JP6734853B2 - 網膜変性処置のためのotx2過剰発現トランスジェニック網膜色素上皮細胞 - Google Patents
網膜変性処置のためのotx2過剰発現トランスジェニック網膜色素上皮細胞 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6734853B2 JP6734853B2 JP2017533228A JP2017533228A JP6734853B2 JP 6734853 B2 JP6734853 B2 JP 6734853B2 JP 2017533228 A JP2017533228 A JP 2017533228A JP 2017533228 A JP2017533228 A JP 2017533228A JP 6734853 B2 JP6734853 B2 JP 6734853B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- otx2
- rpe
- cells
- retinal degeneration
- treatment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
- C12N15/8645—Adeno-associated virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
通常、発現カセットは、転写プロモーター及び転写ターミネーターに操作可能に連結されたOTX2をコードする核酸配列を含むか、又は該核酸配列からなる。
<動物>
色素ジストロフィー性RCS(rdy−/−、p+)ラットをパリ市視覚研究所(Institute de la Vision)の動物施設にて飼育した。成体(雄と雌)の受容動物は、移植時に生後18日齢であった。すべての実験は、眼科及び視力研究における動物の使用についての動物実験倫理委員会(チャールズダーウィン)によって改訂及び認可された、神経科学研究における動物及びヒトの使用の方針に従って行われている。標準的な12時間毎の明暗周期で動物を飼育し、視力機能のすべての評価は、明期の最初の8時間で行われた。すべての動物に、移植の2日前からサクリファイスされる日まで、経口の210mg/lのシクロスポリンA(MerckMillipore239835)投与を飲料水で行った。
網膜剥離有り又は無しの死後のヒト網膜試料、コントロール試料、及び、ブタの天然又は培養初代網膜色素上皮細胞をグアニジン塩酸塩溶液に配置し、塩化セシウム(CsCl2)法を用いて全RNAを精製した(Delyfer等、2013年)。短時間で、組織・細胞試料をポリトロン(Kimematica PT2100)を用いて6MグアニジンHCl内でホモジナイズした。ホモジナイズ後に、試料をpH5.0の2M酢酸カリウムとともに10分室温(RT)でインキュベートし、その後20℃で5,000rpmの遠心分離を10分行った。上清をpH8で5.3mlの100mMTris−HCl、1%N−ラウロイルザルコシン、3.2gのCsCl2に混合し、ポリアロマー超遠心分離チューブ(Rotor SW 41 TI、Beckman)の1.8mlのCsCl/EDTA上部に移して、CsCl勾配を作製した。試料をOptima LE80k(Beckman)を用いて、20℃で24時間、35,000rpmで遠心分離した。ペレットをpH7.5で150μlの10mMTris−HCl、1mMのEDTA、0.1%SDSと、pH7.5で150μlの10mMTris−HCl、1mMのEDTAとに再懸濁した。全RNAをフェノール・クロロホルム抽出を用いて精製し、ジエチルピロカルボネート(diethylpyrocarbonate、DEPC)水に再懸濁した。変性ゲル電気泳動法によりRNA完全性を評価した。
製造者の指示に従ってランダムプライマー(Promega)及びSuper ScriptII逆転写酵素(Invitrogen)を用いて、1μgの全RNAから一本鎖状cDNAを合成した。短時間で、DNAseI(Life technologies、18068−015)処理及び65℃で5分間の不活化後の1μgの全RNAを、5ユニット(U)のRNasinPlus(Promega)、100ngランダムプライマー(Promega)、10mMのdNTP(Invitrogen)、0.1MのDTT、及び4Uの逆転写酵素と混合した。試料を42℃で50分間インキュベートし、72℃で15分間のインキュベーションによって酵素反応を不活化した。ヒト試料、ヒト誘導多能性幹細胞(iPS)由来RPE細胞、及びブタの初代RPE細胞における遺伝子内在発現を遺伝子特異的プライマーを使用してリアルタイムPCRによって定量化した。解析前にプライマー効率を測定し、90%〜110%及びR2≒1である効率を持つプライマーのみを定量化解析に用いた。10ngのcDNAを0.1mMのフォワード・リバースプライマー混合物及び1×powerSYBRGreen(Invitrogen、4367659)に混合した。増幅及び振幅の解析(サイクル閾値(cycle threshold、Ct)を7500リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)を用いて行い、短期間で、95℃で1サイクルを含む第1のセクション、95℃で15秒の次に60℃で20秒の40サイクルの第2のセクション、95℃で1分、55℃で30秒、95℃で30秒の1サイクルの第3のセクションを行った。各遺伝子発現は、製造者の指示に従ってΔCt式法を用いてハウスキーピング遺伝子発現によって正規化された。ヒト網膜剥離における解析とhiPS−RPE及びブタ初代RPE細胞における遺伝子スクリーニングとのために、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase、GAPDH)をハウスキーピング遺伝子として用いた。ヒトiPS−RPEの特性評価のために、18SrRNAをハウスキーピング遺伝子として用いた。比較解析のため、製造者の指示に従ってΔΔCt式法を用いて結果を算出し、表された倍数を2−ΔCt及び/又は2−ΔΔCtとして示した。
ベクタープラスミドpAAV2−CMV−eGFPは、アデノ随伴ウイルス2(AAV2)ゲノム、及びサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの制御下でeGFPをコードする導入遺伝子カセットを有する。pAAV2−CMV−eGFPプラスミドのeGFPをNotI(5’)及びBamHI(3’)制限酵素部位においてOtx2スプライシング変異体のCDSで置換することで、プラスミドpAAV2−CMV−Otx2v(スプライシング変異体)を構築した。フォワードプライマー5’GTGTCCAGGCGGCCGCAAAAATGATGTCTTATCTAAA(配列番号1)及びリバースプライマー5’AATCGGATCCCGATATCTCACAAAACCTGGAATTTCCA(配列番号2)を用いた高性能PCRによって、ラットOtx2及びOtx2LフラグメントをそれぞれプラスミドLA0ACA144YK13CM1及びLA0ACA6YL17.CONTIGから(http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/)増幅した。ヘルパープラスミド(pHelper)は、3つのアデノウイルスヘルパー遺伝子VA、E4及びE2Aや、AAV1カプシドのタンパク質をコードするプラスミドpLT−RC02を提供する(Acland等、2005年)。
CMVプロモーターの制御下において、緑色蛍光タンパク質(GFP)又はOtx2、及びOtx2Lスプライシング変異体をコードする導入遺伝子カセットを有するAAV2ベクターをAAV1カプシドにパッケージングした。短時間で、15×106HEK293細胞に、12μgのpHelperプラスミド、10μgのpLT−RC02、及び6μgのpAAV2−CMV−eGFP、pAAV2−CMV−Otx2、又はpAAV2−CMV−Otx2Lプラスミドのいずれかを、トリプル遺伝子導入した。これらの構築物を、120μlの1μg/μlポリエチレンイミン(PEI)及び500μlのDMEMと混合した。遺伝子導入後48時間で細胞を採取した。上清を、1×ポリエチレングリコール(PEG)溶液(8%PEG、5MのNaCl)で4℃において2時間インキュベートした。細胞を凍結・解凍の3サイクルで溶解し、溶解緩衝液(0.15MのNaCl、50mMのTris−Cl、pH8.5)に再懸濁した。細胞溶解物をPEGペレットと合わせ、Dalkara等(2009年)による記載のようにウイルス粒子をイオジキサノール勾配(15%、25%、40%及び60%)によって採取し遠心分離した。AAVウイルスを含有する40%画分を採取し、1×PBS、0.001%プルロニックによって精製した。ウイルス粒子をPBS、0.001%プルロニック内で保管した。ITR配列を標的とする5’GGAACCCCTAGTGATGGAGTT(配列番号3)及び3’CGGCCTCAGTGAGCGA(配列番号4)であるプライマーを用いてリアルタイムPCRによる絶対定量化で力価を測定し、これはμl毎のウイルスゲノム(vg/μl)として表された。
遺伝子挿入のないヒトiPS細胞株であるhiPSC−2を、8歳の少年の成人ヒト皮膚線維芽細胞から作製した。線維芽細胞はReichman等により十分に特性評価されたものであり(Reichman等、2014年)、これに、OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、c−MYC、及びKLF4を発現するエピソームベクターで遺伝子導入した。HiPSC−2を、10ng/mlのヒト組み換え塩基性線維芽細胞成長因子2(FGF2)(Preprotech)を伴うReproStem培地(ReproCELL)内でマイトマイシンC不活化マウス胚性線維芽細胞のフィーダー層(Zenith Biotech)にて保持した。細胞を標準的な5%CO2/95%空気中において37℃でインキュベートし、機械的な方法で週に1度の継代を行った。Reichman等(2014年)の記載のようにコンフルエントhiPSC−2を分化することで、RPE細胞を取得した。色素細胞のパッチを機械的な方法で切り離し、コンフルエントに達するために、ゼラチン被膜培養ディッシュに広げ、継代0と表示した。RPE細胞は、形態、色素発現と、RPE特異的タンパク質発現を検出する免疫細胞化学(MITF及びZO−1)とによって特性評価された。RPE遺伝子マーカーの発現は、定量的RT−PCR及び特定のプライマーを用いて測定された。ヒトiPS細胞由来RPE細胞は4継代まで増殖可能であり、そのRPE形態を保持する(Singh等、2013年)。遺伝子発現の検討は、継代1の細胞において行われた。
ブタの目は、ピエトレン、ラージホワイト、及びランドレースの3つの育種から採取され、認可と殺場から取得された(Abattoir Guy Harang、ウーダン、仏国)。目を95%エタノールにおいて3分間除菌し、CO2非依存性培地(Invitrogen)に移した。鋸状縁の位置(角膜の3mm)でニードルを用いて小さく切開を行い、角膜のまわりで目を切断し、角膜を後に取り去った。眼球から水晶体や硝子体、神経網膜を取り除いた。RPE・脈絡膜、眼杯をPBSで2度洗浄し、眼杯の2/3までトリプシン−EDTA0.25%を満たし、37℃で1時間40分インキュベートした。やさしく上下にピペッティングすることでRPE細胞を採取し、20%FBS及び10μg/mlゲンタマイシンを含有するDMEM培地に移した。11個の目からのRPE細胞を共にプールし、同じ培地の5つの10cm2ディッシュに播種した。1日目と4日目に培地を取り換えた。5〜6日目までに、培養はコンフルエントになり、RPE細胞に典型的な玉石様外観を示した。
ステージ29のニワトリの胚から目を切り離して、1×PBS内で洗浄し、CO2非依存性培地に目を移した。解剖器具を用いて神経網膜を分離して、角膜、硝子体、水晶体、及び他の残渣組織から慎重に取り除いた。神経網膜を新しいCO2非依存性培地に移し、解剖器具を用いて小片に解離した。小片を新しいチューブに移した。37℃で20分間、トリプシン−EDTA0.25%で解離を行い、続いて遠心分離を行った。10%FBSを含有するM199培地を添加してトリプシン反応を停止し、続いて遠心分離を行った。5μg/mlインスリン;5μg/ml亜セレン酸ナトリウム;16.1μg/mlプトレシン;0.63μg/mlプロゲステロン;100μg/mプロスタグランジン;375μg/mlタウリン;2.56μg/mlシチジン−5’−ジホスホコリン;1.28μg/mlシチジン−5’−ジホスフェートエタノールアミン;0.2μg/mlヒドロコルチゾン;0.02μg/mlトリヨードチロシン;110μg/mlピルビン酸ナトリウム;100μg/mlリノール酸で補完した、CDM培地(50%M199(Life Tec.11150−059)、50%DMEMで、光受容体前駆体をインキュベートした。
インビトロの形質導入のために、初代RPE細胞及び/又はiPS由来RPE細胞を、10%FBSを含有するDMEM内において12×106細胞/ウェルで、12ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を1×PBSで洗浄して、6×1010ウイルス粒子(AAV2.1−GFP又はAAV2.1−Otx2vスプライス変異体)を含有する300μlのDMEMで、5時間インキュベートした。5時間のインキュベーション後、培地を10%FBS及び10μg/mlゲンタマイシンに調節した。細胞を10日間37℃で、5%CO2においてインキュベートした。5日目に培地を1度変えた。移植検討のために、形質導入に用いたウイルスと共に初代RPE細胞を7日間インキュベートした。
ウェスタンブロッティングプロトコルをLeveillard等(2004年)の記載のように行った。短時間で、形質導入したブタ初代RPE細胞を、溶解緩衝液[50mMのTris−HCl−pH7.5、1mMのEDTA、1mMのDTT、50mg/mlのTLCK(Sigma)、1×プロテアーゼ阻害剤(Sigma)、10μg/mlのTritonX−100]内で可溶化し、次に音波処理を行った。用いた抗体は、抗OTX2(R&Dsystems、AF1979、1/1,500)、抗ACTB(1/500)である。45日のインキュベーション後のhiPS−RPE単層の免疫標識を、ZO−1及びMITFについて行った。短時間で、細胞を10分間4%ホルムアルデヒドにおいて固定し、次に1×PBS内で3回の洗浄を行った。室温で1時間、PBS、0.2%ゼラチン、及び0.25%TritonX−100でブロッキングを行い、1次抗体と共に4℃で1晩インキュベーションした。用いた抗体は抗ZO−1(61−7300、Life technology 1/250)及び抗MITF(clone D5、M3621、DACO 1/200)である。スライドを0.1%tween−20を含むPBSで3回洗浄し、Alex−aFluor488又は594(Life Technologies、1/600)とコンジュゲートした適切な2次抗体及びDAPI(1/1000)と共に、1時間室温でインキュベートした。CCD CoolSNAP−HQカメラ(Roper Scientific)を備えたDM6000顕微鏡(Leica microsystems)又は405−、488−、及び543−nmレーザーを備えたオリンパスFV1000共焦点顕微鏡を用いて、蛍光染色シグナルを捉えた。共焦点画像は1.55−又は0.46−μmステップサイズを用いて取得され、4〜8オプティカルセクションの画像に相当するものであった。
クロマチン免疫沈降法(ChIP)を先行の記載のように行った(Reichman等、2010年;Dorval等、2006年;Pattenden等、2002年)。新しいRPE細胞を6つのブタの目から素早く分離し、共にプールした。RPEをPBS内の氷温の4%ホルムアルデヒドで30分間架橋し、PBS内でリンスし、溶解緩衝液[1%SDS、10mMのEDTA、50mMのTris−HCl、pH8.0]及びプロテアーゼ阻害剤(Sigma)内で800bpの平均DNAサイズへと音波処理(Vibra Cell)した。音波処理した試料を15,000rpmで10分間4℃において遠心分離し、上清をGセファロースビーズ(PI−20399、Ficher)で1時間室温(RT)において前精製した。100μlの分割量を希釈緩衝液(1%TritonX−100、2mMのEDTA、150mMのNaCl、20mMのTris−HCl、pH8.0)で1.5mlに希釈し、1)抗体なし、2)2.5μgの抗ウサギ抗体(111‐035‐045、Jackson lab)、3)抗OTX2抗体(ab9566、Millipore)と共に1時間室温でインキュベートした3つの反応物に分けた。試料を15,000rpmで10分間20℃において遠心分離し、上清を15μlのタンパク質Gセファロースビーズ、150μgの超高純度サケ***DNA(15632−011、Invitrogen)及び150μgの酵母tRNA(15401−011、Invitrogen)と混合して、1時間30分間室温でインキュベートした。沈殿物を、TSEI(0.1%のSDS;1%TritonX−100;2mMのEDTA;20mMのTris−HCl、pH8.0;150mMのNaCl)、TSEIIで4回(0.1%SDS;1%TritonX−100;2mMのEDTA;20mMのTris−HCl、pH8.0;500mMのNaCl)、緩衝液IIIで1回(0.25MのLiCl、pH8.0;1%ノニデットP−40;1%デオキシコレート;1mMのEDTA;10mMのTris−HCl、pH8.0)、及び最後にTE緩衝液で3回(10mMのTris−HCl、pH8.0;1mMのEDTA、pH8.0)、室温において10分間連続的に洗浄した。試料を溶出し、100μlの溶出緩衝液(1%SDS;0.1MのNaHCO3)内において65℃で1晩インキュベートすることで架橋を除去した。DNAフラグメントをフェノール・クロロホルム抽出によって精製し、70μlのTE緩衝液に再懸濁した。2μlの免疫沈降物質を増幅するために、準定量的PCRを用いた。25μlにおいて94℃で3分間、40サイクル(94℃で15秒、60℃で15秒、72℃で30秒)、72℃で3分のPCR反応を行った。用いたプライマーは、フラグメントをプロモーター遺伝子に増幅するために設計されたものであり、KCNJ13、フォワード5’-GCAGGCCTTCCATGATTTTA(配列番号5)及びリバース5’-TGAGCTGTCAGATGGCTTTG(配列番号6);SLC16A12、フォワード5’-TGCCTGTCCCACTAGGAAGT(配列番号7)及びリバース5’-GCATCATTTGCCATGTGACT(配列番号8);RDH10、フォワード5’-GGCAACAAGTCCCACCTAAA(配列番号9)及びリバース5’-GTTTACTTGGTGGGGGAGGT(配列番号10);TYRP1、フォワード5’-CCAATTTGCAGGGAACAAAT(配列番号11)及びリバース5’-TGCCTTAAATTGCCTTCTCAA(配列番号12);HGB、フォワード5’-GAACGTCAGGATTCCCTTGA(配列番号13)及びリバース5’-CCATTGGGAGCTTCCTTGTA(配列番号14)である。
AAV2.1−GFP又はAAV2.1−OTX2を有する形質導入初代ブタRPE細胞を、移植前に前述のように1週間インキュベートした。細胞をHBSS(ハンク平衡塩溶液、カルシウム、マグネシウム含有、フェノールレッド非含有)(Invitrogen)で2回洗浄し、Trypsin−EDTA0.05%で解離した。やさしくピペッティングしてRPE細胞を採取し、20%ウシ胎児血清(FBS)を含むHBSSに移した。得られた細胞ペレットを、HBSSに25,000細胞/μlで再懸濁した。手術用顕微鏡を介して直接検眼法で外科的処置を行った(図11)。外科医は各ラットに注入される細胞識別(RPE−GFP又はRPE−OTX2)について知らされないという、盲検法を用いた。受容ラットは、外科的処置の最低10分前に、ケタミン(1000mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)混合物を単回の腹腔内注入することで麻酔された。ハミルトンシリンジ(10μl、モデル1701 RN SYR、NDL販売)に装着した30ゲージの鈍端ハミルトンニードルを、強膜及びRPEを介して網膜下腔へ、接線方向に挿入した。細胞懸濁液を、目毎に50,000細胞で、徐々に注入した。全ての処置中に、塩化ナトリウム液滴を定期的に点眼することで目の脱水状態を防止した。外科的処置後に、角膜の脱水及び破損を理由に、処置及び非処置の両目を閉じた状態にした。ラットは、麻酔から回復するまで35℃のチャンバ内に置かれた。
Cerebral Mechanics Inc(加国)のoptomotry、及びOptoMotry、1.77システムを用いて、回転する正弦格子に対するラットの視運動反応を観察することによって、処置及び非処置の目のコントラスト感度及び視力を測定した(Alexander等、2007年;Prusky等、2004年;Pearson等、2012年)。ラットは、すぐに、格子回転方向に頭部を動かすことで回転する垂直格子に反射的に反応する。用いたプロトコルは、パターン回転に対して2つの目が不均等な感度を有することに基づいて、左右の視力の独立的な測定を行うものである。これについて、右目及び左目は、反時計回り回転及び時計回り回転にそれぞれ最も感度が高い。観察者には、パターン回転の方向と、どちらの目が処置を受けたか及びどちらの目にRPE−GFP又はRPE−OTX2細胞が投与されたかとが「マスク化」される、二重盲検法を用いた。生後50日の各ラットを、4つの内向きのLCDコンピュータモニター画面の中央に位置する台座に素早く配置し、赤外線光源を有する上部の赤外線ビデオカメラで観察した。ラットが台座に慣れると、OptoMotryソフトウエアで無作為に決定された、時計回り又は反時計回りに回転する正弦縞パターンをラットに提示して、7秒の試験を開始した。左目(時計回り回転)及び右目(反時計回り回転)によってそれぞれ不随意反射頭部追跡反応が行われる。コントラスト感度は、0.042周期/角度の空間周波数及び0.5Hzの回転速度で測定された。視力を評価するために、格子は100%の一定コントラストを有し、初期刺激は0.042周期/角度であった。プログラムは、ステアケースパラダイムを使用して、70%以上の正確な観察者反応を得た空間周波数又はコントラスト%として規定した両目の視力又はコントラスト感度の測定を集約する。視力は、閾値反応をもたらす最高空間周波数として規定された。同様に、コントラスト感度は、閾値反応をもたらす最低パーセントコントラストによって100を除算したものとして規定された。このプロトコルにより右目感度と左目感度との分離が可能になる一方で、対側の目が刺激に対して「盲目」であるわけではない。
ラット生後60日又は移植後42日に、SEIMバイオメディカルシステムを用いてERGを記録した。移植実験のため、試験される目に50,000の形質導入RPE細胞の上側網膜下注入を行った。ERGを行う者が、どちらの目に移植を受けたか、どちらの目が未処置であるか、及びどちらの目にRPE−GFP及びRPE−OTX2が投与されたかを認識しないように、2重マスク化プロトコルを用いた。一晩暗所に適応させた後、動物を暗赤色光下で記録するために準備した。動物を、ケタミン(100mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)の腹腔内注入で麻酔し、37℃のサーモスタット制御の加温性プラットフォームで保温した。0.5%マイドリアティカム(Mydriaticum)を用いて瞳孔を拡張させ、オキシブプロカインのクロロハイドレート1.6mg/0.4mlを適用して角膜を局所麻酔した。目を開けて突出を維持するために、上下まぶたを後退させた。角膜が金電極に接触した後に保湿を維持するように、ビスコティアーズ(Viscotears)液体ジェルを各角膜に与えた。ステンレス鋼の参照電極をラットの頭部において皮下に挿入した。ラットの背中に皮下に挿入された第2のニードル電極は信号を接地するために用いられた。記録前にさらに5分間、動物を完全な暗闇に置いた。両目から共にGanzfeld型ERGを取得して内部制御を得た。暗順応記録のため、5kHzのサンプリング周波数、4msのフラッシュ持続時間、及び0.5Hzの周波数刺激を用いて、3μcds/m2、30mcds/m2、0.3、3、及び10cds/m2の光強度で単回のフラッシュ記録を取得した。刺激開始前50msから刺激後450msまでデータを記録した。5分の光適応後に、桿体抑制バックグラウンドにおいて、明順応錐体ERGを行い、10cds/m2の光強度で記録を取得した。バンドパスフィルターを0〜1kHzに設定した。各暗順応反応は10回の反応の平均を表し、各明順応ERG反応は5回の刺激フラッシュ一式からの5回の反応の平均を表す。各群(n=7)についてb波ピークまでの平均時間を各記録において定めた。10Hzのフラッシュライト及び0.3cds/m2の強度で、フリッカー錐体ERG反応を行った。
生後60日の処置ラットに麻酔を行い、上述のように瞳孔を拡張させた。塩化ナトリウム液滴を定期的に点眼することで目の脱水状態を防いだ。OCT画像を両目についてスペクトラルドメイン眼科イメージングシステム(スペクトラルドメイン光干渉断層撮影、OCT、Bioptigen、840nm、HHP;Bioptigen;米国ノースカロライナ州)を用いて記録した。発明者等は、100の総Bスキャンを伴い、Bスキャン毎に1000Aスキャンで、2mm×2mmの周囲からなる矩形スキャンを行った。スキャンはまず視神経中心に取得され、その後神経を側頭・鼻側又は上側・下側に移動させて取得した。OCTスキャンをAVIファイルとしてInVivoVueからエクスポートした。これらのファイルをImageJ(バージョン1.47;アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ)にロードし、Stackregプラグインを用いて登録した。ピクセル数を3.11ピクセル/μmの距離に変換して、画像調整を行った。外顆粒層(ONL)厚を、中心(視神経から)から開始して腹側・背側及び側頭・鼻側に100μm毎に測定し、ImageJ用自家製プラグインを用いて、OCTスキャンで取得された目の全ての領域をカバーした。未処置の目(n=6)、RPE−GFPを移植した目(n=6)、及びRPE−OTX2を移植した目(n=7)の群について、各ポイントの厚み平均を算出した。ONL厚を3D密度マップとして表示した。
高解像度赤外線反射イメージング及び蛍光眼底造影を、先行の記載のように改変型走査レーザー検眼鏡(SLO;Heidelberg Retina Angiograph、Heidelberg Engineering、独国)を用いて行った(Weismann等、1893年)。
先行の記載のようにライブデッドアッセイを行った(Leveillard等、2004年)。簡潔に、GFP、OTX2(配列番号15)及びOTX2L(配列番号16)を有する形質導入RPE細胞をCDM培地で1週間インキュベートした。RPE形質導入細胞の馴化培地を採取し、96ウェル黒色組織培養プレート(Corning)において上述及びAdler等(1989年)による記載のように調製されたニワトリの胚(ステージ29)の初代網膜培養物に添加し、5%CO2において37℃で7日間インキュベートした。14の負のコントロール用ウェル(馴化培地)も含まれる。発明者等は、ライブデッドアッセイ(Molecular Probes)を用いて細胞生存性をモニターした。ライブデッド分析を行う者がどちらの上清がRPE−GFP又はRPE−OTX2形質導入細胞からのものかを認識しないように、マスク化プロトコルが用いられた。取得及び細胞計数のため、発明者等は、Metamorphソフトウエア(Universal Imaging Corporation)をもとにしたアルゴリズムを開発した。2つの励起フィルター(485及び520nm)、2つの蛍光フィルター(520及び635nm)、10×対物レンズ、コンピュータ駆動モーター式走査ステージ(Maerzhaeuser)及びCCDカメラを有する、水銀落射蛍光ランプを備えた反転蛍光顕微鏡下(TE200、Nikon)で、発明者等はプレートを計数した。発明者等は、スクリーニングのために、生存細胞数を負のコントロールの平均生存細胞数と比較した。各アッセイを、各条件について4つの複製物で個別に3回繰り返して行った。
上述のようにケタミン及びキシラジンで動物を麻酔し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)内の2.5%グルタルアルデヒド及び2%ホルムアルデヒドで直ちに灌流した。目を摘出して、固定液(2%ホルムアルデヒド)内で一晩インキュベートした。レンズを除去して、眼杯を5%ショ糖内で5回洗浄した。眼杯を2%四酸化オスミウム(Sigma Aldrich、201030)内で1時間固定した。このステップの後、段階的エタノール(50%、70%、95%)での脱水と、プロピレンオキサイド内での10分のインキュベーションとを行った。その後、1対1の(アラルダイトエポキシ樹脂/プロピレンオキサイド)混合物で、目を室温で一晩インキュベートした。65℃に温めたアラルダイトエポキシ樹脂混合物で一晩包埋を行った。1μm厚のプラスチック切片をライカEM、UC6ウルトラミクロトームを用いて矢状軸に沿って作製し、トルイジンブルー(1%ホウ砂、1%トルイジンブルー)で染色した。
すべてのデータは、他に言及されない限り、平均値±標準誤差として表される。nは、検討されるしかるべき動物、目、又は細胞の数である。統計的有意性を、グラフパッドプリズム6ソフトウエアを用いて、対応のないノンパラメトリックt検定、多重比較のためにボンフェローニ又はダネット補正を伴う分散分析、ウェルチ補正、コルモゴロフ‐スミルノフ、ウィルコクソンの符号付順位和検定、(両側)を適宜適用して評価する。
<培養網膜色素上皮細胞には上皮間葉転換が起こる>
発明者等は、初代ブタRPE細胞の一週間の培養がα平滑筋アクチン(ACTA2)及びビメンチン(VIM)の2つの間葉系マーカーの発現を誘導することを発見した(図1A)。
OTX2が、下方調節された27の遺伝子の発現を調節するかをテストするために、発明者等はラットのOTX2を過剰発現し、また個別にブタ初代RPE細胞においてOTX2Lを過剰発現した。OTX2及びOTX2LcDNAを、アデノ随伴ウイルスベクターにクローニングし、RPE細胞をAAV2.1−GFP、AAV2.1−OTX2、又はAAV2.1−OTX2Lに感染させた。形質導入の7日後、ブタとラットとのOTX2mRNAを区別しないプライマーを用いて定量的RT−PCRによってOTX2発現を検証した(図2A)。
これらの遺伝子がヒトPRE細胞においてOTX2の標的となるかを検証するために、OTX2をヒト誘導多能性幹由来PRE(iPS−RPE)において過剰発現した(Reichman等、2014年)。これらのiPS−RPE細胞は、メラニンを発現し、典型的な玉石状形態を有し、密着結合タンパク質ZO−1及び転写因子MITFを発現する(データは示されず)。ヒトiPS−RPE細胞は、未分化iPS細胞と反対に、正常ヒト死後標本のRPE細胞と同様のレベルに、RDH10に加えてRPE65、MITF、BEST1及びMERTKのようないくつかのRPEマーカーを発現する(図9)。これは、iPS細胞がRPE細胞に分化したことを示す。
RPE移植の効果を、MERTKタンパク質をコードするrdy遺伝子の劣性突然変異を保持する網膜色素変性劣性モデルであるRCSラットにおいて検討した。MERTKは、光受容体の外節貪食に必須である、RPEによって発現される受容体型チロシンキナーゼである。ゆえに、MERTK突然変異は網膜色素変性を引き起こし、RCSの桿体光受容体は出生後(post−natal、PN)23〜60日に変性する。桿体変性についで錐体変性が続く(D’Cruz等、2000年;Pinilla等、2004年;Girman等、2005年)。生後60日までに、桿体及び錐体機能は記録できないものになり、組織学的検査は、光受容体細胞層である外顆粒層(ONL)がほぼ完全に失われることを示した(図7A)。
処置ラットの視覚挙動は、回転格子に対する視運動頭部追跡反応を測定することによって、生後50日に二重盲検法を用いて評価した(図5A)。視力及びコントラスト感度は、パターン回転に対する2つの目の不均等な感度に基づいて右目及び左目の視力の独立的測定をもたらす。つまり、右目及び左目はそれぞれ反時計回りの回転及び時計回りの回転により感度が高い。視力について、固定コントラストの白黒縞の太さが各動物の視覚能力に対して調節され、視力を測定する。コントラスト感度について、これは、コントラスト感度測定のために調節された同じ太さの暗・明の灰色縞のコントラストである(図5B)。
移植による桿体保護を検証するために、大部分のげっ歯動物において95〜97%桿体からなる外顆粒層(ONL)厚を生後60日に測定した。測定は、100μmの間隔をあけた光学的切片で網膜全体(9.5mm2)に行った。測定は、光干渉断層撮影(OCT)によって各切片において100μm毎に行われた(網膜ごとに平均1,005の測定)。光学的切片において、ONLは、この層が存在しない未注入RCSラットの網膜と野生型網膜を比較することで明確に特定される(図6A)。網膜表面全体にわたる各位置における平均ONL厚を用いて、網膜の3次元マップを再構成した。ONLは、画像面にわたる白色優勢によって見て取れるように、移植した目において全体的により厚い(図6B)。細胞が注入された背側・側頭側の1/4の部分に向かってONL厚が徐々に増大することをマップは示す。網膜全体のONLは、RPE−GFPの目と比較してRPE−OTX2の目においてより厚みがある(図6C)。ONLは、網膜面の95%において、未注入の目について平均6.69μm厚であったが、RPE−GFP及びRPE−OTX2についてそれぞれ17.59μm及び25.39μmであった。ONL厚は、RPE−GFPの目について6〜32μmに分布し、RPE−OTX2の目については13〜42μmに移った(図6D)。両曲線の2峰性の態様は、注入部位における桿体の保護からもたらされており、測定における移植細胞自体の存在によるものではない。データは、側頭から鼻側(TN)及び背側から腹側(DV)の2つの中心的セクションに対して、野生型(rdy+/+)目のONL厚で正規化された(図6E)。網膜の背側・側頭側四分円である注入部位において、ONLがRPE−GFPグラフト化目よりもRPE−OTX2グラフト化目において2倍厚いということを発明者等は発見した。これは、野生型目のONL厚の約40%に相当し、GFPについては約20%、及び未処置RCS目については約10%に相当する。移植したRCSの目のONL厚はまた、網膜の反対部分、鼻側・腹側四分円でもより厚みがある。
RPE−GFP及びRPE−OTX2の注入部位から離れた位置の光受容体の救済は、グラフティングされたRPE細胞由来のパラクリン効果を示した。発明者等は、ニワトリ胚からの錐体豊富化初代培養物を用いて、形質導入RPE細胞の馴化培地における神経栄養因子の存在を検証した(Leveillard等、2004年)。AAVベクターに感染させたブタの初代RPE細胞から採取した馴化培地を、ニワトリの網膜培養物に添加した。培養の7日後に、細胞の生存性をライブデッドアッセイを用いて記録した(Leveillard等、2004年)。RPE細胞は、保護分子を自然に分泌した。しかし、RPE−GFPと比較して、RPE−OTX2は大きく細胞生存を導いた(図8A)。OTX2形質導入ブタRPE細胞からの馴化培地は、負のコントロール(培地のみ)より3倍、GFP形質導入RPE細胞からの培地と比較すると2倍、細胞生存の増加を促進した。OTX2で形質導入されたRPE細胞から単離されたRNAの定量的RT−PCR解析は、毛様体神経栄養因子(CNTF)の発現がOTX2によって誘導される一方で、脳由来の神経栄養因子(BDTF)の発現は変化がなかったことを示した(図8B)。
Acland et al. Mol Ther. 2005 Dec;12(6):1072-82
Adler et al. 1989. Science (New York, N.Y.) 243:391-393
Alexander et al. 2007. Nature medicine 13:685-687.
Bennett et al. 2012. Sci Transl Med 4:120ra115.
Birch et al. 2013. Am J Ophthalmol 156:283-292 e281.
Byrne et al. 2015. J Clin Invest.
Da Cruz et al. 2007. Prog Retin Eye Res 26:598-635.
Dalkara et al. 2009. Mol Ther 17:2096-2102.
D'Cruz et al. 2000. Human molecular genetics 9:645-651.
Delyfer et al. 2013. Journal of visualized experiments : JoVE.
Dorval et al. 2006. J Biol Chem 281:744-751.
Fossat et al. 2006. EMBO Rep 7:824-830
Fritsche et al. 2013. Nat Genet 45:433-439, 439e431-432.
Girman et al. 2005. Vision Res 45:343-354.
Gouras et al. 1989. Prog Clin Biol Res 314:659-671.
LaVail et al. 1998. Invest Ophthalmol Vis Sci 39:592-602.
Leveillard et al. 2004. Nature genetics 36:755-759.
Leveillard et al. 2007. Med Sci (Paris) 23:240-242.
Litchfield et al. 1997. Exp Eye Res 64:655-666.
MacLaren et al. 2006. Nature 444:203-207.
Martinez-Morales et al. 2003. J Biol Chem 278:21721-21731
Pattenden et al. 2002. EMBO J 21:1978-1986.
Pearson et al. 2012. Nature 485:99-103.
Pinilla et al. 2004. Vision Res 44:2467-2474.
Prusky et al. 2004. Investigative ophthalmology & visual science45:4611-4616.
Reichman et al. 2010. Hum Mol Genet 19:250-261.
Singh et al. 2013. Invest Ophthalmol Vis Sci 54:6767-6778
Weismann, A., and Spencer, H. 1893. Die Allmacht der Naturzuchtung,eine Erwiderung an Herbert Spencer. Jena,: Fischer. 96 p. pp.
Weismann, A., Parker, W.N., and Ronnfeldt, H. 1893. The germ-plasm :a theory of heredity. London: W. Scott. xxiii, 477 p. pp.
Yang et al. 2009. Mol Ther 17:787-795.
Claims (14)
- 1つ以上の制御配列に操作可能に連結されたOXT2タンパク質をコードする組み換え核酸配列が導入されたことで、OTX2タンパク質を過剰発現してOXT2タンパク質の細胞内レベルを増加させるように改変された初代網膜色素上皮(retinal pigment epithelium、RPE)細胞を含む網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
- OTX2タンパク質は、天然哺乳動物OTX2タンパク質である、請求項1に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
- OTX2タンパク質は、配列番号15若しくは配列番号16に示されるアミノ酸配列、又は配列番号15若しくは配列番号16に示される配列に対して少なくとも99%の同一性を有するそれらの機能性変異体からなる又は含む、請求項1に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
- OTX2タンパク質は、配列番号15若しくは配列番号16に示されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号15若しくは配列番号16に示されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
- 前記RPE細胞は、1つ以上の制御配列に操作可能に連結されたOTX2タンパク質をコードする核酸配列を含む組み換えウイルスベクターを導入することで遺伝子的に改変された、請求項1〜4のいずれか1項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項5に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
- 前記RPE細胞におけるOTX2タンパク質のレベルは、正規化後に、非改変RPE細胞におけるOTX2タンパク質のレベルよりも少なくとも1.5倍高い、請求項1〜6のいずれか1項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
- 眼内注入によって、前記RPE細胞を必要とする対象に投与される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
- 前記眼内注入は、目の網膜下腔への注入である、請求項8に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
- 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
- 眼内注入用に製剤化された、請求項1〜10のいずれか1項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
- 前記網膜変性はRPE機能障害に関する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
- 前記網膜変性は、網膜色素変性、加齢性黄斑変性、網膜剥離、レーベル(Leber)先天黒内障、糖尿病網膜症、ベスト病、スタルガルト病、及びコロイデレミアからなる群から選択される疾患によるものである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
- 前記網膜変性は網膜色素変性によるものである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP14307069 | 2014-12-18 | ||
EP14307069.6 | 2014-12-18 | ||
PCT/EP2015/080288 WO2016097183A1 (en) | 2014-12-18 | 2015-12-17 | Transgenic rpe cells overexpressing otx2 for the treatment of retinal degeneration |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018500906A JP2018500906A (ja) | 2018-01-18 |
JP6734853B2 true JP6734853B2 (ja) | 2020-08-05 |
Family
ID=52396372
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017533228A Active JP6734853B2 (ja) | 2014-12-18 | 2015-12-17 | 網膜変性処置のためのotx2過剰発現トランスジェニック網膜色素上皮細胞 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11865189B2 (ja) |
EP (1) | EP3233093B1 (ja) |
JP (1) | JP6734853B2 (ja) |
KR (1) | KR20170095365A (ja) |
CA (1) | CA2970748C (ja) |
IL (1) | IL252789B (ja) |
WO (1) | WO2016097183A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7048585B2 (ja) * | 2016-09-22 | 2022-04-05 | ソルボンヌ・ユニヴェルシテ | 網膜変性疾患の処置に使用するための光遺伝学的に形質転換した光受容体前駆細胞 |
MX2020001340A (es) * | 2017-07-31 | 2020-08-31 | Reflection Biotechnologies Ltd | Modelos celulares y terapias para enfermedades oculares. |
KR102330387B1 (ko) * | 2019-12-03 | 2021-11-24 | 한국과학기술원 | 호메오단백질의 세포외 분비능 조절방법 및 이를 이용하여 세포외 분비능이 조절된 호메오단백질 변이체 |
WO2021114662A1 (zh) * | 2019-12-09 | 2021-06-17 | 北京大学第三医院(北京大学第三临床医学院) | CYP4V2和RdCVF在制备药物中的用途 |
JP2023519581A (ja) * | 2020-03-26 | 2023-05-11 | ディアメンティス・インコーポレイテッド | 網膜信号データを処理し、状態を識別するためのシステムおよび方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20050105448A (ko) * | 2003-02-03 | 2005-11-04 | 도쿠리쓰교세이호징 가가쿠 기주쓰 신코 기코 | Otx2 유전자를 사용한 망막 시각세포의 재생과 신생 |
CN103555654B (zh) | 2007-04-18 | 2016-04-20 | 哈达锡特医学研究服务及发展有限公司 | 干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞 |
DK2209888T3 (da) | 2007-10-12 | 2020-01-20 | Astellas Inst For Regenerative Medicine | Forbedrede fremgangsmåder til fremstilling af rpe-celler og sammensætninger af rpe-celler |
WO2009132156A1 (en) * | 2008-04-22 | 2009-10-29 | Regenerative Research Foundation | Retinal pigment epithelial stem cells |
IL281453B (en) * | 2009-11-17 | 2022-07-01 | Astellas Inst For Regenerative Medicine | Methods for preparing human rpe cells and pharmaceutical preparations of human rpe cells |
EP3563860A1 (en) * | 2011-11-14 | 2019-11-06 | Astellas Institute for Regenerative Medicine | Pharmaceutical preparations of human rpe cells and uses thereof |
KR101567921B1 (ko) * | 2013-10-11 | 2015-11-10 | 한국과학기술원 | Otx2 단백질을 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 이상질환 예방 및 치료용 조성물 |
-
2015
- 2015-12-17 JP JP2017533228A patent/JP6734853B2/ja active Active
- 2015-12-17 WO PCT/EP2015/080288 patent/WO2016097183A1/en active Application Filing
- 2015-12-17 CA CA2970748A patent/CA2970748C/en active Active
- 2015-12-17 US US15/536,725 patent/US11865189B2/en active Active
- 2015-12-17 KR KR1020177019783A patent/KR20170095365A/ko not_active Application Discontinuation
- 2015-12-17 EP EP15813411.4A patent/EP3233093B1/en active Active
-
2017
- 2017-06-08 IL IL252789A patent/IL252789B/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2016097183A1 (en) | 2016-06-23 |
US11865189B2 (en) | 2024-01-09 |
US20170348434A1 (en) | 2017-12-07 |
IL252789A0 (en) | 2017-08-31 |
CA2970748A1 (en) | 2016-06-23 |
IL252789B (en) | 2022-03-01 |
CA2970748C (en) | 2023-05-09 |
KR20170095365A (ko) | 2017-08-22 |
JP2018500906A (ja) | 2018-01-18 |
EP3233093A1 (en) | 2017-10-25 |
EP3233093B1 (en) | 2022-06-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6827320B2 (ja) | LCA−8及び進行性RPを治療するための組換えAAV−Crumbsホモログ組成物及び方法 | |
JP6734853B2 (ja) | 網膜変性処置のためのotx2過剰発現トランスジェニック網膜色素上皮細胞 | |
US10040835B2 (en) | Vectors encoding rod-derived cone viability factor | |
JP2018529336A (ja) | 網膜色素変性症の治療 | |
TW201408307A (zh) | 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd) | |
Kole et al. | Otx2-genetically modified retinal pigment epithelial cells rescue photoreceptors after transplantation | |
JP2020514328A (ja) | 血流の途絶に起因する神経損傷の治療のための機能性ニューロンの再生 | |
Koh et al. | Subretinal human umbilical tissue-derived cell transplantation preserves retinal synaptic connectivity and attenuates Müller glial reactivity | |
MacLaren et al. | CNTF gene transfer protects ganglion cells in rat retinae undergoing focal injury and branch vessel occlusion | |
US20100239499A1 (en) | Methods and compositions for genetic and retinal disease | |
EP3052124A1 (en) | Use of neuroglobin agonist for preventing or treating mitochondrial rcci and/or rcciii deficiency disease | |
Grob et al. | Clinical trials in retinal dystrophies | |
DK2276501T3 (en) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR GENETIC AND RETINAL DISEASE | |
US20230135501A1 (en) | Gene therapy | |
CN112118857A (zh) | 用于预防或治疗视网膜疾病的包含ccn5作为活性成分的药物组合物 | |
US20210290727A1 (en) | MODULATION OF mTORCI ACTIVITY AND AUTOPHAGY VIA CIB2-RHEB INTERACTION | |
JP2022552003A (ja) | 脊髄損傷およびalsの治療のための機能的ニューロンの再生 | |
CN117062629A (zh) | 用于减少视网膜神经节细胞的变性的方法 | |
JP2020511148A (ja) | 血管新生阻害剤としてのc型レクチンであるレベセチン |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20171018 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20171018 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181022 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20181220 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190110 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20181220 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190822 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190917 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20191211 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200214 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200623 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200710 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6734853 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |