JP6754982B2 - Developmental disability inhibitor - Google Patents

Description

本発明は、口蓋裂などの先天異常、鼻口腔瘻、上顎洞口腔瘻、食道瘻、気管支瘻などの瘻孔に代表される生体の粘膜欠損を、適正かつ安全に再建、閉鎖、修復できる発育障害抑制材に関する。 The present invention is a growth disorder capable of properly and safely reconstructing, closing, and repairing a congenital anomaly such as palatal fissure, a fistula such as a nasal or oral fistula, a maxillary sinus oral fistula, an esophageal fistula, and a bronchial fistula. Regarding suppressors.

外傷、手術等に起因して必要となる粘膜の再生、治療は、これまで自己再生能力に依存した方法が選択されてきた。また、先天的な欠損や奇形に対しての治療方法は皆無に等しかった。しかしながら近年、医療レベルの向上や、再生医療分野の進展により組織移植や、それに使用するスキャホールドの検討などが行われ、患者のＱＯＬは向上しつつある。
粘膜欠損、特に生体内に物理的空隙を生ずるような欠損を治療する医療技術は、骨などの硬組織に対する医療技術と比較して、技術的な遅れが見られる。
上記した粘膜組織の欠損に由来する疾患の具体的な例としては、口蓋裂などの先天異常、鼻口腔瘻、上顎洞口腔瘻、食道瘻、気管支瘻、心室中隔穿孔、横隔膜ヘルニアなどに代表される瘻孔や、歯肉の欠損など多種に渡る。
これら、欠損に対する現在の治療法の一部を以下に説明する。
（ａ）口蓋裂の治療方法としては、主に手術が選択されるが、方法はＰｕｓｈｂａｃｋ法、Ｆｕｒｌｏｗ法などがあり、Ｆｕｒｌｏｗ法は最近広く行われている手術法である（非特許文献１）。口腔側、鼻腔側でそれぞれＺ形成を行う方法で、筋肉を含むように口蓋垂側に基部をもつ粘膜筋弁を作製することにより筋層を後ろに移動させる術式である。しかしながら、本術式では裂の幅が大きいと、とくに口蓋側に基部をもつ弁はうまく移動しないため、縫合が困難となる。
対してＰｕｓｈｂａｃｋ法は、粘骨膜弁を後方に移動させる術式であるが、粘骨膜弁の後方移動により前方に生ずる骨の露出部が瘢痕化することで、上顎骨の発育障害がおこる（非特許文献２）。また、往々にして瘻孔が発生するなどの問題がみられる。このような瘻孔は大きいものでは、（１）飲食物が鼻にまわり、鼻の穴から外部にこぼれ出る（２）鼻の分泌物が口の中に流出する（３）鼻粘膜の炎症や、口臭の原因となる（４）言語障害などの障害が生じるというような問題が顕著になる。
（ｂ）心室中隔穿孔や横隔膜ヘルニアなどの治療方法としてはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）や生物組織由来のシート（パッチ）によって補填されることが多い。これらは一定の治療効果が認められるが、粘膜組織を再生することが出来ず、治癒後の瘢痕拘縮やそれに伴う発育障害などの合併症が生じる場合がある。また、口腔粘膜では、口腔内常在菌が存在するため常に感染のリスクを伴っている（非特許文献３）。 For mucosal regeneration and treatment required due to trauma, surgery, etc., methods that depend on self-renewal ability have been selected so far. In addition, there was almost no cure for congenital defects and malformations. However, in recent years, with the improvement of medical level and the progress of the field of regenerative medicine, tissue transplantation and examination of scaffold used for it have been carried out, and the QOL of patients is improving.
Medical techniques for treating mucosal defects, especially those that create physical voids in vivo, are technically delayed compared to medical techniques for hard tissues such as bone.
Specific examples of the above-mentioned diseases caused by the defect of mucosal tissue include congenital anomalies such as palatal fissure, nasal and oral fistula, maxillary sinus oral fistula, esophageal fistula, bronchial fistula, ventricular septal perforation, and diaphragmatic hernia. There are various types of fistulas and gingival defects.
Some of the current treatments for these defects are described below.
(A) Surgery is mainly selected as a treatment method for cleft palate, but there are Pushback method, Fulllow method and the like, and the Fulllow method is a recently widely used surgical method (Non-Patent Document 1). .. This is a method of performing Z-plasty on the oral side and the nasal cavity side, respectively, and is a surgical method of moving the muscular layer backward by preparing a muscularis mucosae having a base on the uvula side so as to include muscles. However, in this surgical method, if the width of the fissure is large, the valve having a base on the palatal side does not move well, which makes suturing difficult.
On the other hand, the Pushback method is a technique for moving the periosteal flap posteriorly, but the posterior movement of the periosteal flap causes scarring of the exposed part of the bone that occurs anteriorly, resulting in impaired growth of the maxilla (non-progression). Patent Document 2). In addition, problems such as the occurrence of fistulas are often seen. When such a fistula is large, (1) food and drink go around the nose and spill out from the nose hole (2) nasal secretions flow into the mouth (3) inflammation of the nasal mucosa and Problems such as (4) speech disorders and other disorders that cause bad breath become prominent.
(B) As a treatment method for interventricular septal perforation and diaphragmatic hernia, it is often supplemented with polytetrafluoroethylene (PTFE) or a sheet (patch) derived from biological tissue. Although these have a certain therapeutic effect, they cannot regenerate mucosal tissue and may cause complications such as post-healing wound contracture and associated developmental disorders. In addition, since the oral mucosa contains indigenous bacteria in the oral cavity, there is always a risk of infection (Non-Patent Document 3).

Ｆｕｒｌｏｗ法における口蓋粘膜の閉鎖判定法 日本口蓋裂学会雑誌Ｖｏｌ． ４０ （２０１５） Ｎｏ．１ ｐ．１−６Judgment method for closing the palatal mucosa by the Full method Journal of the Japanese Cleft Palate Association Vol. 40 (2015) No. 1 p. 1-6 口蓋裂手術と顎発育に関する諸問題 日本口蓋裂学会雑誌Ｖｏｌ． １７ （１９９２） Ｎｏ．１ ｐ．７−１４Problems related to cleft palate surgery and jaw development Journal of the Japanese Cleft Palate Association Vol. 17 (1992) No. 1 p. 7-14 口腔環境の微生物制御と全身感染症との関連性について Ｊｐｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｃｏｌ （Ｖｏｌ．２３ Ｎｏ．２ ２０１４）Relationship between microbial control of the oral environment and systemic infections Jpn J Clin Ecol (Vol.23 No.2 2014)

本発明は、粘膜欠損創の治癒過程にみられる創収縮に伴う発育障害等の合併症の発現を抑制するために用いる発育障害抑制材を提供することである。
本発明の発育障害抑制材を用いることにより創収縮を予防することができる。 The present invention is to provide a growth disorder inhibitor used for suppressing the occurrence of complications such as growth disorder associated with wound contraction seen in the healing process of a mucosal defect wound.
Wound contraction can be prevented by using the growth-impaired inhibitor of the present invention.

本発明の発育障害抑制材は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）を含む発育障害抑制材であって、円二色性スペクトル法により求めた上記タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合が６０〜８５％であり、上記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち上記アミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及び上記アミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の占める合計の割合が５０〜７０％であり、上記発育障害抑制材が綿状であり、上記発育障害抑制材のかさ密度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌであり、上記発育障害抑制材中の水分含有率が０重量％を超え、２０重量％以下である発育障害抑制材である。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１個又は２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。 The growth-inhibitory inhibitor of the present invention is a growth-inhibitory inhibitor containing a GAGAGS sequence (1) and a protein (A) having the following amino acid sequence (X) and / or the following amino acid sequence (X'). The total ratio of the β-turn structure and the random coil structure of the protein (A) determined by the sex spectrum method is 60 to 85%, and the amino acid sequence (X) out of the total number of amino acids of the protein (A). The total ratio of the number of amino acids and the number of amino acids in the amino acid sequence (X') is 50 to 70%, the growth-inhibitory inhibitor is cotton-like, and the bulk density of the growth-inhibitory inhibitor is 0. It is a growth disorder inhibitor having a water content of 1 to 100 mg / ml and having a water content of more than 0% by weight and 20% by weight or less in the growth disorder inhibitor.
Amino acid sequence (X): At least one amino acid sequence selected from the group consisting of VPGVG sequence (2), GVGVP sequence (3) and GAHGPAGPK sequence (4).
Amino acid sequence (X'): An amino acid sequence in which one or two amino acids in the amino acid sequence (X) are replaced with lysine or arginine, respectively.

本発明において、タンパク質（Ａ）は、天然物からの抽出、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって得られる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。天然物からの抽出、有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、タンパク質（Ａ）を得られるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。 In the present invention, the protein (A) is obtained by extraction from a natural product, an organic synthesis method (enzymatic method, solid phase synthesis method, liquid phase synthesis method, etc.), a gene recombination method, or the like. Regarding the organic synthesis method, "Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV (July 1, 1981, edited by Japan Biochemistry Society, published by Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd.)" or "Sequel Biochemistry Experiment Course 2, Protein Chemistry" (Bottom) (May 20, 1987, edited by the Japan Society for Biochemistry, published by Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd.) ”, etc. can be applied. As for the gene recombination method, the method described in Japanese Patent No. 3338441 can be applied. The protein (A) can be obtained in all of the extraction from natural products, the organic synthesis method, and the gene recombination method, but the gene recombination method is preferable from the viewpoint that the amino acid sequence can be easily changed and mass production can be performed at low cost.

本発明において、円二色性スペクトル法により求めたタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合が６０〜８５％であり、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうちアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の占める合計の割合が５０〜７０％である。
タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合並びにタンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうちアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の占める合計の割合が上記範囲であることで、本発明の発育障害抑制材は、滲出液を吸収してゲル化することができ、吸収した滲出液を適度に創傷部に留まらせ、創傷面を適度な湿潤環境に保つことができる。 In the present invention, the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure of the protein (A) determined by the circular dichroism spectrum method is 60 to 85%, and amino acids out of the total number of amino acids of the protein (A). The total ratio of the number of amino acids in the sequence (X) and the number of amino acids in the amino acid sequence (X') is 50 to 70%.
The total ratio of the β-turn structure and the random coil structure of the protein (A) and the number of amino acids in the amino acid sequence (X) and the number of amino acids in the amino acid sequence (X') among the total number of amino acids in the protein (A). When the ratio of the total occupying the above range is within the above range, the growth-impaired inhibitor of the present invention can absorb the exudate and gelle, and the absorbed exudate is appropriately retained in the wound portion, and the wound surface is covered. It can be maintained in a moderately moist environment.

タンパク質（Ａ）は、円二色性スペクトル法により求めたタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合が６０〜８５％であるタンパク質である。タンパク質の配列が同じでも、タンパク質の作製方法、タンパク質の精製方法、タンパク質を溶解させる溶媒のｐＨ及び溶媒の極性等により、タンパク質のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合は異なる。
タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、６０〜８５％が好ましく、さらに好ましくは６５〜８０％であり、特に好ましくは７０〜７５％である。
上記割合は、タンパク質（Ａ）をリフォールディングすることによって増加させることができる。また、変性剤や熱等で変性させることによって低下させることができる。
タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合は、下記測定方法によって求める。 The protein (A) is a protein in which the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure of the protein (A) determined by the circular dichroism spectrum method is 60 to 85%. Even if the protein sequence is the same, the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure of the protein differs depending on the method for producing the protein, the method for purifying the protein, the pH of the solvent for dissolving the protein, the polarity of the solvent, and the like.
The total ratio of the β-turn structure and the random coil structure of the protein (A) is preferably 60 to 85%, more preferably 65 to 80%, and particularly preferably from the viewpoint of keeping the wound surface in an appropriate moist environment. Is 70-75%.
The percentage can be increased by refolding the protein (A). Further, it can be reduced by denaturing with a denaturing agent, heat or the like.
The total ratio of the β-turn structure and the random coil structure of the protein (A) is determined by the following measuring method.

＜タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合の測定方法＞
タンパク質を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質の水溶液を作製する。作製したタンパク質の水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光株式会社製、「Ｊ−８２０」）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）にてβターン構造の割合とランダムコイル構造の割合とを算出し、これらを合計し、βターン構造とランダムコイル構造との合計の割合とする。 <Measurement method of the total ratio of β-turn structure and random coil structure of protein (A)>
Dissolve the protein in deionized water (4 ° C.) to a concentration of 0.3 mg / ml to prepare an aqueous solution of the protein. The prepared aqueous solution of the protein was measured with a circular dichroism spectrum measuring instrument (manufactured by JASCO Corporation, "J-820") (measurement temperature: 4 ° C.), and a secondary structure analysis program (JWSSE type: JASCO Corporation). The ratio of the β-turn structure and the ratio of the random coil structure are calculated by (manufactured by the company), and these are totaled to obtain the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure.

本発明において、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）及び／又はアミノ酸配列（Ｘ’）を有するものである。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の１個又は２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
なお、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）を複数個有していてもよく、アミノ酸配列（Ｘ’）を複数個有していてもよい。また、タンパク質（Ａ）が複数個のアミノ酸配列（Ｘ）を有している場合には、各アミノ酸配列（Ｘ）の種類が異なっていてもよく、タンパク質（Ａ）が複数個のアミノ酸配列（Ｘ’）を有している場合には、各アミノ酸配列（Ｘ’）の種類が異なっていてもよい。さらに、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）と、アミノ酸配列（Ｘ’）とを共に有していてもよい。 In the present invention, the protein (A) has an amino acid sequence (X) and / or an amino acid sequence (X').
Amino acid sequence (X): At least one amino acid sequence selected from the group consisting of VPGVG sequence (2), GVGVP sequence (3) and GAHGPAGPK sequence (4).
Amino acid sequence (X'): An amino acid sequence in which one or two amino acids in the amino acid sequence (X) are replaced with lysine or arginine, respectively.
The protein (A) may have a plurality of amino acid sequences (X), or may have a plurality of amino acid sequences (X'). When the protein (A) has a plurality of amino acid sequences (X), the type of each amino acid sequence (X) may be different, and the protein (A) has a plurality of amino acid sequences (X). When it has X'), the type of each amino acid sequence (X') may be different. Further, the protein (A) may have both an amino acid sequence (X) and an amino acid sequence (X').

アミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞親和性及び創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、ＶＰＧＶＧ配列（２）及び／又はＧＶＧＶＰ配列（３）が好ましい。 As the amino acid sequence (X), the VPGVG sequence (2) and / or the GVGVP sequence (3) is preferable from the viewpoint of maintaining the cell affinity and the wound surface in an appropriate moist environment.

アミノ酸配列（Ｘ’）として、具体的には、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）、ＧＫＧＲＰ配列（９）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）等が挙げられる。
アミノ酸配列（Ｘ’）は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（７）及び／又はＧＫＧＫＰ配列（８）である。 Specific examples of the amino acid sequence (X') include GKGVP sequence (7), GKGKP sequence (8), GKGRP sequence (9) and GRGRP sequence (10).
The amino acid sequence (X') is preferably at least one sequence selected from the group consisting of the GKGVP sequence (7), the GKGKP sequence (8) and the GRGRP sequence (10) from the viewpoint of keeping the wound surface in an appropriate moist environment. , More preferably the GKGVP sequence (7) and / or the GKGKP sequence (8).

タンパク質（Ａ）は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、アミノ酸配列（Ｘ）の１種が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：ポリペプチド鎖（Ｙ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）の全アミノ酸の個数の０．１〜２０％のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖。 From the viewpoint of keeping the wound surface in an appropriate moist environment, the protein (A) is a polypeptide chain (Y) in which one of the amino acid sequences (X) is continuous from 2 to 200 and / or the following polypeptide chain (Y'). It is preferable to have.
Polypeptide chain (Y'): In the polypeptide chain (Y), 0.1 to 20% of the total number of amino acids in the polypeptide chain (Y) is replaced with lysine or arginine, respectively.

ポリペプチド鎖（Ｙ）は、具体的には、（ＶＰＧＶＧ）_ｂ配列、（ＧＶＧＶＰ）_ｃ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）_ｄ配列である（なお、ｂ〜ｄは、それぞれ、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である）。
タンパク質（Ａ）１分子中に、ポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、（ＶＰＧＶＧ）_ｂ配列、（ＧＶＧＶＰ）_ｃ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）_ｄ配列からなる群から選ばれる１種を有してもよく、２種以上を有してもよい。
また、タンパク質（Ａ）中にポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数は、ポリペプチド鎖（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数ｂ〜ｄが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、ｂ〜ｄが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよい。
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、（ＶＰＧＶＧ）_ｂ配列及び／又は（ＧＶＧＶＰ）_ｃ配列が好ましい。 Specifically, the polypeptide chain (Y) is a (VPGVG) _b sequence, a (GVGVP) _c sequence, and a (GAHGPAGPK) _d sequence (note that _{b to d} are consecutive amino acid sequences (X), respectively). It is a number, an integer of 2 to 200).
When a plurality of polypeptide chains (Y) are contained in one molecule of protein (A), one selected from the group consisting of (VPGVG) _b sequence, (GVGVP) _c sequence and (GAHGPAGPK) _d sequence is possessed. It may have two or more kinds.
When the protein (A) has a plurality of polypeptide chains (Y), the number of consecutive amino acid sequences (X) may be the same or different for each polypeptide chain (Y). That is, it may have a plurality of polypeptide chains (Y) having the same continuous number b to d of the amino acid sequence (X), or may have a plurality of polypeptide chains (Y) having different numbers b to d.
As the polypeptide chain (Y), the (VPGVG) _b sequence and / or the (GVGVP) _c sequence are preferable from the viewpoint of keeping the wound surface in an appropriate moist environment.

ポリペプチド鎖（Ｙ）は、アミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続した（上記ｂ〜ｄが２〜２００）ポリペプチド鎖であるが、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、連続する個数は２〜１００個（上記ｂ〜ｄが２〜１００）が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個（上記ｂ〜ｄが２〜５０）、特に好ましくは２〜４０個（ｂ〜ｄが２〜４０個）である。 The polypeptide chain (Y) is a polypeptide chain having 2 to 200 consecutive amino acid sequences (X) (2 to 200 in b to d above), but is continuous from the viewpoint of keeping the wound surface in an appropriate moist environment. The number to be used is preferably 2 to 100 (2 to 100 for b to d above), more preferably 2 to 50 (2 to 50 for b to d above), and particularly preferably 2 to 40 (2 to 40 above b to d). 2 to 40 pieces).

また、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）における全アミノ酸の個数の０．１〜２０％のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖であり、具体的には、アミノ酸配列（Ｘ）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ）において、アミノ酸配列（Ｘ）の一部又は全部がアミノ酸配列（Ｘ’）に置き換わったポリペプチド鎖が含まれる。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸の個数のうちリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸の個数の合計の割合は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、０．５〜１０％が好ましく、さらに好ましくは１〜５％である。 The polypeptide chain (Y') is a polypeptide chain in which 0.1 to 20% of the total number of amino acids in the polypeptide chain (Y) is replaced with lysine or arginine, respectively. , In the polypeptide chain (Y) in which the amino acid sequence (X) is continuous, a polypeptide chain in which a part or all of the amino acid sequence (X) is replaced with the amino acid sequence (X') is included.
In the polypeptide chain (Y'), the total ratio of the total number of amino acids substituted with lysine or arginine to the total number of amino acids in the polypeptide chain (Y) is from the viewpoint of keeping the wound surface in an appropriate moist environment. , 0.5 to 10%, more preferably 1 to 5%.

ポリペプチド鎖（Ｙ’）であるかどうかは、タンパク質（Ａ）の配列中の全てのリシン及びアルギニンを、他のアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｈ又はＫ）に置きかえたときに、ポリペプチド鎖（Ｙ）となるかによって判断する。 Whether it is a polypeptide chain (Y') or not is determined when all lysine and arginine in the sequence of protein (A) are replaced with other amino acids (G, A, V, P, H or K). It is judged by whether it becomes a polypeptide chain (Y).

タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）とポリペプチド鎖（Ｙ’）との合計の個数は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜８０個であり、特に好ましくは１〜６０個である。 The total number of the polypeptide chains (Y) and the polypeptide chains (Y') in the protein (A) is preferably 1 to 100, more preferably 1 from the viewpoint of keeping the wound surface in an appropriate moist environment. The number is ~ 80, and particularly preferably 1-60.

タンパク質（Ａ）中に、アミノ酸配列（Ｘ）の種類及び／又は連続する個数が異なる（Ｙ）を有している場合は、それぞれを１個として数え、ポリペプチド鎖（Ｙ）の個数はその合計である。ポリペプチド鎖（Ｙ’）も同様である。 If the protein (A) has (Y) in which the type of amino acid sequence (X) and / or the number of consecutive amino acids is different (Y), each is counted as one, and the number of polypeptide chains (Y) is the number. It is a total. The same applies to the polypeptide chain (Y').

本発明においてタンパク質（Ａ）は、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数に占めるアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の合計の割合が５０〜７０％であるものであるが、細胞親和性の観点から、５２．５〜６７．５％が好ましく、さらに好ましくは５５〜６５％である。
タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数に占めるアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の合計の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。 In the present invention, in the protein (A), the total ratio of the number of amino acids in the amino acid sequence (X) and the number of amino acids in the amino acid sequence (X') to the total number of amino acids in the protein (A) is 50 to 70%. However, from the viewpoint of cell affinity, 52.5 to 67.5% is preferable, and more preferably 55 to 65%.
The total ratio of the number of amino acids in the amino acid sequence (X) and the number of amino acids in the amino acid sequence (X') to the total number of amino acids in the protein (A) can be determined by a protein sequencer. Specifically, it can be obtained by the following measurement method.

＜全アミノ酸の個数に占めるアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の合計の割合の測定法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の合計割合を算出する。
アミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の合計割合（％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の個数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝×｛アミノ酸（Ｘ’）中のアミノ酸の個数｝］／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸の個数｝×１００
なお、タンパク質（Ａ）が、複数種類のアミノ酸配列（Ｘ）を有している場合には、以下のようにして上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の個数｝」を求める。
まず、各種類のアミノ酸配列（Ｘ）について、「アミノ酸配列（Ｘ）の数×アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の個数」を求める。その合計値を、上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の個数｝」とする。
タンパク質（Ａ）が、複数種類のアミノ酸配列（Ｘ）に対応する複数種類のアミノ酸配列（Ｘ’）を有する場合も同様にして、上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝×｛アミノ酸（Ｘ’）中のアミノ酸の個数｝」を求める。 <Measurement method of the total ratio of the number of amino acids in the amino acid sequence (X) and the number of amino acids in the amino acid sequence (X') to the total number of amino acids>
The protein (A) is decomposed to about 30 residues or less by using two or more kinds of cleavage methods capable of cleaving with a specific amino acid residue. Then, after separation by high performance liquid chromatography (HPLC), the amino acid sequence is read by a protein sequencer. Peptide mapping is performed from the obtained amino acid sequence to determine the entire sequence of protein (A). Then, the total ratio of the number of amino acids in the amino acid sequence (X) and the number of amino acids in the amino acid sequence (X') is calculated by the following measurement formula.
Total ratio (%) of the number of amino acids in the amino acid sequence (X) and the number of amino acids in the amino acid sequence (X') = [{number of amino acid sequence (X)} x {number of amino acids in amino acid sequence (X)} + {Number of amino acid sequence (X')} x {Number of amino acids in amino acid (X')}] / {Number of all amino acids in protein (A)} x 100
When the protein (A) has a plurality of types of amino acid sequences (X), “{number of amino acid sequences (X)} × {amino acid sequence (X)” in the above formula is as follows. ) Number of amino acids in} ”.
First, for each type of amino acid sequence (X), "the number of amino acid sequences (X) x the number of amino acids in the amino acid sequence (X)" is obtained. The total value is defined as "{number of amino acid sequence (X)} x {number of amino acids in amino acid sequence (X)}" in the above formula.
Similarly, when the protein (A) has a plurality of types of amino acid sequences (X') corresponding to a plurality of types of amino acid sequences (X), "{number of amino acid sequences (X')} × in the above formula. {Number of amino acids in amino acid (X')} "is obtained.

タンパク質（Ａ）において、全アミノ酸の個数のうちＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の個数が占める割合［｛タンパク質（Ａ）中のＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数｝×１００］は、細胞親和性の観点から、５〜５０％が好ましく、さらに好ましくは１０〜４７．５％であり、特に好ましくは２０〜４５％である。
タンパク質（Ａ）における全アミノ酸の個数のうちＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の個数が占める割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求める。 The ratio of the number of amino acids in the GAGAGS sequence (1) to the total number of amino acids in the protein (A) [{number of GAGAGS sequence (1) in protein (A) x 6} / {total number of protein (A)) The number of amino acids} × 100] is preferably 5 to 50%, more preferably 10 to 47.5%, and particularly preferably 20 to 45% from the viewpoint of cell affinity.
The ratio of the number of amino acids in the GAGAGS sequence (1) to the total number of amino acids in the protein (A) can be determined by a protein sequencer. Specifically, it is obtained by the following measurement method.

＜ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が占める割合＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法の２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の個数の占める割合を算出する。
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の個数の占める割合（％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸の数｝×１００ <Ratio occupied by GAGAGS sequence (1)>
The protein (A) is decomposed to about 30 residues or less by using two or more kinds of cleavage methods capable of cleaving with a specific amino acid residue. Then, after separation by high performance liquid chromatography (HPLC), the amino acid sequence is read by a protein sequencer. Peptide mapping is performed from the obtained amino acid sequence to determine the entire sequence of protein (A). Then, the ratio of the number of amino acids in the GAGAGS sequence (1) is calculated by the following measurement formula.
Percentage of the number of amino acids in the GAGAGS sequence (1) (%) = [{Number of GAGAGS sequence (1) x 6} / {Number of all amino acids in protein (A)} x 100

タンパク質（Ａ）はＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するが、タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点、細胞親和性の観点及び創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続する個数は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、２〜１００個が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個であり、特に好ましくは２〜１０個である。 The protein (A) has the GAGAGS sequence (1), but from the viewpoint of making the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure of the protein (A) appropriate, from the viewpoint of cell affinity, and making the wound surface an appropriate moist environment. From the viewpoint of keeping, it is preferable that the GAGAGS sequence (1) has 2 to 200 consecutive polypeptide chains (S).
In the polypeptide chain (S), the number of consecutive GAGAGS sequences (1) is preferably 2 to 100, more preferably 2 to 50, and particularly preferably 2 to 50, from the viewpoint of keeping the wound surface in an appropriate moist environment. Is 2 to 10.

タンパク質（Ａ）が、アミノ酸配列（Ｘ）、アミノ酸配列（Ｘ’）、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）及びポリペプチド鎖（Ｓ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列を合計２個以上有する場合は、これらの間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもよい。介在アミノ酸配列（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）では無いペプチド配列である。介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。介在アミノ酸配列（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（１１）、ＧＡＡＧＹ配列（１２）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。なお、タンパク質（Ａ）は、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有さなくてもよい。
タンパク質（Ａ）が介在アミノ酸配列（Ｚ）を有する場合、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち介在アミノ酸配列（Ｚ）のアミノ酸の個数の占める割合［Σ｛（介在アミノ酸配列（Ｚ）中のアミノ酸の個数）×（介在アミノ酸配列（Ｚ）の数）｝／｛タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数｝×１００］は、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、０％を超え、２５％以下であることが好ましく、さらに好ましくは０％を超え、２２．５％以下であり、特に好ましくは０％を超え、１５％以下である。 The protein (A) is composed of a group consisting of an amino acid sequence (X), an amino acid sequence (X'), a polypeptide chain (Y), a polypeptide chain (Y'), a GAGAGS sequence (1) and a polypeptide chain (S). When having a total of two or more sequences of at least one selected, an intervening amino acid sequence (Z) may be provided between them. The intervening amino acid sequence (Z) is a peptide sequence in which one or more amino acids are linked, and is not a GAGAGS sequence (1), an amino acid sequence (X), or an amino acid sequence (X'). The number of amino acids constituting the intervening amino acid sequence (Z) is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 15, and particularly preferably 1 to 10 from the viewpoint of keeping the wound surface in an appropriate moist environment. .. Specific examples of the intervening amino acid sequence (Z) include a VAAGY sequence (11), a GAAGY sequence (12), and an LGP sequence. The protein (A) does not have to have the intervening amino acid sequence (Z).
When the protein (A) has an intervening amino acid sequence (Z), the ratio of the number of amino acids in the intervening amino acid sequence (Z) to the total number of amino acids in the protein (A) [Σ {(in the intervening amino acid sequence (Z)) (Number of amino acids) x (number of intervening amino acid sequences (Z))} / {number of total amino acids of protein (A)} x 100] exceeds 0% from the viewpoint of keeping the wound surface in an appropriate moist environment. , 25% or less, more preferably more than 0% and 22.5% or less, and particularly preferably more than 0% and 15% or less.

タンパク質（Ａ）は、生体内での分解性の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）、アミノ酸配列（Ｘ’）、介在アミノ酸配列（Ｚ）以外にも、両末端に末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもよい。タンパク質（Ａ）の両末端の構造が、ポリペプチド鎖（Ｙ）に末端アミノ酸配列（Ｔ）が結合した構造であることが好ましい。末端アミノ酸配列（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）では無いペプチド配列である。末端アミノ酸配列（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、生体内での分解性の観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個である。末端アミノ酸配列（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１３）等が挙げられる。なお、タンパク質（Ａ）は、末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していなくてもよい
タンパク質（Ａ）が末端アミノ酸配列（Ｔ）を有する場合、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち末端アミノ酸配列（Ｔ）が占めるアミノ酸の個数の割合は、生体内での分解性の観点から、０％を超え、２５％以下であることが好ましく、さらに好ましくは０％を超え、２２．５％以下であり、特に好ましくは０％を超え、１５％以下である。 The protein (A) has terminal amino acids at both ends in addition to the GAGAGS sequence (1), amino acid sequence (X), amino acid sequence (X'), and intervening amino acid sequence (Z) from the viewpoint of in vivo degradability. It may have a sequence (T). It is preferable that the structure at both ends of the protein (A) is a structure in which the terminal amino acid sequence (T) is bound to the polypeptide chain (Y). The terminal amino acid sequence (T) is a peptide sequence in which one or more amino acids are linked, and is not a GAGAGS sequence (1), an amino acid sequence (X), or an amino acid sequence (X'). The number of amino acids constituting the terminal amino acid sequence (T) is preferably 1 to 100, more preferably 1 to 50, and particularly preferably 1 to 40, from the viewpoint of in vivo degradability. Specific examples of the terminal amino acid sequence (T) include MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASDPM sequence (13). The protein (A) does not have to have the terminal amino acid sequence (T). When the protein (A) has the terminal amino acid sequence (T), the terminal amino acid out of the total number of amino acids in the protein (A). The ratio of the number of amino acids occupied by the sequence (T) is preferably more than 0% and 25% or less, more preferably more than 0% and 22.5% or less from the viewpoint of degradability in the living body. It is particularly preferably more than 0% and 15% or less.

タンパク質（Ａ）は、上記末端アミノ酸配列（Ｔ）以外に、発現させたタンパク質（Ａ）の精製又は検出を容易にするために、タンパク質（Ａ）のＮ又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもよい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９^ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２^ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１^ＴＭ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ） （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ） （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるタンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。 In addition to the terminal amino acid sequence (T), the protein (A) has a special amino acid sequence at the N- or C-terminal of the protein (A) in order to facilitate purification or detection of the expressed protein (A). It may have a protein or peptide (hereinafter referred to as "purification tag"). As the purification tag, a tag for affinity purification is used. Such purified tags include 6 × His tag, V5 tag, Xpress tag, AU1 tag, T7 tag, VSV-G tag, DDDDK tag, S tag, CruzTag09 ^TM , CruzTag22 ^TM , CruzTag41 ^TM , Glu made of polyhistidine. -Glu tag, Ha. There are 11 tags, KT3 tags and the like.
An example of the combination of each purified tag (i) and the ligand (ii) that recognizes and binds the tag is shown below.
(I-1) Glutathione-S-transferase (GTS) (ii-1) Glutathione (i-2) Martose-binding protein (MBP) (ii-2) Amylose (i-3) HQ tag (ii-3) Nickel (ii-3) i-4) Myc tag (ii-4) Anti-Myc antibody (i-5) HA tag (ii-5) Anti-HA antibody (i-6) FLAG tag (ii-6) Anti-FLAG antibody (i-7) 6 × His tag (ii-7) nickel or cobalt As a method for introducing the purified tag sequence, a nucleic acid encoding the purified tag is inserted at the 5'or 3'end of the nucleic acid encoding the protein (A) in the expression vector. Examples thereof include a method and a method using a commercially available purification tag introduction vector.

タンパク質（Ａ）において、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち、上記介在アミノ酸配列（Ｚ）のアミノ酸の個数、末端アミノ酸配列（Ｔ）のアミノ酸の個数及び精製タグのアミノ酸の個数が占める合計割合は、生体内での分解性の観点から、０％を超え、２５％以下が好ましく、さらに好ましくは０％を超え、２２．５％以下であり、特に好ましくは０％を超え、１５％以下である。 In protein (A), the total number of amino acids in the intervening amino acid sequence (Z), the number of amino acids in the terminal amino acid sequence (T), and the number of amino acids in the purified tag out of the total number of amino acids in protein (A). From the viewpoint of degradability in the living body, the ratio is preferably more than 0% and 25% or less, more preferably more than 0% and 22.5% or less, and particularly preferably more than 0% and 15%. It is as follows.

タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）並びにＧＡＧＡＧＳ配列（１）及び／又はポリペプチド鎖（Ｓ）を含む場合、創傷面を適度な湿潤環境に保つ観点から、ポリペプチド鎖（Ｙ）又はポリペプチド鎖（Ｙ’）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｓ）とが交互に化学結合していることが好ましい。 When the protein (A) contains the polypeptide chain (Y) and / or the polypeptide chain (Y') and the GAGAGS sequence (1) and / or the polypeptide chain (S), the wound surface is kept in a moderately moist environment. From the viewpoint, it is preferable that the polypeptide chain (Y) or the polypeptide chain (Y') and the GAGAGS sequence (1) or the polypeptide chain (S) are alternately chemically bonded.

タンパク質（Ａ）１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数と、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比率｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）：アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝は、タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合を適度にする観点から、１：２〜１：６が好ましく、さらに好ましくは１：２〜１：５である。 Ratio of the number of GAGAGS sequences (1) in one molecule of protein (A) to the total number of amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X') {GAGAGS sequence (1): amino acid sequence (X) and amino acids The total of the sequence (X')} is preferably 1: 2 to 1: 6, more preferably 1: 2 from the viewpoint of making the ratio of the total of the β-turn structure and the random coil structure of the protein (A) appropriate. ~ 1: 5.

タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量は、生体内での分解性の観点から、１５〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは３０〜１５０ｋＤａであり、特に好ましくは７０〜１２０ｋＤａである。 The molecular weight of the protein (A) by SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) is preferably 15 to 200 kDa, more preferably 30 to 150 kDa, and particularly preferably 30 to 150 kDa from the viewpoint of in vivo degradability. It is 70 to 120 kDa.

好ましいタンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（１）（Ａ１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（３）であるタンパク質。
（２）（Ａ１１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質。
（３）（Ａ１１−１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続した（ＧＶＧＶＰ）_８配列（１７）のポリペプチド鎖（Ｙ１１）の１個のアミノ酸がＫで置換された（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３配列（６）（Ｙ’１１）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質。
（４）（Ａ１１−１−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）_４配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３配列（６）とを有するタンパク質。
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）_４配列（５）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３配列（６）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、（ＧＡＧＡＧＳ）_２配列（１４）が化学結合した分子質量が約８０ｋＤａの配列（２３）のタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）。
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）_２配列（１４）及び（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３配列（６）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列（１５）のタンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）。 Some of the preferred proteins (A) are illustrated below.
(1) (A1) A protein in which the amino acid sequence (X) is the GVGVP sequence (3).
(2) (A11) Polypeptide chain (Y'1) and GAGAGS sequence (1) in which amino acids in the polypeptide chain (Y1) having 2 to 200 consecutive GVGVP sequences (3) are replaced with lysine (K). A protein having 2 to 200 consecutive polypeptide chains (S1).
(3) (A11-1) 8 consecutive GVGVP sequences (3) (GVGVP) One amino acid in the polypeptide chain (Y11) of ₈ sequences (17) was replaced with K (GVGVP) ₄ GKGVP ( GVGVP) A protein having ₃ sequences (6) (Y'11) and a polypeptide chain (S1) having 2 to 200 consecutive GAGAGS sequences (1).
(4) (A11-1-1) A protein having four consecutive (GAGAGS) ₄ sequences (5) and (GVGVP) ₄ GKGVP (GVGVP) ₃ sequences (6) in which 4 GAGAGS sequences (1) are consecutive.
Specifically, the following proteins are included.
(I) 12 (GAGAGS) ₄ sequences (5) and 13 (GVGVP) ₄ GKGVP (GVGVP) ₃ sequences (6), which are chemically bonded alternately, (GAGAGS) ₂ The protein (SELP8K) of the sequence (23) having a molecular weight of about 80 kDa to which the sequence (14) is chemically bonded.
(Ii) (GAGAGS) ₂ sequences (14) and (GVGVP) ₄ GKGVP (GVGVP) ₃ sequences (6) each have 17 molecules, and the molecular mass having a structure formed by alternately chemically bonding these is about 82 kDa. The protein of sequence (15) (SELP0K).

（５）（Ａ１１−２）ＧＶＧＶＰ配列（３）が１２個連続したポリペプチド鎖の１個のアミノ酸がＫで置換された（ＧＶＧＶＰ）_６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_５配列（２５）（Ｙ’１２）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質。
（６）（Ａ１１−２−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）_４配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）_６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_５配列（２５）とを有するタンパク質。
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）_４配列（５）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）_６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_５配列（２５）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、（ＧＡＧＡＧＳ）_２配列（１４）が化学結合した分子質量が約１０５ｋＤａの配列（２４）のタンパク質。 (5) (A11-2) One amino acid of a polypeptide chain in which 12 consecutive GVGVP sequences (3) were substituted with K (GVGVP) ₆ GKGVP (GVGVP) ₅ sequences (25) (Y'12) And a protein having a polypeptide chain (S1) having 2 to 200 consecutive GAGAGS sequences (1).
(6) (A11-2-1) A protein having four consecutive GAGAGS sequences (1) (GAGAGS), _four sequences (5), and (GVGVP) ₆ GKGVP (GVGVP) _five sequences (25).
Specifically, the following proteins are included.
(I) 12 (GAGAGS) ₄ sequences (5) and 13 (GVGVP) ₆ GKGVP (GVGVP) ₅ sequences (25), which are chemically bonded alternately, (GAGAGS) ₂ A protein of sequence (24) having a molecular weight of about 105 kDa to which sequence (14) is chemically bonded.

（７）（Ａ１２）ＧＶＧＶＰ配列（３）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質。
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）_８配列（１６）及び（ＧＶＧＶＰ）_４０配列（１８）をそれぞれ５個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約１１０ｋＤａの配列（１９）のタンパク質（ＳＥＬＰ６．１）。 (7) (A12) A protein having a polypeptide chain (Y1) having 2 to 200 consecutive GVGVP sequences (3) and a polypeptide chain (S1) having 2 to 200 consecutive GAGAGS sequences (1).
Specifically, the following proteins are included.
(I) Of the sequence (19) having a molecular weight of about 110 kDa having five (GAGAGS) ₈ sequences (16) and 5 (GVGVP) ₄₀ sequences (18), respectively, and having a structure formed by alternately chemically bonding these. Protein (SELP 6.1).

（８）（Ａ２）アミノ酸配列（Ｘ）がＶＰＧＶＧ配列（２）であるタンパク質。
（９）（Ａ２１）ＶＰＧＶＧ配列（２）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ２）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するタンパク質。
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、（ＶＰＧＶＧ）_４配列（２０）及び（ＶＰＧＶＧ）_８配列（２１）をそれぞれ４０個有し、これらが配列（２０）、配列（１）、配列（２１）の順に結合したブロックが４０個化学結合してなる構造を有する分子質量約２００ｋＤａの配列（２２）のタンパク質（ＥＬＰ１．１）。 (8) (A2) A protein whose amino acid sequence (X) is the VPPGVG sequence (2).
(9) (A21) A protein having 2 to 200 consecutive VPGVG sequences (2) in a polypeptide chain (Y2) and a GAGAGS sequence (1).
Specifically, the following proteins are included.
(I) GAGAGS sequence (1), (VPPGVG) ₄ sequences (20) and (VPPGVG) ₈ sequences (21) each have 40, and these are of the sequence (20), sequence (1), sequence (21). The protein (ELP1.1) of the sequence (22) having a molecular weight of about 200 kDa having a structure in which 40 blocks bonded in order are chemically bonded.

本発明の発育障害抑制材は、上記タンパク質（Ａ）を含み発育障害抑制材が綿状であり、発育障害抑制材のかさ密度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌであり、発育障害抑制材中の水分含有率が０重量％を超え、２０重量％以下であるものである。 The growth-inhibitory inhibitor of the present invention contains the above protein (A), the growth-inhibitory inhibitor is cotton-like, and the growth-inhibitory inhibitor has a bulk density of 0.1 to 100 mg / ml, and is contained in the growth-inhibitory inhibitor. The water content is more than 0% by weight and 20% by weight or less.

本発明において、発育障害抑制材のかさ密度は、滲出液吸収の観点から、１〜５０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。 In the present invention, the bulk density of the growth-impairing inhibitor is preferably 1 to 50 mg / ml from the viewpoint of exudate absorption.

