JP5013448B2

JP5013448B2 - 出芽酵母の乳酸耐性又は生産性を向上させる多重遺伝子破壊の組み合わせ

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Publication number: JP5013448B2
Application number: JP2006211210A
Authority: JP
Inventors: 浩美神戸; 充生小畑; 俊原島; 嘉信金子; 峰崇杉山; 治雄高橋; 亘広石田
Original assignee: Teijin Ltd; Toyota Central R&D Labs Inc
Current assignee: Teijin Ltd; Toyota Central R&D Labs Inc
Priority date: 2006-08-02
Filing date: 2006-08-02
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2026-08-02
Also published as: JP2008035727A

Description

本発明は乳酸耐性又は乳酸生成能を有する出芽酵母に関する。

遺伝子組み換えにより乳酸生成能を有するように改変された酵母を乳酸の製造において使用する方法が知られている（特許文献１〜４参照）。しかしながら、乳酸発酵が進むにつれて乳酸濃度が増加して培養液のｐＨが低下し、ｐＨ２〜３程度になると酵母の乳酸生産効率が低くなる。このため、乳酸生産効率を高く保持するためには培養液の中和工程及び脱塩、精製工程が必要となり製造コストが高くなるという問題があった。特許文献５には、乳酸生成能を有する酵母等の耐酸性を向上させる技術が開示されているが、耐酸性は十分なものではなかった。また、２００５年日本農芸化学会大会演題番号３０Ｆ１０５α（株式会社アンデルセンサービス、酒類総合研究所）では酵母の遺伝子（ＳＥＤ１、ＥＧＴ２、ＤＳＥ２、ＳＣＷ１１、ＨＯＣ１、ＳＵＮ４、ＥＡＦ３）をそれぞれ単独で破壊した株が６．１％乳酸（ｐＨ２．５）、０．７％酢酸（ｐＨ４．１）、０．３％塩酸（ｐＨ２．２）に対して耐性を示すことが報告されている。しかしながら酵母を用いて乳酸を効率的に生産するためには耐酸性をより一層向上させることが望まれる。

特許文献６及び７には、バチルス属に属する乳酸生産菌を用いて乳酸を製造する方法が開示されている。バチルス属等のバクテリアを培養するためには培養液のｐＨを６〜８に保つ必要があることから、特許文献６及び７記載の方法による乳酸の製造効率は特許文献１〜４記載の方法よりもより低いものであった。

特許文献８には、乳酸菌の増殖性及び抗菌性物質生産性を増大するための方法が開示されている。特許文献８記載の方法では鉄ポルフィリン、ヘム蛋白質等の添加物を使用する必要があり、培養コストが高くなるという問題があった。

特開２００６−６２７１号公報特開２００６−２０６０２号公報特表２００１−５１６５８４号公報特表２００５−５２８１０６号公報特開２００１−２０４４６４号公報特許第３６８２６７９号公報特開平９−１２１８４４号公報特許第２９９１４５８号公報

以上の通り、遺伝子組み換えにより乳酸生成能を有するように改変された酵母を用いて乳酸を製造する方法では、乳酸発酵が進むにつれて乳酸濃度が増加するため、培養液のｐＨが低下して酵母の培養に適したｐＨ領域（通常４〜６程度）から外れ、乳酸の効率的な製造を行うことが困難であるという問題があった。

そこで本発明は、酵母の乳酸耐性を向上させることを目的とする。本発明はまた乳酸生成能を有する酵母において乳酸生産が進んだ後も乳酸生産性を維持又は向上させることを目的とする。

