬变中的肝组织，需要治疗粉刺的面部表皮组织，和治疗缺血性梗死中的心脏组织。

在一些实施方案中，根据本发明的方法和组合物（例如，微泡和/或微小RNA）可用于增强***切除术之后的隆胸。

IV.药物组合物

在某些实施方案中，本发明提供了包含治疗有效量的微泡或微小RNA的药物组合物，用于治疗本文描述的各种疾病、疾患或病症。在一些实施方案中，本发明提供了包含治疗有效量的微泡或微小RNA的药物组合物，用于治疗糖尿病、心肌梗死、肾病、创伤愈合、瘘管生成或再生、神经再生、***切除术之后的隆胸和/或与美容外科手术相关的病症。

在某些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种微小RNA和药学可接受的载体的药物组合物，所述微小RNA具有与表1和表7-13中鉴定的微小RNA的任何一个（例如，SEQ ID NO.1-29）至少70%（例如，75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%）相同的序列。如本文使用的，术语“药学可接受的载体”包括被政府管理部门批准或在美国药典、欧洲药典、英国药典或其他公认药典中列出用于动物和特别是人的载体。如本文使用的，术语“载体”指与治疗剂（例如，微泡和/或微小RNA）一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。

提供的组合物还可以含有小量润湿剂、乳化剂和/或pH缓冲剂。提供的组合物可以采用固体、液体或凝胶多种形式中的任何一种，包括溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等。适合的药物载体的非限制性实例描述于E.W.Martin的“Remington’sPharmaceutical Sciences”。组合物一般将含有任选为纯化形式的治疗有效量的微泡和/或微小RNA，以及适合量的载体以提供适合施用给人的形式。

制剂通常被调适为适合施用的模式。例如，静脉内施用的组合物可以被配制为在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。这种组合物还可以包括溶解剂和/或局部麻醉剂，例如利多卡因（还称为利诺卡因、木卡因或昔罗卡因）以缓解注射部位的疼痛。

作为进一步实例，用于表面和/或局部使用的组合物可以被配置为，例如包含液体或半固体水包油或油包水乳剂和软膏的洗剂或霜剂。这种组合物还可以包含防腐剂。

用于递送至眼睛的组合物可以被配置为，例如包含在水或油性溶液中的活性成分的滴眼剂和可以无菌形式生产的眼膏。用于递送至鼻的组合物可以被配制为，例如水凝胶或喷雾剂、快速吸收的粗粉、或包含在水或油性溶液中的活性成分（例如，微泡和/或微小RNA）的滴鼻剂。用于局部递送至口腔的组合物可以被配制为，例如包含在一般由糖和***树胶或黄耆胶形成的块中的活性成分的硬锭剂，和包含在惰性块（例如，明胶和甘油或糖和***树胶的惰性块体）中的活性成分的软锭剂。可以将调味成分添加至硬锭剂或软锭剂。

气溶胶和喷雾剂制剂可以包含，例如适合的药学可接受的溶剂（例如乙醇和水）或所述溶剂的混合物。在一些实施方案中，所述制剂包含其他药物佐剂（例如非离子或阴离子表面活性剂、乳化剂和稳定剂）和/或其他种类的活性成分。气溶胶和喷雾剂制剂可以与推进剂气体（例如惰性气体）在升高的压力下混合，或者与挥发性液体（例如，在低于常规室温例如-30至+10°C下、正常大气压下沸腾的液体）混合。

施用途径和剂量方案

在本发明的体内治疗或诱导组织修复、重塑或分化的方法中，微泡、miRNA或其药物组合物一般以实现至少一种所需结果所必要或充分的量和时间施用。例如，可以缓解疾病、疾患或病症的一种或多种症状；延长患者存活时间；或以其他方式产生临床益处的量和时间施用miRNA。

根据本发明的给药方案可以由单剂量或经一段时间的多剂量组成。施用可以是例如每天、每周（或以一些其他多天间隔）、每两周、每月或以间断的时间表一次或多次。通常，施用有效量。微泡、微小RNA或其药物组合物的有效量将随着受试者而变化，并且将取决于若干因素（参见下文）。

微泡、微小RNA或其药学可接受的组合物可以使用有效实现预期治疗效果的任何施用途径来施用。***和局部的施用途径可以根据本发明方法使用。适合的施用途径包括但不限于静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮（例如，局部）、皮内、颅内、鞘内、胸膜内、眶内、鼻内、口服、消化道内（例如，通过栓剂）、结肠直肠（例如，通过栓剂）和脑脊髓内。

根据施用途径，有效剂量可以根据患者的体重和/或体表面积、损伤或患病组织的程度等来计算。适当剂量的优化可以容易地通过本领域技术人员例如临床医生来进行。最终的剂量方案通常由主治医生，通过考虑可能影响微泡、miRNA或其药物组合物（本文统称为“药物”）的作用的各种因素来确定，所述因素例如，药物特定活性、组织损伤的严重度和患者响应性、患者的年龄、状态、体重、性别和饮食、任何目前感染的严重度、施用时间、其他疗法的使用（或不使用）和其他临床因素。

典型剂量包括1fg/kg体重至1mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量范围从100pg/kg体重至1mg/kg体重、10pg/kg体重至1mg/kg体重、1pg/kg体重至1mg/kg体重、100ng/kg体重至1mg/kg体重、10ng/kg体重至1mg/kg体重或1ng/kg体重至1mg/kg体重。

实施例

实施例1–胰腺衍生的探路者细胞（PDPC）的形态学检查和微泡（MV）的鉴定

在本实施例中，通过扫描电镜（EM）进行大鼠胰腺衍生的探路者细胞（PDPC）的形态学研究。扫描电镜图像揭示了目前被鉴定为正在形成的微泡（MV）的PDPC表面的突起。

探路者细胞分离自如之前描述培养的大鼠胰腺。（参见，例如，国际专利公布号WO2006/120476A1，其全部内容在此通过引用并入）。这些大鼠PDPC在含有去除了牛微泡的胎牛血清（FBS）的培养基中生长。

通过扫描电镜拍摄大鼠PDPC亚汇合培养物的图片。图1A显示的代表性图片，显示了成纤维细胞样和小球细胞类型的PDPC。如可以在图1中看到的，两种类型的细胞都具有非常大数目的薄的突起和以复杂方式在多个点与其他细胞的互联。而且，这些细胞在其表面产生大量的小球，其被鉴定为正在形成的微泡（图1B）。

图1A中描述的扁平细胞直径大约15-20μm，并且是被研究的培养物中的主要细胞类型。其他细胞类型大小约3-5μm，形态为球形，并且普遍发现与相同类型的细胞毗连。不希望受任何特定理论束缚，这些球形细胞可以来源于最近经历细胞***的细胞。

可以发现从细胞边缘发出的呈辐射状的不同长度的突起，特别是更扁平、更大类型的细胞。在这些细胞突起末端清楚地观察到推定的微泡（MV）。在一些情况下，MV与细胞实际上不连接，但是依然在细胞和连接的MV附近。还清楚看到MV靠近并围绕小细胞类型的膜（图1B）。在一些区域，通常在细胞突起的末端观察到MV聚簇。鉴定的MV通常具有直径300-600nm的尺寸范围。

实施例2–在大鼠PDPC和分离自大鼠PDPC的MV中miRNA表达的分析

实施例1的结果可以揭示PC对其他细胞和组织作用的机制。为了进一步考察PC作用机制，更详细地研究了获自PDPC的微泡。

在本实施例中，使用差速离心方案从含有去除了牛微泡的血清的培养基中大鼠PDPC培养上清液中纯化MV。使用标准程序从MV和PDPC制备RNA。RNA样品被逆转录（RT）并在定量PCR分析中扩增以分析miRNA的表达。

材料和方法

RNA提取.使用TRI试剂（Sigma）从细胞和微泡（MV）提取RNA，对生产商方案作出以下调整：在将1/5体积氯仿添加至TRI试剂之后，在6°C、以16,000×g离心样品。然后使水相在10°C、16,000×g的条件下通过苯酚:氯仿:异戊醇（pH6.6；Ambion）萃取10分钟。在-20°C沉淀水相至最多2小时。在6°C、16,000×g下离心30分钟之后，在95%冰冷乙醇中洗涤得到的RNA。然后使RNA重悬于DEPC-水，并使用NanoDrop1000分光光度计定量。

miRNA分析.使用Appplied Biosystem’s Taqman低密度检测卡（TLDA）卡分析来自细胞和MV的RNA的微小RNA（miRNA）的表达。对于大鼠PDPC，Taqman啮齿动物微小RNA阵列A和B与MegaPlex RT啮齿动物库（Pool）A和库（Pool）B引物组合使用。通过阵列A根据生产商方案分析MV RNA；使用阵列B的分析正在进行。

