CN112118857A - 用于预防或治疗视网膜疾病的包含ccn5作为活性成分的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防或治疗视网膜疾病的包含CCN5作为活性成分的药物组合物。根据本发明的CCN5防止视网膜色素上皮细胞中由TGF‑β、EEF或抗VEGF药物引起的纤维化变化。另外，CCN5将由纤维化变化引起的视网膜色素上皮细胞的形态或功能损伤恢复到正常细胞水平。因此，包含CCN5作为活性成分的组合物可有利地用于预防或治疗视网膜疾病。

Description

用于预防或治疗视网膜疾病的包含CCN5作为活性成分的药物 组合物
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含CCN5作为活性成分。
背景技术
视网膜是一种透明的薄膜，它排列(line)在眼睛的最内壁，并与眼睛中的玻璃体接触。视网膜用作视觉信息处理的主要器官，其将物体的光学信息转换为电信号并通过视神经将图像传输到脑的视觉皮层。视网膜是一种复杂的组织，其由超过1亿个感光细胞、超过1百万个神经节细胞(其是视网膜输出神经元)以及用作连接这些细胞的缆绳的许多神经元组成。黄斑是区分颜色和物体并提供视觉的视网膜的中心部分，，由感光细胞层和神经节细胞层组成，所述感光细胞层由视锥细胞组成。在黄斑中，图像的电信号被转换成化学信号，后者继而通过由神经节细胞的轴突形成的视神经传输到脑。视网膜的除黄斑外的部分负责识别周围区域并在黑暗中起主要作用。
一旦由于衰老或外部因素而在视网膜中发生异常，这种异常就会引起视觉和视野的问题，并在严重情况下导致失明。视网膜疾病包括视网膜脱离，其中当神经视网膜从视网膜色素上皮(RPE)细胞层脱离时，视网膜从眼睛的后部抬起，从而引起视觉损伤；造成视网膜周围的组织异常的周围性视网膜变性；以及造成黄斑异常的黄斑变性。一旦视网膜从视网膜色素上皮脱离，就不可能接收关于图像的光学信息。另外，不能实现来自脉络膜的营养供给，并因此神经元不能正常地发挥功能。如果这种状况持续存在，则发生永久性视网膜萎缩，导致失明(Yoo,2015)。
视网膜色素上皮位于神经视网膜和脉络膜之间，并且是在维持视网膜功能中起关键作用的立方极化单层。正常视网膜色素上皮具有形态学和功能上不对称的结构。视网膜色素上皮细胞的变形可导致纤维化眼病，如增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)、糖尿病性视网膜病(DR)和年龄相关性黄斑变性(AMD)。在病理学条件下，视网膜色素上皮细胞变形，使得这些细胞不具有它们的天然形态，并且也失去了胞吐功能和吞噬功能。
另一方面，在由于视网膜色素上皮细胞的纤维化变形而开始视觉损伤的情况下，无法实现恢复到先前视力。因此，在早期阶段检测和治疗这种变形是重要的。关于视网膜色素上皮细胞的纤维化变形，其早期检测和治疗可以使视力丧失最小化；然而，目前还没有可靠的治疗方法。
发明公开内容
技术问题
在研究用于由视网膜色素上皮细胞的纤维化变形引起的疾病的治疗剂时，本申请的发明人已经发现CCN5将由转化生长因子-β(TGF-β)引起的视网膜色素上皮细胞的形态或功能损伤恢复到正常细胞水平，因此在预防或治疗视网膜疾病方面具有优异的效果。基于该发现，本申请的发明人已经完成了本发明。
本发明的一个目的是提供用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含CCN5作为活性成分。
问题的解决方案
为了实现上述目的，本发明提供了用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含CCN5或其片段作为活性成分。
另外，本发明提供了用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含编码CCN5的多核苷酸作为活性成分。
另外，本发明提供了用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含含有编码CCN5的多核苷酸的重组病毒作为活性成分。
另外，本发明提供了用于预防或治疗视网膜疾病的方法，其包括将药物组合物施用至个体的步骤。
另外，本发明提供了用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含CCN5或其片段；和抗VEGF药物作为活性成分。
另外，本发明提供了用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含以下物质作为活性成分：编码CCN5的多核苷酸或含有编码CCN5的多核苷酸的重组病毒；和抗VEGF药物。
另外，本发明提供了用于预防或治疗视网膜疾病的试剂盒，其包含以下物质作为活性成分：编码CCN5的多核苷酸或含有编码CCN5的多核苷酸的重组病毒；和抗VEGF药物。
另外，本发明提供了用于预防或治疗视网膜疾病的组合物，其包含引入了编码CCN5的多核苷酸的细胞作为活性成分。
本发明的有益效果
根据本发明的CCN5、编码CCN5的多核苷酸或含有该多核苷酸的病毒防止由TGF-β，EEF(EGTA、EGF和FGF2)，或抗VEGF药物诱导的视网膜色素上皮细胞的纤维化变形。另外，CCN5、编码CCN5的多核苷酸或含有该多核苷酸的病毒可以将由纤维化变形引起的视网膜色素上皮细胞的形态或功能损伤恢复到正常细胞水平。因此，包含CCN5、编码CCN5的多核苷酸或含有该多核苷酸的病毒作为活性成分的组合物可有效地用于预防或治疗视网膜疾病。
附图简述
图1a示意性地示出了用于研究由TGF-β诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形的实验过程。
图1b示出了通过在显微镜下观察用指定浓度的TGF-β处理ARPE-19细胞时ARPE-19细胞的纤维化变形而获得的结果。
图1c示出了通过鉴定用指定浓度的TGF-β处理ARPE-19细胞时发生的蛋白质表达模式的变化而获得的结果。
图1d示出了通过将ARPE-19细胞用TGF-β处理，然后使用抗ZO-1抗体、抗α-SMA抗体和鬼笔环肽观察细胞紧密连接而获得的结果。
图2a示意性地示出了用于鉴定AdCCN5对TGF-β诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形的抑制作用的实验过程。
图2b示出了通过将ARPE-19细胞用AdLacZ或AdCCN5处理，然后在显微镜下观察用TGF-β处理时发生的ARPE-19细胞的形态变化而获得的结果。
图2c示出了通过将ARPE-19细胞用AdLacZ或AdCCN5处理，然后观察用TGF-β处理时发生的ARPE-19细胞中CCN5、间充质标志物蛋白和上皮标志物蛋白表达的变化而获得的结果。
图2d示出了通过将ARPE-19细胞用AdLacZ或AdCCN5处理，然后通过定量实时聚合酶链式反应实验鉴定用TGF-β处理时发生的ARPE-19细胞中间充质标志物蛋白和上皮标志物蛋白的转录物表达的变化而获得的结果。
图2e示出了通过将ARPE-19细胞用AdLacZ或AdCCN5处理，然后使用抗ZO-1抗体、抗α-SMA抗体和鬼笔环肽观察用TGF-β处理时发生的ARPE-19细胞的免疫荧光图像而获得的结果。
图2f示出了通过将ARPE-19细胞用AdLacZ或AdCCN5处理，然后通过胶原凝胶收缩测定观察用TGF-β处理时发生的ARPE-19细胞的收缩性变化而获得的结果。
图3示出了通过比较CCN5对ARPE-19细胞的纤维化变形的抑制作用与A83-01(一种TGF-β受体抑制剂)的抑制作用而获得的结果。
图4a示出了通过鉴定AdCCN5对TGF-β处理的ARPE-19细胞的迁移能力的影响而获得的结果。
图4b示出了通过鉴定AdCCN5对TGF-β处理的ARPE-19细胞中RPE65和MerTK的表达的影响而获得的结果。
