JP6740244B2 - ヘテロ多量体タンパク質複合体のアセンブリおよび産生を最適化する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年3月31日に出願された米国仮特許出願第62/141,009号の優先権を主張し、当該出願の各内容は、その全体が本明細書において参考として援用される。
複合体のアセンブリのために必要とされる各構成成分の発現レベルを調整することによってタンパク質複合体の発現を改善する方法が提供される。これらの方法は、優勢な鎖の発現を制限し、こうしてそれらの相対的存在度を平衡させるのに有効である。本明細書で提供される方法は、一時的発現系ならびに安定してトランスフェクトされた哺乳動物細胞の両方における生産性と最終二重特異的収率との有意な増加をもたらす。
細菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物の細胞での組換え発現は、研究ならびに治療的適用のために使用されるタンパク質の生成のための基礎となる。最近、培地組成、発酵パラメータなどの複数のパラメータを最適化することによって、ならびに目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現を作動するために使用される構築物の最適化によって、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞での組換えタンパク質発現の収率が有意に増強された。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
1つを超えるポリペプチドを含むタンパク質複合体の生成収率を増加させる方法であって、
(a)前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸分子を用意すること;
(b)前記核酸分子を細胞に導入すること;
(c)前記タンパク質複合体中のポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記細胞を培養すること;および
(d)前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの少なくとも1つの発現を減少させること
を含む方法。
(項目2)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、転写率、翻訳率またはmRNA安定性の改変によって達成される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、mRNA二次構造の改変によって達成される、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、転写率の改変、翻訳率の改変、mRNA安定性の改変、mRNA二次構造の改変、またはこれらの要素の任意の組合せの改変によって達成される、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、そのポリペプチドのコドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、前記タンパク質複合体の発現のために使用される宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドの前記コドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、前記タンパク質複合体の発現のために使用される哺乳動物宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドの前記コドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記タンパク質複合体が多重特異的抗体である、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記タンパク質複合体が二重特異的抗体である、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記二重特異的抗体が2つの異なる軽鎖および共通の重鎖で構成される、項目9に記載の方法。
(項目11)
1つを超えるタンパク質複合体が共発現される、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記タンパク質複合体が抗体であり、1つを超える抗体が共発現される、項目11に記載の方法。
特記されない限り、本開示に関連して使用される科学的および専門用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈から特に必要とされない限り、単数形用語は複数形を含み、複数形用語は単数形を含むものとする。一般的に、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴ−またはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、およびその技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。組換えDNAおよびオリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション)のために、標準技術が使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野で一般的に達成される通りに、または本明細書に記載される通りに実行される。前述の技術および手順は、当技術分野で周知である従来の方法に従って、ならびに本明細書全体において引用され、議論される様々な一般的およびより特定の参考文献に記載される通りに一般的に実行される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989年))を参照。本明細書に記載される分析化学、有機合成化学ならびに医薬および製薬化学に関連して利用される命名法、ならびにその検査法および技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、送達および患者の治療のために、標準技術が使用される。
κλ体技術に基づく抗CD19×抗CD47二重特異的抗体44は、共通の重鎖および2つの異なる軽鎖によって構成される。これらの鎖は、プラスミド構築物44によってコードされる(表1)。この発現プラスミドが哺乳動物の細胞でトランスフェクトされるとき、3本の鎖のランダムなアセンブリによって3つの分子が生成される:単一特異的なIgGκ(2つの同一のκ軽鎖を含有する)、単一特異的なIgGλ(2つの同一のλ軽鎖を含有する)および二重特異的IgGκλ(1つのκ軽鎖および1つのλ軽鎖を含有する)。2つの軽鎖が同じ発現率で発現され、同じようにアセンブルされるならば、3つの分子の理論比はIgGκ25%、IgGλ25%およびIgGκλ50%であるはずである。構築物44の場合、二重特異的抗体の最適以下の発現および収率につながるλ軽鎖の優先発現がある。この状況を改善するために、鎖の相対比を調整するために異なる鎖の最適化ならびに脱最適化が実行された。
共通の重鎖および2本の軽鎖(1つのカッパおよび1つのラムダ)の野生型、最適化または脱最適化されたコドンを、3つの独立したCMVプロモーターの下に単一の哺乳動物の発現pNOVIベクターにクローニングした。配列検証の後、Lipofectamine2000を使用して2つの独立した一時的トランスフェクションによって、各構築物のIgG生産性をPeak細胞で評価した。トランスフェクションの7日後に、全体のIgG発現をOctet技術によって評価した。候補15を除いて、全体のIgG生産性に関して候補間に大きな差は観察されなかった。全ての鎖が最適化された構築物15で、生産性の低下傾向が観察された(図2)。PEAK細胞での10日間の生成の後、全体のIgGをFc XL樹脂で精製した。
エレクトロポレーションによるトランスフェクションおよびMSXによる選択の後、FACSによるスクリーニングを実行した。流加条件での生産のために、最も高い生産性のプールを選択した。Octet技術によって、全体のIgG生産性を異なるプールについて評価した(図5)。プロテインAによる精製の後、還元および変性条件で重鎖および軽鎖のサイズをモニタリングするAgilentタンパク質80チップでの電気泳動によって、異なる鎖の比を評価した。
Claims (9)
- 1つを超えるポリペプチドを含むタンパク質複合体の生成収率を増加させる方法であって、
(a)前記複合体中の他のポリペプチドと比較して、細胞内でより豊富に発現される前記複合体中の1つまたは複数のポリペプチドを同定すること;
(b)前記複合体中の前記より豊富に発現されるポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子を改変して、それがコードする前記ポリペプチドの発現の低減をもたらすこと;
(c)前記核酸分子を細胞に導入すること;および
(d)前記タンパク質複合体中のポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記細胞を培養すること
を含み、前記タンパク質複合体が二重特異的抗体である、方法。 - 前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、転写率、翻訳率またはmRNA安定性の改変によって達成される、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、mRNA二次構造の改変によって達成される、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、転写率の改変、翻訳率の改変、mRNA安定性の改変、mRNA二次構造の改変、またはこれらの要素の任意の組合せの改変によって達成される、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、そのポリペプチドのコドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、請求項4に記載の方法。
- 前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、前記タンパク質複合体の発現のために使用される宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドの前記コドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、請求項5に記載の方法。
- 前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、前記タンパク質複合体の発現のために使用される哺乳動物宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドの前記コドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、請求項6に記載の方法。
- 前記二重特異的抗体が2つの異なる軽鎖および共通の重鎖で構成される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 1つを超えるタンパク質複合体が共発現される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
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