结果

比较了细胞和MV中的miRNA分布。表1描绘了来自大鼠PDPC微泡RNA制品的373miRNA的分析结果。如表2所示，分析的373miRNA中，发现20个仅存在于MV中，而在细胞RNA群体中的水平不可检测。23个其他miRNA也仅在MV中可检测，但是这些miRNA以低水平表达。17个miRNA在细胞RNA中被检测，但是未能在MV RNA中被检测。

表2：大鼠PDPC RNA制品和大鼠PDPC衍生的MV RNA制品之间miRNA分布的比较

进一步的工作确定在MV中存在但在PDPC中不存在的miRNA的数目为38，其中22个miRNA以低水平存在。表3显示了在MV中存在但在细胞中不存在的miRNA的更新列表。这些miRNA的示例性序列显示于表1和附录1。不希望受任何特定理论束缚，一些miRNA存在在MV中但不在细胞中，这提示这些MV可能在MV中生成。

表3：在大鼠PDPC微泡中但不在细胞中存在的miRNA

表4列出了细胞中存在但微泡中不存在的miRNA。所示序列是来自褐鼠的序列。来自包括智人和小鼠在内的其他物种的相应miRNA的序列也是本领域已知的；例如，参见http://diana.cslab.ece.ntua.gr/mirgen/.

表4：大鼠PDPC中存在但MV中不存在的miRNA

这些结果说明，MV不仅仅含有细胞质或核内体内容物的随机的样品。不希望受任何特定理论束缚，特定存在于MV中的miRNA可能是细胞间调节子的候选物。可以使用例如实施例3和4中所描述的试验，单独地确认这些MV特异性miRNA。

实施例3–用于表征MV或miRNA对细胞生长的效应的检测

本实施例证实了微泡对大鼠PDPC生长的影响。

使用XCELLINGENCE^TM机器测量去除了牛MV或者去除了MV的大鼠PDPC培养物中的细胞生长，然后将大鼠PDPC MV回加。

在含有牛血清的培养基中培养大鼠PDPC，然后在43小时换成去除了牛MV的培养基。去除MV导致细胞增殖的减少，倍增时间显示为31小时（图2A）。可观察到对倍增时间的负面影响，且稍后恢复。

在一组单独实验中，在48小时去除培养物的MV，然后再过了10小时后添加外源MV。在添加大鼠PDPC衍生的MV后观察到大鼠PDPC倍增时间的剂量依赖性恢复（即，细胞增殖增加）（图2B）。细胞增殖的增加持续48小时，然后减少。接受外源MV细胞的倍增时间的快速恢复的发生远早于正常恢复时间。

这些结果不仅显示MV可以增加细胞增殖；它们还提供了可能的检测，用于表征个体miRNA对PDPC生长速率的效应。还可以针对PC对靶细胞类型的效应开发类似检测。

可以类似地测试MV对其他PC生长速率的效应。例如，可以使用人肾衍生的探路者细胞（KDPC）和***衍生的探路者细胞（LNDPC）替代PDPC。

实施例4–体外细胞损伤检测

本实施例证实已经成功开发了体外检测，其能评估MV或miRNA对刺激伤口修复或从细胞损伤恢复的效应。

成纤维细胞在XCELLIGENCE^TM机器（Roche Applied Science）的孔中生长至汇合，用作靶细胞。然后，培养物用移液器头划痕以模拟创伤。培养物在以下存在下生长：（1）各种组织来源的PC；（2）来源于PC的MV；3）分析的具体miRNA，例如实施例2中所描述的；或者（4）没有上述任何一种的培养基，作为阴性对照。

通过XCELLIGENCE^TM机器读取损伤区域的细胞再生，给出定量读数。可以通过各种培养物的再生速率确定PC、MV和特定miRNA对创伤修复的效应。

实施例5–从低氧条件下培养的细胞生成MV

设计本实施例以显示PC细胞中的MV生成和/或RNA表达谱可以通过改变某些细胞培养条件来优化。前提是培养期间缺氧条件中生长细胞可以减少细胞因子分泌，这可能延长产生MV的细胞的寿命，从而增加MV生成。

在本实施例中，各种类型的细胞的PC在低氧（小于5%O₂）条件下生长；也有在正常（例如，约5%O₂）氧条件下生长的培养物用作对照。可以使用标准方法或已知方法的调适形式定量MV的生成，所述方法例如电镜、FACS、MV重量的测量和基于已知数量/重量比例的计算等。

例如，为了检验低氧对MV的RNA含量的可能影响，从培养物中如实施例2所述分离MV。从MV制备RNA制品并定量，比较两组之间的量（低氧与正常氧）。

实施例6–从条件培养基分离和富集MV

本实施例描述了从条件培养基分离和富集MV。如之前所述，分离和培养各种类型的细胞的PC。（参见，例如，国际专利公布WO2006/120476A1）。在组织培养瓶中在无血清培养基中扩增PC至接近汇合（亚汇合）。（还使用了去除牛微泡的培养基）。收集来自亚汇合培养物的培养基（“条件培养基”）并立即分析或冷冻用于进一步分析。可以通过本领域已知的方法，例如实施例5中提到的那些方法，分析条件培养基中的MV生成。可以使用标准方法从条件培养基收获MV。从条件培养基提取RNA，分析总RNA含量和与MV相关的特定miRNA的量。

实施例7–非织造基底上培养PC以增加条件培养基中的MV生成

本实施例描述了可以增加条件培养基中MV生成的改良的培养方法。PC在各种组成的非织造织物上生长，并且评价了条件培养基中的微泡生成。

用各种组成的非织造织物制备直径为1厘米的圆形基底：

（1）以商品名VICRYL^TM（Ethicon，Inc.，萨默维尔，新泽西州）销售的包含90/10聚乙交酯-丙交酯共聚物（PGA/PLA）纤维的织物；

（2）以商品名95/5PLA/PGA^TM销售的包含95/5聚丙交酯-乙交酯共聚物（PLA/PGA）纤维的织物；和

（3）包含50%（90/10PGA/PLA）纤维和50%PDO纤维的织物。

本实施例中使用的织物具有1mm或1.5mm的厚度和范围为约60至约300mg/mL的密度。

将织物基底放入低簇集24孔板中，并通过在100%乙醇中浸泡4小时来灭菌。然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤基底，并放入含有去除了牛微泡的胎牛血清（FBS）的培养基。

将各种组织来源的PC接种到孔内基底上。用作为对照的PC接种没有基底的24孔组织培养板。培养接种了细胞的基底和对照孔，直至培养物达到亚汇合。

从孔收集来自亚汇合培养物的培养基（“条件培养基”）并分析MV生成，例如如实施例5所述。可以使用标准方法从条件培养基收获MV。

实施例8–大鼠PDPC的RNA表达谱

在本实施例中，对大鼠PDPC进行RNA表达谱。培养PDPC并如实施例2所述提取RNA。表5显示了研究发现在PDPC中表达的miRNA，所述PDPC可用于本文描述的治疗应用。丰富表达的miRNA以黑体显示。这些miRNA的序列可参见附录1。

表5：PDPC中表达的miRNA

实施例10–微泡（MV）纯化

在本实施例中，使用根据图3示意的差速离心方案或商业可获得的外体纯化试剂盒（Exo-Quick^TM Exosome Preciptitation，System Biosciences，山景城，加利福尼亚州），从大鼠PC培养物的上清液纯化MV，所述大鼠PC培养物在血清清除或血清饥饿条件下生长。此外从大鼠间充质干细胞（MSC）纯化对照MV，所述细胞在血清清除或血清饥饿条件下生长。

简言之，为了使用差速离心纯化，以1000x g离心10ml培养基10分钟，以去除细胞碎片。样品在4°C下以16,0000x g进一步离心90分钟。分离沉淀（P1）和上清液（S1）级分，并用10ml PBS洗涤沉淀级分并在4°C以16,000x g离心90分钟。得到的沉淀级分P2在0.2ml缓冲液中重悬。S1上清液级分在4°C以120,000x g离心120分钟，得到的沉淀P3用5ml PBS洗涤并在4°C以120,000x g离心120分钟。得到的沉淀级分P4在0.2ml缓冲液中重悬。

