CN112891540A

CN112891540A - Ogt作为靶点在制备治疗糖尿病中胰高血糖素异常分泌的药物中的应用

Info

Publication number: CN112891540A
Application number: CN202110116263.9A
Authority: CN
Inventors: 田梗; 徐玉雪; 彭越; 吴晓俊; 綦翔宇
Original assignee: Binzhou Medical College
Current assignee: Binzhou Medical College
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2021-06-04

Abstract

本发明公开了一种OGT作为靶点在制备治疗糖尿病中胰高血糖素异常分泌的药物中的应用。该药物为抑制O‑GlcNAc糖基转移酶OGT表达的药物，其中的功能成分可以是shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽和抗体中的至少一种。本发明通过研究发现，敲除或抑制O‑GlcNAc糖基转移酶OGT，能够降低胰高血糖素的分泌量，同时，能促进胰岛α细胞的凋零，抑制其增殖，可将O‑GlcNAc糖基转移酶OGT作为糖尿病治疗的靶点。

Description

OGT作为靶点在制备治疗糖尿病中胰高血糖素异常分泌的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种OGT作为靶点在制备治疗糖尿病中胰高血糖素异常分泌的药物中的应用。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种以高血糖为特征的内分泌代谢性疾病，也是一种可影响全身脏器的终身性疾病。据世界卫生组织(WHO)估计，目前全世界糖尿病患者总数已超过1.3亿，2025年将突破3亿。而从1980年至2010年短短30年期间，中国糖尿病患病率也从0.9％涨至11.6％，成为了世界上糖尿病患者最多的国家。至2017年，全球每4例糖尿病患者就有1例来自中国。体内长期高血糖会导致多个组织器官，如心脏、肾脏、视网膜、神经等的慢性损伤和功能障碍，因此糖尿病已成为世界各国共同面对的健康问题。目前，全球糖尿病医疗保健支出总额达6730亿美元，仅次于肿瘤排行第二位。每年约有460万人死于糖尿病，平均每7秒钟就有1人因糖尿病离世。

糖尿病分为I型糖尿病和II型糖尿病两种，其中后者占总糖尿病人数的90％，血糖紊乱是糖尿病患者临床主要表征。机体血糖平衡主要是由两种激素共同调控决定：一种是由胰岛α细胞分泌的具有升高血糖浓度的胰高血糖素 (Glucagon)；另一种是由胰岛β细胞分泌的具有降低血糖浓度的胰岛素 (Insulin)。胰岛素主要作用于肝脏、肌肉和脂肪组织，通过增加糖原合成反应、抑制糖异生作用促使多余的葡萄糖转换成糖原或脂肪储存起来。反之，当机体血糖浓度降低时，胰高血糖素通过激活肝脏中糖原分解反应和糖异生作用，释放葡萄糖从而升高血糖的浓度。因此，胰高血糖素和胰岛素的分泌紊乱都会导致机体血糖平衡受损，严重低血糖可能会引起机体急性脑损伤等不良反应；而高血糖则是糖尿病最常见的临床特征。研究发现糖尿病患者体内胰高血糖素分泌异常增加，从而引起高血糖，与糖尿病的发生密切相关。在糖尿病病情得到控制，血糖基本正常时，胰高血糖素的高分泌状态可以得到抑制，甚至可以恢复到正常水平。因此胰高血糖素又可作为糖尿病疗效观察的一个辅助指标。糖尿病患者血糖紊乱是由于胰岛β细胞胰岛素分泌不足或相对不足，以及胰岛α细胞功能紊乱或胰高血糖素分泌过多共同导致，但是相较于β细胞和胰岛素的广泛研究，我们对于α细胞功能及胰高血糖素的分泌调控机制仍未完全清楚，这也有可能成为治疗糖尿病进程的阻碍之一，因此探索生理与病理水平下胰岛α细胞的功能变化及其分泌胰高血糖素的具体调控机制具有很大的研究前景，备受国内外学者关注。

氧连接的氮-乙酰氨基葡萄糖糖基化反应(O-GlcNAcylation，O-GlcNAc修饰)是一种新型的蛋白翻译后修饰，底物二磷酸尿苷-N-乙酰葡萄糖胺(uridine diphosphate N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc)来自细胞外葡萄糖、游离脂肪酸、甘油和氨基酸谷氨酰胺。一方面细胞内O-GlcNAc水平可以作为营养物质的感受器(sensor)在生理条件下调控细胞代谢通路，另一方面当O-GlcNAc水平发生紊乱，机体会发生一系列病理反应，如糖尿病、心脏病和癌症等，但尚未见O-GlcNAc糖基转移酶OGT与糖尿病的产生机理的相关报道，也未见其是否会影响胰高血糖素分泌量的相关报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种OGT作为靶点在制备治疗糖尿病中胰高血糖素异常分泌的药物中的应用，糖尿病环境下，OGT促进胰高血糖素分泌的原理为：长时间高糖刺激会促使细胞内发生大量蛋白糖基化反应，主要是通过：①与细胞膜上PIP3结合的O-GlcNAc转移酶OGT被磷酸化激活，将IR通路中的IRS1、PI3K、PDK1和Akt等蛋白糖基化修饰，抑制磷酸化，阻止IR-PI3K通路激活，切断IR通路对钙通路的抑制作用，促进钙离子胞内释放，从而促进胰高血糖素分泌；②同时OGT将Ca²⁺/钙调蛋白激酶2和4糖基化修饰，从而促进了钙通道的激活，进而推动胰高血糖素更多分泌。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

O-GlcNAc糖基转移酶OGT作为靶点在制备治疗糖尿病中胰高血糖素异常分泌的药物中的应用。

进一步地，药物为抑制O-GlcNAc糖基转移酶OGT表达的药物。

进一步地，药物中抑制O-GlcNAc糖基转移酶OGT表达的成分为shRNA、 siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽和抗体中的至少一种。

进一步地，药物通过抑制O-GlcNAc糖基转移酶OGT的表达来抑制糖尿病患者胰岛α细胞分泌胰高血糖素。

O-GlcNAc糖基转移酶OGT作为标志物在制备糖尿病检测和/或疗效评价试剂中的应用。

一种糖尿病检测和/或疗效评价用试剂盒，包括检测O-GlcNAc糖基转移酶 OGT表达量的引物。

一种O-GlcNAc糖基转移酶OGT抑制剂在制备治疗糖尿病中胰高血糖素异常分泌的药物中的应用。

进一步地，抑制剂能抑制O-GlcNAc糖基转移酶OGT表达。

本发明的有益效果为：

通过敲除或抑制O-GlcNAc糖基转移酶OGT，能够降低胰高血糖素的分泌量，同时，能促进胰岛α细胞的凋零，抑制其增殖，可将O-GlcNAc糖基转移酶 OGT作为糖尿病治疗的靶点。

附图说明

图1为sh-OGT载体构建的检测结果；

图2为OGT敲除小鼠的PCR检测结果；

图3为OGT敲除对小鼠胰岛功能影响的检测结果；

图4为OGT敲除小鼠餐前餐后胰高血糖素分泌量的检测结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1构建胰岛α细胞OGT特异性敲除小鼠模型

1、腺病毒sh-OGT载体构建

(1)针对小鼠Ogt基因同源区设计三个shRNA靶点，具体序列如下：

shRNA-1:5’-GCAGCTTATCTTCGTGCCTTA-3’；(SEQ ID NO.1)

shRNA-2:5’-CCCATTTCTTTCAGCAGAAAT-3’；(SEQ ID NO.2)

shRNA-3:5’-GCTCTTAATATGCCCGTTATT-3’；(SEQ ID NO.3)

并针对每个靶点设计相应引物，引物序列如下：

oligo-1F:CCGGGCAGCTTATCTTCGTGCCTTACTCGAGTAAGGCACGAA GATAAGCTGCTTTTTG；(SEQ ID NO.4)

oligo-1R:AATTCAAAAAGCAGCTTATCTTCGTGCCTTACTCGAGTAAGG CACGAAGATAAGCTGC；(SEQ ID NO.5)

oligo-2F:CCGGCCCATTTCTTTCAGCAGAAATCTCGAGATTTCTGCTGAA AGAAATGGGTTTTTG；(SEQ ID NO.6)

oligo-2R:AATTCAAAAACCCATTTCTTTCAGCAGAAATCTCGAGATTTCT GCTGAAAGAAATGGG；(SEQ ID NO.7)

oligo-3F:CCGGGCTCTTAATATGCCCGTTATTCTCGAGAATAACGGGCAT ATTAAGAGCTTTTTG；(SEQ ID NO.8)

oligo-3R:AATTCAAAAAGCTCTTAATATGCCCGTTATTCTCGAGAATAAC GGGCATATTAAGAGC。(SEQ ID NO.9)

(2)通过上述引物和shRNA靶点分别构建得到腺病毒载体 Adeno-FV010-OGT-shRNA-1、Adeno-FV010-OGT-shRNA-2和 Adeno-FV010-OGT-shRNA-3；并以Adeno-FV010-EGFP-CON为对照。

2、病毒转染

(1)在腺病毒载体中加入带有红色荧光标签的Gcg胰高血糖素启动子，转染小鼠胰岛α细胞及分离培养的胰岛组织团，在荧光显微镜下可特异性标记胰岛α细胞(见图1C，图中右侧为显微镜下带有荧光的胰岛α细胞)。

(2)将构建的腺病毒载体转入TC1-6中，具体过程为：

S1、在感染前12-18小时，将目的细胞种植在孔板中；

S2、从-80℃冰箱取出病毒，放冰上或4℃融化，待完全融化后使用台式离心机低速离心20秒(使病毒完全悬于离心管底部即可)；

S3、根据病毒MOI值为100感染细胞；

S4、病毒加入后划“十”字方向轻轻摇匀，使病毒均匀分布于细胞表面，放回培养箱孵育；

S5、培养8-12小时后观察细胞状态；

S6、病毒感染细胞24H后，更换培养基；

S7、病毒感染细胞48H-72小时后检测OGT基因mRNA水平，其结果见图 1中A和B，其中A为western blotting检测结果，B为PCR检测结果，图中， shOgt-1表示腺病毒载体Adeno-FV010-OGT-shRNA-1转染的细胞；shOgt-2表示腺病毒载体Adeno-FV010-OGT-shRNA-2转染的细胞；shOgt-3表示腺病毒载体 Adeno-FV010-OGT-shRNA-3转染的细胞。

如图1中A和B所示；细胞中OGT表达量明显降低，可以确定胰岛α细胞中OGT基因敲除成功。

2、胰腺α细胞组织特异性OGT敲除小鼠的构建

选用C57BL/6小鼠作为载体，利用ES细胞打靶技术构建胰岛细胞组织特异性OGT基因敲除小鼠(Gcg^Cre-OGT^loxp/loxp)，具体过程为：

在NCBI上查找Ogt基因序列号(NM_139144)，共有22个外显子被鉴定，利用DNA同源重组和胚胎干细胞显微注射等技术基础上的ES打靶技术，将两个LoxP位点***到Ogt基因的2号外显子两端，制备floxed小鼠。2号外显子敲除会导致小鼠Ogt基因功能的丧失，然后选择胰腺特异性重组酶Gcg-Cre小鼠与OGT-floxed小鼠进行杂交，并通过PCR进行验证，其结果图2。

如图2所示，图中左侧区域显示的两条条带均为杂合子，右侧区域三条条带中，最下方的条带为野生型，其余两条条带为纯合子，表明成功构建得到了 OGT敲除的小鼠模型。

采用STZ诱导构建得到的OGT敲除小鼠，构建得到1型糖尿病小鼠模型，并在实施例2中对其进行相关功能性检测。

实施例2检测实施例1构建的OGT特异性敲除小鼠模型中OGT敲除对小鼠胰岛功能的影响

1、细胞增殖能力检测

采用Cell Counting Kit-8(CCK8)试剂检测胰岛α细胞增殖能力，其检测具体过程：细胞贴壁培养后加shRNA-Ogt病毒转染24小时，加PBS清洗后，按照培养基与CCK8试剂10：1的比例加入反应液(按照每个96孔加100μL)。37℃培养箱孵育30分钟-4小时，用酶标仪测定450nm波长处OD值；检测结果见图3A。

如图3A所示，与对照组相比，OGT敲除后，小鼠细胞的增殖能力显著降低。

2、细胞凋亡检测

应用流式细胞术检测Ogt基因敲降后α细胞凋亡水平变化，其具体过程为： FITCAnnexin V Apoptosis Detection Kit试剂盒购买自eBioscience。胰酶消化对照组和shOgt组细胞，离心后加入适量1×binding buffer重悬，使细胞数保持在 1-5×10⁶/ml。取100μL细胞悬液与5ml离心管，加入5μL Annexin V试剂。室温放置10-15分钟后离心，取200μL 1×binding buffer重悬细胞，加入5μL Propidium Iodide staining Solution，冰上保存并立即在流式细胞仪中进行检测；检测结果见图3B。如图3B所示，OGT敲除后，加速了小鼠胰岛α细胞的凋亡。

3、研究OGT敲除对胰岛组织分泌胰高血糖素和释放Ca²⁺的影响

分离野生小鼠和OGT敲除小鼠胰岛细胞团，并用带有胰岛α细胞特异性标记的腺病毒载体转染两组胰岛细胞团，依靠红色荧光探针区分出α细胞，观测其数量改变，并在全内角显微镜下，实时监测不同浓度葡萄糖以及胰岛素刺激下的α细胞中Ca²⁺实时动态变化，收集培养上清检测胰高血糖素的分泌。收集各组胰岛细胞团，Western Blot检测胰岛组织钙调蛋白激酶O-GlcNAc水平的变化；免疫染色检测α细胞中Glucagon的表达变化。其检测结果见图3中C和D。

如图3C所示，与对照组相比，OGT敲除后，Ca²⁺的释放显著降低，表明 OGT敲除能影响调控Ca²⁺通道；图3D可见，在敲除OGT后，与对照组相比，胰高血糖素的分泌量显著降低，表明通过敲除或抑制OGT的表达，能调控降低糖尿病环境中胰高血糖素的分泌量。

4、检测敲除小鼠Gcg^Cre-OGT^loxp/loxp(OGT-α)与对照组小鼠OGT-loxp在餐前(before)和餐后(after)体内胰高血糖素的分泌量，其具体过程为：正常饮食饮水喂养小鼠，于实验前一天晚8点将小鼠饲料撤离且更换小鼠垫料防止垫料中有散落的食物碎片，但不撤掉饮水。12小时后即第二天早上8点测量小鼠血液胰高血糖素即为餐前值。测量完餐前值之后将食物放回鼠笼，2小时后再一次测量血液中胰高血糖素的值即为餐后值，其结果如图4所示。

OGT敲除小鼠体内胰高血糖素的分泌量在餐前明显低于对照组，在餐后同样低于对照组，可以看出，通过敲除OGT基因，能够明显的降低小鼠体内胰高血糖素的分泌量。

序列表

<110> 滨州医学院

<120> OGT作为靶点在制备治疗糖尿病中胰高血糖素异常分泌的药物中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagcttatc ttcgtgcctt a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccatttctt tcagcagaaa t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctcttaata tgcccgttat t 21

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgggcagct tatcttcgtg ccttactcga gtaaggcacg aagataagct gctttttg 58

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aattcaaaaa gcagcttatc ttcgtgcctt actcgagtaa ggcacgaaga taagctgc 58

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccggcccatt tctttcagca gaaatctcga gatttctgct gaaagaaatg ggtttttg 58

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aattcaaaaa cccatttctt tcagcagaaa tctcgagatt tctgctgaaa gaaatggg 58

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgggctctt aatatgcccg ttattctcga gaataacggg catattaaga gctttttg 58

<210> 9

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aattcaaaaa gctcttaata tgcccgttat tctcgagaat aacgggcata ttaagagc 58

Claims

1.O-GlcNAc糖基转移酶OGT作为靶点在制备治疗糖尿病中胰高血糖素异常分泌的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制O-GlcNAc糖基转移酶OGT表达的药物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物中抑制O-GlcNAc糖基转移酶OGT表达的成分为shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽和抗体中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过抑制O-GlcNAc糖基转移酶OGT的表达来抑制糖尿病患者胰岛α细胞分泌胰高血糖素。

5.O-GlcNAc糖基转移酶OGT作为标志物在制备糖尿病检测和/或疗效评价试剂中的应用。

6.一种糖尿病检测和/或疗效评价用试剂盒，其特征在于，包括检测O-GlcNAc糖基转移酶OGT表达量的引物。

7.一种O-GlcNAc糖基转移酶OGT抑制剂在制备治疗糖尿病中胰高血糖素异常分泌的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂能抑制O-GlcNAc糖基转移酶OGT表达。

9.一种治疗糖尿病的药物，其特征在于，包括权利要求7所述的抑制剂或权利要求1所述药物。