图4c示出了通过使用pHrodo Red BioParticles鉴定AdCCN5对TGF-β处理的ARPE-19细胞的吞噬作用的影响而获得的结果。
图4d示出了通过使用TAMRA标记的凋亡胸腺细胞测量AdCCN5对TGF-β处理的ARPE-19细胞的吞噬作用的影响而获得的结果。
图5示出了通过鉴定AdCCN5对TGF-β-SMAD信号传导途径的影响而获得的结果。
图6a示意性地示出了用于鉴定CCN5是否能够恢复由TGF-β诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形的实验过程。
图6b示出了通过在显微镜下观察ARPE-19细胞的变形被AdCCN5恢复而获得的结果。
图6c示出了通过将ARPE-19细胞用TGF-β处理，然后用AdCCN5处理，然后观察ARPE-19细胞中CCN5、间充质标志物蛋白和上皮标志物蛋白表达的变化而获得的结果。
图6d示出了通过将ARPE-19细胞用TGF-β处理，然后用AdCCN5处理，然后使用抗ZO-1抗体、抗α-SMA抗体和鬼笔环肽观察ARPE-19细胞而获得的结果。
图6e示出了通过胶原凝胶收缩测定鉴定AdCCN5对ARPE-19细胞的收缩性正常化的影响而获得的结果。
图7a示出了通过将ARPE-19细胞用TGF-β处理，然后用AdCCN5处理，然后观察它们的迁移能力正常化而获得的结果。
图7b示出了通过将ARPE-19细胞用TGF-β处理，然后用AdCCN5处理，然后观察ARPE-19细胞中RPE65和MerTK的表达被恢复而获得的结果。
图7c示出了通过将ARPE-19细胞用TGF-β处理，然后使用pHrodo RedBioParticles鉴定AdCCN5对ARPE-19细胞的吞噬作用的影响而获得的结果。
图7d示出了通过将ARPE-19细胞用TGF-β处理，然后使用TAMRA标记的凋亡胸腺细胞测量AdCCN5对ARPE-19细胞的吞噬作用的影响而获得的结果。
图8a示意性地示出了用于鉴定A83-01在TGF-β处理的ARPE-19细胞中的作用的实验过程。
图8b示出了通过观察A83-01在ARPE-19细胞中未使由TGF-β引起的CCN5、CCN2、间充质标志物蛋白和上皮标志物蛋白的表达变化正常化而获得的结果。
图9a示意性地示出了用于测量CCN5对Ccl2-/-小鼠中RPE变形的恢复作用的过程。
图9b示出了通过CCN5、RPE65、MerTK、间充质标志物蛋白和上皮标志物蛋白表达的变化鉴定AAV9-CCN5对Ccl2-/-小鼠的RPE细胞的影响而获得的结果。
图9c示出了通过用抗ZO-1抗体、抗CCN5抗体、抗RPE65抗体或抗α-SMA抗体染色鉴定AAV9-CCN5对Ccl2-/-小鼠的RPE细胞中紧密连接形成的影响而获得的结果。
图10a示意性地示出了用于鉴定EEF诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形是否可以被AdCCN5防止的过程。
图10b示出了通过在显微镜下观察EEF处理的ARPE-19细胞的形态变化而获得的结果。
图10c示出了通过将AdCCN5处理的ARPE-19细胞用EEF处理，然后观察ARPE-19细胞中CCN5、CCN2、间充质标志物蛋白和上皮标志物蛋白表达的变化而获得的结果。
图10d示出了通过将AdCCN5处理的ARPE-19细胞用EEF处理，然后使用抗ZO-1抗体、抗α-SMA抗体和鬼笔环肽观察ARPE-19细胞而获得的结果。
图11a示意性地示出了用于鉴定贝伐单抗(Beva)诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形是否被AdCCN5防止的过程。
图11b示出了通过在显微镜下观察贝伐单抗处理的ARPE-19细胞的形态变化而获得的结果。
图11c示出了通过将AdCCN5处理的ARPE-19细胞用贝伐单抗处理，然后观察ARPE-19细胞中CCN5、CCN2、间充质标志物蛋白和上皮标志物蛋白表达的变化而获得的结果。
图11d示出了通过将AdCCN5处理的ARPE-19细胞用贝伐单抗处理，然后使用抗ZO-1抗体、抗α-SMA抗体和鬼笔环肽观察ARPE-19细胞而获得的结果。
图12a示意性地示出了用于鉴定在将ARPE-19细胞用TGF-β处理，然后用编码CCN5的修饰的mRNA处理的情况下，TGF-β诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形是否被CCN5恢复的过程。
图12b示出了通过将TGF-β处理的ARPE-19细胞用编码CCN5的修饰的mRNA处理，然后观察ARPE-19细胞中CCN5、CCN2、间充质标志物蛋白和上皮标志物蛋白表达的变化而获得的结果。
图12c示出了通过将TGF-β处理的ARPE-19细胞用编码CCN5的修饰的mRNA处理，然后使用抗ZO-1抗体、抗α-SMA抗体和鬼笔环肽观察ARPE-19细胞而获得的结果。
图13a示意性地示出了用于鉴定TGF-β诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形是否被CCN5蛋白恢复的过程。
图13b示出了通过将TGF-β处理的ARPE-19细胞用CCN5蛋白处理，然后观察ARPE-19细胞中CCN5、CCN2、间充质标志物蛋白和上皮标志物蛋白的表达而获得的结果。
图13c示出了通过将TGF-β处理的ARPE-19细胞用CCN5蛋白处理，然后使用抗ZO-1抗体、抗α-SMA抗体和鬼笔环肽观察ARPE-19细胞而获得的结果。
图14a示意性地示出了用于测量在将ARPE-19细胞同时用抗-VEGF药物(贝伐单抗、兰尼单抗(Rani)和阿柏西普(Afli))和CCN5蛋白处理的情况下，抗-VEGF药物诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形是否被CCN5蛋白抑制的过程。
图14b示出了通过将ARPE-19细胞同时用抗-VEGF药物(贝伐单抗、兰尼单抗和阿柏西普)和CCN5蛋白处理，然后观察ARPE-19细胞中CCN5、CCN2、间充质标志物蛋白和上皮标志物蛋白的表达而获得的结果。
图14c示出了通过将ARPE-19细胞同时用抗-VEGF药物(贝伐单抗、兰尼单抗和阿柏西普)和CCN5蛋白处理，然后使用抗ZO-1抗体、抗α-SMA抗体和鬼笔环肽观察ARPE-19细胞而获得的结果。
图15a示意性地示出了用于鉴定在将iPSC衍生的RPE细胞用AAV2-CCN5处理，然后用TGF-β处理的情况下，TGF-β诱导的RPE细胞的纤维化变形是否被CCN5抑制的实验过程。
图15b示出了通过将iPSC衍生的RPE细胞用AAV2-CCN5处理，然后用TGF-β处理，然后使用抗ZO-1抗体、抗α-SMA抗体和鬼笔环肽观察RPE细胞的图像而获得的结果。
实施本发明的最佳方式
在本发明的一个方面，提供了用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含CCN5或其片段作为活性成分。
如本文所用，术语“CCN5”是指属于CCN家族(CCN1-6)的细胞外基质(ECM)相关蛋白，其在血管疾病、血管生成、肿瘤发生、纤维化疾病的诱导和细胞功能如细胞分化和存活的调节中起多种作用。与其它CCN家族蛋白不同，CCN5蛋白不具有C末端结构域，并且也被称为WISP-2、HICP、Cop1、CTGF-L等。另外，CCN5蛋白由250个氨基酸残基的单条多肽链组成。
本发明的用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物可以预防或治疗视网膜色素上皮细胞的纤维化变形。纤维化变形可以由选自TGF-β、EGTA、EGF、FGF-2和抗VEGF药物中的任一种诱导。在本发明的实施方案中，确定了CCN5防止由被称为视网膜色素上皮(RPE)细胞变形的触发物的TGF-β诱导的RPE细胞的纤维化变形。另外，在另一个实施方案中，确定了CCN5将已经发生纤维化变形的RPE细胞恢复为正常细胞。
本文所用的CCN5可以是人源的或动物来源的CCN5。在本发明的实施方案中，确定了小鼠来源的或人源的CCN5对RPE细胞的纤维化变形具有抑制作用。
小鼠来源的CCN5可以是包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。另外，编码小鼠来源的CCN5的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。另外，在本发明中，小鼠来源的CCN5可以是成熟的形式。具体地，小鼠来源的CCN5可以是通过从SEQ ID NO:1的氨基酸序列中排除对应于信号肽的位置1-23的氨基酸而获得的位置24-251的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
人源的CCN5可以是包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽。另外，编码人源的CCN5的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。另外，在本发明中，人源的CCN5可以是成熟的形式。具体地，人源的CCN5可以是通过从SEQ ID NO:4的氨基酸序列中排除对应于信号肽的位置1-23的氨基酸而获得的位置24-250的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
如本文所用，术语“视网膜疾病”是指由视网膜色素上皮细胞的变形或功能丧失引起的疾病。具体地，视网膜疾病可以是选自增殖性玻璃体视网膜病变、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、脉络膜新生血管和视网膜水肿中的任一种。在本文中，视网膜色素上皮(RPE)位于神经视网膜和脉络膜之间，并且是在维持视网膜功能中起重要作用的立方极化单层。
增殖性玻璃体视网膜病变是这样一种疾病，其中在糖尿病性视网膜病恶化的情况下或在视网膜脱离手术中裂缝不完全闭合的情况下，纤维化细胞在视网膜表面或玻璃体内增殖以形成膜，并且膜收缩从而引起视网膜脱离。在发生视网膜脱离的情况下，视网膜色素上皮细胞被释放并转化成纤维化细胞；并且纤维化细胞与在视网膜表面增殖的神经胶质细胞结合，以形成薄膜或牵引带。当该薄膜或牵引带收缩时，随着整个视网膜凝聚形成固定的褶皱。这里，在严重的情况下，除了视盘之外的整个视网膜可以以漏斗形脱离。
糖尿病性视网膜病是由于糖尿病引起的外周循环障碍而在眼睛的视网膜中发生的并发症。该疾病最初可能没有症状，并且可能在发生其侵入黄斑时表现出视力下降的症状。根据进展阶段，糖尿病性视网膜病可分为单纯性视网膜病、增殖前视网膜病和增殖性视网膜病。
黄斑变性是一种这样的疾病，其中随着逐渐衰老黄斑功能降低，从而使视力降低或丧失。在由于这种疾病视力开始下降的情况下，无法实现恢复到先前视力。该疾病被称为年龄相关性黄斑变性，并且是老年人视力丧失的主要原因。黄斑变性分为两种类型：干性黄斑变性和湿性黄斑变性。约90％的患有黄斑变性的患者患有干性黄斑变性，并且这种干性黄斑变性在年龄相关性沉积物积聚在视网膜下或发展诸如视网膜色素上皮萎缩的病变的情况下发生。当黄斑中的视觉细胞被缓慢破坏时，随着时间的推移，黄斑功能降低并且中心视力降低。对于湿性黄斑变性，由于构成黄斑下层的脉络膜中许多新血管的异常形成而出现症状。湿性黄斑变性的进展快于干性黄斑变性，其可能导致视力的急剧下降，并在2个月至3年内导致失明。
脉络膜新生血管是这样的一种疾病，其中脉络膜由于异常血管的形成而受损，从而发生视觉损伤。脉络膜新生血管是世界范围内不可逆性视力丧失的主要原因之一。对于脉络膜新生血管，尽管进行了各种治疗尝试，但大多数患者的视力预后较差。
视网膜水肿意指视网膜肿胀。由于各种原因在视网膜或黄斑中的细血管如毛细血管中发生变性或异常，可能发生出血，导致视网膜水肿。在视网膜中发生水肿的情况下，可能出现各种症状，包括视力下降。
在包含CCN5作为活性成分的用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物中，可以包含相对于药物组合物的总重量10重量％至95重量％的作为活性成分的CCN5蛋白。而且，除了活性成分之外，本发明的药物组合物还可以包含一种或多种表现出相同或相似功能的活性成分。除了上述活性成分之外，根据本发明的药物组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的载体以用于施用。
在本发明的另一方面，提供了用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含编码CCN5的多核苷酸作为活性成分。
多核苷酸可以是编码CCN5的mRNA。编码CCN5的mRNA可以是与编码CCN5的多核苷酸的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5互补的序列。在本发明的实施方案中，确定了编码CCN5的修饰的mRNA将由被称为使RPE细胞变形的触发物的TGF-β或EEF(EGTA、EGF和FGF-2)诱导的RPE细胞的纤维化变形恢复到正常细胞水平。修饰的mRNA是指已经以各种形式修饰的mRNA。此类修饰包括mRNA的5'端加帽、与mRNA的3'端结合(聚腺苷酸化)的poly A尾，以及添加修饰的核苷酸如5-甲基胞苷和2-硫代尿苷。
在本发明的又一个方面，提供了用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含含有编码CCN5的多核苷酸的重组病毒作为活性成分。
多核苷酸可以是编码代表CCN5的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的核苷酸序列，并且核苷酸序列可以是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5。另外，多核苷酸还可以包含与其可操作地连接的启动子，以便表达CCN5。
如本文所用，术语“可操作地连接的”是指核苷酸表达调节序列(例如，启动子、信号序列或转录因子结合位点阵列)与另一核苷酸序列之间的功能性结合。调节序列可以调节其它核酸序列的转录和/或翻译。
具体地，与编码CCN5的多核苷酸结合的启动子可以优选地在动物细胞中操作，且更优选地在哺乳动物细胞中操作，以调节CCN5蛋白基因的转录。启动子包括来源于哺乳动物病毒的启动子和来源于哺乳动物细胞基因组的启动子。
启动子可以是选自巨细胞病毒(CMV)启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV tk启动子、RSV启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人IL-2基因启动子、人IFN基因启动子、人IL-4基因启动子、人淋巴毒素基因启动子和人GM-CSF基因启动子中的任一种。然而，启动子不限于此。具体地，启动子可以是CMV启动子。
病毒可以是选自腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒和痘苗病毒中的任一种。腺相关病毒不限于特定的血清型，并且且可以优选为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9中的任一种。
腺相关病毒(AAV)适合作为本发明的基因递送***，因为它能够感染非***细胞并具有感染各种类型细胞的能力。关于AAV载体的构建和使用的细节具体公开于第5,139,941号和第4,797,368号美国专利中。
通常，AAV病毒可以通过共转染包含侧翼为两个AAV末端重复的目的基因序列的质粒和包含野生型AAV编码序列而没有末端重复的表达质粒来产生。
视网膜疾病如上所述，并且可以是选自增殖性玻璃体视网膜病变、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、脉络膜新生血管和视网膜水肿中的任一种。
另外，包含含有编码CCN5的多核苷酸的重组病毒作为活性成分的的用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物的剂量可以根据各种因素而变化，包括疾病类型、疾病严重程度、药物组合物中包含的活性成分和其它成分的类型和量、制剂类型和患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、治疗持续时间和同时使用的药物。
在本发明的又一个方面，提供了用于预防或治疗视网膜疾病的方法，其包括向个体施用根据本发明的用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物的步骤，所述药物组合物包含以下物质作为活性成分：CCN5或其片段、编码CCN5的多核苷酸或含有编码CCN5的多核苷酸的重组病毒。
根据本发明的包含CCN5或其片段、编码CCN5的多核苷酸或含有编码CCN5的多核苷酸的重组病毒作为活性成分的药物组合物的剂量可以根据各种因素而变化，包括疾病类型、疾病严重程度、药物组合物中包含的活性成分和其它成分的类型和量、制剂类型和患者的年龄、体重、总体健康状况、性别、施用时间、施用途径、治疗持续时间和同时使用的药物。
然而，在根据本发明的包含CCN5作为活性成分的用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物中，可以含有0.0001-100mg/kg有效量的CCN5蛋白，使得药物组合物表现出期望的效果。这里，施用可以一天进行一次或数次。
另外，包含在根据本发明的药物组合物中的重组病毒可以以基于成人每天1.0×105至1.0×1015个病毒基因组的量施用。具体地，在本发明的药物组合物的剂量中，病毒可以以基于成人每天1.0×105至1.0×1015、1.0×107至1.0×1013、1.0×108至1.0×1012或1.0×109至1.0×1010的量施用。
另外，本发明的药物组合物可以通过本领域已知的各种方法施用至有需要的个体。个体可以是哺乳动物，特别是人。本领域技术人员可以考虑施用方法、体液体积、粘度等适当地选择施用途径。具体地，可以经由选自静脉内途径、动脉内途径、腹腔内途径、肌内途径、胸骨内途径、透皮途径、鼻内途径、吸入途径、局部途径、直肠途径、经口途径、眼内途径、玻璃体内途径和皮内途径中的任一种进行施用。在本发明的实施方案中，经玻璃体内施用编码CCN5的病毒。
在本发明的又一方面，提供了用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含CCN5或其片段；和抗VEGF药物作为活性成分。
如本文所用，术语“抗VEGF药物”是指用于抑制血管内皮生长因子(VEGF)的药物，并且可以用于治疗特定的癌症或年龄相关性黄斑变性。具体地，抗VEFG药物可以是贝伐单抗、兰尼单抗或阿柏西普。
以商品名安维汀(Avastin)出售的贝伐单抗是用于治疗多种类型的癌症和特定眼病的药物。对于癌症，贝伐单抗通过缓慢注射到静脉中施用并且用于结肠直肠癌、肺癌、成胶质细胞瘤、肾细胞癌等。另外，对于黄斑变性，贝伐单抗通过直接注射到眼睛中来施用。在贝伐单抗用于癌症的情况下，其常见的副作用包括鼻出血、头痛、高血压、皮疹等。它的其它严重的副作用包括胃肠穿孔、出血、过敏反应、血凝块和感染风险增加。在贝伐单抗用于眼病的情况下，其副作用包括视力丧失和视网膜脱离。贝伐单抗是血管生成抑制剂并且属于基于单克隆抗体的药物。贝伐单抗通过减缓新血管的生长而起作用。
以商品名诺适得(Lucentis)出售的兰尼单抗是从与贝伐单抗相同的亲本小鼠抗体产生的单克隆抗体片段(Fab)。兰尼单抗是一种抗血管生成药物，已被批准用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性，在有效性和副作用率方面与贝伐单抗相似。
以商品名艾力雅(Eylea)出售的阿柏西普是一种在美国和欧洲已经被批准治疗湿性黄斑变性的药物。
在本发明的又一方面，提供了用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含作为以下物质作为活性成分：编码CCN5的多核苷酸或含有编码CCN5的多核苷酸的重组病毒；和抗VEGF药物。
另外，根据本发明，提供了用于预防或治疗视网膜疾病的试剂盒，其包含以下物质作为活性成分：编码CCN5的多核苷酸或含有编码CCN5的多核苷酸的重组病毒；和抗VEGF药物。
这里，编码CCN5的多核苷酸、含有编码CCN5的多核苷酸的重组病毒和抗VEGF药物如上所述。
在本发明的又一方面，提供了用于预防或治疗视网膜疾病的组合物，其包含引入了编码CCN5的多核苷酸的细胞作为活性成分。
细胞可以是引入了编码CCN5的外源多核苷酸的细胞。具体地，CCN5可以是人源CCN5。
另外，细胞可以是干细胞或视网膜色素上皮细胞。干细胞可以是诱导的多能干细胞(iPSC)或成体干细胞。具体地，成体干细胞可以是间充质干细胞(MSC)、专能干细胞或羊膜上皮细胞。另外，间充质干细胞可以来源于选自脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜和胎盘中的任一种。
在本发明的实施方案中，进行了实验，其鉴定CCN5在已经通过TGF-β诱导了纤维化变形的人诱导的多能干细胞来源的RPE细胞中的作用。作为上述实验的结果，已经确定了可通过CCN5防止TGF-β诱导的iPSC衍生的RPE细胞的纤维化变形。
因此，根据本发明，可以提供用于预防或治疗视网膜疾病的组合物，其包含引入了编码CCN5的多核苷酸作为活性成分的细胞以用于预防或治疗RPE细胞的纤维化变形。另外，根据本发明，可以提供含有细胞的细胞治疗剂，所述细胞中引入了编码CCN5的多核苷酸。
在本发明中，“细胞治疗剂”是指用于治疗、诊断和预防目的的医疗产品，其通过一系列动作获得，如进行活的自体细胞、同种异体细胞或异种细胞的离体增殖和筛选，或者在其他方面改变细胞的生物学特性，以恢复细胞和组织的功能。
根据所用细胞的类型和分化程度可以将细胞治疗剂分为体细胞治疗剂和干细胞治疗剂。干细胞治疗剂可分为胚胎干细胞治疗剂和成体干细胞治疗剂。
发明模式
在下文中，将通过实例的方式详细描述本发明。然而，以下实例仅用于说明本发明，并且本发明不限于此。
I.实验准备和实验方法
实施例1.动物模型
通过将Ccl2-/-小鼠(Jackson Laboratories,USA)与C57BL/6野生型(WT)小鼠(Damul Science,Korea)回交10次来产生模型小鼠。将AAV9-VLP或AAV9-CCN5注射到18月龄Ccl2-/-小鼠中。所有动物实验方法和方案都得到光州科学技术院(Gwangju Institute ofScience and Technology)生命科学学院的动物护理和使用委员会的批准，并根据批准的指南(IACUC GIST-2015-24)在其中的设施中进行。这里，VLP意指病毒样颗粒。
将已接受AAV9-VLP的年龄匹配的WT小鼠用作对照。通过以3:1的比例腹腔内注射Zoletil 50(Virbac,France)和Rompun(Bayer Korea,Korea)来麻醉小鼠。在手术操作之后，每隔一天监测小鼠以检查是否发生任何不良事件。作为监测的结果，在其它器官中没有观察到有害的临床症状。12周后，用CO2使小鼠安乐死，并摘除眼睛。
实施例2.试剂
重组的TGF-β2购自PeproTech Korea(Korea)。用10ng/ml的重组TGF-β2处理ARPE-19细胞。重组的EGF和FGF-2购自Invitrogen(USA)。用1mM EGTA、10ng/ml EGF和20ng/mlFGF-2处理ARPE-19细胞。另外，用三种抗VEGF药物，即贝伐单抗(0.25mg/ml,Genetech/Roche,USA)、兰尼单抗(0.125mg/ml,Novartis Pharma Stein AG,Switzerland)和阿柏西普(0.5mg/ml,Bayer Pharma AG,Germany)处理ARPE-19细胞。
实施例3.腺相关病毒(AAV)载体和腺病毒的产生
通过请求美国公司Virovek Inc.进行生产和纯化，而获得了使用CMV启动子的表达人CCN5基因的AAV(血清型2和9)。由此，获得了AAV2-CCN5和AAV9-CCN5。另外，在先前的研究中已经描述了用于产生和纯化表达氨基端血凝素(HA)标记的小鼠CCN5的重组腺病毒的方法(Yoon PO等人.The opposing effects of CCN2 and CCN5 on the development ofcardiac hypertrophy and fibrosis.J Mol Cell Cardiol.2010；49(2):294-303)。以这种方式，产生了AdLacZ和AdCCN5，它们分别是含有编码LacZ和CCN5的基因的腺病毒。
实施例4.编码CCN5的修饰的mRNA的产生
通过请求美国公司TriLink BioTechnologies进行生产和纯化，而获得了编码CCN5的修饰的mRNA。该修饰的mRNA在5'端用CleanCap加帽，并且具有与3'端连接的polyA尾。另外，该修饰的mRNA含有5-甲基胞苷和2-硫代尿苷。
实施例5.细胞培养物
在37℃下，在5％CO2培养箱中，使用含有1％抗生素(Gibco,USA)和10％胎牛血清(FBS；HyClone,USA)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle'smedium)和Ham's F12营养混合物培养基(DMEM/F12；Welgene,Korea)培养视网膜色素上皮细胞系(ARPE-19；ATCC,USA)。每隔一天用新鲜培养基替换培养基。当细胞在培养板中培养至一定程度时，使用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA(Gibco,USA)传代培养这些细胞。
人iPSC衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞获自Axol Bioscience(USA)。在37℃下，在5％CO2培养箱中，使用比例为7:3的含有2％B-27补充剂(Gibco,USA)和1％抗生素-抗真菌剂(Gibco,USA)的杜尔贝科改良伊格尔培养基和Ham's F12营养混合物培养基(DMEM/F12；Gibco,USA)培养细胞。将细胞以100,000个细胞/孔接种在用Matrigel(Corning LifeScience,USA)预包被的8孔室载玻片(Corning Life Science,USA)上，并每天用新鲜培养基替换培养基。
将培养的细胞分成以下两组，并进行药物处理：一组中视网膜色素上皮细胞向间充质细胞分化的诱导被抑制；且另一组中，引起已诱导分化成间充质细胞的视网膜色素上皮细胞回复到正常视网膜色素上皮细胞。将ARPE-19细胞在无血清培养基中生长24小时。然后，将细胞用AdCCN5以50的感染复数(MOI)处理，然后用10ng/ml的TGF-β2(PeproTechKorea,Korea)处理，或者用TGF-β2处理，然后用AdCCN5处理。
实施例6.蛋白质印迹
对于体外实验，将培养的ARPE-19细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并用冷的RIPA缓冲液(1％NP-40、50mM Tris-HCl[pH 7.4]、150mM NaCl和10mM NaF)和蛋白酶抑制剂混合物(Roche,Germany)的混合溶液悬浮。将细胞悬液用超声波发生器以5％的振幅、2秒开/1秒关的周期处理5分钟。
对于体内实验，从Ccl2-/-小鼠摘除眼睛。仅从每只眼睛中取出视网膜/脉络膜/巩膜复合物，并将其置于冷的RIPA缓冲液中。使用1/8英寸微尖端，以5％的振幅、2秒/2秒的开关周期，用超声波发生器将复合物处理10秒。将细胞裂解物以13,000rpm离心20分钟。取其中溶解有蛋白质的上清液，并使用二喹啉甲酸蛋白质测定试剂盒(BCA,Thermo FisherScientific,USA)测量其中的蛋白质浓度。将等量的蛋白质样品与5×SDS缓冲液混合，并进行SDS-PAGE电泳。然后，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore,USA)。将膜在含有5％脱脂奶的Tris缓冲液中封闭1小时，然后与一抗在4℃下孵育过夜。然后，将膜与缀合有辣根过氧化物酶(HRP，Jackson ImmunoResearch)的二抗一起孵育，用化学发光底物(Amersham)处理，并通过ImageQuant LAS 4,000小型成像器(GE Healthcare)显影。使用ImageJ软件(NIH)进行蛋白质定量分析。
实施例7.免疫荧光染色
将通过接种在每个孔含有盖玻片的12孔培养板中而生长的细胞，用4％甲醛固定并用0.2％Triton X-100处理10分钟。用在PBS中的5％牛血清白蛋白的稀释溶液封闭细胞，并与抗ZO-1和抗α-SMA抗体在4℃下孵育过夜。对于二抗，将细胞在室温下与FITC或AlexaFluor 594缀合的二抗、用于f-肌动蛋白染色的Texas Red缀合的鬼笔环肽(Invitrogen,USA)和用于核染色的Hoechst 33342(Invitrogen,USA)孵育1小时。使用落射荧光显微镜(Zeiss,Germany)观察结果。对于视网膜平置(flat-mount)实验，从小鼠摘除眼睛，并将每只眼睛在4％甲醛中固定24小时。将RPE/脉络膜/巩膜复合物用含有半渗透溶液和封闭溶液的溶液在室温下分别处理2小时和1小时，然后与一抗在4℃下孵育过夜。将复合物用PBS洗涤并与二抗在室温下孵育2小时。用PBS进行洗涤，并用DAPI(Sigma Aldrich,USA)进行核染色。将RPE/脉络膜/巩膜复合物再次用PBS洗涤，并用Fluoromount(Sigma Aldrich,USA)封片。在荧光显微镜下进行观察。
同时，本发明中使用的一抗的信息显示在下表1中。
[表1]
抗体 制造商 稀释比 所进行的实验 来源
ZO-1 Invitrogen 1:1000 WB,ICC 兔
ZO-1 Invitrogen 1:200 IHC 小鼠
闭合蛋白 Invitrogen 1:1000 WB 兔
纤连蛋白 Sigma-Aldrich 1:1000 WB 兔
α-SMA Sigma-Aldrich 1:1000 WB,ICC 小鼠
波形蛋白 Santa Cruz 1:1000 WB 小鼠
HA Roche 1:1000 WB 小鼠
I型胶原 Abcam 1:1000 WB 小鼠
CCN5 GenScript 1:1000 WB 小鼠
CCN5 OriGene 1:200 IHC 兔
MerTK R&D Systems 1:1000 WB 山羊
RPE65 Abcam 1:1000 WB 小鼠
GAPDH Abcam 1:1000 WB 兔
实施例8.RNA提取和定量实时聚合酶链式反应
使用Trizol(Invitrogen,USA)试剂提取RNA。使用逆转录试剂盒(Promega,USA)合成cDNA，并使用SYBR green(TAKARA,Japan)进行实时聚合酶链式反应。通过分析扩增反应曲线来分析RNA水平，并且该分析以一式三份或一式四份进行。通过归一化为18s rRNA来定量基因的相对表达水平。
实施例9.胶原凝胶收缩测定
按先前所述进行胶原凝胶收缩测定(Liu Y等人,Induction by latanoprost ofcollagen gel contraction mediated by human tenon fibroblasts:role ofintracellular signaling molecules,Investigative ophthalmology&visual science,2008；49(4):1429-36)。具体地，将培养的ARPE-19细胞与1.2mg/ml胶原溶液(Invitrogen,USA)混合，并加入1N NaOH以中和胶原溶液的pH。将胶原凝胶悬浮液(1×105个细胞/孔，500μL)添加到24孔培养板中，并在37℃下聚合1小时。当形成胶原凝胶时，用移液管尖端移除其边缘，使得凝胶悬浮于培养基中。然后，用各种试剂进行处理，并使用ImageJ软件测量和分析胶原凝胶收缩的程度。
实施例10.细胞迁移能力的体外分析
为了测量细胞迁移能力，将ARPE-19细胞置于12孔培养板上，每个孔含有盖玻片，并培养直至培养的细胞覆盖盖玻片的整个区域。根据实验设计进行试剂处理，然后使用200μL尖端刮擦细胞。24小时后，将细胞用DAPI染色并在荧光显微镜下观察。此后，使用ImageJ软件测量细胞迁移距离。
实施例11.吞噬作用测定
将ARPE-19细胞以5×104个细胞/孔的密度接种到24孔培养板中，并用AdLacZ或AdCCN5和TGF-β处理。用TAMRA标记的凋亡胸腺细胞或1mg/ml pHrodo Red BioParticles(Invitrogen,USA)的处理，在37℃下在5％CO2培养箱中分别进行6小时和4小时，以观察其对吞噬作用活性的影响。
为了产生TAMRA标记的凋亡胸腺细胞，从5-6周龄C57BL/6小鼠获得胸腺，并使用5ml注射器活塞和细胞滤器解离以分离单个胸腺细胞。将胸腺细胞用50μM TAMRA-SE(Invitrogen，USA)在37℃下在细胞培养箱中染色30分钟。此后，通过在37℃的条件下于含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺的RPMI中孵育20分钟，并用完全RPMI洗涤一次来使胸腺细胞脱色。通过在37℃下在CO2细胞培养箱中，用50μM***(Calbiochem,Germany)处理4小时来诱导胸腺细胞的凋亡。此后，用完全RPMI洗涤细胞3次，并将2×105个凋亡胸腺细胞重悬于300μl吞噬细胞培养基中。
将凋亡的胸腺细胞悬液与ARPE-19细胞在细胞培养箱中孵育。此后，用冷的PBS洗涤吞噬细胞5次，胰蛋白酶消化，并悬浮在完全培养基中。然后，使用FACSCantoTM II流式细胞仪(BD,USA)进行分析。
根据前向散射/侧向散射图门控此类ARPE-19细胞，以区分已进行吞噬作用的ARPE-19细胞和未进行吞噬作用的ARPE-19细胞。将标志物M1用于门控，然后计算来自每个样品20,000个活细胞的荧光阳性事件的百分比。使用FlowJo软件分析数据。
实施例12.AAV9-CCN5和AAV9-VLP的玻璃体内注射
使用33G针在手术显微镜(Leica Microsystems Ltd.,Germany)下经玻璃体内注射AAV9-CCN5。相对的眼睛用作AAV9-VLP对照。
实施例13.统计分析
将定量基因表达分析重复三次或更多次。实验结果以平均值±标准偏差的形式表示，并且使用学生t检验进行统计分析。统计显著性通过星号表示(*，p<0.05或**，p<0.01)。
II.CCN5在ARPE-19细胞中的作用的鉴定
实验实例1.CCN5对ARPE细胞纤维化变形的抑制作用的鉴定
ARPE-19是来自人RPE的自发诱导分化的细胞系。成熟的ARPE-19细胞形成鹅卵石样单层并表达上皮细胞特有的标志物蛋白。用5ng/ml或10ng/ml的TGF-β处理培养的ARPE-19细胞2天(图1a)。结果示于图1b-1d中。
如图1b所示，在用TGF-β处理后，ARPE-19细胞获得成纤维细胞形态。特别地，如图1c所示，确定了用TGF-β处理显著降低了人源CCN5蛋白的表达水平。同时，间充质标志物蛋白α-SMA、波形蛋白、纤连蛋白和I型胶原的表达增加，而上皮标志物蛋白ZO-1和闭合蛋白的表达显著降低。另外，通过免疫荧光染色确定了，在用TGF-β处理的情况下，α-SMA和f-肌动蛋白的表达增加，并且紧密连接的形成被抑制(图1d)。根据这些结果，发现用TGF-β处理诱导ARPE-19细胞的纤维化变形。因此，在随后的实验中，用10ng/ml的TGF-β处理ARPE-19细胞48小时，以诱导纤维化变形。
用表达小鼠来源的CCN5的重组腺病毒(AdCCN5)或AdLacZ(作为对照)来感染ARPE-19细胞。在感染后第2天，用TGF-β处理细胞(图2a)。结果示于图2b-2d中。
如图2b所示，AdCCN5显著抑制由TGF-β诱导的形态变化。另外，如图2c所示，蛋白质印迹显示AdCCN5使TGF-β诱导的间充质标志物蛋白和上皮标志物蛋白表达的变化正常化。也通过定量实时聚合酶链式反应实验鉴定了这些变化(图2d)。另外，通过免疫荧光染色发现，对于ZO-1，其中紧密连接被TGF-β破坏的现象被小鼠来源的AdCCN5抑制；并且确定了由TGF-β诱导的α-SMA的表达增加和f-肌动蛋白的形成被AdCCN5抑制(图2e)。
另一方面，由于α-SMA表达增加而增加的收缩能力是上皮细胞纤维化变形的标志。胶原凝胶收缩测定显示，由TGF-β引起的细胞收缩性增加被小鼠来源的AdCCN5显著降低。这些结果示于图2f中。
A83-01是TGF-β受体的抑制剂，其结构与ALK-5抑制剂相似。通过蛋白质印迹观察到，人源的CCN5以与A83-01相同的水平抑制TGF-β诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形(图3)。
从上述结果，发现CCN5防止TGF-β诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形。
实验实例2.CCN5对ARPE-19细胞功能退化的预防作用的鉴定
TGF-β引起ARPE-19细胞的形态变化以及功能退化。用小鼠来源的AdCCN5或AdLacZ感染ARPE-19细胞2天，然后再次用TGF-β处理2天。刮擦(scratch)细胞单层。24小时后，在显微镜下检查细胞单层。结果示于图4a中。如图4a所示，TGF-β增加了ARPE-19细胞的迁移能力，并且AdCCN5显著抑制了ARPE-19细胞的迁移。
酶RPE65对于正常视力是必需的，并且用于将全反式视黄醛转化为11-顺式视黄醛。另外，蛋白质MerTK在RPE细胞的吞噬活性中起关键作用。蛋白质印迹显示用TGF-β处理后，酶RPE65和蛋白MerTK的表达水平显著降低，并且这种降低被小鼠诱导的AdCCN5抑制。这些结果示于图4b中。
使用pH敏感的荧光团标记的物质pHrodo Red标记的BioParticles和TAMRA标记的凋亡胸腺细胞观察RPE细胞的吞噬功能。荧光团标记的物质在被酸性吞噬体吞噬的情况下被活化。将RPE细胞与这些荧光团标记的物质一起孵育并通过流式细胞术分析。结果示于图4c和4d中。
如图4c和4d所示，TGF-β可显著降低RPE细胞的吞噬活性，而小鼠来源的AdCCN5极大抑制这种现象。从上述结果，发现AdCCN5防止由TGF-β诱导的ARPE-19细胞的功能退化。
实验实例3.CCN5对TGF-β-SMAD信号传导途径的抑制作用的鉴定
将蛋白质印迹用于鉴定人源的CCN5是否对TGF-β-SMAD信号传导途径具有影响。结果示于图5中。
如图5所示，TGF-β上调作为TGF-β受体的TGF-βRII，以及SNAI1和SNAI2的表达水平，所述SNAI1和SNAI2是参与由TGF-β诱导的上皮-间充质转化(EMT)的转录因子。然而，AdCCN5极大降低了这些转录因子的表达。另外，用AdCCN5处理抑制了由TGF-β引起的SMAD2的磷酸化的增加，并且抑制了由TGF-β引起的SMAD4表达的增加。另外，用AdCCN5处理抑制了由TGF-β引起的SMAD7表达的降低。CCN2是参与RPE细胞的纤维化变形的促纤维化分子，并且是TGF-β信号传导的下游靶标。TGF-β增加了CCN2的表达水平，并且这样的增加被AdCCN5抑制。从上述结果，发现CCN5抑制TGF-β-SMAD信号传导途径。
实验实例4.CCN5对ARPE-19细胞纤维化变形的修复作用的鉴定
进行了实验以观察人源的CCN5是否能够恢复由于TGF-β而已经形成的ARPE-19细胞的纤维化变形。为此目的，用TGF-β处理ARPE-19细胞2天，然后用AdCCN5或AdLacZ感染(图6a)。结果示于图6b-6e中。
如图6b所示，由TGF-β诱导的ARPE-19细胞的形态变化被AdCCN5恢复到其原始形状。另外，蛋白质印迹显示AdCCN5显著地使间充质标志物蛋白(α-SMA、波形蛋白和纤连蛋白)的表达增加和上皮标志物蛋白(ZO-1和闭合蛋白)的表达降低正常化，所述增加和降低均由TGF-β诱导(图6c)。另外，免疫荧光染色显示TGF-β破坏的紧密连接被AdCCN5显著恢复，并且AdCCN5使TGF-β引起的α-SMA的表达增加正常化。另外，鬼笔环肽染色揭示AdCCN5使TGF-β引起的f-肌动蛋白水平升高正常化(图6d)。另外，胶原凝胶收缩测定显示AdCCN5显著降低了由TGF-β引起的细胞收缩性增加(图6e)。从上述结果，发现CCN5能够恢复TGF-β诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形。
实验实例5.CCN5对ARPE-19细胞功能退化的修复作用的鉴定
用TGF-β处理ARPE-19细胞2天，然后用人源的AdCCN5或AdLacZ感染。然后，分析ARPE-19细胞的功能。结果示于图7a-7d中。
如图7a所示，AdCCN5显著降低了TGF-β诱导的ARPE-19细胞的迁移能力提高。如图7b所示，AdCCN5显著地使已经被TGF-β降低的蛋白质RPE65和MerTK的表达正常化。另外，流式细胞仪分析显示由TGF-β降低的吞噬活性被AdCCN5显著恢复(图7c和7d)。从上述结果，发现CCN5能够将TGF-β诱导的ARPE-19细胞的功能缺陷恢复到正常。
用TGF-β处理ARPE-19细胞两天后，用式1的A83-01(Sigma-Aldrich,USA)-一种TGF-β抑制剂进行处理(图8a)：
[式1]
Figure BDA0002777418230000231
结果示于图8b中。如图8b所示，与CCN5不同，A83-01不能使间充质标志物蛋白(α-SMA、波形蛋白和纤连蛋白)和上皮标志物蛋白(ZO-1和闭合蛋白)的表达的异常变化正常化(图8b)。从上述结果，发现抑制TGF-β信号转导可以防止TGF-β诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形，并且不能恢复已经形成的纤维化变形。
实验实例6.CCN5对RPE纤维化变形的体内修复作用的鉴定
年老的Ccl2-/-小鼠具有干性年龄相关性黄斑变性的特征，包括RPE的纤维化变形。使用玻璃体内注射，将表达人源的CCN5的重组腺相关病毒(AAV9-CCN5)注射到18月龄Ccl2-/-小鼠的右眼中，并将对照病毒(AAV9-VLP)注射到左眼中。注射后12周，摘除眼睛以获得RPE层并进行分析(图9a)。结果示于图9b和9c中。
如图9b所示，与正常(WT)小鼠眼睛的RPE层相比，CCN5在Ccl2-/-小鼠眼睛的RPE层中的表达显著降低，并且这样的降低被AAV9-CCN5恢复。在Ccl2-/-小鼠的RPE中，间充质标志物蛋白(α-SMA、波形蛋白和纤连蛋白)的表达显著增加，而上皮标志物蛋白(ZO-1和闭合蛋白)和RPE功能相关的标志物蛋白(RPE65和MerTK)的表达极大降低。这样的变化被AAV9-CCN5恢复到正常。
另外，检查了RPE/脉络膜/巩膜复合物以鉴定RPE细胞的紧密连接的独特特征。结果示于图9c中。
如图9c所示，观察到注射了AAV9-VLP的18月龄正常小鼠的RPE中所示的有序六边形形状的紧密连接结构，已经变形为注射了对照病毒的年龄匹配的Ccl2-/-小鼠的RPE中的不规则形状。相反，，确定了在经玻璃体内注射AAV9-CCN5的年龄匹配的Ccl2-/-小鼠的RPE中，紧密连接已经恢复到其正常形状。另外，同时，蛋白RPE65的表达降低被正常化，并且α-SMA的表达也降低(图9c)。从上述结果，发现CCN5恢复了年老Ccl2-/-小鼠的RPE中所示的纤维化变形。
实验实例7.CCN5对紧密连接破坏引起的ARPE-19细胞的纤维化变形的预防作用
细胞紧密连接对于RPE功能是重要的，并且紧密连接的破坏与各种眼病密切相关。在用EGTA、EGF和FGF-2(下文称为EEF)的组合处理RPE细胞的情况下，RPE细胞的紧密连接被破坏，导致RPE的正常形态和功能的丧失。
用人源的AdCCN5或AdLacZ感染ARPE-19细胞2天，然后再次用EEF处理2天(图10a)。结果示于图10b-10d中。如图10b所示，AdCCN5显著抑制EEF处理诱导的形态变化。蛋白质印迹显示，AdCCN5抑制CCN2和间充质标志物蛋白(α-SMA、波形蛋白和纤连蛋白)的表达增加，并且抑制上皮标志物蛋白(ZO-1和闭合蛋白)的表达降低，所述增加和降低都是由EEF的组合诱导的(图10c)。EEF降低CCN5的表达是值得注意的结果。另外，免疫荧光染色显示AdCCN5抑制EEF诱导的紧密连接的破坏，并抑制EEF诱导的α-SMA表达的增加。鬼笔环肽染色显示AdCCN5抑制通过EEF形成的f-肌动蛋白(图10d)。从上述结果，发现CCN5防止由EEF诱导的紧密连接的破坏引起的ARPE-19细胞的纤维化变形。
实验实例8.CCN5对贝伐单抗诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形的预防作用
抑制新血管形成的抗VEGF药物的使用是用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性的广泛使用的方法。然而，这种方法具有引起RPE细胞中的形态变化和功能变化的副作用。贝伐单抗是常用于治疗各种癌症或湿性年龄相关性黄斑变性的第一代抗VEGF药物。在本实验实例中，检查了贝伐单抗是否诱导ARPE-19细胞中的纤维化变形，以及这种不良结果是否被人源的CCN5防止。具体的实验过程示于实施例2中，并且该实验过程示意性地示于图11a中。实验结果示于图11b-11d中。
如图11b所示，在用贝伐单抗处理ARPE-19细胞的情况下，细胞的形态改变，并且这种现象被AdCCN5抑制。蛋白质印迹显示AdCCN5抑制间充质标志物蛋白(α-SMA、波形蛋白和纤连蛋白)的表达增加，并且抑制上皮标志物蛋白(ZO-1和闭合蛋白)的表达降低，所述增加和降低都是由贝伐单抗诱导的(图11c)。贝伐单抗降低CCN5的表达是值得注意的结果。另外，免疫荧光染色显示AdCCN5抑制由贝伐单抗诱导的紧密连接的破坏(图11d)。从上述结果，发现CCN5防止由贝伐单抗诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形。
实验实例9.编码CCN5的修饰的mRNA和CCN5蛋白的作用
根据图12a和13a中示意性示出的实验过程，使用编码人源的CCN5的修饰的mRNA(下文称为modRNA-CCN5)或纯化的人源的CCN5蛋白进行实验。结果示于图12b-12c和图13b-13c中。
蛋白质印迹显示在ARPE-19细胞中，modRNA-CCN5和纯化的CCN5蛋白抑制间充质标志物蛋白(α-SMA、波形蛋白和纤连蛋白)的表达增加，并将上皮标志物蛋白(ZO-1和闭合蛋白)的表达降低恢复到正常水平，所述增加和降低均由TGF-β诱导(图12b和13b)。另外，免疫荧光染色显示modRNA-CCN5和纯化的CCN5蛋白将被TGF-β破坏的紧密连接恢复到正常(图12c和图13c)。结果显示，即使在CCN5以修饰的mRNA和纯化的蛋白的形式递送的情况下，其在修复TGF-β诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形方面也具有优异的效果。
实验实例10.CCN5对抗VEGF药物(贝伐单抗、兰尼单抗和阿柏西普)诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形的预防作用
检查了作为抗VEGF药物的贝伐单抗、兰尼单抗和阿柏西普是否等同地诱导ARPE-19细胞中的纤维化变形，以及该变形是否被人源的CCN5防止(图14a)。实验过程示意性地示出于图14a中，并且实验结果示于图14b和14c中。
如图14b所示，作为抗VEGF药物的贝伐单抗、兰尼单抗和阿柏西普等同地导致CCN5表达降低和CCN2表达增加，并且这种现象被CCN5蛋白抑制。蛋白质印迹显示CCN5抑制间充质标志物蛋白(α-SMA、波形蛋白和纤连蛋白)的表达增加和上皮标志物蛋白(ZO-1和闭合蛋白)的表达降低，所述增加和降低均由抗VEGF药物诱导(图14c)。另外，免疫荧光染色显示，CCN5抑制紧密连接的破坏、α-SMA的表达增加和f-激动蛋白的形成，所有这些都是由抗VEGF药物诱导的(图14c)。这些结果显示CCN5防止由抗VEGF药物诱导的ARPE-19细胞的纤维化变形。
实验实例11.CCN5对TGF-β诱导的iPSC衍生的RPE细胞的纤维化变形的预防作用
在人iPSC衍生的RPE细胞中，进行用于鉴定人源的CCN5对TGF-β诱导的RPE细胞的纤维化变形的预防作用的实验。接种iPSC衍生的RPE细胞，并在2周后，用AAV2-CCN5感染细胞。然后，进行培养25天，然后用TGF-β进行处理3天(图15a)。在细胞接种的2周内，iPSC衍生的RPE细胞显示紧密堆积的鹅卵石形状。一个月后，细胞开始显示RPE细胞特异性色素沉着，同时形成圆顶形状。结果示于图15b中。
免疫荧光染色显示AAV2-CCN5抑制紧密连接的破坏、α-SMA的表达增加和f-肌动蛋白的形成，所有这些都是由TGF-β诱导的(图15b)。上述结果显示CCN5防止由TGF-β诱导的iPSC衍生的RPE细胞的纤维化变形。
序列表
<110> 光州科学技术院(Gwangju Institute of Science and Technology)
<120> 用于预防或治疗视网膜疾病的包含CCN5作为活性成分的药物组合物
<130> PCB901003GIS
<150> KR 10-2018-0056499
<151> 2018-05-17
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CCN5(小鼠)
<400> 1
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Ala Gly Pro Ser Gly Arg Gly Ala Val Cys Leu Phe Glu Glu Asp
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<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> CCN5(小鼠)
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<210> 6
<211> 227
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<223> CCN5(除信号肽外，人)
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Gln Leu Cys Pro Thr Pro Cys Thr Cys Pro Trp Pro Pro Pro Arg Cys
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225

Claims (20)

1.用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含CCN5或其片段作为活性成分。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述CCN5是包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物预防或治疗视网膜色素上皮细胞的纤维化变形。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述纤维化变形由选自TGF-β、EGTA、EGF、FGF-2和抗VEGF药物中的任一种引起。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述视网膜疾病是选自增殖性玻璃体视网膜病变、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、脉络膜新生血管和视网膜水肿中的任一种。
6.用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含编码CCN5的多核苷酸作为活性成分。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述多核苷酸是编码CCN5的mRNA。
8.用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含含有编码CCN5的多核苷酸的重组病毒作为活性成分。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
10.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述病毒是选自腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒和痘苗病毒中的任一种。
11.用于预防或治疗视网膜疾病的方法，其包括：
向个体施用权利要求1-10中任一项所述的药物组合物的步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其中经由选自静脉内途径、动脉内途径、腹腔内途径、肌内途径、胸骨内途径、透皮途径、鼻内途径、吸入途径、局部途径、直肠途径、经口途径、眼内途径、玻璃体内途径和皮内途径中的任一种进行施用。
13.用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含CCN5或其片段以及抗VEGF药物作为活性成分。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述抗VEGF药物是贝伐单抗、兰尼单抗或阿柏西普。
15.用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含以下物质作为活性成分：
编码CCN5的多核苷酸或含有编码CCN5的多核苷酸的重组病毒；和
抗VEGF药物。
16.用于预防或治疗视网膜疾病的试剂盒，其包含以下物质作为活性成分：
编码CCN5的多核苷酸或含有编码CCN5的多核苷酸的重组病毒；和
抗VEGF药物。
17.用于预防或治疗视网膜疾病的组合物，其包含引入了编码CCN5的多核苷酸的细胞作为活性成分。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述CCN5是人源CCN5。
19.如权利要求17所述的组合物，其中所述细胞是干细胞或视网膜色素上皮(RPE)细胞。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述干细胞是间充质干细胞或iPSC。
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