JP6771422B2 - 免疫グロブリン断片を用いたヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤 - Google Patents

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Description

本発明は、ヒト卵胞刺激ホルモン結合体を含む生体内持続性及び安定性が向上したヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤、並びにその製造方法に関する。本発明は、個体の生殖能力を向上させる方法、又は不妊などの生殖障害を有する個体を治療する方法を提供する。
一般に不妊とは、結婚後に円満な夫婦関係を維持して一定期間経過しても妊娠できない状態をいい、この一定期間を通常は１年とするが、場合によっては２〜３年とすることもある。一般的には結婚後１年以内に約８５％が妊娠し、妊娠の可能性は結婚１カ月以内が約２５％、６カ月以内が約７０％、１年以内が約８５％という調査結果が報告されている。男女の妊娠能力は男女どちらも２４才に最高となり、その後５年毎に妊娠にかかる時間が２倍ずつ増加する。３５才以後の妊娠能力は急激に低下する。
不妊の原因は、一方に又は双方にあり得る。男性に不妊の原因がある場合を男性不妊症といい、女性に不妊の原因がある場合を女性不妊症という。統計的には、男性不妊症又は女性不妊症が合計７０％、男性不妊と女性不妊が複合している場合が約２０％、その他に原因不明の要因が約１０〜１５％である。
不妊治療剤市場は全世界的に２００６年に１０億ドルを越え、毎年６％代の成長率を示しており、２０１１年には１２億ドルを超えると予想されている。韓国国内市場の場合、２００６年の９０億から２００７年の１２０億へと急激な成長を示しており、今後５年間は目を見張る成長の可能性を秘めていると予想される。
不妊治療剤は別名***誘導剤ともいい、代表的な***誘導剤はヒト卵胞刺激ホルモン（ｈｕｍａｎ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）である。これは脳下垂体で産生されて内分泌系から分泌されるホルモンであり、それぞれ９２個と１１１個のアミノ酸で構成されたアルファサブユニットとベータサブユニットが非共有結合により連結されており、各サブユニットは２つのアスパラギンにより連結される糖鎖を有する糖タンパク質ホルモンである（Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ，１９９６：２（５）：３７１−３８２）。女性の場合は、卵胞刺激ホルモンの産生又は分泌の程度が不十分であると***誘導が正常に行われなくて不妊の原因となり、男性の場合は、正常かつ十分な数の***形成が制限されると不妊の原因となる。よって、このような患者の治療のために卵胞刺激ホルモンが用いられるようになり、最初は女性の尿から卵胞刺激ホルモンを分離、精製して用いていた。他の多くのタンパク質製剤と同様に、特に安全性の問題が台頭し、現在は市場の８０％以上が組換え製品に代替されている。代表的な製品として、メルクセローノ（ＭＳＤ）の「ゴナールエフ（Ｇｏｎａｌ−Ｆ）」や、オルガノン（Ｏｒｇａｎｏｎ）の「ピュレゴン（Ｐｕｒｅｇｏｎ）」などがある。
女性不妊の原因は、***障害と卵管閉塞がそれぞれ３５％を占め、子宮内膜症が２０％、正確な原因が把握されない場合が１０％であることが知られている。女性不妊の治療のために用いられる補助生殖技術には、体外受精（ＩＶＦ−ＥＴ）、配偶子卵管内移植（ＧＩＦＴ）、接合子卵管内移植（ＺＩＦＴ）、卵細胞質内***注入法（ＩＣＳＩ）などがある。これらのプログラムの進行のためには***誘導が必要であり、その際に用いられるのがヒト卵胞刺激ホルモンである。また、無***症を患う女性にもこのホルモンは用いられている。男性不妊の原因は、大きく***異常と解剖学的要因による異常に分けられ、***異常の場合はヒト卵胞刺激ホルモンが治療のために用いられることがある。
補助生殖技術による女性不妊のための治療にＦＳＨが用いられる場合は、一般に***周期開始後２〜３日目から毎日１５０ＩＵ〜２２５ＩＵ単位で投与し始め、最大で毎日４５０ＩＵまで投与することができ、適切な卵胞発達に至るまで、短くは５日、長くは２０日ほど投与する。無***症に適用する際は、７５〜１５０ＩＵ単位で始め、必要に応じて７日又は１４日間隔で３７．５ＩＵ又は７５ＩＵ単位、最大で１日２２５ＩＵまで投与し、最長で４週間まで投与する。男性不妊にＦＳＨが用いられる場合は、週３回の間隔で１５０ＩＵ単位、最大で３００ＩＵまで投与し、最長で１８カ月まで投与する。
現在用いられている組換えヒト卵胞刺激ホルモンは、過去の尿由来のヒト卵胞刺激ホルモンに比べて、製造時の低い精製収率、供給の不安定性、及び特に安全性の面で明らかに改善されている。しかし、未だ患者の利便性の面では、治療期間中に１０回以上、毎日投与を受けなければならないという不便があり、男性患者の場合は最長で１８カ月まで治療を受けなければならないので、多くの投与量に伴う経済的負担が大きな欠点として挙げられる。このような不妊治療は、女性、男性の両方で妊娠に至るまで持続的に行われなければならない。よって、投与回数を減らせば減らすほど患者の利便性が増大し、コスト面でも少ない用量で少ない投与であるほど有利になると期待されるので、他のタンパク質製品の開発戦略と同様に持続型製品が切実に求められている。
このようなニーズに応えるべく、持続型製品についての研究が始められ、ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ＦＳＨ（ＭｅｒｃｋＳｅｒｏｎｏ社）やＣＴＰ（ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を含むＦＳＨ−ＣＴＰ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−ｐｌｏｕｇｈ社）剤形の臨床試験が行われている。そのうち、ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ＦＳＨは、天然型ＦＳＨの短い半減期を克服するために、アミノ酸の一部を置換して高糖鎖ＦＳＨを開発（ＷＯ−２００５０２０９３４）して臨床２相を行っているが、増加した半減期が天然型の２倍にはならないので、ＦＳＨ−ＣＴＰ（ｃｏｒｉｆｏｌｌｉｔｒｏｐｉｎ ａｌｆａ）より半減期が短く、アミノ酸の変形により免疫学的問題を引き起こすことが報告されている。ＦＳＨ−ＣＴＰ（ＵＳ５５８５３４５）は、ＦＳＨなどの性腺刺激ホルモンの１つである絨毛性腺刺激ホルモン（ｈｕｍａｎ ｃｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）のベータサブユニットのｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅをＦＳＨのベータサブユニットのＮ末端に連結したものである。ＣＴＰは、構成アミノ酸のうち４つのｓｅｒｉｎ残基がグリコシル化されており、ＦＳＨに比べてｈＣＧの血中半減期を大幅に増加させることが知られている（Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ， ２００２： １７（８）： １９８７−１９９３）。現在、シェリング・プラウ（ｓｃｈｅｒｉｎｇ−ｐｌｏｕｇｈ）により臨床３相試験が行われており、女性患者の補助生殖プログラムに関して試験を行った結果、効能は従来のＦＳＨと同程度であり、薬を投与された女性が妊娠する確率は従来の製品と持続型製品のどちらも約３８％であり、１週間製剤までのみ可能であると報告されている。しかし、前述した通り、患者によって差があるが、卵胞が発達するのに通常約１０日かかる。補助生殖プログラムで１週間製剤を用いる場合、さらに数回の天然型ＦＳＨの投与を必要とする。また、ＦＳＨ−ＣＴＰは、初期投与量が天然型ＦＳＨの１週間総量より多いので、過剰卵巣刺激症候群などの副作用を引き起こす可能性が高い。
そこで、本発明者らは、ヒト卵胞刺激ホルモンの血中半減期の増加及び生体内活性の維持を同時に最大化する方法として、免疫グロブリンＦｃ領域、二末端又は三末端の反応基を有する非ペプチド性重合体、及び卵胞刺激ホルモンを共有結合によりＮ末端以外のアミノ酸残基に部位選択的に又はＮ末端に互いに連結させる製造方法を用いると、結合体の生体内の効力持続効果が画期的に増加することを確認して本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、ヒト卵胞刺激ホルモンの生体内活性を維持しながらも血中半減期を延長させて一層優れたヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤及びその製造方法を提供することにある。
本発明のヒト卵胞刺激ホルモン結合体は、糖タンパク質の生体内活性が比較的高く維持され、血中半減期が大幅に増加する効果がある。
