JP6786477B2 - 3−hpを生産することができる組換え酵母およびこれを利用した3−hpの製造方法 - Google Patents
3−hpを生産することができる組換え酵母およびこれを利用した3−hpの製造方法 Download PDFInfo
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Description
本発明の他の目的は、前記組換え酵母を利用して3−HPを製造する方法を提供するところにある。
一般に酵母でアセチル−CoAは[アセトアルデヒド→酢酸→アセチル−CoA]の代謝経路を経て取得されて、酢酸は、酵母の細胞基質内で生成されて、アセチル−CoA取得過程でATPがAMPに転換されてエネルギーが消費される(図1、Y.Chen et al.,Metabolic Engineering,22:104−109,2014)。
本発明において、AADH遺伝子は、下記の表1〜3に記載された遺伝子で構成された群から選択された遺伝子と60%以上の相同性を有する核酸であることを特徴とし、アセトアルデヒドからアセチル−CoAを生合成する機能を有する限り特別な制限はない。
3−HP生成個体の必須の特徴は、高濃度の3−HPに対する相当な耐性を有して、菌株能力の最小限の損失だけで発酵時産物を蓄積できることである。低pHで高濃度の3−HPに対する耐性を有するか否かおよび前記条件下で成長してブドウ糖代謝できるか否かを確認するために、718個の種々の野生型酵母菌株を調べた(表12)。
特定の機能を有する候補酵素を確認するために、相同性−基盤データベース調査を行った。それぞれ多くの探索配列(query sequences)でデータベースを調べた。追加で、関連があるタンパク質族(family)をInterProドメイン注釈を基盤としたUniprot/SwissProtから調べた。相同性−基盤調査は、Uniprot(SwissProtおよびTrEMBL)およびblastpを利用したGenBankタンパク質データベース、tblastnを利用したGenBankヌクレオチドデータベース(tsa_nt、eny_ntおよびpat)で行った。E−値(E−value)が1e−30より小さい配列を抜き取った。しかし、いくつかの場合においては、E−値が1e−80より小さい配列を対象に追加的な分析を行った。翻訳に対する案内として探索配列を利用したGeneWiseでヌクレオチドヒットをタンパク質配列で翻訳した。GeneWiseで長いACC配列を翻訳することは難しすぎるので、その代わりにblast−xml outputからタンパク質配列(探索配列と一致する部分)を抜き取った。不要な配列を除去するために、調べられた配列をBLASTCLUSTまたはCD−HITを利用して、各々相同性が80%以上である配列を含むクラスターで集合化した。各クラスターでただ一つの代表配列だけを保存した。配列の必要なセットをタンパク質族のPFAMドメインまたはMAFFTを利用してアラインメントした。MAFFTによる全域アラインメント(alignment)は、タンパク質族がどのようなPFAMとも関連がないか、タンパク質の配列が数個のPFAMドメインで分離する場合に適用した。系統数はPHYLIPまたはFASTTREEを利用した様々な配列アラインメントをベースに作った。系統数はE.C.数字、個体名、blast E−値で注釈を付けて、Geneiousソフトを利用して可視化した。
CoAへの還元は、アセチル基を含有したアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(AADH,E.C.1.2.1.10)により行われる。AADHは、機能的に相同性がある三つのグループに分けられる(wei et al.,Nat. Commun., 4:2580, 2013):1)AADHおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する二機能タンパク質(E. coliadhE type genes, GenBank No: NP_415757, query sequence)、2)エタノールアミン異化作用に関与するタンパク質(E. colieutE type genes, GenBank No: AAG57564, query sequence)、および3)4−ヒドロキシ−2−ケト吉草酸塩(4−hydroxy−2−ketovalerate)異化作用に関与するアルドラーゼ−デヒドロゲナーゼ複合体の一部である二機能タンパク質(E. coli mphF type genes, GenBank No: NP_414885)。関心対象はグループ1(adhE type)とグループ2(eutE type)酵素である。
アセチル−CoAカルボキシラーゼ(ACC,EC 6.4.1.2)は、脂肪酸生合成に重要な酵素である多機能ビオチン−依存性カルボキシラーゼである。アセチル−CoAのマロニル−CoAへの転換に対する触媒作用をするために、助酵素としてATPおよびビオチンを使用する。まず、ビオチンカルボキシラーゼが炭酸水素塩(bicarbonate)と共にビオチンのATP−依存性カルボキシ化に対する触媒作用をする。次に、カルボキシトランスフェラーゼが、マロニル−CoAを形成するためにビオチンからアセチル−CoAにカルボキシル基を移動させる。真核酵素は、大きいマルチドメイン酵素である反面、これに相応する原核酵素は、別の遺伝子によってコードされる様々なサブユニットで構成されている。ACCの活性は、アセチル−CoA恒常性を維持するために、翻訳段階および翻訳後段階で調節される(例えば、リン酸化反応および凝集)。他の酵母種におけるACC操作は、増加したACC活性および増加したマロニル−CoA由来産物の生成を引き起こした。ACC活性を有する酵素をエンコードする遺伝子をSaccharomyces cerevisiae(GenBank No: CAA96294.1, query sequence)、Yarrowia lipolytica(GenBank No: XP_501721.1, query sequence)及びMucor circinelloides(GenBank No: EPB82652.1, query sequence)で確認または想定した。候補アセチル−CoAカルボキシラーゼ遺伝子をKazachstania exigua(配列番号 1)およびCandida humilis(配列番号 2)の新しく配列化されたゲノムで確認して、酵母発現プラスミドでクローニングした。ACC活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な真核マルチドメインACC遺伝子は表4の通りである。
マロニル−CoAで3−HPへの還元(マロネートセミアルデヒド中間体を経る)は、C−末端アルデヒドデヒドロゲナーゼドメインおよびN−末端アルコールデヒドロゲナーゼドメイン機能基を共に有する二機能マロニル−CoAレダクターゼによって行われることができる。このような活性を有する非常に基質−特異的でNADPH−依存的な酵素は、3−ヒドロキシプロピオネートサイクルと呼ばれる独立栄養CO2固定化経路に関与する光栄養緑色非硫黄細菌Chloroflexus aurantiacus(GenBank No: AAS20429.1、 query sequence)内で特性化される(Hugler et al.,J.Bacteriol.184:2404−2410,2002)。このような二機能マロニル−CoAレダクターゼ活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な遺伝子は表5の通りである。
実施例2−3の二機能マロニル−CoAレダクターゼとは異なり、マロニル−CoAは二種類の個別的な酵素によって3−HPで触媒できる。この経路によると、マロニル−CoAがまずマロニル−CoAレダクターゼ(MCR、EC 1.2.1.75)またはCoA−アシル基を含有したマロネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼによりマロネートセミアルデヒドに還元された後、連続的に3−ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼ(3−HPDH、EC 1.1.1.59またはEC 1.1.1.298)により3−HPに還元される。MCRは、3−ヒドロキシプロピオネート/4−ヒドロキシブチレートサイクルを介して有機物質内に炭素を自己栄養で固定するいくつかの耐熱好酸性古細菌(thermoacidophilic archaea)により利用されるNADPH−依存性酵素である(Berg et al.,Science,318:1782−1786,2007)。MCR活性を有する酵素をエンコードする遺伝子は、Metallosphaera sedula(GenBank No: ABP94884.1, query sequence)及びSulfolobus tokodaii(GenBank No: BAB67276.1, query sequence)内で特性化される。たとえ前記MCRは、Chloroflexus aurantiacus二機能マロニル−CoAレダクターゼ酵素に対する類似のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を共有するとしても、これらはChloroflexusおよびSulfolobaceae内自己栄養経路が収束的に進化する点および他の遺伝子が分類学上群内類似の代謝過程を実行するために利用される点を示すいかなる相当する配列類似性を示さない(Alber et al.,J.Bacteriol.,188:8551−8559,2006)。特に、古細菌MCRは、アスパルテート−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼと高い配列類似性を示す。MCR活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な遺伝子は表6の通りである。
マロネートセミアルデヒドは、可逆3−ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼ(HPDH、EC 1.1.1.59、NADH−依存的)またはマロネートセミアルデヒドレダクターゼ(EC 1.1.1.298、NADPH−依存的)により3−HPに還元される。このような酵素は、自然にバクテリアおよび植物内β−アラニン代謝、プロパノエート代謝またはウラ室分解に関与する。さらに、このような酵素は、3−ヒドロキシプロピオネート/4−ヒドロキシブチレートサイクルを介した炭素固定化のためにいくつかの耐熱好酸性古細菌で必要とする(Kockelkorn and Fuchs,J.Bacteriol.,191:6352−6362,2009)。3−ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼまたはマロネートセミアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をエンコードする遺伝子をEscherichia coli(GenBank No: EFV00080.1, query sequence), Saccharomyces cerevisiae(GenBank No: DAA10125.1, query sequence), Metallosphaera sedula(GenBank No: ABP96133.1, query sequence), Sulfolobus tokodaii(GenBank No: BAK54608.1, query sequence)及びEscherichia coli(GenBank No: ACR64730.1, query sequence)で確認または想定した。3−ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼまたはマロネートセミアルデヒドレダクターゼ活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な遺伝子は表7の通りである。
3−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ(HIBADH、EC 1.1.1.31)はバリンおよび他の分岐鎖アミノ酸の代謝に関与する重要な酵素である。HIBADHは、3−ヒドロキシイソブチレートのメチルマロネートセミアルデヒドへのNADH−またはNADPH依存性可逆的転換を触媒する。しかし、広範囲な基質特異性により、HIBADHはマロネートセミアルデヒドを3−HPに転換することによって3−ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼ活性も示す(Yao et al.,Appl.Biochem.Biotechnol.160:694−703,2010)。HIBADH活性を有する酵素は、Pseudomonas putida(GenBank No: ADR61938.1, query sequence), Pseudomonas aeruginosa(GenBank No: AAG06957.1, query sequence), Bacillus cereus(GenBank No: AAP10961.1, query sequence)及びAlcaligenes faecalis(GenBank No: EJC65559.1, query sequence)内で確認した。HIBADH活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な遺伝子は表8の通りである。
4−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ(HBDH、EC 1.1.1.61)は、ブタノエート代謝に自然に関与する酵素である。HBDHは4−ヒドロキシブタノエートのサクシネートセミアルデヒドへの遺伝子NAD+−依存的可逆転換を触媒する。しかし、HBDHは酵素反応が類似するので、マロネートセミアルデヒドを3−HPに転換させてもよい。HBDH活性を有する酵素をCupriavidus necator(GenBank No: AAC41425.1, query sequence)及びClostridium kluyveri(GenBank No: EDK35022.1, query sequence)内で確認した。HBDH活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な遺伝子は表9の通りである。
3−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ(BDH、EC 1.1.1.30)は、ブタノエート代謝に自然に関与する酵素である。BDHは、3−ヒドロキシブチレートのアセトアセテートへのNAD+−依存的可逆転換を触媒するが、他の3−ヒドロキシモノカルボキシ酸も酸化させることができる。例えば、BDHは、酵素反応が類似するので、マロネートセミアルデヒドを3−HPに転換させることができる。BDH活性を有する酵素をPseudomonas aeruginosa(GenBank No:GAA17557.1, query sequence)内で確認した。BDH活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な遺伝子は表10の通りである。
[ACC分光光度酵素アッセイ]
分光光度ACCアッセイは、カップリングされたアッセイで、補助者NAD(P)Hが必要とされる反応で、ACC反応によって生成された産物が追加で消費されて、異議酸化を分光光度計で監視することができる。
インビトロで最も顕著に使用されるのは14Cカーボネートの使用に基づくものである。放射能炭酸を酸および非揮発性物質(即ち、マロニル−CoA)に導入する過程が続く。マロニル−CoAに転換されなかった14C標識した炭酸水素ナトリウムを酸及び熱処理で除去し、残りのNaH14CO3及び可能な反応副産物を14C標識したCO2に転換する。
Kozakら(2014、Metab。Eng。21:46−59)に記載されたように、30℃で340nm NAD+還元をモニタリングしてAADH活性を測定した。細胞溶解物のために酵母細胞を収集、または水で水洗し、100mM Tris−HClバッファ(pH7.5)、および1X EDTAを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル(1X EDTA free protease inhibitor cocktail(Roche))を含む溶解バッファに再サスペンションした。細胞を5500rpm Precellys24ホモジナイザーで3x40秒間ガラスビーズで溶解し、各回の間に氷で維持した。溶解物16000gを、4℃で20分間遠心分離し、上澄み液を収集した。ブラッドフォード法を使用して総タンパク質濃度を測定した。
Cheら(2014,Metab.Eng.22:104−109)に記載された方法を少し変形してMCR酵素活性を測定した。この方法は、340nmでNAD(P)Hの酸化をモニタリングしたことに基づくものである。
候補遺伝子の発現と酵母で活性能を評価するために、一連の酵母発現プラスミドを作製した。まず、新規pBlueScriptベースMCS(multiple cloning site)をデザインして、全ての可能なRE(restriction enzyme)サイトの組み合わせを使用することができる。以降の変形されたMCSをpRS−ベースのシリアルの酵母同原体および多コピープラスミドに位置させた。以降、10個のREサイトのセットを使用して、9つの異なるセットのプロモーターとターミネーターをpRS−ベース酵母発現ベクターにクローニングした。以後、3−HPの生産のための様々な経路の酵素の組み合わせを評価するために、これらのプラスミドシステムを使用して連続的に9つの遺伝子を、低または高コピー数で同時に、適切な酵母菌株で発現した。
SNF1結実があるまたはない、産業的に利用されるS. cerevisiae VSK−128菌株に形質転換させたACC1遺伝子を表13に示した。多コピープラスミドでACC遺伝子を発現しており、これらはPDC1 pプロモーターの調節下にあった。QuikChange II Site Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies)を使用してShi etら(2014)に記載された変形されたACC1sc遺伝子を構築した。
文献では、ACC酵素活性を検出するために精製されたまたは一部精製されたACC酵素と一緒に分光光学的アッセイ(spectrophotometric assays)が使用されてきた。対照群と比較して、吸光の変化が検出されないが、ACCが過発現した酵母細胞溶解物を分光光学的アッセイで試験した。
5つのAADH遺伝子(すなわち、ADHEpm、ADHEec、EUTec、EUTdzとLIN1129li)を優先的に選択して、CEN.PK lab菌株に形質転換した。TEF1プロモーター調節下にある全て多コピープラスミドで、これらのAADHが発現した。全ての5つのAADH遺伝子はAADH活性を示したが、3つのeutE−type AADH遺伝子(すなわち、EUTec、EUTdzとLIN1129li)は、adhE−type AADHs(つまり、ADHEpmとADHEec)と比較して、酵母ではるかに高いAADH活性を示した。
グルコースベース培地で成長できないようにPDHバイパスが欠けていた菌株を製作しようと、産業S. cerevisiae VSK−128菌株からの全てのコピーのACS2遺伝子を欠失させた。25個の異なるAADH変異体を含む発現ベクターを、これらのACS2結実菌株に形質転換して、グルコース上で、これらの菌株の成長回復能を評価した。
8つの全長Chloroflexus MCRホモログを2つの機能性ドメインで切断し、酵母から6個アキアMCRと一緒に酵素活性についてMCR−特異的ドメインをアッセイした。これらのMCRは、多コピープラスミドで発現され、これらはTEF1プロモーター下で調節され、CEN.PK lab菌株に形質転換された。
4つの異なるアキアMCR Metallosphaera sedula(MCRms)、Sulfolobus tokodai(MCRst)、Candidatus caldiarchaeum(MCRcc)、およびSulfolobales archaeon(MCRsa1)についてpBAT T7プロモーターベースの発現構築物を作製した。これらの構造物は、精製のタグが含まれていない、E. coliコドン最適化され、先に記載した条件で発現された(表15)。
0.4mM NAD(P)H、0.15mM Malonyl−CoA、Tris−HCl pH7、2mM MgCl2。20倍希釈された溶解物に対して室温でMTP(マイクロタイタープレート)フォーマットでアッセイを行った。以降、A365でNADPHまたはNADHの酸化が連続された。テストした4つのアキア遺伝子の中で、MCRsa1とMCRstが最も高いMCR活性を示した。しかし、タグ付けされたMCRcaに対して測定されたものよりも、MCR活性がより少なかった。Candidatus caldiarchaeum MCR(MCRcc)について(E.coli細胞溶解物中)NADPHまたはNADHの活性は測定されなかった。
[実施例4:組換え酵母培養を通じた3−HPの製造]
[S. cerevisiaeのシェイクフラスコ培養]
選別的アガベースプレートで新鮮な培養された菌株から小さなリングの細胞を取って250mLフラスコで20mLの選別的SCベースの培地を接種するために使用されて、全てのグルコースおよびエタノールが消費されるまでの2日間(30℃、250rpm)培養した。最終的な細胞密度を測定し、培養物を5分間4000rpmで遠心分離した。上澄み液をHPLCまたはGC/MSで分析して、培養上澄み液で3−HP、およびその他の主要な代謝物の蓄積を測定した。しかし、他の培養条件はまた、特定の菌株、目的(例えば、グルコース開始量、空気の量、バッジの種類とバッジに追加物質の追加など)に応じてテストした。
250〜500mL培地を含むMultiforsバイオリアクター(最大動作体積500mL、24−ブレードのRusthonタービンインペラ、Infors HT、スイス)で培養した。培養物を、初期1.2、2.4、または3.6のボリュームガス(体積培養)−1min−1(vvm)で30℃、300または900〜950rpmで維持した。培養物のpHは、2M NaOHまたは2M H3PO4を追加してpH5.5±0.2で一定に維持された。Clerol FBA3107消泡剤(Cognis France、Ponthierry Paris、0.03%v/v)を追加して泡の生成を調節した。Ar中3%CO2、5%CO2と0.99%ArとN2のうち15%O2、N2中20%O2プラス20%ArとN2の0.04%エタノールで調整されたPrima Pro Process mass spectrometerでガス濃度(CO2、O2、N2とAr)を継続的に分析した。
注入体積は10μLのWaters Alliance e2695 HPLC system(Waters、Milford、USA)を使用して培養上清サンプルを分析した。HPLCでFast Acid Analysis Column(100mm X7.8mm)(Bio−Rad、USA)に接続されたAminex HPX−87H Organic Acid Column(300mm X7.8mm)(Bio−Rad、USA)を停滞期に使用した。カラムを+55℃に維持し、0.3または0.5ml min−1の流量で5.0mM H2SO4(Merck KgaA、Germany)を溶出液として使用した。
テストサンプルおよび標準曲線は次の方法で準備した。
50μLHCl(6N)で上澄み液(0.5ml)を酸性化し、3−HPA(TCI)標準溶液とスパイクした。5μL乳酸内部標準溶液(Sigma Aldrich(ISOTEC)sodium L−lactate−3,3,3−d3 98atom%、5.5g/l)と約0.2gのNaClを追加した。ラベリングされた3−HPは、商業的に入手不可能なので、このような乳酸安定同位体製品を内部標準として選択し、サンプルマトリックスに存在していないことで利用可能でありながら、3−HPと構造的に/化学的に最も類似した化合物であるためである。混合物を約3分間ボルテックスミキサーでシェイクした。以降のサンプルを約3分間ボルテックスミキサーで混合して、酢酸エチル0.5mlで2回抽出した。10000rpmで5分間遠心分離して層を分離した。GCバイアルに上層を収集し、蒸発させた。乾燥された残留物は、60℃で1時間インキュベーションし、1%TMCSを含むMSTFA(50μL)に誘導した。誤差を最小化するために、サンプルと同じ方法で黒カーブ(calibration curve)の標準を抽出した。
3−HPプラスミド発現菌株は、2つの異なる発現プラスミド(即ち、pSK−084および/またはpSK−085)から3−HPのパス酵素(即ち、AADH、ACC1、MCRとHPDH)一つ、二つまたは3つのことを同時に発現した(図4)。これらの菌株を使用してVSK−128酸耐性S. cerevisiae菌株で3−HPの生産のための他の3−HPのパス酵素(およびこれらの酵素の組み合わせ)の効果を評価した。菌株を250mLフラスコ中、20mLの選別SCベース培地(20g/Lグルコース)で培養し、全てのグルコースおよびエタノールが消費されるまでの2日間(30℃、250rpm)で培養した。
必要に応じて追加の3−HPのパス酵素を発現することもある様々なS. cerevisiae株で表16に示すように、25個のAADH、8つのACC1、10個の2機能性HPDH−MCR(二官能性HPDH−MCR)、6つのアキアMCRと28個HPDHの3−HPの生産能について分析した。多くの新規3−HPのパス酵素(ゲノムマイニング分析を介して得)が酵素で前の公開された3−HPのパス酵素と比較して活性があることを示し、優れた特性(すなわち、より高い活性、より優れた補助因子評価)を保持することを示した。
[培養条件]
最初のテストした菌株について、様々な他の培養条件を評価することにより、様々な培養条件は、菌株の3−HPの生産パフォーマンスに影響を与えるかを確認した。S. cerevisiae VSK−128(Δura3、Δhis3)菌株は、2つのプラスミドを発現するのには、1つはHIBADHpaまたはHPDHec遺伝子を含み、2回目プラスミドはMCRsa2遺伝子を含んでいる。2つの菌株は、培養中に同様に行動して、非常によく似代謝物のプロファイルを有する。
1.好気性、バッチプロセス、初期高濃度グルコース(120g/L)
3日目に追加グルコース100g/L添加した。
2.嫌気性、バッチプロセス、初期高濃度グルコース(100g/L)
フラスコを密封し、100rpmsでもっとゆっくりシェイクした。
3.好気性、バッチプロセス、繰り返しグルコーススパイキング
初期グルコース20g/L、以後毎日40g/Lを添加した。
4.好気性、仮想の流加バッチプロセス、初期多数のグルコース精製(glucose tablets)
5つのタブレットを最初に添加し、さらに5つのタブレットを3日目に添加した。さまざまな量のEnzyme A溶液(50〜150μL/日)を毎日添加した。
5.好気性、仮想の流加バッチプロセス、繰り返しグルコース精製スパイキング
1つのタブレットを最初に添加し、2つのタブレットを1日と2日に添加して、3つのタブレットを3日と4日に添加した。さまざまな量のEnzyme A溶液(50〜150μL/日)を毎日添加した。
6.好気性、バッチプロセス、繰り返しガラクトーススパイキング
初期ガラクトースは、20g/Lであり、以後毎日40g/L添加した。
全ての一般的なグルコースベースの培養によって同様に培養され、ガラクトース流加培養によって、よりゆっくり培養される。一方、他の培養条件と比較して、流加培養条件によって細胞の成長がさらに促進される。特に、流加培養(精製スパイキング)の条件は、初期培養からの成長を大幅に向上させる。
これらの培養を介して、ほとんどの成長は、一般的に2日の後半に起こって、かなり多くの3−HPはまた、2日目の生産されており、これは成長と3−HPの生産は、互いに関連性があることを示唆している。流加培養(精製スパイキング)培養条件で3−HP(〜0.85g/L)が最も多く生産され、ガラクトース流加培養を介して最も少ない量の3−HP(〜0.12g/L)が生産されており、他の培養条件から全て約0.3乃至0.4g/Lの3−HPを生産した。これらの結果は、培養条件に3−HPの生産レベルに大きな影響を与えることができる(図5)。
全ての培養から2〜3日までのグルコースが急速に消費され、以降、グルコース消費は成長および3−HPの生産と大幅に減少した(4−5日目)。流加培養では、グルコースは精製から放出されるように急速に消費されるように見える、これは、これらの培養がグルコース制限条件下で行われたことを示す。
グルコース流加培養でグリセロール蓄積はかなり高く、ガラクトース流加培養よりもはるかに低い。酢酸の蓄積は、他の培養条件の間ではかなり似ているが、流加培養(多数の錠剤)の条件で、より多くの酢酸が生産された。
追加の3−HPの生産菌株[(EutEec、HPDH−MCRca、ACC1sc_S1157A)と(HIBADHpa、MCRsa2)]を最も有望な流加培養(精製スパイキング)培養条件に応じて、培養して、性能を確認した。
Claims (5)
- Saccharomyces cerevisiaeの組換え体である組換え酵母であって、
外因性AADH遺伝子、内因性または外因性ACC遺伝子、外因性MCR遺伝子、および外因性HPDH遺伝子を含有して、[ピルビン酸→アセトアルデヒド→アセチル−CoA→マロニル−CoA→マロネートセミアルデヒド→3−HP]生合成経路を介して3−ヒドロキシプロピオン酸(3−HP)を生産することができ、
前記酵母は、
アセトアルデヒドからアセチル−CoAに直接転換し、配列番号74、76、77、80、83、90、91、93、94、96〜98からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、アセチル基を含有したアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(AADH)をコードする外因性遺伝子と、
配列番号99〜106からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアセチル−CoAカルボキシラーゼ(ACC)をコードする内因性または外因性の遺伝子と、
配列番号107〜109、及び114、並びに、GenBank Accession No. WP_020198954.1、AGE74568.1、AGE74357.1、及びBAB67276.1からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するマロニル−CoAレダクターゼ(MCR)をコードする外因性遺伝子と、
配列番号117〜131、及び133〜144、並びに、GenBank Accession No. ESM32057.1からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼ(HPDH)をコードする外因性遺伝子と、
を含む、組換え酵母。 - 前記組換え酵母は、耐酸性を有することを特徴とする請求項1に記載の組換え酵母。
- 下記の段階を含む3−HPの製造方法:
(a)請求項1に記載の組換え酵母を少なくとも一つの炭素源を含有する培地で培養して、3−HPを生成させる段階、および
(b)前記生成された3−HPを回収する段階。 - 前記炭素源は、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、プルクトース、セルロース、グルコースオリゴマーおよびグリセロールで構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項3に記載の製造方法。
- 前記培養は、pHが2.6〜4.0で行うことを特徴とする請求項4に記載の製造方法。
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