本発明は以下の発明を包含する。
（１）乳酸耐性に関与する遺伝子が２つ以上破壊されていることを特徴とする出芽酵母。
（２）乳酸耐性に関与する遺伝子が、ＤＳＥ２、ＳＣＷ１１、ＥＡＦ３及びＳＥＤ１からなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子であることを特徴とする（１）記載の出芽酵母。
（３）乳酸耐性を有することを特徴とする（１）記載の出芽酵母。
（４）Δｄｓｅ２Δｅａｆ３、Δｓｃｗ１１Δｅａｆ３、Δｄｓｅ２Δｅａｆ３Δｓｅｄ１、Δｓｃｗ１１Δｅａｆ３Δｓｅｄ１、又はΔｄｓｅ２Δｓｃｗ１１Δｅａｆ３Δｓｅｄ１である多重遺伝子破壊株であることを特徴とする（３）記載の出芽酵母。
（５）乳酸生成に関与する遺伝子が導入されており、かつ乳酸生成能を有することを特徴とする（１）記載の出芽酵母。
（６）乳酸耐性に関与する遺伝子が破壊されておらず、かつ乳酸生成に関与する遺伝子が導入されている乳酸生成能を有する出芽酵母と比較して乳酸生産量が１０％以上高いことを特徴とする（５）記載の出芽酵母。
（７）Δｄｓｅ２Δｅａｆ３、Δｄｓｅ２Δｓｃｗ１１、Δｓｃｗ１１Δｓｅｄ１、Δｅａｆ３Δｓｅｄ１、Δｓｃｗ１１Δｅａｆ３Δｓｅｄ１、又はΔｄｓｅ２Δｓｃｗ１１Δｅａｆ３Δｓｅｄ１である多重遺伝子破壊株であることを特徴とする（６）記載の出芽酵母。
（８）出芽酵母において乳酸耐性に関与する遺伝子を２つ以上破壊することにより出芽酵母に乳酸耐性を付与する方法。
（９）出芽酵母において乳酸耐性に関与する遺伝子を２つ以上破壊するとともに乳酸生成に関与する遺伝子を導入することにより出芽酵母に乳酸生産性を付与する方法。

本発明により、酵母の乳酸耐性を向上させることができる。また本発明により、乳酸生成能を有する酵母において乳酸生産が進んだ後も乳酸生産性を維持又は向上させることができる。

（出芽酵母）
本発明に使用される出芽酵母はサッカロミセス・セレビシエに分類される株である限り特に限定されない。

（乳酸生成に関与する遺伝子）
当該出芽酵母には乳酸生成に関与する遺伝子が導入されていてもよい。乳酸生成に関与する遺伝子としては乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子が挙げられる。乳酸生成に関与する遺伝子の採取源は特に限定されず、例えばウシ、ヒトのような動物、大腸菌、乳酸菌のような原核生物、植物を含め、ほとんどの生物から乳酸生成に関与する遺伝子を得ることができる。遺伝子採取源である生物からのｍＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡライブラリーの作製は常法により行うことができる。

乳酸生成に関与する遺伝子の出芽酵母への導入は常法により行うことができる。例えば、当該遺伝子を組み込んだ組換えベクターにより出芽酵母を形質転換することにより導入が可能である。当該組換えベクターは、適当なベクターに乳酸生成に関与する遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。乳酸生成に関与する遺伝子を挿入するためのベクターは宿主である出芽酵母中で複製可能なものであれば特に限定されないが、例えばＹＥｐ型、ＹＲｐ型、ＹＣｐ型のベクターを使用できる。さらに、核外遺伝子として複製しなくとも、染色体に組み込むことにより複製を可能にするベクターであってもよい。染色体への組み込みを効率よく行うためには、ＹＩｐ型のベクターが利用できる。また、レトロトランスポゾンにより染色体へ組み込むこともできる。

乳酸生成に関与する遺伝子をベクターに挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。

乳酸生成に関与する遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、乳酸生成に関与する遺伝子、ターミネーターのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３遺伝子などの各種栄養要求性マーカー、ジェネティシン耐性遺伝子、メトトレキセート耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、オーレオバシジンが挙げられる。

乳酸生成に関与する遺伝子を組み込んだ組換えベクターの具体例としては特願２００３−３３４０９２号において構築されたｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターのようなものがある。

本発明において使用される乳酸生成能を有する出芽酵母は、上記組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。

本発明の耐酸性乳酸生成微生物を得るための形質転換は、上記手法により得られた耐酸性微生物に、乳酸生成に関与する遺伝子を含む本発明の組換えベクターを導入し得る方法であれば特に限定されるものではない。例えば、酢酸リチウム法、カルシウムイオンを用いる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０，１９７２）、エレクトロポレーション法等の通常行われる遺伝子工学的手法により形質転換を行う。

（乳酸耐性に関与する遺伝子の破壊）
本発明において「乳酸耐性に関与する遺伝子」とは、出芽酵母の遺伝子であって、それを破壊した場合に出芽酵母の乳酸耐性が向上する遺伝子を意味する。乳酸耐性に関与する遺伝子としては、具体的にはＤＳＥ２、ＳＣＷ１１、ＥＡＦ３及びＳＥＤ１が挙げられる。

これらの遺伝子をそれぞれ単独で破壊した場合に酵母の乳酸耐性が向上することは、背景技術の章で示したとおり本願出願前に公知であった。本発明者らは驚くべきことに、これらの遺伝子のうち２種以上を組み合わせて破壊した場合に、単独で破壊した場合と比較して出芽酵母の乳酸耐性及び／又は乳酸生産性が顕著に向上することを見出した。