ヒト卵胞刺激ホルモンを精製するための染料親和性クロマトグラフィーの結果である。 ヒト卵胞刺激ホルモンを精製するための疎水性クロマトグラフィーの結果である。 ヒト卵胞刺激ホルモンを精製するためのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果である。 ヒト卵胞刺激ホルモンを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィーの結果である。 （ａ）〜（ｃ）は、精製されたヒト卵胞刺激ホルモンをサイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、及び等電点電気泳動ゲルで分析した結果である。 両末端を有する非ペプチド性重合体から作成したヒト卵胞刺激ホルモン−３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を分析した結果である。 両末端を有する非ペプチド性重合体から作成したヒト卵胞刺激ホルモン−３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の純度をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した結果である。 三末端を有する非ペプチド性重合体から作成したヒト卵胞刺激ホルモン−３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の純度をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した結果である。 （ａ）および（ｂ）は、持続型及び天然型ヒト卵胞刺激ホルモンのｉｎ ｖｉｖｏ効力試験の比較結果である。 持続型ヒト卵胞刺激ホルモンとＣＴＰ−フュージョンヒト卵胞刺激ホルモンのｉｎ ｖｉｖｏ効力試験の比較結果である。 両末端を有する重合体と三末端を有する重合体を用いて作成されたヒト卵胞刺激ホルモンのｉｎ ｖｉｖｏ効力試験の比較結果である。 持続型ヒト卵胞刺激ホルモン製剤のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態確認試験の結果である。 （ａ）および（ｂ）は、ヒト卵胞刺激ホルモンのベータ・チェーンに８０％以上ペグ化された結果を確認するために逆相カラムを用いて分析した結果である。 ヒト卵胞刺激ホルモンのベータサブユニットへの結合を分析した結果である。
上記目的を達成するための一態様として、本発明は、ヒト卵胞刺激ホルモン及び免疫グロブリンＦｃ領域が二末端又は三末端に反応基を有する非ペプチド性重合体を介して互いに共有結合により連結されたヒト卵胞刺激ホルモン結合体を含む、生体内持続性及び安定性が増加したヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤を提供する。
本発明において用いられるヒト卵胞刺激ホルモンは、脳下垂体で産生されて内分泌系から分泌される糖タンパク質ホルモンであり、卵巣で卵胞の生産、発達及び成熟を刺激する機能を有する。アルファサブユニットとベータサブユニットのアミノ酸配列は次の通りである。
アルファサブユニット
ＡＰＤＶＱＤＣＰＥＣＴＬＱＥＮＰＦＦＳＱＰＧＡＰＩＬＱＣＭＧＣＣＦＳＲＡＹＰＴＰＬＲＳＫＫＴＭＬＶＱＫＮＶＴＳＥＳＴＣＣＶＡＫＳＹＮＲＶＴＶＭＧＧＦＫＶＥＮＨＴＡＣＨＣＳＴＣＹＹＨＫＳ（配列番号１）
ベータサブユニット
ＮＳＣＥＬＴＮＩＴＩＡＩＥＫＥＥＣＲＦＣＩＳＩＮＴＴＷＣＡＧＹＣＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴＦＫＥＬＶＹＥＴＶＲＶＰＧＣＡＨＨＡＤＳＬＹＴＹＰＶＡＴＱＣＨＣＧＫＣＤＳＤＳＴＤＣＴＶＲＧＬＧＰＳＹＣＳＦＧＥＭＫＥ（配列番号２）
具体的な一態様によれば、本発明において用いたヒト卵胞刺激ホルモンは、動物細胞を用いた組換えタンパク質生産方法で生産することができる。
また、本発明において、ヒト卵胞刺激ホルモンは、様々な部位で非ペプチド性重合体に結合される。例えば、アルデヒド反応基は、低いｐＨではＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリシン残基とも共有結合を形成することができる。反応ｐＨを変えてペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）反応を進めると、イオン交換カラムを用いて反応混合物から位置異性体を分離することができる。
Ｎ末端以外の位置にカップリングする場合、天然アミノ酸配列において修飾しようとするアミノ酸残基の位置に反応性チオール基を導入すると、非ペプチド性重合体のマレイミドリンカーを用いて共有結合を形成することができる。
非ペプチド性重合体にアルデヒドリンカーを用いると、Ｎ末端とリシン残基にあるアミノ基と反応し、選択的に反応収率を向上させるために変形した形態のヒト卵胞刺激ホルモンを使用できる。例えば、Ｎ末端をブロックする方法、リシン残基を置換する方法、Ｃ末端にアミノ基を導入する方法などを用いると、１つの反応するアミノ基を希望の位置に維持することができ、ペグ化及びカップリング収率を向上させることができる。Ｎ末端の保護方法としては、ジメチル化（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）以外にも、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）方法などが可能であり、こららのアルキル化（ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ）方法に限定されるものではない。
本発明の好ましい態様において、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン結合体は、卵胞刺激ホルモンのＮ末端に特異的に免疫グロブリンＦｃ領域が結合されたヒト卵胞刺激ホルモン結合体である。ヒト卵胞刺激ホルモンのアルファサブユニットとベータサブユニットのＮ末端は受容体との結合に関与しないので、本発明は、ヒト卵胞刺激ホルモンのＮ末端に特異的にＦｃ領域を結合させることにより、ヒト卵胞刺激ホルモンの活性を維持しながらも生体内の半減期が増加する優れた効果を有することを確認した。
本発明において、「活性」という用語は、ヒト卵胞刺激ホルモンがヒト卵胞刺激ホルモン受容体に結合してヒト卵胞刺激ホルモンとして作用することを意味する。
このようなＮ末端特異的結合体の製造はｐＨ調整により行われ、好ましいｐＨ範囲は４．５〜７．０である。
本発明において、「Ｎ末端」という用語は、「Ｎ末端領域」という用語と混用される。
具体的な一実施例として、本発明者は、ヒト卵胞刺激ホルモンのＮ末端に選択的にカップリングする方法として、二末端の反応基を有する非ペプチド性重合体を用いる場合は、天然型ヒト卵胞刺激ホルモンにＰＥＧを結合させる際にｐＨ６．０で反応させてＮ末端のペグ化反応を誘導した。他の方法として、三末端の反応基を有する非ペプチド性重合体を用いる場合は、ヒト卵胞刺激ホルモンにＰＥＧを結合させる際にモル比を変えてｐＨ６．０で反応を誘導した。三末端を有する非ペプチド性重合体を用いる場合は、両末端を有する非ペプチド性重合体を用いる場合より、ＰＥＧの使用量が減少するので、収率を増加させることができる。
免疫グロブリンＦｃ領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるので、薬物のキャリアとして安全に使用できる。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、全免疫グロブリン分子に比べて相対的に分子量が小さいので、結合体の製造、精製及び収率の面で有利である。アミノ酸配列が抗体毎に異なるので、高い非均質性を示すＦａｂ部分を除去することにより、物質の同質性が大幅に増加し、血中抗原性の誘発可能性が低くなるという効果も期待することができる。
本発明において、「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除いたものであり、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び重鎖不変領域３（ＣＨ３）部分を含むタンパク質を意味する。ここで、重鎖不変領域にヒンジ（ｈｉｎｇｅ）部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に該当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）１つ又は２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体（ｍｕｔａｎｔ）をも含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２又は３２７〜３３１番のアミノ酸残基が変形のために適当な部位として用いられる。また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されるか、天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されるか、又は天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されるなど、様々な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、国際公開第９７／３４６３１号、国際公開第９６／３２４７８号などに開示されている。
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知である（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。
場合によっては、Ｆｃ領域はリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、アミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）などにより修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。
前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同じ生物学的活性を示すが、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させた誘導体である。
また、このようなＦｃ領域は、ヒト、及びウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの他の動物の生体内から分離した天然型から得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換え型又はその誘導体であってもよい。ここで、天然型から得る方法は、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素を処理して得ることができる。パパインを処理するとＦａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンを処理するとｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）２に切断される。これらの断片は、サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。ヒト由来のＦｃ領域は、微生物から得られた組換え型免疫グロブリンＦｃ領域であることが好ましい。
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法、微生物を用いた遺伝工学的方法などの通常の方法が用いられる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）の結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞毒性又は補体依存性細胞毒性が低下又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域は、薬物のキャリアとして本来の目的に適する。
本発明において、「糖鎖の除去（Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域を意味し、「非グリコシル化（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」とは、原核生物、好ましくは大腸菌から産生されてグリコシル化されていないＦｃ領域を意味する。
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来、又はそれらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）もしくはそれらのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）によるＦｃ領域であってもよい。ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来であることが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが知られているＩｇＧ由来であることが最も好ましい。
本発明において、「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合して二量体又は多量体を形成することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃ断片からなる群から選択される２つ以上の断片から二量体又は多量体を製造することができる。
本発明において、「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」とは、２つ以上の異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が単鎖免疫グロブリンＦｃ領域内に存在することを意味する用語である。本発明においては、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から選択される１つ〜４つのドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含んでもよい。
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けられ、本発明においては、それらの組み合わせ又はそれらのハイブリッド化も可能である。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであることが好ましく、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ， Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などのエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）のほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域であることが最も好ましい。すなわち、本発明の薬物のキャリアとして最も好ましい免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域である。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒト生体において抗原として作用し、それに対する新規な抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こす非ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましい。
本発明において、「非ペプチド性重合体」とは、繰り返し単位が２つ以上結合された生体適合性重合体を意味し、前記繰り返し単位はペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに連結される。
本発明に使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸， ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸， ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、好ましくはポリエチレングリコールである。当該分野に知られたこれらの誘導体や当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体も本発明に含まれる。
従来のインフレームフュージョン（ｉｎｆｒａｍｅ ｆｕｓｉｏｎ）方法で製造された融合タンパク質に用いられていたペプチド性リンカーの欠点は、生体内でタンパク質分解酵素により容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血中半減期の増加効果を期待したほど得られないということである。しかし、本発明においては、タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体を用いるので、キャリアと同様にペプチドの血中半減期を維持することができる。よって、本発明において用いられる非ペプチド性重合体は、このような役割を果たすもの、すなわち生体内のタンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であれば限定されることなく用いられる。非ペプチド性重合体の分子量は、１〜１００ｋＤａの範囲、好ましくは１〜２０ｋＤａの範囲である。また、前記免疫グロブリンＦｃ領域に結合される本発明の非ペプチド性重合体は、１種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが用いられてもよい。
本発明に用いられる非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃ領域及びタンパク質薬物に結合される反応基を有する。