对于使用Exo-Quick^TM外体沉淀（System Biosciences，山景城，加利福尼亚州）沉淀MV，根据生产商说明，用Exo-Quick试剂处理1ml培养基。回收MV沉淀并重悬于缓冲液。

使用标准方法，对通过每种纯化方法（差速离心和沉淀）获得的级分的总蛋白和总RNA进行定量。表6显示对于测试的纯化方法的每个级分中获得的示例性总蛋白和总RNA量。

表6–从MV纯化的总蛋白和总RNA

实施例11–来自血清饥饿PC的MV的RNA表达谱

在本实施例中，使用差速离心方案（描述于实施例10），从大鼠或人PC培养物的上清液纯化MV，所述培养物在血清饥饿条件下生长约24小时。如实施例2所述，从PC和MV制备RNA。

测定并比较大鼠PC、MV级分和外体级分的微小RNA表达谱。如图4所示，测定了在血清饥饿条件下生长24小时的微小RNA，其表达与在血清充足条件下生长相比发生了改变，并且鉴定了大鼠PC、MV级分和外体级分中的重叠微小RNA序列。如图4中所看到的，有35个miRNA是响应于血清饥饿表达增加的所有样品所共有的。图5显示了大鼠PC、MV级分和外体级分的miRNA表达谱的示例性图形对比。如图5中所看到的，响应于血清饥饿表达增加的微小RNA可以在各种细胞功能中发挥作用，包括细胞周期、损伤反应、应激反应、细胞存活和免疫信号传导。

测定并比较了大鼠PC、大鼠MSC和人PC的微小RNA表达谱。如图6所示，测定了在血清饥饿条件下生长24小时的微小RNA，其表达与在血清充足条件下生长相比发生了改变，并且鉴定了大鼠PC、大鼠MSC和人类PC中的重叠微小RNA序列。如图6中所看到的，有26个miRNA是响应于血清饥饿表达增加的所有样品所共有的。

如上所述，鉴定了获自大鼠PC细胞的MV中的miRNA，所述细胞在血清饥饿条件下生长。表7描绘了从大鼠PC RNA制品获得的MV的miRNA的分析结果。

表7.来自血清饥饿的大鼠PC的MV中的示例性miRNA序列

表8描述了来自大鼠PC RNA制品的miRNA的分析结果

表8.血清饥饿的大鼠PC中的示例性miRNA序列

表9列出了在血清饥饿条件下生长的大鼠PC（表8中鉴定的）和来自在血清饥饿条件下生长的大鼠PC的MV（表7中鉴定的）之间共有的miRNA。

表9.血清饥饿的大鼠PDPC和来自血清饥饿的大鼠PDPC的MV中的miRNA序列

表10列出了包括外体在内的大鼠PC微泡中发现的miRNA，。

表10.大鼠PC04MV（包括外体）中发现的miRNA

表11列出了大鼠PC微泡和PC（不包括外体）中发现的miRNA。

表11-大鼠微泡和细胞（不包括外体）中发现的miRNA

表12列出了大鼠PC外体和PC（不包括比外体大的外泌型囊泡）中发现的miRNA。

表12–大鼠PC04外体和细胞（不包括比外体大的外泌型囊泡）中发现的miRNA。

测定并比较了从血清饥饿条件下生长的人PC获得的人PC和MV的微小RNA表达谱。如图7所示，测定了在血清饥饿条件下生长24小时的微小RNA，其表达与在血清充足条件下生长相比发生了改变，并且鉴定了人PC和MV中的重叠微小RNA序列。如能在图7中所看到的，有43个miRNA是响应于血清饥饿表达增加的所有样品所共有的。

从在血清饥饿条件下生长的人PC获得的MV的miRNA与从在相当条件下生长的大鼠PC获得的那些相比较。如在图8中可以看到的，有7个miRNA都是在血清饥饿的刺激下表达增加。图9显示了从在血清饥饿条件下生长的PC获得的大鼠MV和人MV的miRNA表达谱的示例性图形比较。如在图9中可以看到的，响应于血清饥饿表达增加的微小RNA可以在各种细胞功能中发挥作用，包括例如细胞周期、MAPK信号传导途径、TGFβ信号传导途径和DNA甲基化。

表13描述了从人PC RNA制品获得的MV的miRNA的分析结果。

表13.从血清饥饿条件下生长的人PC获得的MV的miRNA

等同替代和范围

本领域技术人员将可识别，或使用不多于常规实验能够确定本文描述的具体实施方案的许多等同替代。本发明的范围并不是被限于上文所述，而是如本发明的权利要求所示。

本领域技术人员将可识别，或使用不多于常规实验能够确定根据本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同替代。本发明的范围并不是限于上文所述，而是如本发明的权利要求所示。

在权利要求中，除非指明相反或者与上下文明显相反，冠词例如“一”、“一”和“该”可以表示一个或多于一个。如果组成员的一个、多于一个或全部存在于、用于或以其他方式相关于给定产品或方法，除非指明相反或与上下文明显相反，在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求书或说明书被认为是满足的。本发明包括这样的实施方案，其中一个组成员确切地存在于、用于或者在其他方面相关于给定产品或方法。本发明包括这样的实施方案，其中多于一个或所有组成员存在于、用于或者在其他方面相关于给定产品或方法。而且，要理解的是，本发明涵盖来自所列权利要求的一个或多个的一个或多个限制、要素、从句、描述性术语等，被引入另一权利要求的所有变化形式、组合和排列。例如，从属于另一权利要求的任何权利要求可以被调整以包括从属于相同的基本权利要求的任何其他权利要求中存在的一个或多个限制。而且，当权利要求引述组合物时，要理解的是，其包括为了本文公开的任何目的使用所述组合物的方法，并且包括根据本文公开的方法或本领域已知的其他方法的任何一个制备所述组合物的方法，除非另外指明或者除非本领域普通技术人员明显知道会产生矛盾或不一致。

当要素以列表提出时，例如，以马库什形式提出时，要理解的是，要素的每个亚组也被公开，并且任何要素可以从组中去除。应该理解，一般而言，当发明，或者发明的各方面，被提及包括特定要素、特征等时，本发明的某些实施方案或本发明的各方面由或者基本上由所述要素、特征等组成。为了简明的目的，那些实施方案没有在本文以这些文字具体提出。还要注意，术语“包括”意为开放的，并且允许包括其他要素或步骤。

当给出范围时，包括端点。而且，要理解，除非另外指明或者与上下文和本领域普通技术人员的理解明显相反，被表示为范围的值可以是本发明不同实施方案中所述范围内的任何特定值或子范围，除非上下文清楚指明相反，至所述范围下限单位的十分之一。

此外，要理解，落入现有技术的本发明的任何特定实施方案可以明确排除在任何一个或多个权利要求之外。因为这样的实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，它们可以被排除，即使本文没有明确提出排除。无论是否与现有技术的存在有关，本发明组合物的任何特定实施方案（例如，任何类型的细胞；任何神经细胞***；突触囊泡循环的任何报告分子；任何电刺激***；任何成像***；任何突触囊泡循环检测；任何突触囊泡循环调节子；任何使用方法；等）可以因为任何原因而从任何一个或多个权利要求排除。

参考文献的并入

本申请引用的所有出版物和专利文件通过整体引用并入本文，如同每个出版物或专利文件的内容被并入本文。

Claims (85)

1.一种治疗疾病、疾患或病症的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的微泡。

2.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是糖尿病。

3.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是心肌梗死。

4.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是肾病。

5.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是创伤愈合。

6.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是瘘管再生。

7.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是神经再生。

8.权利要求7所述的方法，其中所述神经再生包括CNS再生。

9.权利要求7所述的方法，其中所述神经再生包括外周神经***再生。

10.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是***切除术之后的隆胸。

11.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症与美容外科手术有关。

12.一种在体内诱导组织修复、重塑或分化的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的微泡。

13.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于与患病组织相同的组织。

14.权利要求1-12任一项所述的方法，其中所述微泡来源于与患病组织不同的组织。

15.权利要求1-12任一项所述的方法，其中所述微泡来源于胰脏细胞、肾细胞、肝细胞、脾细胞、***、子宫肌层细胞、外周血细胞、脐带血细胞、骨髓细胞、血清、间充质干细胞或其组合。

16.权利要求15所述的方法，其中所述微泡来源于胰腺衍生的探路者（pathfinder）细胞。

17.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于自体细胞。

18.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于非自体细胞。

19.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于非织造基底上生长的细胞。

20.权利要求19所述的方法，其中所述非织造基底含有脂肪族聚酯纤维。

21.权利要求20所述的方法，其中所述脂肪族聚酯纤维选自：丙交酯（其包括乳酸D-、L-和内消旋丙交酯）、乙交酯（包括乙醇酸）、ε-己内酯、对二氧环己酮（1,4-二氧杂环己烷-2-酮）、三亚甲基碳酸酯（1,3-二氧杂环己烷-2-酮）的同聚物或共聚物及其组合。

22.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于在氧压小于或等于5%的培养条件下生长的细胞。

23.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于在室内空气氧条件下生长的细胞。

24.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于生长至大约80-99%汇合的细胞。

25.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于在血清饥饿条件下生长的细胞。

26.权利要求25所述的方法，其中所述细胞在血清饥饿条件下生长约24小时。

27.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于在血清充足条件下生长的细胞。

28.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于在无血清培养基中生长的细胞。

29.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡通过差速超速离心分离或纯化。

30.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡通过沉淀分离或纯化。

31.前述权利要求任一项所述的方法，其中大部分微泡具有大于约100nm的尺寸。

32.前述权利要求任一项所述的方法，其中大部分微泡具有大于约1μm的尺寸。

33.前述权利要求任一项所述的方法，其中大部分微泡具有大约100nm至1μm范围的尺寸。

34.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡包含一种或多种微小RNA（miRNA），所述一种或多种微小RNA选自miRNA-122、miRNA-127、miRNA-133b、miRNA-323、miRNA-433、miRNA-451、miRNA-466h、miRNA-467c、miRNA-467e、miRNA-468、miRNA-491、miRNA-495、miRNA-546、miRNA-666、miRNA-680、miRNA-346、miRNA-136、miRNA-202、miRNA-369、miRNA-370、miRNA-375、miRNA-376b、miRNA-381、miRNA-434、miRNA-452、miRNA-465a、miRNA-465b、miRNA-470、miRNA-487b、miRNA-543、miRNA-547、miRNA-590、miRNA-741、miRNA-881、miRNA-206、miRNA-224、miRNA-327、miRNA-347，及其组合。

35.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡包含一种或多种微小RNA，所述一种或多种微小RNA选自miRNA-122、miRNA-127、miRNA-133b、miRNA-323、miRNA-433、miRNA-451、miRNA-466h、miRNA-467c、miRNA-467e、miRNA-468、miRNA-491、miRNA-495、miRNA-546、miRNA-666、miRNA-680、miRNA-346，及其组合。

36.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡不含有miRNA-129-5p、miRNA-190、miRNA-203、miRNA-32、miRNA-34c、miRNA-376c、miRNA-384-3p、miRNA-499b、miRNA-455、miRNA-582-5p、miRNA-615-3p、miRNA-615-5p、miRNA-7b、miRNA-17-3p、miRNA-381和miRNA-505。

37.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的微泡的范围是1fg-1mg/kg体重。

38.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡通过静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮、皮内、颅内、鞘内、胸膜内、眼窝内、鼻内、口服、消化道内、结肠直肠和/或脑脊髓内施用。

39.前述权利要求任一项所述的方法，所述微泡每天施用。

40.权利要求1-38任一项所述的方法，所述微泡每周施用。

41.权利要求1-38任一项所述的方法，所述微泡每两周施用。

42.权利要求1-29任一项所述的方法，所述微泡每月施用。

43.一种通过施用从微泡获得、分离或纯化的一种或多种微小RNA，来治疗疾病、疾患或病症的方法。

44.权利要求43所述的方法，其中所述微泡来源于在血清饥饿条件下生长的细胞。

45.权利要求44所述的方法，其中所述细胞在血清饥饿条件下生长约24小时。

46.权利要求43所述的方法，其中所述微泡来源于在血清充足条件下生长的细胞。

47.权利要求43所述的方法，其中所述微泡来源于在无血清培养基中生长的细胞。

48.权利要求43所述的方法，其中从微泡获得、分离或纯化的所述微小RNA包括在微泡中差异表达的微小RNA。

49.权利要求48所述的方法，其中从微泡获得、分离或纯化的所述微小RNA包括在微泡中差异表达的微小RNA，所述微泡来源于应激条件下生长的细胞。

50.权利要求49所述的方法，其中所述应激条件选自氧压、细胞培养汇合、细胞培养基中的血清耗竭，及其组合。

51.一种治疗疾病的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的一种或多种微小RNA，所述微小RNA具有与SEQ ID NO:1-587的任何一个至少80%相同的序列。

52.权利要求51所述的方法，其中所述疾病是糖尿病。

53.权利要求51所述的方法，其中所述疾病是心肌梗死。

54.权利要求51所述的方法，其中所述疾病是肾病。

55.权利要求51所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是创伤愈合。

56.权利要求51所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是瘘管再生。

57.权利要求51所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是神经再生。

58.权利要求57所述的方法，其中所述神经再生包括CNS再生。

59.权利要求57所述的方法，其中所述神经再生包括外周神经***再生。

60.权利要求51所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是***切除术之后的隆胸。

61.权利要求51所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症与美容外科手术有关。

62.一种在体内诱导组织修复、重塑或分化的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的一种或多种微小RNA，所述微小RNA具有与SEQ ID NO:1-587的任何一个至少80%相同的序列。

63.权利要求51-62任一项所述的方法，其中所述一种或多种微小RNA具有与SEQ IDNO:1-29的任何一个至少80%相同的序列。

64.权利要求51-62任一项所述的方法，其中所述一种或多种微小RNA选自SEQ IDNO:1-587。

65.权利要求51-64任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的一种或多种微小RNA的范围是1fg-1mg/kg体重。

66.权利要求51-65任一项所述的方法，其中所述一种或多种miRNA通过静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮、皮内、颅内、鞘内、胸膜内、眼窝内、鼻内、口服、消化道内、结肠直肠和/或脑脊髓内施用。

67.权利要求51-62任一项所述的方法，其中所述一种或多种miRNA每天施用。

68.权利要求51-62任一项所述的方法，其中所述一种或多种miRNA每周施用。

69.权利要求51-62任一项所述的方法，其中所述一种或多种miRNA每两周施用。

70.权利要求51-62任一项所述的方法，其中所述一种或多种miRNA每月施用。

71.一种药物组合物，其包含治疗有效量的微泡，用于治疗糖尿病、心肌梗死、肾病、创伤愈合、瘘管再生、神经再生、***切除术之后的隆胸，和/或与美容外科手术有关的病症。

72.一种药物组合物，其包含一种或多种微小RNA以及药学可接受的载体，所述一种或多种微小RNA具有与SEQ ID NO:1-587的任何一个至少80%相同的序列。

73.权利要求72所述的药物组合物，其中所述一种或多种微小RNA包括与SEQ IDNO:1-29的任何一个至少80%相同的序列。

74.权利要求72所述的药物组合物，其中所述一种或多种微小RNA选自SEQ IDNO:1-587。

75.权利要求71-74任一项所述的药物组合物，其中所述一种或多种微小RNA以用于治疗糖尿病、心肌梗死或肾病的治疗有效量存在。

76.一种用于鉴定诱导细胞生长和/或再生的miRNA的方法，该方法包括

提供细胞，所述细胞在除去微泡的培养基中生长；

向所述培养基添加miRNA；

确定与对照相比，所述miRNA的添加是否增加了细胞增殖速率，从而鉴定所述miRNA是否诱导细胞生长和/或再生。

77.权利要求76所述的方法，其中所述细胞是胰腺衍生的探路者细胞。

78.权利要求76或77所述的方法，其中所述细胞增殖速率通过倍增时间来确定。

79.权利要求76-78任一项所述的方法，其中所述miRNA分离自微泡。

80.一种用于鉴定诱导细胞生长和/或再生的miRNA的方法，该方法包括：

在生长至汇合的细胞中产生创伤区；

用miRNA治疗所述细胞；

确定与对照相比，在所述创伤区的被治疗的细胞的再生速率，从而鉴定所述miRNA是否诱导细胞生长和/或再生。

81.权利要求80所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞或心肌细胞。

82.权利要求80或81所述的方法，其中所述再生速率被定量确定。

83.权利要求80-82任一项所述的方法，其中所述对照是未经治疗、但在相同条件下生长的细胞。

84.权利要求80-83任一项所述的方法，其中所述miRNA分离自微泡。

85.一种使用根据权利要求76-84任一项所述方法鉴定的、诱导细胞生长和/或再生的miRNA。

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