本発明に係る出芽酵母の好ましい形態は、ＤＳＥ２、ＳＣＷ１１、ＥＡＦ３及びＳＥＤ１からなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは３つ、特に好ましくは４つの遺伝子が破壊されている出芽酵母である。

本発明に係る出芽酵母の好ましい形態は、乳酸耐性が顕著に向上した出芽酵母であり、具体的には８（ｗ／ｖ）％乳酸を含む寒天培地におけるコロニー形成能を有する出芽酵母である。寒天培地の具体的な組成としては、ＹＰＤＡ培地（５％ＹＰＤＢｒｏｔｈ（ＳＩＧＭＡ；２％グルコース、２％バクトペプトン、１％イーストエキストラクト含有）、０．０４％アデニン）に８ｗ／ｖ％になるようにＬ−乳酸（ナカライテスク株式会社製）を加えたものが挙げられる。コロニー形成能を評価する培養条件は、培養温度３０℃、培養時間２６４時間、初菌濃度５μLあたり１０^６個である。このような性質を有する出芽酵母としては、Δｄｓｅ２Δｅａｆ３又はΔｓｃｗ１１Δｅａｆ３である二重遺伝子破壊株、Δｄｓｅ２Δｅａｆ３Δｓｅｄ１又はΔｓｃｗ１１Δｅａｆ３Δｓｅｄ１である三重遺伝子破壊株、或いはΔｄｓｅ２Δｓｃｗ１１Δｅａｆ３Δｓｅｄ１である四重遺伝子破壊株が挙げられる。ここで、Δｄｓｅ２Δｅａｆ３という表記は、ＤＳＥ２遺伝子とＥＡＦ３遺伝子とが共に破壊された株であることを意味する。他の破壊株の表記についても同様にして解釈する。

本発明に係る出芽酵母の他の好ましい形態は、乳酸生成に関与する遺伝子が導入された乳酸生成能を有する出芽酵母であって、乳酸存在下での乳酸生産性が顕著に向上した出芽酵母である。具体的には、乳酸耐性に関与する遺伝子が破壊されておらず、かつ乳酸生成に関与する遺伝子が導入されている出芽酵母（本明細書において「親株」と表記することがある）と比較して乳酸生産量が１０％以上高い出芽酵母である。この比較は次のような手順で行う。乳酸耐性に関与する遺伝子が２つ以上破壊されており、かつ乳酸生成に関与する遺伝子が導入された乳酸生成能を有する出芽酵母の培養は１００ｍｌ三角フラスコを用い、１０％ＹＰＤ培地（１％ＢａｃｔｏＹｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，２％Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ、１０％Ｄ−グルコース）４０ｍｌに前培養した菌液２ｍｌを添加して３０℃にて７２時間静置培養したのち、培地中のＬ−乳酸濃度（ｗ／ｖ％）を測定する。そして、対照である親株の培地中のＬ−乳酸濃度の値を１００としたときに、培地中のＬ−乳酸濃度の値が１１０以上である出芽酵母を、乳酸生産量が１０％以上高いものとして判別する。このような性質を有する出芽酵母としては、Δｄｓｅ２Δｅａｆ３、Δｄｓｅ２Δｓｃｗ１１、Δｓｃｗ１１Δｓｅｄ１又はΔｅａｆ３Δｓｅｄ１である二重遺伝子破壊株、Δｓｃｗ１１Δｅａｆ３Δｓｅｄ１である三重遺伝子破壊株、或いはΔｄｓｅ２Δｓｃｗ１１Δｅａｆ３Δｓｅｄ１である四重遺伝子破壊株が挙げられる。

本発明に係る出芽酵母の最も好ましい形態は、乳酸耐性と、乳酸生成に関与する遺伝子が導入されて乳酸生成能を持たせた場合の乳酸生産性とが両方とも向上した出芽酵母である。より具体的には、８（ｗ／ｖ）％乳酸を含む寒天培地におけるコロニー形成能を有するとともに、親株と比較して乳酸生産量が１０％以上高い出芽酵母である。このような性質を有する出芽酵母としては、Δｄｓｅ２Δｅａｆ３である二重遺伝子破壊株、Δｓｃｗ１１Δｅａｆ３Δｓｅｄ１である三重遺伝子破壊株、或いはΔｄｓｅ２Δｓｃｗ１１Δｅａｆ３Δｓｅｄ１である四重遺伝子破壊株が挙げられる。

遺伝子の破壊方法として、本明細書の実施例では、ＬＥＵ２遺伝子（ＣｇＬＥＵ２）、ＨＩＳ３遺伝子（ＣｇＨＩＳ３）などのマーカー遺伝子を該遺伝子の一部を含むような長いプライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物（遺伝子破壊用ＤＮＡ断片）で、相同組換えにより遺伝子破壊を行った。

しかし，その他の相同組換えによる遺伝子の破壊方法も使用可能である。以下にその例を示す。

（代替方法１）乳酸生成に関与する遺伝子の出芽酵母染色体への導入と同様にして破壊したい遺伝子断片を組み込んだ、出芽酵母中で自立複製不可能な組換えベクター（出芽酵母自立被製配列を保持していないベクター、例えば、ＹＩｐベクターや大腸菌由来のプラスミド）を構築する。この際、標的遺伝子のＮ末端及びＣ末端を一部削除した遺伝子断片を持つ不完全な組換えベクターを構築し標的遺伝子座に挿入すると、染色体上で２コピーの標的遺伝子が生成するが、いずれもＮ末端又はＣ末端コード部に欠失を持つようになることから、特定遺伝子の機能を失わせることが可能である。

（代替方法２）同様に標的遺伝子の機能を失わせる点変異を両端に１箇所以上持つ標的遺伝子断片を保持した組換えベクターを標的遺伝子座に導入する。染色体上で２コピーの標的遺伝子が生成するが、いずれもコード部に点変異を持つようになることから、標的遺伝子の機能を失わせることができる。

（代替方法３）本明細書中の実施例では破壊対象遺伝子の配列の４５ｂｐの部分配列を持つ組換えＤＮＡ断片を使用したが、部分配列の長さは４５ｂｐには限定されない。すなわち、４５ｂｐよりも長い破壊対象遺伝子の部分配列あるいは４５ｂｐよりも短い破壊対象遺伝子の部分配列を持つ組換えＤＮＡ断片をベクター上で構築した後、制限酵素処理で切り出して回収する、あるいはＰＣＲを繰り返して行い、破壊対象遺伝子のより長いあるいは短い部分配列を付与した細換えＤＮＡ断片を作製し、出芽酵母に導入して遺伝子破壊を行う方法を採用してもよい。

（代替方法４）また、相同組換え以外の方法でも該遺伝子の機能を欠失できれば使用可能である。これらには（１）突然変異剤を用いて点変異体を作製しスクリーニングする方法、（２）トランスポゾンを用いた挿入ライブラリーからスクリーニングする方法等がある。

遺伝子破壊の際に、破壊対象の遺伝子に挿入する遺伝子としては、遺伝子破壊株を選別するための、マーカーとなる遺伝子を用いるのが良い。これらには抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性変異を相補する（その栄養源を必要としなくなる）遺伝子などが挙げられる。

以下に本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は以下の実施例には限定されない。

１．遺伝破壊株の作製方法
ＤＳＥ２、ＳＣＷ１１、ＥＡＦ３及びＳＥＤ１からなる群から選択される遺伝子が１〜４個破壊された株の組み合わせは１５通りある。これら１５種類すべての組み合わせの多重破壊株を以下のように作製した。実験は、Ｍｅｔｈｏｄｉｎｙｅａｓｔｇｅｎｅｔｉｃｓ２００５（Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇｈａｒｂｏｒｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）に記載されている方法に従って行った。

１．１．α型のＢＹ４７４２株由来Δｄｓｅ２破壊株からΔｄｓｅ２Δｓｃｗ１１二重破壊株の構築
図２−１に示すプラスミドｐ３００８（ｐＵＧ−ＣｇＬＥＵ２）上の選択マーカーの上流と下流の配列を一部に持つＤＮＡ断片であるＳＣＷ１１フォワード（配列番号３）とＳＣＷ１１リバース（配列番号４）を合成した。ｐ３００８を鋳型として、ＳＣＷ１１フォワードとＳＣＷ１１リバースをプライマーとして、ＰＣＲ法で増幅してＳＣＷ１１遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を作製した。なおプラスミドｐ３００８はＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３８（６），９０９−９１４，２００５に基づき作製したものである。

得られた破壊用ＤＮＡ断片を用いてΔｄｓｅ２破壊株を形質転換した。Δｄｓｅ２破壊株は、ＢＹ４７４２株（ＭＡＴα ｌｅｕ２Δ０ｈｉｓ３Δ１ｕｒａ３Δ０ｌｙｓ２Δ０）のＤＳＥ２遺伝子がジェネティシン耐性遺伝子であるｋａｎＭＸ（Ｗａｃｈ，Ａ．ｅｔａｌ．；ＮｅｗｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｍｏｄｕｌｅｓｆｏｒｃｌａｓｓｉｃａｌｏｒＰＣＲ−ｂａｓｅｄｇｅｎｅｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｙｅａｓｔ．１０（１３），１７９３−１８０８（１９９４））で破壊された株であり、破壊株セット（ＢＹ４７４２株由来非必須遺伝子破壊ライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））由来の株をそのまま使用した。ロイシン非要求性の株を選抜することにより、Δｄｓｅ２Δｓｃｗ１１二重破壊株を得た。選抜した株は、ゲノムＤＮＡを調製し、図１−２に示すようなＳＣＷ１１遺伝子の上流と下流に相同性を持つＳＣＷ１１Ｆ１（配列番号１１）とＳＣＷ１１Ｒ１（配列番号１２）をプライマーとしたＰＣＲによりＳＣＷ１１遺伝子の破壊を確認した。

１．２．ａ型のＢＹ４７４１株からΔｅａｆ３Δｓｅｄ１二重破壊株の構築
図２−２に示すプラスミドｐ３００９（ｐＵＧ−ＣｇＨＩＳ３）上の選択マーカーの上流と下流の配列を一部に持つＤＮＡ断片であるＥＡＦ３フォワード（配列番号５）とＥＡＦ３リバース（配列番号６）を合成した。それら合成ＤＮＡをプライマーとして、ｐ３００９を鋳型にしてＰＣＲ法で増幅することにより、ＥＡＦ３遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を作製した。なおプラスミドｐ３００９はＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３８（６），９０９−９１４，２００５に基づき作製したものである。

得られた破壊用ＤＮＡ断片でＢＹ４７４１株（ＭＡＴａｌｅｕ２Δ０ｈｉｓ３Δ１ｕｒａ３Δ０ｍｅｔ１５Δ０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を形質転換して、ヒスチジン非要求性となった株を選抜することによりΔｅａｆ３破壊株を得た。選抜した株は、ゲノムＤＮＡを調製し、図１−２に示すようなＥＡＦ３遺伝子の上流と下流に相同性を持つＥＡＦ３Ｆ１（配列番号１３）とＥＡＦ３Ｒ１（配列番号１４）をプライマーとしたＰＣＲによりＥＡＦ３遺伝子の破壊を確認した。

次に、プラスミド（ｐＵＧ６−ｚｅｏｃｉｎ^ｒ）上の選択マーカーの上流と下流の配列を一部に持つＤＮＡ断片であるＳＥＤ１フォワード（配列番号７）とＳＥＤ１リバース（配列番号８）を合成した。それら合成ＤＮＡをプライマーとして、ｐＵＧ６−ｚｅｏｃｉｎ^ｒを鋳型にしてＰＣＲ法で増幅することにより、ＳＥＤ１遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を作製した。なおプラスミド（ｐＵＧ６−ｚｅｏｃｉｎ^ｒ）は次の手順で調製したものである。ゼオシンフォワード（配列番号１７）とゼオシンリバース（配列番号１８）をプライマーとし、ｐＰＩＣＺ−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｖ１９５−２０）を鋳型としたＰＣＲによってｚｅｏｃｉｎ^ｒ遺伝子（ゼオシン耐性遺伝子）を含む約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。次に、回収した断片をＸｈｏI／Ｂｇ１IIで消化し、ｐＵＧ６のＸｈｏI／ＢｇｌIIギャップに挿入してｐＵＧ６−ｚｅｏｃｉｎ^ｒを構築した。

得られたＳＥＤ１遺伝子破壊用ＤＮＡ断片で構築したΔｅａｆ３破壊株を形質転換して、ゼオシン耐性の株を選抜することによりΔｅａｆ３Δｓｅｄ１二重破壊株を得た。選抜した株は、ゲノムＤＮＡを調製し、図１−２に示すようなＳＥＤ１遺伝子の上流と下流に相同性を持つＳＥＤ１Ｆ１（配列番号１５）とＳＥＤ１Ｒ１（配列番号１６）をプライマーとしたＰＣＲによりＳＥＤ１遺伝子の破壊を確認した。

１．３．多重破壊株の作製
１．１．および１．２．で得られた２種類の一倍体の二重破壊株どうしをＹＰＤＡ寒天培地上で２４時間交雑させ、ジェネティシン耐性、ロイシン非要求性、ヒスチジン非要求性且つゼオシン耐性となる株を選抜することにより二倍体を単離した。
そして得られた二倍体を１２時間ＹＰＤＡ寒天培地上で生育させ、その後胞子形成培地（０．５％酢酸ナトリウム、２％アガー）に塗布し、２３℃で４日間培養して胞子形成させた。

次に「微生物遺伝学実験法」（共立出版）に記載されている方法に従って以下の操作を行った。
プレート上の菌体をかきとり０．３ｍｇ／ｍｌのＺｙｍｏｌｙａｓｅ（ＺＹＭＯＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）溶液中で５分間処理して子嚢壁を消化した。次にマイクロマニピュレータ（ＳＹＮＧＥＲＭＳＭＳＴＳＴＥＭＳＥＲＩＥＳ２００、ＳＩＮＧＥＲＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて胞子を解剖し、ＹＰＤＡプレート上で分離し３０℃で３日間培養した。このようにして合計２９子嚢１０８胞子を得た。得られた胞子を、マーカー（ロイシン要求性、ヒスチジン要求性、カナマイシン耐性、ゼオシン耐性）を指標として分類した。

その結果、表１のように全１５種類のΔｄｓｅ２、Δｓｃｗ１１、Δｅａｆ３、Δｓｅｄ１の単一又は多重破壊株が得られた。

２．６、７、８ｗ／ｖ％乳酸添加平板培地での耐性試験
表１に示す菌株を５ｍｌのＹＰＤＡ液体培地（５％ＹＰＤＢｒｏｔｈ（ＳＩＧＭＡ；２％グルコース、２％バクトペプトン、１％イーストエキストラクト含有）、０．０４％アデニン）に植菌して３０℃、１７０ｒｐｍ振とうで終夜培養した。次に、５ｍｌＹＰＤＡ液体培地に再度植菌し、ＯＤ［６６０ｎｍ］で約１．０になるまで同様に振とう培養した。その後、Ｍｅｔｈｏｄｉｎｙｅａｓｔｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）に従ってＯＤから細胞濃度を算出し、１ｘ１０^６細胞／５μｌから１ｘ１０^１細胞／５μｌまでの１０希釈系列の細胞溶液を調製した。その後、ＹＰＤＡ寒天培地（ＹＰＤＡ培地に２％アガー添加）に０、６、７、８ｗ／ｖ％となるようにＬ−乳酸（ナカライテスク）を添加した平板培地に、それぞれの細胞溶液を５μｌずつスポットして、３０℃で２４時間（０ｗ／ｖ％）、９６時間（６ｗ／ｖ％）、２６４時間（７ｗ／ｖ％）、２６４時間（８ｗ／ｖ％）保温して、乳酸耐性を確認した。
その結果を図３に示す。

３．６ｗ／ｖ％乳酸添加液体培地での生育挙動試験
それぞれの菌株を５ｍｌの試験管ＹＰＤＡ液体培地に植菌して３０℃、１７０ｒｐｍ振とうで終夜培養した。次に、８ｍｌのＹＰＤＡ液体培地或いは６％Ｌ−乳酸添加ＹＰＤＡ液体培地を含むφ１６ｍｍ試験管にＯＤ［６００ｎｍ］で０．１となるように植菌した。そして、３０℃、１７０ｒｐｍ振とう培養し、培養液用比色計ＣＯ８０００Ｂｉｏｗａｖｅ（ＷＰＡＢｉｏｃｈｒｏｍＬｉｍｉｔｅｄ，ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｃｉｅｎｃｅｐａｒｋ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて経時的に培養液のＯＤ［６００ｎｍ］を測定した。
その結果を図４に示す。

表１に示す全１５種類Δｄｓｅ２、Δｓｃｗ１１、Δｅａｆ３、Δｓｅｄ１の単一又は多重破壊株について乳酸生産能を検証するため、組換えベクターの構築、形質転換酵母の作製は以下の方法で行った。

本出芽酵母中でＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｌ−Ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ遺伝子、以下、Ｌ−ＬＤＨ遺伝子と称す）が発現可能な染色体導入用ベクター構築を行った。本実施例で検討したベクターをｐＢＨＰＨ−ＬＤＨＫＣＢベクターと名づけた。以下、本実施例におけるベクター構築工程の詳細を図６に基づいて説明するが、ベクター構築の手順はこれに限定されるものではない。なお、エタノール沈殿処理、制限酵素処理等のＤＮＡサブクローニングに関わる一連操作の詳細は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ‘ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ’（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙｐｒｅｓｓ．１９８９）に従った。また、反応に使用した一連の酵素類は、特に限定しない限りにおいては、タカラバイオ社製のものを使用した。

一般的なＤＮＡサブクローニング法に従って、プレベクターｐＨＰＨ−ＬＤＨＫＣＢベクターの構築を行った。特願２００３−３３４０９２号において構築したｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターを制限酵素ＰｓｔＩ処理を行い、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ反応により、切断末端を平滑末端化した。続いて、制限酵素ＣｌａＩ処理を行った試料を電気泳動（ＧｅｌＭａｔｅ２０００、東洋紡）し、ＴａＫａＲａＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ）によって、ベクター部分をアガロースゲルより回収した。続いて次に記載するように同様の操作により、インサート部分を回収した。具体的には、ハイグロマイシン遺伝子が酵母内で発現できるよう構築したｐＢＨＰＨ−ＰＴベクターを、制限酵素ＳｐｅＩ、Ｔ４ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、制限酵素ＣｌａＩの順で反応させ、本試料を電気泳動、ＴａＫａＲａＲＥＣＯＣＨＩＰによって、インサート部分を回収した。

上記にて回収したベクターおよびインサート断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって連結させた。ＤＮＡ連結反応は、ＬｉｇａＦａｓｔＲａｐｉｄＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ（プロメガ社製）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。また、Ｌｉｇｅｔｉｏｎ反応溶液のコンピテント細胞への形質転換には、大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡社製）を使用した。いずれの場合も、抗生物質アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有したＬＢプレート下でコロニー選抜を行い、各コロニー用いたコロニーＰＣＲ反応を行うことで、目的のベクターであるかを確認した。ＰＣＲ反応のプライマーは、下記の合成ＤＮＡ（キアゲン社製）を用い、反応粂伴は９６℃５分の処理の後、９６℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒のサイクルで２５サイクル反応させ、７２℃５分ののち、４℃で終了とした。反応液に色素を添加後、電気泳動にて増幅断片の有無を確認した。

上記ＰＣＲ反応には、以下の合成ＤＮＡをプライマーとして利用した。
ＴＤＨ３Ｐ−Ｆ；５’−ＡＧＣＧＴＴＧＡＡＴＧＴＴＡＧＣＧＴＣＡＡＣ−３’（２２ｍｅｒ）（配列番号１９）
ＣＹＣ１Ｔ−Ｒ；５’−ＡＣＡＴＧＣＧＴＡＣＡＣＧＣＧＴＴＴＧＴＡＣ−３’（２２ｍｅｒ）（配列番号２０）

構繁したベクターの塩基配列を決定した。ＬＢ培養液にて３７℃、１８時間培養した上記プラスミドを含む大腸菌を集菌し、アルカリ抽出法によってプラスミドＤＮＡを調製した。これをＧＦＸＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（ＡｍｅｒｃｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）にてカラム精製した。次に、分光光度計Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３０００（ＡｍｅｒｃｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）にてＤＮＡ濃度を測定し、ＤＮＡ塩基配列キットＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）に従ってシークエンシング反応を行った。反応試料を塩基配列解析装置ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にセットし、構築ベクターの塩基配列を決定した。なお、機器の使用方法の詳細は本装置付属のマニュアルに従った。

構築したプラスミドベクターｐＢＨＰＨ−ＬＤＨＫＣＢのマップを図７に示す。
乳酸耐性向上への関与が確認された出芽酵母へＬＤＨ遺伝子が導入された形質転換体の作製は次のように行った。各酵母をＹＰＤ培養液５ｍｌにて、３０℃で対数増殖期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．８）まで培養した。これにＦｒｏｚｅｎ−ＥＺＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｔｉｏｎＩＩキット（ＺＹＭＯＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、本コンピテントセルに上述のｐＢＨＰＨ−ＬＤＨＫＣＢを制限酵素ＡｐａＩ、ＳａｃＩ処理し、遺伝子導入した。これらの形質転換試料を洗浄後、１ｍｌのＹＰＤ培養液にて一晩、回復培養を実施し、これを集菌、洗浄後、１００μｌの減菌水に溶解させた。本試料をハイグロマイシン濃度１５０μｇ／ｍｌのＹＰＤ培地に塗沫し、それぞれについて３０℃静置培養下で形質転換体の選抜を行った。

得られたそれぞれのコロニーを同濃度のハイグロマイシン選抜培地で再度単離し、生育能を安定に保持している株を形質転換候補株とした。次に、これらの候補株をＹＰＤ培養液２ｍｌで一晩培養し、これにゲノムＤＮＡ調製キット、ＧＥＮとるくん^ＴＭ−酵母用−（タカラバイオ社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。調製した各ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ解析を行い、導入遺伝子の有無が確認できたものを形質転換株とした。ＰＣＲ反応のプライマーは、下記の合成ＤＮＡ（キアゲン社製）を用い、反応条件は９６℃５分の処理の後、９６℃３０秒、５３℃３０秒、７２℃６０秒のサイクルで４０サイクル反応させ、７２℃５分ののち４℃で終了とした。反応液に色素を添加後、電気泳動にて増幅断片の有無を確認した。

上記ＰＣＲ反応には、以下の合成ＤＮＡをプライマーとして利用した。
ＬＤＨ−Ｆ；５’−ＡＴＧＧＣＴＡＣＴＴＴＧＡＡＡＧＡＴＣ−３’（１９ｍｅｒ）（配列番号２１）
ＬＤＨ−Ｒ；５’−ＴＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＴＴＣＴＴＴＴＴＧ−３’（２４ｍｅｒ）（配列番号２２）

以上のようにして作製した形質転換酵母をそれぞれＹＰＤ液体培地５ｍｌに植菌し、３０℃、１３０ｒｐｍにて一晩、振盪培養を行い、ＯＤ６００ｎｍ＝１．２のものを初発菌体とした。このうちの２ｍｌを１０％グルコース含有ＹＰＤ培養液４０ｍｌにそれぞれ植菌し、３０℃の恒温槽（ヤマト社製）にて、３日間、静置条件下で発酵させた。

７２時間後の発酵液を採取し、本溶液中に含まれるＬ−乳酸生産量（ｗ／ｖ％）、エタノール生産量およびグルコース残存量を測定した。測定には、多機能バイオセンサＢＦ−５装置（王子計測機器社製）を用い、仕様の詳細は付属のマニュアルに従った。
測定の結果を図５に示す。

各遺伝子を破壊するための断片を作製するためのプライマーを示す図である。下線部は鋳型プラスミドとのアニーリング部位を指す。各遺伝子が破壊されているか否かを確認するために使用する、各遺伝子を増幅するためのプライマーを示す図である。ｐＵＧ−ｚｅｏｓｉｎ^ｒ構築用プライマーを示す図である。プラスミドｐ３００８（ｐＵＧ−ＣｇＬＥＵ２）の構築図である。プラスミドｐ３００９（ｐＵＧ−ＣｇＨＩＳ３）の構築図である。培地中の乳酸濃度とコロニーの形成との関係を示す図である。各遺伝子破壊株の増殖の経時変化を示す図である。乳酸生成能を有する各遺伝子破壊株のL-乳酸生産量を示す図である。プラスミドベクターの構築方法を示す図である。プラスミドベクターｐＢＨＰＨ−ＬＤＨＫＣＢのマップを示す図である。

配列番号１〜２２：合成ＤＮＡ：プライマー

Claims

Δdse2Δeaf3、Δscw11Δeaf3、Δdse2Δeaf3Δsed1、Δscw11Δeaf3Δsed1、又はΔdse2Δscw11Δeaf3Δsed1である多重遺伝子破壊株であることを特徴とする出芽酵母。
乳酸生成に関与する遺伝子が導入されており、かつΔdse2Δeaf3、Δdse2Δscw11、Δscw11Δsed1、Δeaf3Δsed1、Δscw11Δeaf3Δsed1、又はΔdse2Δscw11Δeaf3Δsed1である多重遺伝子破壊株であることを特徴とする出芽酵母。
出芽酵母においてΔdse2Δeaf3、Δscw11Δeaf3、Δdse2Δeaf3Δsed1、Δscw11Δeaf3Δsed1、又はΔdse2Δscw11Δeaf3Δsed1となるように遺伝子を破壊することにより出芽酵母に乳酸耐性を付与する方法。
出芽酵母においてΔdse2Δeaf3、Δdse2Δscw11、Δscw11Δsed1、Δeaf3Δsed1、Δscw11Δeaf3Δsed1、又はΔdse2Δscw11Δeaf3Δsed1となるように遺伝子を破壊するとともに乳酸生成に関与する遺伝子を導入することにより出芽酵母に乳酸生産性を付与する方法。