前記非ペプチド性重合体の両末端反応基は、反応アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）基及びスクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）誘導体からなる群から選択されることが好ましい。ここで、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネートが用いられる。特に、前記非ペプチド性重合体が２つの両末端又は三末端に反応アルデヒド基の反応基を有する場合、非特異的反応を最小限に抑え、非ペプチド性重合体の両末端で生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンとそれぞれ結合するのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合により連結されたものよりはるかに安定的である。アルデヒド反応基は、低いｐＨではＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリシン残基と共有結合を形成することができる。
前記非ペプチド性重合体の二末端反応基又は三末端反応基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。例えば、一末端にはマレイミド基、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、又はブチルアルデヒド基を有してもよい。両末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合、公知の化学反応により前記ヒドロキシル基を前述した様々な反応基として活性化してもよく、商業的に入手可能な変形した反応基を有するポリエチレングリコールを用いて本発明のヒト卵胞刺激ホルモン結合体を製造してもよい。
このような本発明のヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤は、女性においては卵胞の生成、発達及び成熟を促進し、男性においては***形成を誘導するというヒト卵胞刺激ホルモンの生体内活性が維持されるだけでなく、ヒト卵胞刺激ホルモンの血中半減期及びそれによるヒト卵胞刺激ホルモンの生体内の効力持続効果を画期的に増加させる。よって、不妊治療のための補助生殖技術である体外受精（ＩＶＦ−ＥＴ）、配偶子卵管内移植（ＧＩＦＴ）、接合子卵管内移植（ＺＩＦＴ）、及び卵細胞質内***注入法（ＩＣＳＩ）又は試験管ベビー技術と、無***症、低性腺刺激ホルモン性性腺機能低下症及び多嚢胞性卵巣症候群の治療とに有用である。
本発明の持続性製剤は、生体内持続性及び安定性を維持する上で優れた効果がある。本発明の具体的な実施例によれば、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤は、天然型ヒト卵胞刺激ホルモンに比べて半減期が約１０倍近く増加した（表２）。
本発明の持続性製剤は、薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。薬学的に許容される担体としては、経口投与の場合は結合剤、潤滑剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いてもよい。薬学的に許容される担体としては、注射剤の場合は緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いてもよい。薬学的に許容される担体としては、局所投与用の場合は基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを用いてもよい。
本発明の持続性製剤は、前述した薬学的に許容される担体と混合して様々な形態に製造してもよい。例えば、持続性製剤は、経口投与の場合は錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態に製造してもよい。持続性製剤は、注射剤の場合は使い捨てアンプル又は複数回投薬形態に製造してもよい。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放型製剤などに剤形化してもよい。
製剤化に適する担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などを用いてもよい。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含んでもよい。
本発明による持続性製剤は、不妊治療のための補助生殖技術である体外受精（ＩＶＦ−ＥＴ）、配偶子卵管内移植（ＧＩＦＴ）、接合子卵管内移植（ＺＩＦＴ）、卵細胞質内***注入法（ＩＣＳＩ）又は試験管ベビー技術と、無***症、低性腺刺激ホルモン性性腺機能低下症及び多嚢胞性卵巣症候群（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ ｏｖａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療とに有用であるため、本発明による持続性製剤を投与することにより、前記疾患の治療を図ることができる。
本発明において、「投与」とは、所定の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味する。本発明の持続性製剤は、製剤が標的組織に送達されるものであれば、いかなる一般的な経路を介して投与してもよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などであるが、これらに限定されるものではない。しかし、経口投与の場合はペプチドが消化されるので、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化することが好ましい。
注射剤の形態で投与されることが好ましい。また、持続性製剤は、活性物質を標的細胞に送達することのできる任意の装置により投与することができる。
また、本発明の持続性製剤は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、並びに疾患の重篤度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類により決定される。本発明の薬学的組成物は、生体内持続性及び力価に優れるので、本発明の薬学的製剤の投与回数及び頻度を著しく減少させることができる。
他の態様として、本発明は、（１）両末端にアルデヒド、マレイミド又はスクシンイミド誘導体反応基を有する非ペプチド性重合体を用いてヒト卵胞刺激ホルモンのアミノ基又はチオール基に共有結合により連結する段階と、（２）前記（１）の反応混合物からＮ末端以外の位置に非ペプチド性重合体が共有結合したヒト卵胞刺激ホルモンを含む連結体を分離する段階と、（３）分離した連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びヒト卵胞刺激ホルモンに結合された結合体を生成する段階とを含むヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の製造方法を提供する。
本発明において、用語「連結体」とは、非ペプチド性重合体とヒト卵胞刺激ホルモンのみが共有結合により連結された中間体であり、後に連結体中の非ペプチド性重合体のヒト卵胞刺激ホルモンが連結されていない他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を結合させる。
好ましい一態様として、本発明は、（１）両末端にアルデヒド反応基を有する非ペプチド性重合体をヒト卵胞刺激ホルモンのリシン残基に共有結合により連結する段階と、（２）（１）の反応混合物からリシン残基に非ペプチド性重合体が共有結合したヒト卵胞刺激ホルモンを含む連結体を分離する段階と、（３）分離した連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びヒト卵胞刺激ホルモンに結合されたタンパク質結合体を生成する段階とを含むヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の製造方法を提供する。（１）の非ペプチド性重合体及びヒト卵胞刺激ホルモンのリシン残基は、ｐＨ７．５以上で連結されることがより好ましい。
好ましい他の態様として、本発明は、（１）三末端の反応基を有する非ペプチド性重合体の二末端反応基を免疫グロブリンＦｃのＮ末端アミノ基に共有結合により連結する段階と、（２）（１）で製造された反応混合物から非ペプチド性重合体に連結した免疫グロブリンＦｃを含む連結体を分離する段階と、（３）分離した連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端にヒト卵胞刺激ホルモンを共有結合により連結する段階とを含むヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の製造方法を提供する。
好ましいさらに他の態様として、本発明は、前記持続性製剤を個体に投与する段階を含む、生殖障害を有する個体を治療する方法を提供する。前記生殖障害は不妊であることが好ましい。
また、好ましいさらに他の態様として、本発明は、薬学的に有効な量の前記持続性製剤を投与する段階を含む、個体の生殖能力を向上させる方法を提供する。
ここで、個体は、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタなどの哺乳類であってもよい。
以下、下記実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
ヒト卵胞刺激ホルモンの産生
ヒト卵胞刺激ホルモンを産生するために、産生細胞株であるＨＭＦＳ１２６（寄託番号ＫＣＴＣ１１５２９ＢＰ）細胞株を、無血清培地を用いて総体積７．５Ｌ、実産生体積５Ｌの動物細胞用生物反応器で培養してヒト卵胞刺激ホルモンを産生した。産生方法を簡単に説明すると次の通りである。まず、生物反応器で培養を始めるために必要な細胞数を確保するために、冷凍保管されている細胞株を解凍し、総体積２５０ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコで３０ｍｌの無血清培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＨＯ ｍｅｄｉｕｍ，ＳＡＦＣ，Ｃａｔ．＃６３２２５Ｃ）を用いて培養を始め、２日毎に継代培養した。１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように生物反応器に接種し、細胞数を拡張した。連続培養方法により、生物反応器で無血清培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＨＯ ｍｅｄｉｕｍ，ＳＡＦＣ，Ｃａｔ．＃６３２８９Ｃ）を用いて細胞数が１００×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上になるように３７℃で培養した。その後、温度を３０．５℃に降下させ、１ｍＭ酪酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒａｔｅ，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃ Ｂ−５８８７）を添加して約２０日間培養し、ヒト卵胞刺激ホルモンを産生した。産生期間中は継続して無血清培地を一定速度で添加し、添加した分だけ反応器から流出する培養上澄液を２４時間毎に回収して遠心分離した。その後、限外濾過膜（ＳＡＲＴＯＣＯＮ Ｓｌｉｃｅ Ｃａｓｓｅｔｔｅ，ＰＥＳＵ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，ＭＷＣＯ １０Ｋ）を１Ｌの１Ｎ ＮａＯＨで１時間以上洗浄し、５Ｌの滅菌水を用いて最終洗浄した。ヒト卵胞刺激ホルモンの発現培養液を注入して２０倍に濃縮した。ここで、卵胞刺激ホルモンの損失はほとんどなく、濃縮された卵胞刺激ホルモンの最終濃度は０．１ｍｇ／ｍｌに維持された。１バッチが終了するまで濃縮された発現培養液を−２０℃の冷凍状態で保管し、バッチが終了すると回収して精製した。
［実施例２］
染料親和性クロマトグラフィー段階
染料親和性クロマトグラフィー段階のために、濃縮されたヒト卵胞刺激ホルモン培養液に、最終濃度が５０ｍＭになるように１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．０）バッファを添加し、その後最終濃度が０．２Ｍになるように３．５Ｍ塩化カリウム溶液を順次添加した。各溶液が添加された培養液を０．４５μｍ（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２ ３００，Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｃａｐｓｕｌｅ，０．８＋０．４５μｍ）の濾過フィルタで最終濾過して染料親和性クロマトグラフィーに負荷した。本発明においては、染料親和性クロマトグラフィーとしてブルーセファロース（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）レジンが充填されたカラムを用い、負荷された試料は平衡及び洗浄バッファＡ（５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．０）＋０．２Ｍ塩化カリウム）と溶出バッファＢ（５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．０）＋２．５Ｍ塩化カリウム）溶液を用いて定組成溶離（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ）によりタンパク質を溶出した。（図１）
［実施例３］
疎水性クロマトグラフィー段階
染料親和性クロマトグラフィー段階で溶出した試料に、最終的に１００ｍＭになるように１Ｍトリス（ｐＨ７．０）バッファを添加して試料のｐＨを約８．０に補正し、その後疎水性クロマトグラフィーに負荷した。本発明においては、疎水性クロマトグラフィーとしてソース１５ＰＨＥ（Ｓｏｕｒｃｅ １５ ＰＨＥ，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）レジンが充填されたカラムを用い、負荷された試料は溶媒Ａ（１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）＋１Ｍ硫酸アンモニウム）から溶媒Ｂ（１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）＋２０％イソプロパノール）になるように６カラム容量で線形濃度勾配によりタンパク質を溶出した。（図２）
［実施例４］
限外濾過を用いたヒト卵胞刺激ホルモンの濃縮及び定溶濾過段階
限外濾過膜（ＳＡＲＴＯＣＯＮ Ｓｌｉｃｅ Ｃａｓｓｅｔｔｅ，ＰＥＳＵ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，ＭＷＣＯ １０Ｋ）を１Ｌの１Ｎ
ＮａＯＨと５Ｌの滅菌水を用いて洗浄し、その後疎水性クロマトグラフィー溶出液を希釈バッファ（１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０））で３倍に希釈して濃縮及び定溶濾過した。最終の定溶濾過希釈倍数は１０００倍となり、濃縮されたヒト卵胞刺激ホルモンの最終濃度は約１ｍｇ／ｍｌとなり、限外濾過膜の分離能（ＭＷＣＯ）は１０Ｋのサイズが用いられた。
［実施例５］
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー段階
１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）溶液で定溶濾過されて１ｍｇ／ｍｌの濃度まで濃縮された試料をセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに負荷した。本発明においては、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとしてマクロプレップセラミックヒドロキシアパタイトタイプ１（Ｃｅｒａｍｉｃ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ １ ８０μｍ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）レジンが充填されたカラムを用い、濃縮された試料は溶媒Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０））で平衡化された状態のカラムに負荷された。その後、カラムに吸着せずに溶出するフロースルー分画にヒト卵胞刺激ホルモンが含まれる溶出液を回収し、溶媒Ｂ（５００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０））でカラムに吸着したヒト卵胞刺激ホルモン以外のタンパク質を溶出、除去した。（図３）
［実施例６］
限外濾過及びエタノール処理段階
限外濾過膜（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２ ＰＬＣＣＣ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社，ＭＷＣＯ ５Ｋ）を０．５Ｌの０．１Ｎ ＮａＯＨと２Ｌの滅菌水を用いて洗浄し、その後ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから得られたヒト卵胞刺激ホルモンを２ｍｇ／ｍｌの濃度まで濃縮した。濃縮したヒト卵胞刺激ホルモンは、濃縮した試料と同じ体積の１００％エタノール溶液と混ぜて常温で恒温処理した。恒温処理において、卵胞刺激ホルモンの濃度は１ｍｇ／ｍｌ、エタノールの濃度は５０％となるようにし、常温で３時間ゆっくり攪拌しながら恒温処理した。
［実施例７］
陰イオン交換クロマトグラフィー段階
エタノール処理段階を経たヒト卵胞刺激ホルモンは、サイズ排除クロマトグラフィーにより１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）バッファでバッファ交換し、溶媒Ａ（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５））で平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーに負荷された。陰イオン交換クロマトグラフィーとしてはソース１５Ｑ（Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）レジンが充填されたカラムが用いられ、負荷された試料は溶媒Ａと溶媒Ｂ（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）＋１Ｍ塩化ナトリウム）を用いて溶媒Ｂの濃度が４０％となるように１０カラム容量で線形濃度勾配によりタンパク質を溶出した。（図４）
［実施例８］
精製されたヒト卵胞刺激ホルモンの分析
４段階のカラムクロマトグラフィーを経て精製されたヒト卵胞刺激ホルモンは、ＥＰに記載された卵胞刺激ホルモンの試験法に従って確認及び純度確認試験を行った。ヒト卵胞刺激ホルモンの純度はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ，ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、逆相クロマトグラフィー、免疫ブロッティング、質量分析試験などにより卵胞刺激ホルモンの物質確認試験を行い、等電点電気泳動（ＩＥＦ，Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｆｏｃｕｓｉｎｇ）によりグリコシル化の程度を測定した。宿主由来ＤＮＡ及びタンパク質定量を行った。［図５（ａ）〜（ｃ）］
［実施例９］
ヒト卵胞刺激ホルモンのペグ化（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）と精製
３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を２つ有するＰＥＧ，ＩＤＢ Ｉｎｃ．，韓国）を、実施例７で得て実施例８で確認されたヒト卵胞刺激ホルモンのベータ・チェーンに８０％以上ペグ化するために、ヒト卵胞刺激ホルモンとＰＥＧのモル比を１：１５、タンパク質の濃度を１．５ｍｇ／ｍｌとし、４℃で６時３０分間反応させた。ここで、反応はｐＨ６．０、１００ｍＭの濃度のＰｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ緩衝液内で行われ、還元剤である２０ｍＭ ＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ３）を添加して反応させた。反応液からＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ（ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ １ｍｌ， アマシャムバイオサイエンス）によりモノペグ化された（Ｍｏｎｏｐｅｇｙｌａｔｅｄ）タンパク質を精製した。ＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ（ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ １ｍｌ， アマシャムバイオサイエンス）に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）０．７Ｍ硫酸アンモニウムを用いて試料を結合させ、徐々に硫酸アンモニウムの濃度を低くし、有機溶媒を添加して試料を溶出させた。ＨＩＣカラムに結合力の弱いヒト卵胞刺激ホルモンが先に溶出し、結合力の強いヒト卵胞刺激ホルモン−３．４Ｋ ＰＥＧ試料が後で溶出した。溶出したピークのモノペグ化はＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌを用いて確認した。ヒト卵胞刺激ホルモンのベータ・チェーンに８０％以上ペグ化された結果を確認するために、逆相カラムを用いて分析した結果を図１３（ａ）および（ｂ）に示す。
Ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ（ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ １ｍｌ，アマシャムバイオサイエンス）
流速：１．０ｍｌ／分
勾配：Ｂ １００→０％ １００分 Ｂ（Ａ： ２０ｍＭトリスｐＨ８．０＋０．７Ｍ硫酸アンモニウム， Ｂ：
２０ｍＭトリスｐＨ８．０＋２０％ ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）
［実施例１０］
ヒト卵胞刺激ホルモン−３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体（ＨＭ１２１６０Ａ）の製造
実施例９の方法を用いて３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧを濾胞刺激ホルモンと反応させ、モノペグ化濾胞刺激ホルモンのみ精製して免疫グロブリンＦｃ（ハンミ，韓国）とカップリングさせた。濾胞刺激ホルモン−３．４Ｋ ＰＥＧと免疫グロブリンＦｃのモル比を１：８．５、全タンパク質濃度を４０ｍｇ／ｍｌとし、４℃で１６時間反応させた。反応液は１００ｍＭ Ｋ−Ｐ ｐＨ６．０であり、還元剤である２０ｍＭ ＳＣＢを添加した。
カップリング反応液は２つの精製カラムにより精製した。まず、カップリング反応に関与しない多量の免疫グロブリンＦｃを除去するために、Ｂｌｕｅ ＨＰ（ＨｉＴｒａｐ ５ｍｌ， アマシャムバイオサイエンス）を用いた。Ｂｌｕｅ ＦＦに結合力の低い免疫グロブリンＦｃは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いると溶出し、低い濃度のｓａｌｔと高いｐＨ（０．２Ｍ ＫＣｌ＋５０ｍＭ Ｇｌｙ−ＮａＯＨ ｐＨ９．０）を用いて残った免疫グロブリンＦｃを完全に除去した。その後、高い濃度のｓａｌｔと高いｐＨ（２．５Ｍ ＫＣｌ＋５０ｍＭ Ｇｌｙ−ＮａＯＨ ｐＨ９．０）を用いて反応しない濾胞刺激ホルモン−３．４Ｋ ＰＥＧと濾胞刺激ホルモン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃを溶出させた。
一次精製により免疫グロブリンＦｃが除去されるが、親和性カラムにおいては濾胞刺激ホルモン−３．４Ｋ ＰＥＧと濾胞刺激ホルモン−免疫グロブリンＦｃは結合力の差が大きくないので分離しない。
よって、二物質の疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）を用いて二次精製した。ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ（ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ １ｍｌ，アマシャムバイオサイエンス）に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）１．３Ｍ硫酸アンモニウムを用いた。ＨＩＣカラムに結合力の弱い濾胞刺激ホルモン−３．４Ｋ ＰＥＧは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）１．３Ｍ硫酸アンモニウムにおいてＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯに結合せずに溶出し、結合力の強い濾胞刺激ホルモン−免疫グロブリンＦｃ試料は硫酸アンモニウムの濃度を低くすることにより後で溶出した。これらの疎水性の差が大きいので、イオン交換カラムよりはるかに分離が容易であった（図６）。ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果、純度９７．６６％を示した（図７）。
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｂｌｕｅ ＨＰ（ＨｉＴｒａｐ ５ｍｌ，アマシャムバイオサイエンス）
流速：３．０ｍｌ／分
勾配：Ａ ０→１００％ ０分 Ｂ→１００％ ０分 Ｃ（Ａ：２０ｍＭトリスｐＨ７．５，Ｂ：５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウムｐＨ９．０＋０．２Ｍ塩化カリウム，Ｃ：５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウムｐＨ９．０＋２．５Ｍ塩化カリウム）
Ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ（ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ １ｍｌ，アマシャムバイオサイエンス）
流速：１．０ｍｌ／分
勾配：Ｂ １００→０％ １００分 Ｂ（Ａ：２０ｍＭトリスｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１．３Ｍ硫酸アンモニウム）
［実施例１１］
ヒト卵胞刺激ホルモンと免疫グロブリンＦｃのペグ化（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）と精製
５Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（３）ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を３つ有するＰＥＧ，ＮＯＦ．，日本）を免疫グロブリンＦｃ（ハンミ，韓国）の２つのＮ末端にペグ化させるために、タンパク質とＰＥＧのモル比を１：２、タンパク質の濃度を６ｍｇ／ｍｌとし、４℃で４時間３０分反応させた。
ここで、反応はｐＨ６．０、１００ｍＭの濃度のＰｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ緩衝液内で行われ、還元剤である２０ｍＭ ＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ３）を添加して反応させた。
反応液からＳＯＵＲＣＥ Ｑ（ＦｉｎｅＬＩＮＥ １０００ｍｌ， アマシャムバイオサイエンス）によりモノペグ化された（Ｍｏｎｏｐｅｇｙｌａｔｅｄ）タンパク質を精製した。溶出したピークのモノペグ化はＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌを用いて確認した。
Ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ Ｑ（ＦｉｎｅＬＩＮＥ １０００ｍｌ，アマシャムバイオサイエンス）
流速：４０．０ｍｌ／分
勾配：Ａ ０→４％ １分 Ｂ→２４％ ８０分 Ｂ（Ａ：２０ｍＭトリスｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１Ｍ ＮａＣｌ）
［実施例１２］
ヒト卵胞刺激ホルモン−５Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体（ＨＭ１２１６０Ｂ）の製造
実施例１１の方法を用いて５Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（３）ＰＥＧを免疫グロブリンＦｃの２つのＮ−ｔｅｒｍと反応させ、モノペグ化免疫グロブリンＦｃのみ精製し、実施例７で得て実施例８で確認されたヒト卵胞刺激ホルモンとカップリングさせた。ヒト卵胞刺激ホルモンと免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ ＰＥＧのモル比を１：４．５、全タンパク質濃度を４０ｍｇ／ｍｌとし、４℃で１６時間反応させた。反応液は１００ｍＭ Ｋ−Ｐ ｐＨ６．０であり、還元剤である２０ｍＭ ＳＣＢを添加した。
カップリング反応液は２つの精製カラムにより精製した。まず、カップリング反応に関与しない多量の免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ ＰＥＧを除去するために、Ｂｌｕｅ ＦＦ（Ｖａｎｔａｇｅ Ｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｌｕｍｎ ３８ｍｌ，ミリポア）を用いた。Ｂｌｕｅ ＦＦに結合力の低い免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ ＰＥＧは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いると溶出し、低い濃度のｓａｌｔと高いｐＨ（０．２Ｍ ＫＣｌ＋５０ｍＭ Ｇｌｙ−ＮａＯＨ ｐＨ９．０）を用いて残った免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ ＰＥＧを完全に除去した。その後、高い濃度のｓａｌｔと高いｐＨ（２．５Ｍ ＫＣｌ＋５０ｍＭ Ｇｌｙ−ＮａＯＨ ｐＨ９．０）を用いて反応しないヒト卵胞刺激ホルモンとヒト卵胞刺激ホルモン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃを溶出させた。
一次精製により免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ ＰＥＧが除去されるが、親和性カラムにおいてはＦＳＨとＦＳＨ−免疫グロブリンＦｃは結合力の差が大きくないので分離しない。
よって、二物質の疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）を用いて二次精製した。ＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ（ＸＫ １９ｍｌ，アマシャムバイオサイエンス）に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）１Ｍ硫酸アンモニウムを用いて一次精製した試料を結合させ、徐々に硫酸アンモニウム濃度を低くして試料を溶出させた。ＨＩＣカラムに結合力の弱い濾胞刺激ホルモンが先に溶出し、結合力の強い濾胞刺激ホルモン−免疫グロブリンＦｃ試料が後で溶出した。これらの疎水性の差が大きいので、イオン交換カラムよりはるかに分離が容易である。ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果、純度９８．０７％を示した（図８）。
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｂｌｕｅ ＦＦ（Ｖａｎｔａｇｅ Ｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｌｕｍｎ ３８ｍｌ，ミリポア）
流速：５．０ｍｌ／分
勾配：Ａ ０→１００％ ０分 Ｂ→１００％ ０分 Ｃ（Ａ：２０ｍＭトリスｐＨ７．５，Ｂ：５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウムｐＨ９．０＋０．２Ｍ塩化カリウム，Ｃ：５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウムｐＨ９．０＋２．５Ｍ塩化カリウム）
Ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ（ＸＫ １９ｍｌ，アマシャムバイオサイエンス）
流速：２．０ｍｌ／分
勾配：Ｂ １００→０％ １５０分 Ｂ（Ａ：２０ｍＭトリスｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１Ｍ硫酸アンモニウム）
［実施例１３］
持続型及び天然型ヒト卵胞刺激ホルモンのインビボ効力試験の比較
ヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤のインビボ効力を測定するために、未成熟雌ラットを用いて卵巣重量の増加を確認した。２１日齢の未成熟雌ラットに３日間持続性製剤を０．５又は１．５ｍｃｇ／ｈｅａｄ（ＦＳＨ濃度基準）で単回投与し、天然型ヒト卵胞刺激ホルモンを０．５ｍｃｇ／ｈｅａｄの用量で毎日、又は１．５ｍｃｇ／ｈｅａｄの用量で単回投与した。３日間の試験期間中、ヒト卵胞刺激ホルモン製剤の投与と同時に、ヒト性腺刺激ホルモン（ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）を１３．３ＩＵ／ｈｅａｄの用量で毎日並行投与した。ここで、用いられたヒト卵胞刺激ホルモンは、両末端を有する非ペプチド性重合体で連結された持続性製剤であった。最初に試験物質を投与し、７２時間経過後に試験動物を安楽死させ、卵巣を摘出して重量を測定した。単回投与されたヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤は同量投与された天然型ヒト卵胞刺激ホルモンに比べて卵巣重量が２６％増加し、１／３の用量で同等の卵巣重量の増加効果を示した［図９（ａ）および（ｂ）］。
［実施例１４］
持続型ヒト卵胞刺激ホルモンとＣＴＰ−フュージョンヒト卵胞刺激ホルモンのインビボ効力試験の比較
ヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤のインビボ効力について、Ｏｒｇａｎｏｎ社で開発中のＣＴＰ−フュージョンヒト卵胞刺激ホルモン持続型製剤との比較試験を行うために、Ｏｒｇａｎｏｎ社で行った次の効能試験法に従い、ヒト卵胞刺激ホルモンのインビボ効力試験を行った。２１日齢の未成熟雌ラットに３日間、持続性製剤を１．４又は２．８ｍｃｇ／ｈｅａｄ（ヒト卵胞刺激ホルモン濃度基準）で単回投与し、天然型ヒト卵胞刺激ホルモンを２．８ｍｃｇ／ｈｅａｄの用量で単回投与した。ここで、用いられたヒト卵胞刺激ホルモンは、両末端を有する非ペプチド性重合体で連結された持続性製剤であった。ヒト性腺刺激ホルモンの併用投与は行わなかった。最初に試験物質を投与し、７２時間経過後に試験動物を安楽死させ、卵巣を摘出して重量を測定した。持続性製剤投与群は、ヒト卵胞刺激ホルモン投与群に比べて１／２用量投与群では３８％、同量投与群では６８％の卵巣重量の増加が確認された。本試験と同じ試験法を用いたＣＴＰ−フュージョンヒト卵胞刺激ホルモンのヒト卵胞刺激ホルモンの効力試験において、ＣＴＰ−フュージョンヒト卵胞刺激ホルモン投与群は天然型ヒト卵胞刺激ホルモン投与群に比べて、同量投与では２９％の卵巣重量の増加を示す結果から（表１）、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤のインビボ効力がより優れるものと予測される（図１０）。
Figure 0006771422
［実施例１５］
両反応基末端を有する重合体と三反応基末端を有する重合体を用いて作成されたヒト卵胞刺激ホルモンのインビボ効力試験の比較
末端が２つ又は３つである異なる非ペプチド性重合体を用いて製造された各ヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤のインビボ効力を比較するために、未成熟雌ラットを用いて卵巣重量の増加を確認した。２１日齢の未成熟雌ラットに３日間、両末端を有する重合体で製造された、又は三末端を有する非ペプチド性重合体を用いて製造されたヒト卵胞刺激ホルモンを０．３、０．０７５又は０．０１８ｍｃｇ／ｈｅａｄ（ヒト卵胞刺激ホルモン濃度基準）で単回投与した。３日間の試験期間中、ヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の投与と同時に、ヒト性腺刺激ホルモンを１３．３ＩＵ／ｈｅａｄの用量で毎日並行投与した。最初に試験物質を投与し、７２時間経過後に試験動物を安楽死させ、卵巣を摘出して重量を測定した。単回投与された２種類の持続性製剤はどちらも濃度依存的な卵巣重量の増加効果を示し、投与物質間、投与濃度群間の卵巣重量の増加に差は認められなかった。上記結果からヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の製造における両末端又は三末端を有する非ペプチド性重合体の差異に伴う効力差はないことが確認された（図１１）。
［実施例１６］
持続型ヒト卵胞刺激ホルモン製剤のインビボ薬物動態確認試験
ヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の生体内持続性を確認するために、未成熟雌ラットを用いて薬物動態を確認した。２１日齢の未成熟雌ラットに天然型又は持続型ヒト卵胞刺激ホルモンを８０ｇ／ｋｇ（ヒト卵胞刺激ホルモン基準）を単回皮下投与し、その後酵素免疫測定キットを用いて時間による血中濃度の変化を測定し、測定された濃度値からＷｉｎｎｏｌｉｎ ５．２ソフトウェアを用いて薬物動態パラメータを算出した（表２）。ここで、用いられたヒト卵胞刺激ホルモンは、三末端を有する非ペプチド性重合体で連結された持続性製剤であった。ヒト卵胞刺激ホルモンの半減期は８５．６時間であり、天然型ヒト卵胞刺激ホルモンに比べて約１０倍長い持続性を示すことが確認された（図１２）。
Figure 0006771422
［実施例１７］
卵胞刺激ホルモン−３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の結合部位の確認
卵胞刺激ホルモンと３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃの結合部位を確認するために、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィーを用いた。濃度１ｍｇ／ｍｌの卵胞刺激ホルモン２０μｇを低いｐＨで逆相クロマトグラフィーにかけ、その結果アルファサブユニットとベータサブユニットが分離したことを確認した。同一条件で卵胞刺激ホルモン−３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を逆相クロマトグラフィーにかけた結果、３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃが結合していないアルファサブユニット、ベータサブユニットと３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃが結合したサブユニットが分離した。その結果、卵胞刺激ホルモン−３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の場合、濾胞刺激ホルモンに比べてベータサブユニットのピークが著しく減少したことが確認された（図１４）。２１５ｎｍの波長のインテグレーションを基準にベータサブユニットの８０％、アルファサブユニットの２０％が３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃに結合したことが確認された。

Claims (12)

  1. ヒト卵胞刺激ホルモン及び免疫グロブリンＦｃ領域が、末端反応基として２つのプロピオンアルデヒド基を有するポリエチレングリコールを介して連結されたヒト卵胞刺激ホルモン結合体を含む、生体内持続性及び安定性が増加したヒト卵胞刺激ホルモンの持続性製剤であって、
    前記ポリエチレングリコールの前記プロピオンアルデヒド基のうちの１つが、前記ヒト卵胞刺激ホルモンのベータサブユニットのＮ末端と結合し、
    前記ポリエチレングリコールの分子量が、３．４ｋＤａであり、
    反応基末端が２つであるポリエチレングリコールの両末端が、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及び卵胞刺激ホルモンのアミノ基に結合されたものである、
    ヒト卵胞刺激ホルモンの持続性製剤。
  2. 免疫グロブリンＦｃ領域が非グリコシル化されたことを特徴とする請求項１に記載の持続性製剤。
  3. 免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される１つ〜４つのドメインからなるものである請求項１に記載の持続性製剤。
  4. 免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジ領域をさらに含むものである請求項３に記載の持続性製剤。
  5. 免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来するＦｃ領域である請求項１に記載の持続性製剤。
  6. 免疫グロブリンＦｃ領域の各ドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである請求項５に記載の持続性製剤。
  7. 免疫グロブリンＦｃ領域が、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である請求項６に記載の持続性製剤。
  8. 免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項５に記載の持続性製剤。
  9. 免疫グロブリンＦｃ領域がヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である請求項６に記載の持続性製剤。
  10. 不妊治療用補助生殖技術である体外受精（ＩＶＦ−ＥＴ）、配偶子卵管内移植（ＧＩＦＴ）、接合子卵管内移植（ＺＩＦＴ）、卵細胞質内***注入法（ＩＣＳＩ）又は試験管ベビー技術に用いるためのものである請求項１に記載の持続性製剤。
  11. 低性腺刺激ホルモン性性腺機能低下症又は多嚢胞性卵巣症候群（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ ｏｖａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療用である請求項１に記載の持続性製剤。
  12. （１）両末端に末端反応基として２つのプロピオンアルデヒド基を有するポリエチレングリコールをヒト卵胞刺激ホルモンのアミノ基に共有結合させる段階と、
    （２）前記（１）の反応混合物からポリエチレングリコールのプロピオンアルデヒド基のうちの１つが共有結合されたヒト卵胞刺激ホルモンを含む連結体を分離する段階と、
    （３）分離した連結体のポリエチレングリコールの他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により連結し、ポリエチレングリコールの両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及び卵胞刺激ホルモンに結合されたペプチド結合体を生成する段階とを含み、
    前記ポリエチレングリコールのプロピオンアルデヒド基のうちの１つが、前記ヒト卵胞刺激ホルモンのベータサブユニットのＮ末端と結合し、
    前記ポリエチレングリコールの分子量が、３．４ｋＤａであり、
    反応基末端が２つであるポリエチレングリコールの両末端が、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及び卵胞刺激ホルモンのアミノ基に結合されたものである、
    請求項１のヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の製造方法。
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