発育障害抑制材中の水分含有率は、滲出液吸収の観点から、０重量％を超え、２０重量％以下であり、好ましくは０重量％を超え、１０重量％以下である。
発育障害抑制材中の水分含有率は、下記測定方法によって求めることができる。 From the viewpoint of exudate absorption, the water content in the growth-impairing inhibitor is more than 0% by weight and 20% by weight or less, preferably more than 0% by weight and 10% by weight or less.
The water content in the growth-impaired inhibitor can be determined by the following measuring method.

＜発育障害抑制材中の水分含有率の測定方法＞
発育障害抑制材０．１ｇの水分含有率を微量水分測定装置（平沼産業社製、「ＡＱ−２２００」）にて測定する。 <Measuring method of water content in growth-impaired material>
The water content of 0.1 g of the growth-impaired inhibitor is measured with a trace water content measuring device (manufactured by Hiranuma Sangyo Co., Ltd., "AQ-2200").

本発明の発育障害抑制材は、タンパク質（Ａ）以外に無機塩及び／又はリン酸（塩）を含んでもよい。なお、本発明の発育障害抑制材は、無機塩及び／又はリン酸（塩）を含んでいなくてもよい。 The growth-impairing inhibitor of the present invention may contain an inorganic salt and / or phosphoric acid (salt) in addition to the protein (A). The growth-impairing inhibitor of the present invention does not have to contain an inorganic salt and / or phosphoric acid (salt).

無機塩として、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。なお、本明細書において、リン酸塩は無機塩に含まない。
発育障害抑制材中の無機塩の含有量（重量％）は、細胞親和性の観点から、発育障害抑制材の重量を基準として０重量％を超え、３重量％以下が好ましく、さらに好ましくは０重量％を超え、１重量％以下、特に好ましくは０重量％を超え、０．５重量％以下である。 Specific examples of the inorganic salt include sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, sodium sulfate, potassium sulfate, calcium sulfate, magnesium sulfate, sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate, calcium hydrogen carbonate, magnesium hydrogen carbonate and the like. Can be mentioned. In addition, in this specification, phosphate is not included in an inorganic salt.
From the viewpoint of cell affinity, the content (% by weight) of the inorganic salt in the growth inhibitory material is preferably more than 0% by weight and 3% by weight or less based on the weight of the growth inhibition material, and more preferably 0. It is more than% by weight and less than 1% by weight, particularly preferably more than 0% by weight and less than 0.5% by weight.

リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
リン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩等が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
発育障害抑制材中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、細胞親和性の観点から、発育障害抑制材の重量を基準として０重量％を超え、２重量％以下が好ましく、さらに好ましくは０重量％を超え、０．５重量％以下であり、特に好ましくは０重量％を超え、０．０５重量％以下である。 Phosphoric acid (salt) means phosphoric acid and / or phosphate.
Examples of phosphoric acid (salt) include phosphoric acid and phosphate.
Examples of the salt include alkali metal salts and alkaline earth metal salts, and specific examples thereof include sodium salt, potassium salt, calcium salt and magnesium salt.
The content (% by weight) of phosphoric acid (salt) in the growth inhibitory material is preferably more than 0% by weight and 2% by weight or less based on the weight of the growth inhibition material from the viewpoint of cell affinity. It preferably exceeds 0% by weight and is 0.5% by weight or less, and particularly preferably exceeds 0% by weight and is 0.05% by weight or less.

本発明の発育障害抑制材は、糖及び／又は抗菌剤を含んでいてもよい。
糖としては、公知の糖を用いることができ、例えば、単糖｛トリオース、テトロース、ペプトース、ヘキソース及びヘプトース等｝、オリゴ糖及び多糖｛デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、キトサン、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、ペクチン、キシログルカン及びキサンタンガム等｝等が挙げられる。
抗菌剤としては、公知の抗菌剤を用いることができ、例えば、銀イオン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシン等が挙げられる。 The growth-impairing inhibitor of the present invention may contain a sugar and / or an antibacterial agent.
As the sugar, known sugars can be used, for example, monosaccharides {triose, tetrose, pectin, hexose, heptose, etc.}, oligosaccharides and polysaccharides {starch, glycogen, cellulose, chitin, chitosan, agarose, carrageenan, heparin. , Hyaluronic acid, pectin, xyl cellulose, xanthan gum, etc.} and the like.
As the antibacterial agent, a known antibacterial agent can be used, and examples thereof include silver ion, amphotericin B, gentamicin, penicillin and streptomycin.

発育障害抑制材中の糖の含有量は、発育障害抑制材の重量を基準として、創傷治癒の観点から、０．１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜５重量％である。
抗菌剤の含有量は、発育障害抑制材の重量を基準として、創傷治癒の観点から、０．００１〜１重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜０．１重量％である。 The sugar content in the growth-impairing inhibitor is preferably 0.1 to 10% by weight, more preferably 0.5 to 5% by weight, based on the weight of the growth-impairing inhibitor from the viewpoint of wound healing. ..
The content of the antibacterial agent is preferably 0.001 to 1% by weight, more preferably 0.005 to 0.1% by weight, based on the weight of the growth-impairing inhibitor, from the viewpoint of wound healing.

本発明の発育障害抑制材の製造方法は、上記タンパク質（Ａ）を５０重量％以上、１００重量％未満含有するタンパク質水溶液を凍結乾燥する発育障害抑制材の製造方法である。
タンパク質水溶液中のタンパク質（Ａ）の含有量は、細胞親和性の観点から、タンパク質水溶液の重量を基準として、７０重量％以上、１００重量％未満が好ましく、さらに好ましくは８０重量％以上、１００重量％未満である。 The method for producing a growth-inhibitory inhibitor of the present invention is a method for producing a growth-inhibitory inhibitor in which an aqueous protein solution containing 50% by weight or more and less than 100% by weight of the protein (A) is freeze-dried.
From the viewpoint of cell affinity, the content of the protein (A) in the aqueous protein solution is preferably 70% by weight or more and less than 100% by weight, more preferably 80% by weight or more and 100% by weight, based on the weight of the aqueous protein solution. Less than%.

タンパク質水溶液中は、糖及び／又は抗菌剤を含んでもよい。
タンパク質水溶液中の糖の含有量は、滲出液吸収の観点から、タンパク質水溶液の重量を基準として、０．０１〜５重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１重量％である。
タンパク質水溶液中の抗菌剤の含有量は、創傷治癒の観点から、タンパク質水溶液の重量を基準として、０．００００１〜１重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜０．１重量％である。 The aqueous protein solution may contain sugars and / or antibacterial agents.
From the viewpoint of exudate absorption, the sugar content in the protein aqueous solution is preferably 0.01 to 5% by weight, more preferably 0.1 to 1% by weight, based on the weight of the protein aqueous solution.
From the viewpoint of wound healing, the content of the antibacterial agent in the aqueous protein solution is preferably 0.00001 to 1% by weight, more preferably 0.0001 to 0.1% by weight, based on the weight of the aqueous protein solution.

凍結乾燥は、公知の凍結乾燥方法を用いることができる。
凍結乾燥には、一次乾燥と二次乾燥がある。一次乾燥とは、試料表面から氷を昇華させるものである。二次乾燥とは、分子間に結合している水を除くものである。
凍結乾燥において、一次乾燥の温度は、タンパク質の立体構造維持の観点から、０℃以下が好ましく、さらに好ましくは−１０℃以下である。また、二次乾燥の温度は、タンパク質の立体構造維持の観点から、１０〜３０℃が好ましく、さらに好ましくは、１０〜２０℃である。
凍結乾燥時間は、タンパク質の立体構造維持の観点から、一次乾燥と二次乾燥との合計で、１２〜４８時間が好ましく、さらに好ましくは１８〜４２時間である。 For freeze-drying, a known freeze-drying method can be used.
Freeze-drying includes primary drying and secondary drying. Primary drying is the sublimation of ice from the sample surface. Secondary drying is the removal of water bound between molecules.
In freeze-drying, the temperature of the primary drying is preferably 0 ° C. or lower, more preferably −10 ° C. or lower, from the viewpoint of maintaining the three-dimensional structure of the protein. The temperature of the secondary drying is preferably 10 to 30 ° C., more preferably 10 to 20 ° C. from the viewpoint of maintaining the three-dimensional structure of the protein.
From the viewpoint of maintaining the three-dimensional structure of the protein, the freeze-drying time is preferably 12 to 48 hours, more preferably 18 to 42 hours in total of the primary drying and the secondary drying.

本発明の発育障害抑制材を患部に適用する方法としては、従来用いられている脱脂綿と同様の方法で用いることができ、例えば、患部の壊死組織を除去した後、患部に合わせた形に加工した発育障害抑制材を乗せて、ポリウレタンフィルム等で覆う等が挙げられる。 As a method of applying the growth-impaired inhibitor of the present invention to the affected area, it can be used in the same manner as the conventionally used absorbent cotton. For example, after removing the necrotic tissue of the affected area, it is processed into a shape suitable for the affected area. It is possible to put the growth-impaired inhibitory material on it and cover it with a polyurethane film or the like.

本発明の発育障害抑制材は、滲出液を吸収し、吸収した滲出液を適度に創傷部に留まらせることができ、創傷部を菌に感染しにくくさせることができる。また、本発明の発育障害抑制材は、生分解性に優れているため、熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創、褥瘡性皮膚潰瘍及び糖尿病性皮膚潰瘍等の創傷を治癒する発育障害抑制材として好適に用いることができる。 The growth-impaired inhibitor of the present invention can absorb exudate, allow the absorbed exudate to appropriately stay in the wound, and make the wound less susceptible to bacterial infection. In addition, since the growth-impairing inhibitor of the present invention is excellent in biodegradability, it heals wounds such as burns, skin collection wounds, skin ablation wounds and traumatic skin defect wounds, decubitus skin ulcers and diabetic skin ulcers. It can be suitably used as a growth-impairing inhibitor.

以下に実施例として本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail below as examples, but the present invention is not limited to these examples.

＜製造例１＞
［ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製］
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰ８Ｋ生産株を用いて、配列（２３）のタンパク質（Ａ）であるＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）を生産する方法を示す。 <Manufacturing example 1>
[Preparation of SELP8K protein (A1-1)]
-Production of SELP8K protein (A1) A plasmid pPT0345 encoding SELP8K was prepared according to the method described in Examples of Japanese Patent No. 4088341.
The prepared plasmid was transformed into Escherichia coli to obtain a SELP8K-producing strain. Hereinafter, a method for producing the SELP8K protein (A1), which is the protein (A) of the sequence (23), will be shown using this SELP8K-producing strain.

○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の培養
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）培養した。培養液が濁度ＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、４０ｍｌを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間培養した。培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。 ○ Culture of SELP8K protein (A1) Using an overnight culture solution of a SELP8K-producing strain grown at 30 ° C., 50 ml of LB medium in a 250 ml flask was inoculated. Kanamycin was added to a final concentration of 50 μg / ml, and the culture broth was cultured at 30 ° C. with stirring (200 rpm). When the culture solution had turbidity OD600 = 0.8 (absorbance meter UV1700: manufactured by Shimadzu Corporation), 40 ml was transferred to a flask preheated to 42 ° C. and cultured at the same temperature for about 2 hours. The cultured culture solution was cooled on ice, the turbidity OD600 of the culture solution was measured, and Escherichia coli was collected by centrifugation.

○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製
集菌した大腸菌を、下記１：菌体溶解、２：遠心分離による不溶性細片の除去、３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー、６：限外濾過、７：凍結乾燥により大腸菌バイオマスから精製した。このようにして、分子質量が約８０ｋＤａの配列（２３）のタンパク質（Ａ１）の精製物であるＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を得た。 ○ Purification of SELP8K protein (A1) The collected Escherichia coli is subjected to the following 1: cell lysis, 2: removal of insoluble fragments by centrifugation, 3: sulfur precipitation, 4: ultrafiltration, 5: anion exchange chromatography. , 6: Purified from Escherichia coli biomass by ultrafiltration and 7: freeze-drying. In this way, a SELP8K protein (A1-1), which is a purified product of the protein (A1) having a molecular weight of about 80 kDa (23), was obtained.

１：菌体溶解
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。 1: Bacterial lysis 200 g of deionized water was added to 100 g of collected Escherichia coli, and the cells were dissolved with a high-pressure homogenizer (55 MPa) to obtain a bacterial cell lysate containing the dissolved cells. Then, the cell lysate was adjusted to pH 4.0 with glacial acetic acid.

２：遠心分離による不溶性細片の除去
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。 2: Removal of insoluble fragments by centrifugation Further, the cell lysate was centrifuged (6300 rpm, 4 ° C., 30 minutes), and the supernatant was collected.

３：硫安沈殿
回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。溶解した液に対して、同様に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。 3: Ammonium sulfate precipitation A saturated ammonium sulfate solution was added to the recovered supernatant so that the ammonium sulfate concentration was 25% by weight. Then, after allowing to stand for 8 to 12 hours, the precipitate was collected by centrifugation. The recovered precipitate was dissolved in deionized water. Similarly, a saturated ammonium sulfate solution was added to the dissolved solution so that the ammonium sulfate concentration was 25% by weight. Then, after allowing to stand for 8 to 12 hours, the precipitate was collected by centrifugation. The recovered precipitate was dissolved in deionized water to obtain a solution.

４：限外濾過
３で得た溶液を分子質量３０，０００カットの限外濾過装置（ホロファーバー：ＧＥヘルスケア製）に供した。３で得た溶液に対して、１０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のタンパク質を得た。 4: Ultrafiltration The solution obtained in 3 was subjected to an ultrafiltration device (holofer bar: manufactured by GE Healthcare) having a molecular weight of 30,000 cuts. Ultrafiltration was carried out using 10 times the amount of deionized water with respect to the solution obtained in No. 3, and the protein after ultrafiltration was obtained.

５：陰イオン交換クロマトグラフィー
限外濾過後のタンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解して２０ｇ／Ｌとし、陰イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（アマシャム社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ １０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。 5: Anion exchange chromatography The protein after ultrafiltration was dissolved in 10 mM sodium acetate buffer to 20 g / L, and an anion exchange column HiPrepSP XL16 / 10 (manufactured by GE Healthcare) was set in AKTAPlime (Amersham). Made). The eluate fraction was recovered using 500 mM 10 mM sodium acetate buffer as the eluate.

６：限外濾過
５で得た溶液を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のタンパク質を得た。 6: Ultrafiltration The solution obtained in 5 was treated in the same manner as in "4: Ultrafiltration" above to obtain a protein after ultrafiltration.

７：凍結乾燥
タンパク質を脱イオン水に溶解して５ｇ／Ｌとし、水位が１５ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れる。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−４０℃、１６時間かけて凍結させる。凍結後、真空度が８Ｐａ以下、−２０℃で、９０時間かけて１次乾燥、真空度が８Ｐａ以下、２０℃で、２４時間かけて２次乾燥させ、精製したＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を得た。 7: Lyophilize Protein is dissolved in deionized water to 5 g / L, and placed in a stainless steel vat so that the water level is 15 mm or less. Then, it is placed in a freeze dryer (manufactured by Nihon Techno Service Co., Ltd.) and frozen at -40 ° C for 16 hours. After freezing, SELP8K protein (A1-1) purified by primary drying at a vacuum degree of 8 Pa or less and -20 ° C for 90 hours and secondary drying at a vacuum degree of 8 Pa or less and 20 ° C. for 24 hours. Got

○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の同定
得られたＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を下記の手順で同定した。
ラビット抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対するラビット抗６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いて、得られたタンパク質（Ａ１−１）をウエスタンブロット法により分析した。見かけ分子質量８０ｋＤａのタンパク質バンドが、各抗体に抗体反応性を示した。また得られたタンパク質をアミノ酸分析システム（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ島津製作所社製）によるアミノ分析に供した結果、該生成物が、グリシン（４３．７重量％）、アラニン（１２．３重量％）、セリン（５．３重量％）、プロリン（１１．７重量％）及びバリン（２１．２重量％）に富むものであった。また、該生成物はリシンを１．５重量％含んでいた。下記の表１は、精製された生成物の組成と、合成遺伝子配列から推測された予測理論組成との相関関係を示す。
したがって、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）はＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）であり、ポリペプチド鎖（Ｙ）中のバリンのうち１個がリシンに置換された（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３配列（６）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）を１３個及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）_４配列（５）のポリペプチド鎖（Ｙ１１）を１２個有し、これらが交互に化学結合してなる配列（２３）のタンパク質であることを確認した。 -Identification of SELP8K protein (A1-1) The obtained SELP8K protein (A1-1) was identified by the following procedure.
The obtained protein (A1-1) was analyzed by Western blotting using a rabbit anti-SELP8K antibody and a rabbit anti-SELP8K antibody (manufactured by Roland) against a 6 × His tag of the C-terminal sequence. A protein band with an apparent molecular weight of 80 kDa showed antibody reactivity with each antibody. Further, as a result of subjecting the obtained protein to amino analysis by an amino acid analysis system (manufactured by Prominence Shimadzu Corporation), the products were glycine (43.7% by weight), alanine (12.3% by weight), and serine (5). It was rich in 0.3% by weight), proline (11.7% by weight) and valine (21.2% by weight). The product also contained 1.5% by weight lysine. Table 1 below shows the correlation between the composition of the purified product and the predicted theoretical composition inferred from the synthetic gene sequence.
Therefore, the SELP8K protein (A1-1) is a polypeptide chain (Y) in which eight GVGVP sequences (3) are consecutive, and one of the valine in the polypeptide chain (Y) is replaced with lysine (GVGVP). ) ₄ GKGVP (GVGVP) 13 consecutive polypeptide chains (Y'11) of ₃ sequences (6) and 4 consecutive GAGAGS sequences (1) (GAGAGS) Polypeptide chains (Y11) of ₄ sequences (5) It was confirmed that there were 12 proteins, and these were the proteins of the sequence (23) formed by alternately chemically binding.

＜ウエスタンブロット法＞
ウエスタンブロット用サンプル２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３００ｍＭ ジチオスレイトール、６％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３％ ブロモフェノールブルー、及び３０％ グリセロールを含む）１０μＬを添加して９５℃で、５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをフッ化ポリビニリデンメンブレン（以下、単に「メンブレン」ともいう）にトランスファーし、これをブロッキングバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、及び５％ スキムミルクを含む）に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）をＴＢＳ−Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ＥＣＬ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＴＢＳ−Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、ＥＣＬ−Ａｄｖａｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により酵素反応を行った。ルミノメーターＦｏｒＥＣＬ（アマシャム社製）を用いて、高感度インスタント黒白フィルム（富士フイルム株式会社製）に感光させ、バンドを可視化した。肉眼でバンドが確認できない場合、タンパク質（Ａ１−１）が分解吸収され、無くなったと判断した。 <Western blotting>
20 μL of Western blot sample containing 3 × SDS treatment buffer (containing 150 mM Tris HCl (pH 6.8), 300 mM dithiothreitol, 6% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.3% bromophenol blue, and 30% glycerol) 10 μL was added and heated at 95 ° C. for 5 minutes to prepare a sample for electrophoresis. SDS-PAGE was performed using 15 μL of this electrophoresis sample. After migration, the gel is transferred to a polyvinylidene fluoride membrane (hereinafter, also simply referred to as “membrane”), which is transferred to a blocking buffer (20 mM Tris (pH 7.6), 137 mM NaCl, 0.1% Tween 20, and 5% skim milk. The membrane was blocked by immersing it in (including) and shaking it at room temperature for 1 hour. After the blocking treatment, the membrane was washed with TBS-T (containing 20 mM Tris (pH 7.6), 137 mM NaCl, and 0.1% Tween 20) for 2 minutes. Next, the membrane is immersed in a primary antibody solution (primary antibody: anti-His-tag antibody (manufactured by Rockland) diluted 1/500 with TBS-T) and allowed to stand overnight at 4 ° C. to obtain the antibody. The reaction was carried out. After the reaction, this membrane was washed with TBS-T for 5 minutes four times, and then a solution of a secondary antibody (secondary antibody: ECL anti-) that was capable of binding to the primary antibody and bound to horseradish peroxidase as a labeling enzyme. Immerse the membrane in a solution of rabbit IgG HRP linked F (ab') 2 fragment (manufactured by GE Healthcare Bioscience) diluted to 1/2000 with TBS-T) and allow it to stand at room temperature for 30 minutes for antibody reaction. Was done. After the reaction, the membrane was washed with TBS-T for 5 minutes four times, and then an enzymatic reaction was carried out by ECL-Advance Western Blotting Detection Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience). The band was visualized by exposing it to a high-sensitivity instant black-and-white film (manufactured by FUJIFILM Corporation) using a luminometer ForECL (manufactured by Amersham Co., Ltd.). When the band could not be confirmed with the naked eye, it was judged that the protein (A1-1) was decomposed and absorbed and disappeared.

○βターン構造とランダムコイル構造との合計割合の測定
得られたＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を用いて下記の手順でβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合を測定した。
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）水溶液を作製した。作製したＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光：Ｊ−８２０）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）を用いて、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を算出した。結果を表２に示す。
＜製造例２＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、下記「５−２：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−２）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５−２：リフォールディング（大希釈法）
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である１０Ｍウレア溶液にて、６Ｍウレア溶液となるように調製し、１２時間、４℃で静置した。調製した溶液を透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）に投入し、溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。この操作を残り３回、計５回の透析を繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。 ○ Measurement of total ratio of β-turn structure and random coil structure Using the obtained SELP8K protein (A1-1), the total ratio of β-turn structure and random coil structure was measured by the following procedure.
SELP8K protein (A1-1) was dissolved in deionized water (4 ° C.) so as to be 0.3 mg / ml to prepare an aqueous solution of SELP8K protein (A1-1). The prepared SELP8K protein (A1-1) aqueous solution was measured with a circular dichroism spectrum measuring instrument (JASCO Corporation: J-820) (measurement temperature: 4 ° C.), and a secondary structure analysis program (JWSSE type: JASCO Corporation) was used. The total ratio of β-turn structure and random coil structure was calculated using (manufactured by the company). The results are shown in Table 2.
<Manufacturing example 2>
In the "preparation of SELP8K protein (A1-1)" of Production Example 1, between "5: anion exchange chromatography" and "6: ultrafiltration" of "purification of SELP8K protein (A1)", the following SELP8K protein (A1-2) was prepared in the same manner except that "5-2: refolding (large dilution method)" was performed, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.
5-2: Refolding (large dilution method)
The elution fraction of the anion exchange chromatography was prepared to be a 6M urea solution with a 10M urea solution as a protein denaturant, and allowed to stand at 4 ° C. for 12 hours. The prepared solution was put into a dialysis membrane (manufactured by Viskase Companies, Inc.) and dialyzed against deionized water having a volume 10 times the elution fraction for 12 hours. Then, the deionized water was discarded, and dialysis was performed for 12 hours with a new volume of deionized water 10 times the volume of the eluted fraction. After repeating this operation three times, a total of five times, the solution in the dialysis membrane was recovered.

＜製造例３＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、下記「５−３：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−３）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５−３：リフォールディング（大希釈法）
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である１０Ｍウレア溶液にて、６Ｍウレア溶液となるように調製し、１２時間、４℃で静置した。調製した溶液を透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）に投入し、溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の３倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。溶出画分の３倍容量の脱イオン水による透析を残り５回繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。 <Manufacturing example 3>
In the "preparation of SELP8K protein (A1-1)" of Production Example 1, between "5: anion exchange chromatography" and "6: ultrafiltration" of "purification of SELP8K protein (A1)", the following SELP8K protein (A1-3) was prepared in the same manner except that "5-3: refolding (large dilution method)" was performed, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.
5-3: Refolding (large dilution method)
The elution fraction of the anion exchange chromatography was prepared to be a 6M urea solution with a 10M urea solution as a protein denaturant, and allowed to stand at 4 ° C. for 12 hours. The prepared solution was put into a dialysis membrane (manufactured by Viskase Companies, Inc.) and dialyzed against deionized water having a volume 10 times the elution fraction for 12 hours. Then, the deionized water was discarded, and dialysis was performed for 12 hours with a new volume of deionized water three times the volume of the eluted fraction. After repeating dialysis with 3 times the volume of deionized water of the eluted fraction for the remaining 5 times, the solution in the dialysis membrane was recovered.

＜製造例４＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」に代えて下記「５’：アフィニティクロマトグラフィー」とする以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−４）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５’：アフィニティクロマトグラフィー
「４：限外濾過」後のタンパク質を、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いたアフィニティクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア社製、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）にて精製し、溶出画分を回収した。 <Manufacturing example 4>
In the "preparation of SELP8K protein (A1-1)" of Production Example 1, the following "5': affinity chromatography" is used instead of "5: anion exchange chromatography" of "purification of SELP8K protein (A1)". SELP8K protein (A1-4) was prepared in the same manner except for the above, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.
5': Affinity chromatography The protein after "4: ultrafiltration" is purified by affinity chromatography using His-tag (manufactured by GE Healthcare, Ni Sepharose 6 Fast Flow), and the eluted fraction is collected. did.

＜比較製造例１＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」に代えて下記「５’’：アフィニティクロマトグラフィー」とする以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−５）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５’’：アフィニティクロマトグラフィー
「４：限外濾過」後のタンパク質を、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いたアフィニティクロマトグラフィー（クロンテック社製、ＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｅｐ Ｃｏｌｕｍｎｓ）にて精製し、溶出画分を回収した。 <Comparative manufacturing example 1>
In "Preparation of SELP8K protein (A1-1)" of Production Example 1, the following "5": Affinity chromatography "is used instead of" 5: Anion exchange chromatography "of" Purification of SELP8K protein (A1) ". SELP8K protein (A1-5) was prepared in the same manner except for the above, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.
5'': Affinity chromatography The protein after "4: ultrafiltration" is purified by affinity chromatography using His-tag (manufactured by Clontech, TALON® Single Step Volumes), and the eluted fraction. Was recovered.

＜比較製造例２＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施せず、上記「５’：アフィニティクロマトグラフィー」を行う以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−６）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。 <Comparative manufacturing example 2>
In the "preparation of SELP8K protein (A1-1)" of Production Example 1, perform "3: sulfur precipitation, 4: ultrafiltration, 5: anion exchange chromatography" of "purification of SELP8K protein (A1)". Instead, the SELP8K protein (A1-6) was prepared in the same manner except that the above "5': affinity chromatography" was performed, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.

＜比較製造例３＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施しない以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−７）を作製し、βシート構造率を測定した。結果を表２に示す。 <Comparative manufacturing example 3>
In the same manner as in "Preparation of SELP8K protein (A1-1)" of Production Example 1, SELP8K protein (A1-) except that "5: Anion exchange chromatography" of "Purification of SELP8K protein (A1)" is not performed. 7) was prepared, and the β-sheet structure ratio was measured. The results are shown in Table 2.

＜実施例１＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、濃度が１ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（１）を得た。タンパク質水溶液（１）を５０ｍｌ遠心管チューブ（アズワン製）に入れた。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−４０℃、１６時間かけて凍結させた。凍結後、真空度が８Ｐａ以下、−２０℃で、９０時間かけて１次乾燥し、真空度が８Ｐａ以下、２０℃で、２４時間かけて２次乾燥させ、発育障害抑制材（１）を得た。 <Example 1>
SELP8K protein (A1-1) is dissolved in 20 mM phosphate buffer (NaCl: 8 g / L, KCl: 0.2 g / L, pH 7.4) to obtain a protein aqueous solution (1) having a concentration of 1 mg / ml. It was. The aqueous protein solution (1) was placed in a 50 ml centrifuge tube (manufactured by AS ONE). Then, it was placed in a freeze dryer (manufactured by Nihon Techno Service Co., Ltd.) and frozen at −40 ° C. for 16 hours. After freezing, the vacuum degree of 8 Pa or less, -20 ° C, primary drying for 90 hours, and the vacuum degree of 8 Pa or less, 20 ° C, 24 hours for secondary drying, the growth disorder inhibitor (1). Obtained.

＜実施例２＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が２５．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（２）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（２）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（２）を得た。 <Example 2>
SELP8K protein (A1-1) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (2) having a concentration of 25.1 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (2) was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (2)" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜実施例３＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が４８．４ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（３）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（３）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（３）を得た。 <Example 3>
SELP8K protein (A1-1) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (3) having a concentration of 48.4 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (3) was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (3)" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜実施例４＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が１ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（４）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（４）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（４）を得た。 <Example 4>
SELP8K protein (A1-1) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (4) having a concentration of 1 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (4) was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (4)" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜実施例５＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が２４．７ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（５）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（５）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（５）を得た。 <Example 5>
SELP8K protein (A1-1) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (5) having a concentration of 24.7 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (5) was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (5)" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜実施例６＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が４８．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（６）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（６）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（６）を得た。 <Example 6>
SELP8K protein (A1-1) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain an aqueous protein solution (6) having a concentration of 48.2 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (6) was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (6)" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜実施例７＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が１ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（７）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（７）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（７）を得た。 <Example 7>
SELP8K protein (A1-1) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (7) having a concentration of 1 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (7) was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (7)" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜実施例８＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が２４．４ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（８）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（８）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（８）を得た。 <Example 8>
SELP8K protein (A1-1) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain an aqueous protein solution (8) having a concentration of 24.4 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (8) was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (8)" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜実施例９＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が４９．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（９）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（９）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（９）を得た。 <Example 9>
SELP8K protein (A1-1) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (9) having a concentration of 49.1 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (9) was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (9)" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜実施例１０＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−２）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（１０）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１０）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（１０）を得た。 <Example 10>
SELP8K protein (A1-2) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (10) having a concentration of 5 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (10) was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (10)" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜実施例１１＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−３）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（１１）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１１）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（１１）を得た。 <Example 11>
SELP8K protein (A1-3) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (11) having a concentration of 5 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (11) was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (11)" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜実施例１２＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−４）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（１２）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１２）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（１２）を得た。 <Example 12>
SELP8K protein (A1-4) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (12) having a concentration of 5 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (12) was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (12)" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜比較例１＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が０．０１ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（１’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１’）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（１’）を得た。 <Comparative example 1>
SELP8K protein (A1-1) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain an aqueous protein solution (1') having a concentration of 0.01 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (1') was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (1')" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜比較例２＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が１５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（２’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（２’）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（２’）を得た。 <Comparative example 2>
SELP8K protein (A1-1) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (2') having a concentration of 150 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (2') was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (2')" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜比較例３＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（３’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（３’）」を用いること及び発育障害抑制材中の水分含有率が２５．１％となるように調整すること以外は同様にして、発育障害抑制材（３’）を得た。 <Comparative example 3>
SELP8K protein (A1-1) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (3') having a concentration of 5 mg / ml.
Except for using "protein aqueous solution (3')" instead of "protein aqueous solution (1)" and adjusting the water content in the growth-impairing inhibitor to be 25.1% in Example 1. In the same manner, a growth disorder inhibitor (3') was obtained.

＜比較例４＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（４’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（４’）」を用いること及び発育障害抑制材中の水分含有率が３０．２％となるように調整すること以外は同様にして、発育障害抑制材（４’）を得た。 <Comparative example 4>
SELP8K protein (A1-1) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (4') having a concentration of 5 mg / ml.
Except for using "protein aqueous solution (4')" instead of "protein aqueous solution (1)" and adjusting the water content in the growth-impairing inhibitor to be 30.2% in Example 1. In the same manner, a growth disorder inhibitor (4') was obtained.

＜比較例５＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−５）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（５’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（５’）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（５’）を得た。 <Comparative example 5>
SELP8K protein (A1-5) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (5') having a concentration of 5 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (5') was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (5')" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜比較例６＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−６）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（６’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（６’）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（６’）を得た。 <Comparative Example 6>
SELP8K protein (A1-6) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (6') having a concentration of 5 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (6') was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (6')" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜比較例７＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−７）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度が５ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液（７’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（７’）」を用いる以外は同様にして、発育障害抑制材（７’）を得た。 <Comparative Example 7>
SELP8K protein (A1-7) was dissolved in 20 mM phosphate buffer to obtain a protein aqueous solution (7') having a concentration of 5 mg / ml.
In Example 1, a growth disorder inhibitor (7') was obtained in the same manner except that the "protein aqueous solution (7')" was used instead of the "protein aqueous solution (1)".

＜比較例８＞
発育障害抑制材として用いるコラーゲンスポンジ（オリンパステルモバイオマテリアル株式会社製、商品名「テルダーミス」）を準備した。 <Comparative Example 8>
A collagen sponge (manufactured by Olympus Terumo Biomaterials Co., Ltd., trade name "Terdermis") used as a growth inhibitory material was prepared.

＜評価１＞
○かさ密度の測定
遠沈管（アズワン社製）５０ｍｌ容量の重量（Ｇ_１）（ｍｇ）をそれぞれ小数点以下１桁まで測定した。
これらの遠沈管に、タンパク質水溶液（１）〜（１２）及び（１’）〜（７’）をそれぞれ１０ｍｌ入れ、実施例１〜１２及び比較例１〜７の条件で凍結乾燥させた。
凍結乾燥後の遠沈管の重さ（Ｇ_２）（ｍｇ）をそれぞれ小数点以下１桁まで測定した。また、遠沈管中の発育障害抑制材の体積（Ｖ）（ｍｌ）を、遠沈管の目盛りから読み取った。
得られた重量（Ｇ_１）、（Ｇ_２）及び体積（Ｖ）から、下記式によりかさ密度を算出した。結果を表３に示す。
かさ密度（ｍｇ／ｍｌ）＝｛（Ｇ_２）−（Ｇ_１）｝／（Ｖ） <Evaluation 1>
○ Measurement of bulk density The weight (G ₁ ) (mg) of a 50 ml volume of a centrifuge tube (manufactured by AS ONE Corporation) was measured to one digit after the decimal point.
In these centrifuge tubes, 10 ml of each of the aqueous protein solutions (1) to (12) and (1') to (7') was placed, and freeze-dried under the conditions of Examples 1 to 12 and Comparative Examples 1 to 7.
The weight (G ₂ ) (mg) of the centrifuge tube after freeze-drying was measured to one digit after the decimal point. In addition, the volume (V) (ml) of the growth-impaired inhibitor in the centrifuge tube was read from the scale of the centrifuge tube.
From the obtained weight (G ₁ ), (G ₂ ) and volume (V), the bulk density was calculated by the following formula. The results are shown in Table 3.
Bulk density (mg / ml) = {(G ₂ )-(G ₁ )} / (V)

＜評価２＞
○水分含有率の測定
発育障害抑制材（１）〜（１２）及び（１’）〜（７’）をそれぞれ０．１ｇ用いて、微量水分測定装置（平沼産業社製、「ＡＱ−２２００」）にて水分含有率を測定した。結果を表３に示す。 <Evaluation 2>
○ Measurement of water content A trace water content measuring device (manufactured by Hiranuma Sangyo Co., Ltd., "AQ-2200") using 0.1 g of each of the growth-impairing inhibitor (1) to (12) and (1') to (7') ) Measured the water content. The results are shown in Table 3.

＜評価３＞
（健常ラットを用いた口腔粘膜欠損層モデルでの治療試験）
５週齢Ｗｉｓｔｅｒ系ラットを準備し口蓋に３ｍｍ径の粘骨膜欠損創を作製した。発育障害抑制材（１）〜（１２）及び（１’）〜（７’）並びにコラーゲンスポンジを各々、投与し、ポリウレタンフィルムを貼付した。治療前ならびに治療期間４週目の犬歯間距離を計測し、術前を１００とした犬歯間成長率を算出した。
また、粘骨膜欠損創を作製しない５週齢Ｗｉｓｔｅｒ系ラットを準備し、準備直後及び準備から４週目の犬歯間距離を計測し準備直後を１００とした犬歯間成長率を算出した。この創傷を作製していないラットの犬歯間成長率を１００として、発育障害抑制材（１）〜（１２）及び（１’）〜（７’）並びにコラーゲンスポンジを用いた場合の発育障害抑制率を評価した。結果を表３に示す。 <Evaluation 3>
(Treatment test using a model of oral mucosal defect layer using healthy rats)
A 5-week-old Wister rat was prepared to prepare a 3 mm diameter periosteal defect wound on the palate. Growth disorder inhibitores (1) to (12) and (1') to (7') and collagen sponge were administered, respectively, and a polyurethane film was attached. The distance between the canines before the treatment and at the 4th week of the treatment period was measured, and the growth rate between the canines was calculated with the preoperative value as 100.
In addition, 5-week-old Wister rats that did not produce periosteal defect wounds were prepared, and the canine interdental distance was measured immediately after preparation and 4 weeks after preparation, and the canine growth rate was calculated with 100 immediately after preparation. Assuming that the canine interdental growth rate of the rat in which this wound is not prepared is 100, the growth disorder suppression rate when the growth inhibition materials (1) to (12) and (1') to (7') and collagen sponge are used. Was evaluated. The results are shown in Table 3.

本発明の発育障害抑制材は、口蓋裂などの先天異常、鼻口腔瘻、上顎洞口腔瘻、食道瘻、気管支瘻、などの瘻孔に代表される生体の粘膜欠損を、適正かつ安全に再建、閉鎖、修復できる発育障害抑制材として有用である。 The growth-impairing inhibitor of the present invention properly and safely reconstructs mucosal defects of living organisms represented by fistulas such as congenital abnormalities such as palatal fissures, nasal and oral fistulas, maxillary sinus oral fistulas, esophageal fistulas, and bronchial fistulas. It is useful as a growth disorder inhibitor that can be closed and repaired.

Claims (7)

ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）を含む、口腔粘膜の創収縮に伴う粘膜組織の発育障害抑制材であって、
円二色性スペクトル法により求めた前記タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合が６０〜８５％であり、
前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち前記アミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の個数及び前記アミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸の個数の占める合計の割合が５０〜７０％であり、
前記発育障害抑制材が綿状であり、
前記発育障害抑制材のかさ密度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌであり、
前記発育障害抑制材中の水分含有率が０重量％を超え、２０重量％以下である発育障害抑制材。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１個又は２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。 A material for suppressing the growth disorder of mucosal tissue associated with wound contraction of the oral mucosa, which comprises the GAGAGS sequence (1) and the protein (A) having the following amino acid sequence (X) and / or the following amino acid sequence (X').
The total ratio of the β-turn structure and the random coil structure of the protein (A) determined by the circular dichroism spectral method is 60 to 85%.
The total ratio of the number of amino acids in the amino acid sequence (X) and the number of amino acids in the amino acid sequence (X') to the total number of amino acids in the protein (A) is 50 to 70%.
The growth-impaired inhibitor is cotton-like and
The bulk density of the growth-impaired inhibitor is 0.1 to 100 mg / ml.
A growth-impaired inhibitor having a water content of more than 0% by weight and 20% by weight or less in the growth-impaired inhibitor.
Amino acid sequence (X): At least one amino acid sequence selected from the group consisting of VPGVG sequence (2), GVGVP sequence (3) and GAHGPAGPK sequence (4).
Amino acid sequence (X'): An amino acid sequence in which one or two amino acids in the amino acid sequence (X) are replaced with lysine or arginine, respectively. 前記タンパク質（Ａ）１分子中の、前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数と前記アミノ酸配列（Ｘ）及び前記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比率｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）：アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝が、１：２〜１：６である請求項１に記載の発育障害抑制材。 Ratio of the number of the GAGAGS sequence (1) in one molecule of the protein (A) to the total number of the amino acid sequence (X) and the amino acid sequence (X') {GAGAGS sequence (1): amino acid sequence (X'). ) And the sum of the amino acid sequences (X')}, according to claim 1, wherein the growth-impaired inhibitor. 前記タンパク質（Ａ）が、前記アミノ酸配列（Ｘ）の１種が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、
前記タンパク質（Ａ）中の前記ポリペプチド鎖（Ｙ）と前記ポリペプチド鎖（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個である請求項１又は２に記載の発育障害抑制材。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：ポリペプチド鎖（Ｙ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）の全アミノ酸の個数の０．１〜２０％のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖。 The protein (A) has 2 to 200 consecutive polypeptide chains (Y) and / or the following polypeptide chains (Y') in one of the amino acid sequences (X).
The growth-impaired inhibitor according to claim 1 or 2, wherein the total number of the polypeptide chain (Y) and the polypeptide chain (Y') in the protein (A) is 1 to 100.
Polypeptide chain (Y'): In the polypeptide chain (Y), 0.1 to 20% of the total number of amino acids in the polypeptide chain (Y) is replaced with lysine or arginine, respectively. 前記タンパク質（Ａ）が、前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ）を有する請求項１〜３のいずれかに記載の発育障害抑制材。 The growth-impairing inhibitor according to any one of claims 1 to 3, wherein the protein (A) has a polypeptide chain (S) in which the GAGAGS sequence (1) is continuous from 2 to 200. 前記タンパク質（Ａ）において全アミノ酸の個数のうち前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の個数が占める割合が５〜５０％である請求項１〜４のいずれかに記載の発育障害抑制材。 The growth-impaired inhibitor according to any one of claims 1 to 4, wherein the ratio of the number of amino acids in the GAGAGS sequence (1) to the total number of amino acids in the protein (A) is 5 to 50%. 前記タンパク質（Ａ）が、（ＧＡＧＡＧＳ）_４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３配列（６）を有するタンパク質（Ａ１１−１−１）である請求項１〜５のいずれかに記載の発育障害抑制材。 One of claims 1 to 5, wherein the protein (A) is a protein (A11-1-1) having (GAGAGS) ₄ sequences (5) and (GVGVP) ₄ GKGVP (GVGVP) ₃ sequences (6). Described growth disorder inhibitor. 前記タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量が１５〜２００ｋＤａである請求項１〜６のいずれかに記載の発育障害抑制材。 The growth-impairing inhibitor according to any one of claims 1 to 6, wherein the protein (A) has a molecular weight of 15 to 200 kDa by SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis).