JP6731250B2 - 生物粒子計数器校正用の標準粒子懸濁液の製造方法、及び、生物粒子計数器の校正方法 - Google Patents

Description

本発明は、生物粒子計数器校正用の標準粒子懸濁液の製造方法、及び、生物粒子計数器の校正方法に属する。

厚生労働省から「水道におけるクリプトスポリジウム等対策指針」が出され、浄水処理施設から出るろ過水の濁度を０．１度以下に維持することとなっている。本来、ろ過水濁度０．１度以下を維持する目的はクリプトスポリジウム対策であるが、近年、ゲリラ雷雨等の急激な気候変動により、浄水処理施設の原水である湖沼やダム湖にピコ植物プランクトンが大量発生しやすくなり、このピコ植物プランクトンの大量発生がろ過漏出障害等を引き起こすため、ろ過水濁度０．１度以下を担保することが困難になりつつある。そこで、本来の、クリプトスポリジウム等の生物粒子の個数や濃度を正確に測定できる状態を維持するため、簡便でリアルタイムにピコ植物プランクトン（藻類）などの生物粒子の数を計数できる装置が求められている。

このような装置として、現在、蛍光顕微鏡による目視計数方法が存在するが、この方法では、計数に手間がかかり計数値の再現性も悪いため、前記のような急激な天候変動に対応した生物粒子の個数や濃度変化をリアルタイムで測定するのは困難である。そこで、藻類などの生物粒子の別の検出法として、リアルタイムで生物粒子数を計数できる自家蛍光法が開発されている（特許文献１）。

藻類などの生物粒子を正確に計数するためには、測定装置を測定に適した状態に恒常的に維持しておく必要があり、例えば光学系においては散乱光や蛍光を受光する受光部の感度、光軸などが適正に維持されていなければならない。したがって、測定に先立って測定装置が測定に適正な状態であるかをチェックし、必要であれば、装置を適切な状態に校正しなければならない。

特開２０１３−１４８３９１号公報

藻類などの生物粒子を検出する水質検査装置を校正（精度管理）するためには、標準粒子が用いられる。このような校正に用いられる標準粒子は、標準粒子中に含まれる蛍光色素の量と標準粒子が発する蛍光強度との相関関係が精密に制御されている必要がある。しかしながら、生物粒子が発する自家蛍光と同程度の吸収波長及び蛍光波長を有し、安定した高い蛍光強度を示す標準粒子は存在しなかった。そのため、生物粒子を検出する水質検査装置の校正を簡便に実施できず、経時的に測定精度が低下するなどの問題があったため、浄水処理施設等の所望の水質測定の現場における測定結果の安定性を担保することができなかった。また、水質測定の現場において水質測定装置の検出系にいったん誤差が生じると装置の製造元に校正を依頼するなど、煩雑な手間が必要になるという問題があった。

水質測定の現場における測定誤差を小さくするためには、安定的な蛍光強度を示すことはもちろんのこと、現場では、環境に応じて生物粒子の濃度が低濃度の場合や高濃度の場合などと様々に変化するため、低強度の蛍光を示す標準粒子と高強度の蛍光強度を示す標準粒子とがそれぞれ必要になると考えられる。しかしながら、特に、安定的にクロロフィルなどの生物粒子に近い挙動を示す蛍光色素を高濃度で含有する粒子は存在しなかった。

本発明が解決しようとする課題は、生物粒子計数器の校正（精度管理）に適した標準粒子懸濁液の製造方法を提供することである。

前記課題は、例えば、以下の手段により解決することができる。
なお、本発明において、数値範囲を表す「ａ〜ｂ」等の表記は、ａ以上、ｂ以下と同義であり、ａ及びｂをその範囲内に含むものとする。

＜１＞ 樹脂製粒子と、生物粒子と同程度の吸収波長及び蛍光波長を有する蛍光色素とを含む液体を用い、少なくとも該蛍光色素を樹脂製粒子中に取り込むことで標準粒子を形成する工程を含むことを特徴とする、
生物粒子計数器校正用の標準粒子懸濁液の製造方法。

＜２＞ 前記樹脂製粒子が、該粒子の質量１００質量％に対し、スチレンに由来する構成単位を８０質量％以上含む、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞ 前記標準粒子１ｇあたりの蛍光色素の含有量が２．０μｍｏｌ／ｇ以上である、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞ 前記標準粒子の体積平均粒子径が０．１〜２μｍである、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の製造方法。

＜５＞ 前記蛍光色素としてテトラピロール環を有する化合物を含む、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の製造方法。

＜６＞ 前記標準粒子が、生物粒子と同程度の粒径、およびそれに対応した散乱光強度を有する、＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の製造方法。

＜７＞ 生物粒子に光を照射することで生じる蛍光に応じて信号（電圧）を生成する回路、及び、前記信号（電圧）に基づき前記生物粒子の数を計数可能な部位を有する生物粒子計数器を用い、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の製造方法で得られる標準粒子懸濁液に光を照射することで生じる蛍光に応じて信号（電圧）を生成する信号生成ステップと、
前記信号生成ステップで用いた標準粒子懸濁液に含まれる標準粒子と同程度の蛍光色素含有量の粒子を用いて予め前記信号生成ステップと同様の方法で測定しておいた基準信号値を特定し、前記信号生成ステップで生成した信号値が該基準信号値になるように、前記回路を調整する調整ステップとを含む、
生物粒子計数器の校正方法。

本発明の製造方法によれば、生物粒子計数器の校正（精度管理）に適した標準粒子懸濁液を提供することができ、特に、生物粒子が発する自家蛍光と同程度の吸収波長及び蛍光波長を有し、安定した蛍光強度を示し、所望の強度（低強度から高強度のうちの任意の強度）の蛍光強度を示し、好ましくは、生物粒子と同程度の粒径、およびそれに対応した散乱光強度を有する標準粒子懸濁液を提供することができる。
また、本発明の製造方法により製造された標準粒子懸濁液を用いることで、蛍光色素含有量の値に対応する蛍光強度と散乱光強度、蛍光色素含有量に対応した測定パラメータ値を一度に得ることができ、生物粒子計数器の状態をより簡便に把握できる。また、たとえ生物粒子計数器の状態が悪いことが判明しても、本発明の粒子懸濁液を用いて測定した結果と、予め測定しておいた基準データとから、該計数器を適切な状態の感度に合わせることなどの校正が容易である。

図１は、本発明の実施の形態に係る、校正装置を有する生物粒子計数器の構成例を示す概略ブロック図である。 図２（Ａ）は、標準粒子の蛍光色素含有量の値と、該蛍光色素含有量の値に対応する第１信号の基準電圧値（ここでは蛍光波高値）との関係の一例を示す図（図１の基準データ３１）である。図２（Ｂ）は、標準粒子の蛍光色素含有量の値と、該蛍光色素含有量の値に対応する第２信号の基準電圧値（ここでは散乱光波高値）との関係の一例を示す図（図１の基準データ３１）である。 図３は、図１に示す校正装置２の動作の一例について説明するフローチャートである。

本発明の生物粒子計数器校正用の標準粒子懸濁液（以下、「本発明の標準粒子懸濁液」または単に「懸濁液」ともいう。）の製造方法は、樹脂製粒子と、生物粒子と同程度の吸収波長及び蛍光波長を有する蛍光色素とを含む液体を用い、少なくとも該蛍光色素を樹脂製粒子中に取り込むことで標準粒子を形成する工程を含むことを特徴とする。

≪生物粒子計数器用の標準粒子懸濁液≫
本発明の懸濁液は、生物粒子と同程度の吸収波長及び蛍光波長を有する蛍光色素を含み、好ましくは、生物粒子と同程度の粒径、およびそれに対応した散乱光強度を有することを特徴とする。なお、本発明における標準粒子を、単に「標準粒子」ともいい、以下において、単に「粒子」という場合には、蛍光色素を含まない粒子のことをいう。

＜標準粒子＞
前記標準粒子としては、体積平均粒子径が、好ましくは０．１〜２μｍ、より好ましくは０．２〜１．５μｍ、さらに好ましくは０．３〜１．０μｍの範囲内にある粒子が挙げられる。標準粒子の粒径が前記範囲にあると、該粒子は、生物粒子と同程度の散乱光強度を示しやすくなるため好ましい。なお、本発明における標準粒子の体積平均粒子径は、レーザー回折散乱光粒度分布測定装置、ＬＳ１３３２０型にて測定できる。

本発明の懸濁液における前記標準粒子の粒子径変動係数（ＣＶ）は３０％以下が好ましく、２０％以下がさらに好ましい。なお、本発明における標準粒子の粒子径変動係数は、レーザー回折散乱光粒度分布測定装置、ＬＳ１３３２０型にて測定できる。

さらに、水中において生物粒子と近い挙動を示す標準粒子を得ることを目的として、前記標準粒子は、水中における平均比重が０．９０〜１．５の粒子が好ましい。
平均比重は、次のようにして測定される。つまり、比重計を用いて測定された各種の比重の水溶液を用意しておき、この水溶液に乾燥させた標準粒子群を浮かべ、該粒子群の沈降状況を観察し、該粒子群が完全に沈まずに水溶液中に浮遊している溶液の比重をもって、平均比重とする。

（樹脂製粒子）
前記標準粒子は、樹脂製粒子を含み、膨潤性の樹脂製粒子を含むことが好ましい。
前記膨潤性の樹脂製粒子としては、樹脂製粒子を溶媒に浸漬させた際に、該粒子が溶媒を吸収して体積が膨張する粒子のことをいい、樹脂製粒子を溶媒に浸漬させた際に、該粒子が溶媒を吸収し、体積が浸漬前に比べ、５０〜８００％程度膨張する粒子であることが好ましい。

粒子が膨潤性か否かは、例えば、溶媒吸収時の粒子を光学顕微鏡観察することで確認できる。ポリスチレン粒子を例に挙げて膨潤量の測定方法を説明する。
まず、光学顕微鏡観察により膨潤前のポリスチレン粒子の任意の１００個の粒子の直径を測定し、得られた直径から体積の平均値を算出する。次に、ポリスチレン粒子を３０体積％のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）水溶液に５分間浸漬し、浸漬後の粒子についても同様に光学顕微鏡観察により任意の１００個の粒子の直径から体積の平均値を算出する。浸漬前の粒子の体積の平均値を１００％として膨潤後の粒子の体積の平均値を算出する。溶媒の選定は粒子の材質に応じ、適宜選択すればよい。

このような樹脂製粒子としては特に制限されないが、重合性不飽和芳香族化合物、重合性不飽和カルボン酸化合物、重合性不飽和スルホン酸化合物もしくはその塩、重合性カルボン酸エステル化合物、不飽和カルボン酸アミド化合物、重合性不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、及び、共役ジエン化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を用いて得られる粒子であることが好ましく、重合性不飽和芳香族化合物、重合性不飽和カルボン酸化合物、重合性不飽和スルホン酸化合物もしくはその塩、及び、重合性カルボン酸エステル化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を用いて得られる粒子であることがより好ましい。

樹脂製粒子の原料化合物として、具体的には、スチレン、クロルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、ビニルトルエン、ビニルナフタレン、ジビニルナフタレン、（メタ）アクリル酸α−ナフチル、（メタ）アクリル酸β−ナフチルなどの重合性不飽和芳香族類；（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸などの重合性不飽和カルボン酸類；スチレンスルホン酸ソーダなどの重合性不飽和スルホン酸類若しくはその塩；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニルなどの重合性カルボン酸エステル類；等が挙げられる。

また、樹脂製粒子の原料化合物として、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニル；などの重合性不飽和カルボン酸アミド類、重合性不飽和ニトリル類、ハロゲン化ビニル類、共役ジエン類等を挙げることができる。

これらのうち、蛍光色素を容易に取り込むことができ、得られる標準粒子からの蛍光色素の脱落を抑制できる等の点から、重合性不飽和芳香族類由来の構成単位と、重合性不飽和カルボン酸類及び重合性不飽和スルホン酸類若しくはその塩から選ばれる少なくとも１種由来の構成単位とを含む共重合体が好ましく、特にスチレンと、重合性不飽和カルボン酸及び重合性不飽和スルホン酸から選ばれる少なくとも１種との共重合体がより好ましい。

前記樹脂製粒子中の重合性不飽和芳香族類、好ましくはスチレン由来の構成単位の含有量は、該粒子を構成する全構成単位の質量１００質量％に対し、好ましくは８０質量％以上であり、より好ましくは９０質量％以上であり、特に好ましくは９５質量％以上である。重合性不飽和芳香族類は、特に後述する非水溶性の蛍光色素との親和性が高く、標準粒子からの蛍光色素の脱落を抑制できる観点で好ましい。

重合性不飽和芳香族類と重合性不飽和カルボン酸及び重合性不飽和スルホン酸から選ばれる少なくとも１種との共重合比は、重合性不飽和芳香族類、重合性不飽和カルボン酸及び重合性不飽和スルホン酸の総使用量１００質量％に対し、樹脂製粒子の分散性の観点から、重合性不飽和カルボン酸及び重合性不飽和スルホン酸の使用量が、好ましくは０．０１〜５質量％であり、より好ましくは０．１〜３質量％であり、特に好ましくは０．３〜１質量％である。

前記樹脂製粒子は、市販品を用いてもよく、従来公知の方法で合成したものを用いてもよい。前記従来公知の方法としては、特に制限されないが、分散重合法、懸濁重合法、乳化重合法が挙げられ、乳化重合法が好ましい。

（蛍光色素）
前記標準粒子は、生物粒子と同程度の吸収波長及び蛍光波長を有する蛍光色素を含む。生物粒子と同程度の吸収波長とは、例えば分光光度計により測定した吸収スペクトルから得られた吸収極大波長が、３５０〜５００ｎｍの範囲内にあることをいう。また、生物粒子と同程度の蛍光波長とは、分光蛍光光度計により測定した蛍光スペクトルから得られた最大蛍光波長が６００〜７５０ｎｍの範囲内にあることをいう。

前記蛍光色素は、テトラピロール環を有する化合物を含むことが好ましく、非水溶性の蛍光色素が好ましい。非水溶性であるとは、２５℃の水１００ｇに対する蛍光色素の溶解量が３ｇ以下であることをいい、好ましくは２ｇ以下、より好ましくは１ｇ以下である。溶解度が前記範囲内であると、蛍光色素の樹脂製粒子に対する着色性に優れ、水中に標準粒子を分散させても蛍光色素の脱落が少なく、安定した蛍光強度を示す懸濁液を得ることができる。

テトラピロール環を有する化合物としては、ポルフィリン又はポルフィリン誘導体が挙げられる。ポルフィリンとは、４つのピロール環を構成する４つの窒素原子、及び、種々の金属原子で容易に置換できる２つの置換可能水素原子を有する化合物のことをいう。ポルフィリン誘導体としては、ポルフィリン環骨格中にさらに該骨格を形成する環以外の他の環を含むポルフィリン（例：フタロシアニン）；ポルフィリン環骨格の１つ以上の炭素原子をヘテロ原子で置換した構造を有するポルフィリン（骨格炭素の置換体）；ポルフィリン環骨格の１つ以上の窒素原子を炭素原子又は窒素原子以外のヘテロ原子で置換した構造を有する誘導体（骨格窒素の置換体）；ポルフィリンの末端（メソ−、β−）部分又はコア原子（ピロール環の窒素原子に結合、配位する）部分に、水素以外の置換基又は原子を有する誘導体；ポルフィリン環骨格の１つ以上の不飽和結合が飽和結合に変換された構造を有する誘導体（ヒドロポルフィリン、例えば、クロリン、バクテリオクロリン、イソバクテリオクロリン、デカヒドロポルフィリン、コルフィン、ピロコルフィン）；１つ以上のポルフィリン原子に対し、１つ以上の金属原子が配位した構造を有する誘導体（メタロポルフィリン）；ポルフィリン環骨格にピロール単位やピロメテニル単位が導入された、つまり、５つ以上のピロール環等の環を含む骨格を有する誘導体（環拡張ポルフィリン）；ポルフィリン環骨格のうち、１つ以上の基（例：メゾ位）が少ない誘導体（省略ポルフィリン、例えば、コリン、コロール）；及び、前記誘導体の組み合わせを含む。

前記ポルフィリン環骨格の１つ以上の不飽和結合が飽和結合に変換された構造を有する誘導体の具体例としては、クロロフィルａ、ｂ、ｄ又はｆが挙げられる。
バクテリオクロリンは、２つの部分的に飽和された非隣接（すなわち、トランス）ピロール環を有し、イソバクテリオクロリンは、２つの部分的に飽和された隣接（すなわち、シス）ピロール環を有する。

本発明では、テトラピロール環を有する化合物の中でも、下記式（１）で表される化合物又はその金属錯体が特に好ましい。

式（１）において、
Ｒは独立に、水素原子、ハロゲン原子（好ましくは臭素原子）、ニトロ基、シアノ基又はアルコキシル基（例えばメトキシ基、エトキシ基）を表し、
Ｇは独立に、ハロゲン原子、水酸基、スルホン酸基、カルボキシ基、アルコキシ基又はアミノ基を表し、
ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に、０〜５の整数を表し、Ｇの各フェニル基における置換位置も同じであっても異なっていてもよく、
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤはそれぞれ独立に、メゾ位の炭素原子とともに、ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン又はイソバクテリオクロリン骨格を形成する５員環の窒素含有環を表す。

式（１）で表されるテトラフェニルポルフィリン又はその誘導体の金属錯体における金属としては、マグネシウム、亜鉛、銅、鉄、ニッケル、コバルト、マンガン、チタン、アルミニウム等が挙げられ、好ましくはマグネシウムが挙げられる。前記蛍光色素としては、前記課題を解決し易い化合物が好ましく、式（１）で表される、金属錯体ではないテトラフェニルポルフィリン骨格を有する化合物が好ましい。

前記蛍光色素としては、後述する浸潤法において十分な量の蛍光色素を粒子中に留めることができる蛍光色素が好ましく、非水溶性の色素であることが好ましく、浸潤法に使用する有機溶媒（例：ＴＨＦ）に対する溶解度が高い色素であることが好ましく、用いる樹脂製粒子との相溶性が高い色素であることが好ましく、得られた標準粒子を水系媒体中に分散させても該標準粒子中から色素漏出し難い色素であることが好ましい。樹脂製粒子を構成するポリマーとの相溶性が高い、非水溶性の蛍光色素を用いた場合、得られる標準粒子を水系媒体中に分散させても、色素の漏出が生じ難く、蛍光色素の濃度が所定濃度である標準粒子が得られるため、このような標準粒子を用いることで、安定した検量線を引くことができ、校正の精度が向上する。

前記標準粒子における蛍光色素の含有量は、標準粒子１ｇあたりに換算して２μｍｏｌ／ｇ以上であることが好ましく、５〜８０μｍｏｌ／ｇであることがより好ましく、６〜４０μｍｏｌ／ｇがさらに好ましい。
蛍光色素の含有量が前記範囲内であると、十分な蛍光強度を示しつつ、消光が生じ難い標準粒子が得られるため好ましい。

本発明において、蛍光色素の含有量（粒子内に取り込まれた蛍光色素、もしくは粒子表面に結合した蛍光色素のことをいう。）は、以下のようにして求められる値である。
すなわち、標準粒子を、該粒子を溶解可能な有機溶媒（例：Ｎ−メチルピロリドン）にて溶解し、得られた溶解液の吸収スペクトルを測定する。得られた吸光度を用い、別途測定した目的色素のみの濃度検量線から溶解液中の色素の濃度を算出することで、標準粒子中の色素含有量が求められる。
標準粒子を溶解させることで、懸濁液中の濁度の影響を排除することができ、懸濁液中に含まれる目的色素の量を測定することができる。

＜標準粒子の製造方法＞
標準粒子の製造方法としては、（手法１）化学結合により粒子表面に蛍光色素を固定化する方法、（手法２）蛍光色素の存在下で造粒し、粒子化する過程で蛍光色素を該粒子に取り込ませる方法、（手法３）樹脂製粒子と、生物粒子と同程度の吸収波長及び蛍光波長を有する蛍光色素とを含む液体を用い、少なくとも該蛍光色素を樹脂製粒子中に取り込む工程を含む浸潤法、より好ましくは、膨潤性の樹脂製粒子を蛍光色素を含む有機溶媒中で膨潤させ、少なくとも該蛍光色素を該粒子中に取り込む浸潤法などが考えられるが、本発明では、（手法３）を用いる。

前記（手法１）では、化学結合により蛍光色素が粒子表面に結合しているため、色素の脱落が少なく安定した蛍光強度が得られる一方で、蛍光色素の導入量を多くすることができず、特に、高濃度の検量線を作成するための測定点数が十分に得られないため、結果として、得られた標準粒子を用いた場合、校正精度が落ちる傾向にある。（手法２）では、十分な高蛍光強度の標準粒子の製造が困難である傾向にあり、特に、高濃度の検量線を作成するための測定点数が十分に得られず誤差の低減が困難となる傾向にある。また、造粒過程において、所定量の蛍光色素を粒子に取り込ませることが困難となる傾向にあるため、結果として、得られた標準粒子を用いた場合、校正精度が落ちる場合がある。
一方で、前記（手法３）によれば、得られる標準粒子中の蛍光色素量を所望量に容易に制御することができ、所望の発光強度を有する標準粒子、特に高蛍光強度の標準粒子を容易に製造することができる。

以下、前記標準粒子を製造する方法の好ましい一例を挙げる。
まず、乳化重合などにより、例えば、スチレン−メタクリル酸共重合体からなる樹脂製粒子を製造する。好ましい組成、粒子径等は前記の通りである。

次に、この樹脂製粒子群を水系媒体中に分散させ、水系分散液を調製する。該水系分散液中の樹脂製粒子の濃度としては、０．５〜１０質量％の範囲が好ましく、１〜５質量％がより好ましく、２〜３質量％がさらに好ましい。

樹脂製粒子を分散する水系媒体としては、水を５０質量％以上含むものが好ましく、８０質量％以上含むものがより好ましく、９０質量％以上含むものがさらに好ましい。

前記水系分散液は、界面活性剤などの添加剤を含有していてもよい。
界面活性剤としては、ノニオン系界面活性剤が挙げられ、中でも粒子分散安定性を高めることから高分子系界面活性剤が好ましく、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ４０７（ＢＡＳＦ社製、シグマアルドリッチ社製）がより好ましい。界面活性剤濃度は、蛍光色素吸収時に０．１〜１質量％の範囲内で含まれることが好ましい。

得られた樹脂製粒子の水系分散液に、蛍光色素を有機溶媒に溶解した色素溶液を加えて撹拌しながら染色する。樹脂製粒子の水系分散液に色素溶液を加えると、樹脂製粒子が膨潤し、溶媒中に存在する色素が徐々に樹脂製粒子内に吸収されてゆく。

蛍光色素を溶解する溶媒としては、例えば、エチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類；メタノール、エタノールなどのアルコール類；塩化メチレン；二塩化エチレン；クロロホルム；四塩化炭素；酢酸エチル；酢酸メチル；メチルエチルケトン；シクロヘキサン；シクロペンタン；ＴＨＦ；トルエン；ヘキサン；ヘプタンなどが挙げられ、用いる蛍光色素の種類等に応じて１種類又は２種類以上が用いられる。本発明においては、水に溶解し、且つ、蛍光色素の溶解度が高いことから、ＴＨＦが好ましい。

色素溶液における蛍光色素の濃度は０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲内が好ましく、０．２〜２ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．５〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌがさらに好ましい。

樹脂製粒子の水系分散液と色素溶液との使用割合は、樹脂製粒子と蛍光色素との比率が、樹脂製粒子１００ｇに対して、蛍光色素が０．１〜６ｇの範囲内となるように使用することが好ましく、０．２〜３ｇがより好ましく、０．６〜２ｇがさらに好ましい。
なお、蛍光色素の使用量が多くなれば、得られる標準粒子の蛍光強度が増加する傾向にあるが、蛍光色素の使用量があまりに多くなると、消光現象によって、得られる標準粒子の蛍光強度が飽和状態に達する場合がある。このため、蛍光強度の点やコストの点などを考慮すると、蛍光色素の使用量は前記範囲にあることが好ましい。

蛍光色素吸収時における有機溶媒濃度は、樹脂製粒子の組成、粒子径などにより決定されるが、１５〜５０体積％が好ましく、２０〜４５体積％がより好ましく、２５〜４０体積％がさらに好ましい。この範囲内であると、樹脂製粒子の膨潤が十分となり、蛍光色素を取り込みやすい。また、得られる標準粒子からの蛍光色素の浸出が低減され、樹脂製粒子の状態変化による凝集や形状の変化を抑制できる。

蛍光色素を樹脂製粒子に吸収させる温度は、２０〜３０℃の範囲で樹脂製粒子を重合する際の反応温度を超えない範囲に設定することが好ましい。

また、蛍光色素を樹脂製粒子に吸収させる時間（樹脂製粒子の水系分散液と色素溶液とを、撹拌する時間）は、用いる蛍光色素の種類、樹脂製粒子の組成、粒子径などにより決定されるが、通常、２〜３０分が好ましい。

蛍光色素を樹脂製粒子に吸収させる工程は、前記色素溶液で用いた有機溶媒を除去することにより終了する。
前記有機溶媒を除去する方法としては、遠心分離処理又は透析処理が挙げられる。さらに、蛍光色素濃度が飽和溶解度以上になって標準粒子から浸出することを防ぐために、界面活性剤による洗浄工程を設けておくことが好ましい。このように処理された標準粒子は、水（溶液）中で蛍光色素が浸出し難いため好ましい。

前記のように、所定時間蛍光色素を吸収させ、遠心分離処理などにより色素溶液と標準粒子とを分離した後、水などの溶媒に標準粒子を分散させて本発明の懸濁液を得ることができる。

＜標準粒子懸濁液＞
本発明の懸濁液は、前記標準粒子と、分散媒、好ましくは水系媒体とを少なくとも含み、必要に応じて凝集防止剤、屈折率調節剤、防腐剤などの公知の添加剤を含んでいてもよい。

本発明の懸濁液中の標準粒子の濃度は、所望の用途に応じ適宜調整すればよい。

前記水系媒体としては、本発明の懸濁液中の液体成分１００質量％に対し、水を８０質量％以上含むものが好ましく、９０質量％以上含むものが好ましく、９５質量％以上含むものがさらに好ましい。

≪生物粒子計数器の校正方法≫
本発明において、生物粒子計数器の校正方法は、例えば
生物粒子に光を照射することで生じる蛍光に応じて信号（電圧）を生成する回路、及び、前記信号（電圧）に基づき前記生物粒子の数を計数可能な部位を有する生物粒子計数器を用い、前記本発明の懸濁液に光を照射することで生じる蛍光に応じて信号（電圧）を生成する信号生成ステップと、
前記信号生成ステップで用いた標準粒子懸濁液に含まれる標準粒子と同程度の蛍光色素含有量の粒子を用いて予め前記信号生成ステップと同様の方法で測定しておいた基準信号値を特定し、前記信号生成ステップで生成した信号値が該基準信号値になるように、前記回路を調整する調整ステップとを含む、
ことを特徴とする。

図１は、本発明の実施の形態に係る、校正装置を有する生物粒子計数器の構成例を示す概略ブロック図である。図１に示す生物粒子計数器１の校正が、本発明に係る生物粒子計数器の校正方法に従って、校正装置２によって実行される。

生物粒子計数器１は、例えば、特開２０１３−１１７４６６号公報に記載の装置のように、生物粒子又は標準粒子を含む試料液体が流動するフローセル（図示せず）と、フローセル内の所定の計測域に対してレーザー光などの光を照射する光源及び光学系（図示せず）と、その照射光に基づいて、計測域内の粒子（生物粒子又は校正用粒子）が発する蛍光と散乱光とを分離する光学系（図示せず）とを備える。

さらに、生物粒子計数器１は、生物粒子又は標準粒子に光を照射することで生じる蛍光に応じて第１信号（電圧）を生成する第１回路１１と、その光の照射の際に生じる生物粒子又は標準粒子からの散乱光に応じて第２信号（電圧）を生成する第２回路１２と、その第１信号及び第２信号に基づき生物粒子又は標準粒子の数を計数する計数処理部１３などとを備える。

第１回路１１は、例えば、フォトダイオードなどの蛍光受光部１１ａと、増幅器１１ｂと、Ａ／Ｄ変換器１１ｃとを備える。例えば、蛍光受光部１１ａは、前述の生物粒子又は標準粒子からの蛍光を受光し、受光した蛍光の強度に応じた電圧の電気信号を出力し、増幅器１１ｂは、その電気信号の電圧を所定の増幅率で増幅し、Ａ／Ｄ変換器１１ｃは、増幅後の電気信号をデジタル信号へ変換する。

第２回路１２は、例えば、フォトダイオードなどの散乱光受光部１２ａと、増幅器１２ｂと、Ａ／Ｄ変換器１２ｃとを備える。例えば、散乱光受光部１２ａは、前述の生物粒子又は標準粒子からの散乱光を受光し、受光した散乱光の強度に応じた電圧の電気信号を出力し、増幅器１２ｂは、その電気信号の電圧を所定の増幅率で増幅し、Ａ／Ｄ変換器１２ｃは、増幅後の電気信号をデジタル信号へ変換する。

計数処理部１３は、例えば、第１回路１１から出力されるデジタル信号及び第２回路１２から出力されるデジタル信号に基づいて、計測域を通過する生物粒子又は標準粒子を粒径区分ごとに計数するデジタル処理回路である。なお、粒径区分の閾値は、粒子（蛍光色素の含有量がゼロの粒子、具体的には、蛍光色素を含まない以外は前記標準粒子と同じ粒子）の粒径に対応する散乱光強度に基づき設定されている。

生物粒子又は標準粒子は、前述の計測域を通過する際に、照射されるレーザー光などの光に対応する蛍光及び散乱光を発する。なお、蛍光特性を有さない非生物粒子が計測域を通過する際には、散乱光は発せられるが、蛍光は発せられない。このため、計数処理部１３は、前述の計測域を通過する生物粒子又は標準粒子の１つずつに対応して、パルス状の第１信号及び第２信号を検出し、このパルス状の第１信号及び第２信号の数に基づいて、生物粒子又は標準粒子の数を計測する。その際、パルス状の第１信号及び第２信号の波高値がそれぞれ所定の閾値を超えた場合、生物粒子又は標準粒子の数がカウントされる。

つまり、計数処理部１３は、同一のタイミングでパルス状の第１信号及び第２信号が観測された場合に、生物粒子又は標準粒子が観測されたものとしてカウントし、第２信号が観測されたタイミングで第１信号が観測されない場合、非生物粒子が観測されたものとして、生物粒子又は標準粒子としてカウントしない。また、第２信号の波高値に基づいて生物粒子又は標準粒子の粒径が計測され、第１信号の波高値に基づいて生物粒子又は標準粒子の蛍光強度が計測される。したがって、生物粒子計数器１は、生物粒子又は標準粒子の数だけではなく、粒径及び蛍光強度（の分布）を観測することができる。

さらに、生物粒子計数器１は、例えば、インターフェイス１４と制御部１５とを備える。インターフェイス１４は、校正装置２などの外部の装置に有線又は無線で接続しデータ通信を行う。例えば、生物粒子計数器１からの計測結果の出力、生物粒子計数器１への各種指令の入力などがインターフェイス１４を介して行われる。

制御部１５は、生物粒子計数器１の内部装置（第１回路１１、第２回路１２、計数処理部１３、インターフェイス１４など）を制御し、計測開始、計測終了、計測結果の出力、第１回路１１及び第２回路１２の調整などの生物粒子計数器１の動作を制御する。

他方、校正装置２は、例えば、インターフェイス２１と、計測値取得部２２と、回路調整部２３と、記憶装置２４と、入力装置２５と、表示装置２６と、制御部２７とを備える。

インターフェイス２１は、生物粒子計数器１のインターフェイス１４と有線又は無線でデータ通信を行う通信装置である。生物粒子計数器１からの計測結果の取得、生物粒子計数器１への校正指令の提供などがインターフェイス２１を介して実行される。

計測値取得部２２は、例えば、生物粒子計数器１から、標準粒子についての第１信号の電圧値（例：蛍光波高値）及び第２信号の電圧値（例：散乱光波高値）を取得する。

なお、計測値取得部２２は、事前に生物粒子計数器１によって計測され、保存されている、標準粒子懸濁液についての第１信号の電圧値及び第２信号の電圧値を生物粒子計数器１から取得してもよいし、生物粒子計数器１に計測を実行させ、計測された標準粒子懸濁液についての第１信号の電圧値及び第２信号の電圧値を生物粒子計数器１から取得してもよい。

生物粒子計数器１の校正時には、前記本発明の懸濁液を、生物粒子計数器１のフローセル内に流入させ、第１信号及び第２信号の計測が行われる（信号生成ステップ）。

回路調整部２３は、記憶装置２４から基準データ３１を読み出して、基準データ３１に基づいて、計測値取得部２２により取得された標準粒子懸濁液についての第１信号の電圧値及び第２信号の電圧値がそれぞれの基準データ（基準電圧値）になるように、生物粒子計数器１の第１回路１１及び第２回路１２をそれぞれ調整する。

具体的には、回路調整部２３は、（ａ）基準データ３１を使用して、今回の校正に使用された標準粒子懸濁液（つまり、計測値取得部２２によって第１信号の電圧値が取得された標準粒子を含む液体）に含まれる標準粒子と同程度の蛍光色素含有量の粒子を用いて、予め前記信号生成ステップと同様の方法で測定しておいた第１信号の基準電圧値を特定し、（ｂ）校正時に生物粒子計数器１で測定した標準粒子懸濁液の第１信号の電圧値（校正時測定電圧値）が、基準データ３１に基づいて特定した基準電圧値になるように、第１回路１１を調整する。また、回路調整部２３は、（ｃ）基準データ３１を使用して、今回の校正に使用された標準粒子懸濁液（つまり、計測値取得部２２によって第２信号の電圧値が取得された標準粒子を含む液体）に含まれる標準粒子と同程度の蛍光色素含有量の粒子を用いて、予め前記信号生成ステップと同様の方法で測定しておいた第２信号の基準電圧値を特定し、（ｄ）校正時に生物粒子計数器１で測定した標準粒子懸濁液の第２信号の電圧値（校正時測定電圧値）が、基準データ３１に基づいて特定した基準電圧値になるように、第２回路１２を調整する。

この実施の形態では、蛍光強度の校正において、回路調整部２３は、標準粒子についての第１信号の電圧値（校正時測定電圧値）を基準電圧値に合わせるために増幅器１１ｂの増幅率の補正係数を導出し、導出した補正係数を、インターフェイス２１を介して生物粒子計数器１に出力し、生物粒子計数器１の第１回路１１を調整している。つまり、インターフェイス１４，２１を介して前記補正係数が受信され、増幅器１１ｂの増幅率がその補正係数に基づいて、生物粒子計数器１の制御部１５により設定される。具体的には、その補正係数と現在の増幅率との積に増幅率が設定される。

例えば、標準粒子懸濁液を用いて取得された第１信号の電圧値（校正時測定電圧値、例えば波高値）がＶ１であり、該懸濁液に含まれる標準粒子と同程度の蛍光色素含有量の粒子を用いて予め測定しておいた第１信号の基準電圧値がＶ１ｒである場合、補正係数Ｃ１は、Ｖ１ｒ／Ｖ１とされる。変更前の増幅器１１ｂの増幅率がＡ１である場合、変更後の増幅率は、Ｃ１×Ａ１とされる。

また、散乱光強度の校正において、回路調整部２３は、標準粒子についての第２信号の電圧値（校正時測定電圧値）を基準電圧値に合わせるために増幅器１２ｂの増幅率の補正係数を導出し、導出した補正係数を、インターフェイス２１を介して生物粒子計数器１に出力し、生物粒子計数器１の第２回路１２を調整している。つまり、インターフェイス１４，２１を介して前記補正係数が受信され、増幅器１２ｂの増幅率がその補正係数に基づいて、生物粒子計数器１の制御部１５により設定される。具体的には、その補正係数と現在の増幅率との積に増幅率が設定される。

例えば、標準粒子懸濁液を用いて取得された第２信号の電圧値（校正時測定電圧値、例えば波高値）がＶ２であり、該懸濁液に含まれる標準粒子と同程度の粒径及び蛍光色素含有量の粒子を用いて予め測定しておいた第２信号の基準電圧値がＶ２ｒである場合、補正係数Ｃ２は、Ｖ２ｒ／Ｖ２とされる。変更前の増幅器１２ｂの増幅率がＡ２である場合、変更後の増幅率は、Ｃ２×Ａ２とされる。

さらに、この実施の形態では、基準データ３１は、複数の粒径のそれぞれについて、蛍光色素含有量の値と、該蛍光色素含有量の値に対応する第１信号の基準電圧値及び第２信号の基準電圧値などの個別基準データを含んでおり、回路調整部２３は、基準データ３１から、校正に使用された標準粒子の蛍光色素含有量及び／又は粒径に対応する基準データを選択し使用する。

記憶装置２４は、例えば、フラッシュメモリなどの不揮発性の記憶装置であって、基準データ３１を記憶している。なお、通常、基準データ３１は、近似式、テーブルなどで表現されている。したがって、回路調整部２３は、近似式を計算したりテーブルを参照したりして、前述の基準電圧値を特定する。

また、入力装置２５は、校正装置２に対するユーザー操作を検出するハードキー、タッチパネルなどであり、表示装置２６は、ユーザーに対して各種情報を表示する液晶ディスプレイ、インジケータなどである。

制御部２７は、入力装置２５に対して行われたユーザー操作などに基づいて、校正装置２の内部装置（計測値取得部２２、回路調整部２３、表示装置２６など）を制御して、生物粒子計数器１の校正などを実行する部分である。

例えば、入力装置２５に、使用する標準粒子懸濁液中の標準粒子の粒径の値、蛍光色素含有量の値などが入力されると、制御部２７は、計測値取得部２２に、該懸濁液を用いて前述の第１信号及び第２信号の電圧値を取得させ、また、入力された粒径及び蛍光色素含有量の値を回路調整部２３に提供し、今回測定した電圧値と基準電圧値との関係に基づいて、回路調整部２３に、生物粒子計数器１の第１回路１１及び第２回路１２の調整を実行させる。

なお、前述の基準電圧値は、予め、所定の計測環境にて、標準粒子懸濁液を使用して正確に計測された電圧値であり、基準データ３１であり、記憶装置２４に格納される。

また、計測値取得部２２及び回路調整部２３は、コンピュータでプログラムを実行してソフトウェア的に実現してもよいし、専用回路でハードウェア的に実現してもよい。

なお、この実施の形態では、標準粒子についての前述の第１信号及び第２信号の電圧値（校正時測定電圧値及び基準電圧値、ここでは波高値）は、それぞれ、複数個の標準粒子についての電圧値の平均値とされる。生物粒子計数器１が、この平均値を計算するか、校正装置２の計測値取得部２２が、第１信号及び第２信号のそれぞれについて、複数個の標準粒子についての電圧値を取得し、取得した電圧値の平均値を計算する。

次に、前記校正装置２の動作の一例について説明する。図３は、図１に示す校正装置２の動作の一例について説明するフローチャートである。

校正装置２では、入力装置２５により所定のユーザー操作が検出されると、制御部２７は、この校正装置２に接続されている生物粒子計数器１の自動校正を開始する。まず、制御部２７は、表示装置２６を介して、ユーザーに対して、標準粒子の粒径及び蛍光色素含有量の値の入力を促す。

ユーザーが、入力装置２５に対して、今回の校正に使用する標準粒子の粒径及び蛍光色素含有量の値を入力する（ステップＳ１）と、制御部２７は、入力された粒径及び蛍光色素含有量の値を回路調整部２３に出力する。

回路調整部２３は、基準データ３１のうち、入力された粒径及び／又は蛍光色素含有量に対応する基準データを選択して読み出し（ステップＳ２）、該基準データに基づいて、第１信号の基準電圧値Ｖ１ｒと第２信号の基準電圧値Ｖ２ｒとを特定する。

また、制御部２７は、インターフェイス２１を介して、モード切り替え指示を生物粒子計数器１に出力し、生物粒子計数器１の動作モードを校正モードに切り替える。校正モードでは、第１回路１１の増幅器１１ｂ及び第２回路１２の増幅器１２ｂの増幅率が変更可能となる。その後、計測値取得部２２は、ユーザーが入力した粒径及び蛍光色素含有量と同様の標準粒子を用いて、生物粒子計数器１で第１信号及び第２信号を測定し、該第１信号の電圧値Ｖ１及び第２信号の電圧値Ｖ２（校正時測定電圧値、ここでは波高値）を生物粒子計数器１から取得する（ステップＳ３）。なお、その校正時測定電圧値についての計測は、ステップＳ２の前に行われてもよいし、動作モードが校正モードに切り替えられた後に実行されてもよい。

計測値取得部２２によって、前述の第１信号の電圧値Ｖ１及び第２信号の電圧値Ｖ２が取得されると、回路調整部２３は、その第１信号の電圧値Ｖ１及び第２信号の電圧値Ｖ２に基づいて、補正係数Ｃ１，Ｃ２を計算する（ステップＳ４）。

そして、回路調整部２３は、インターフェイス１４，２１を介して、その補正係数Ｃ１，Ｃ２を生物粒子計数器１の制御部１５に提供し、制御部１５に、その補正係数Ｃ１，Ｃ２に基づいて増幅器１１ｂ，１２ｂの増幅率を変更させる（ステップＳ５）。

生物粒子計数器１の制御部１５は、増幅率の変更後、自動的に、動作モードを校正モードから計測モードに戻す。

以上のように、前記実施の形態によれば、計測値取得部２２は、生物粒子に光を照射することで生じる蛍光に応じて第１信号（電圧）を生成する第１回路１１、及び生物粒子に光を照射することで生じる散乱光に応じて第２信号（電圧）を生成する第２回路１２を有し、第１信号及び／又は第２信号に基づき生物粒子を計数する生物粒子計数器１から、標準粒子懸濁液に光を照射することで生じる蛍光に応じて生成する第１信号の電圧値Ｖ１（校正時測定電圧値）及び第２信号の電圧値Ｖ２（校正時測定電圧値）を取得する。回路調整部２３は、前記校正時測定電圧値を測定する際に用いた標準粒子と同様の粒径及び蛍光色素含有量の粒子を用いて、予め測定しておいた基準信号値（前記第１信号に対応する基準電圧値Ｖ１ｒ及び前記第２信号に対応する基準電圧値Ｖ２ｒ）を、基準データ３１から特定し、前記電圧値Ｖ１が、基準電圧値Ｖ１ｒになるように第１回路１１を調整し、また、電圧値Ｖ２が、基準電圧値Ｖ２ｒになるように第２回路１２を調整する。

これにより、自動的に蛍光及び散乱光の検出回路である第１回路１１及び第２回路１２が正確に校正される。つまり、生物粒子計数器１の蛍光及び散乱光の感度を基準値に合わせることができるため、生物粒子計数器の蛍光及び散乱光の感度のバラツキが低減される。特に、標準粒子として、湿潤法で粒子内部に蛍光色素を取りこませた粒子を用いる場合、蛍光特性のバラツキが少なく、蛍光色素含有量の値と蛍光の検出信号である第１信号の基準電圧値との対応関係を予め正確に特定しておくことができる。そのため、その対応関係を基準データ３１として用意しておくことで、計数対象となる生物粒子が変化し、計数対象となる生物粒子に対応して生物粒子計数器１を改めて校正する際に、変更後の計数対象となる生物粒子に対応した標準粒子の蛍光色素含有量の値を入力することで、計数対象となる生物粒子に合わせて生物粒子計数器を正確に校正することができる。
また、１回の計測及び校正によって、蛍光の検出回路である第１回路１１及び散乱光の検出回路である第２回路１２の両方が並行して校正できるので、校正に要する時間や手間が少なくて済む。

なお、前述の実施の形態は、本発明の好適な例であるが、本発明は、これらに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、種々の変形、変更が可能である。

例えば、前記実施の形態において、校正装置２は、前述の校正の後に、所定数の校正用粒子を含む所定個数濃度液体内の校正用粒子か、所定数の校正用粒子と所定数の標準粒子であるポリスチレン粒子とを含む所定個数濃度液体内の校正用粒子とポリスチレン粒子とを生物粒子計数器１に計数させ、その計数結果に基づいて生物粒子計数器１の計数効率を特定し評価するようにしてもよい。

また、前記の実施の形態では、補正係数Ｃ１，Ｃ２に基づいて、増幅器１１ｂ，１２ｂの増幅率を調整しているが、その代わりに、補正係数Ｃ１，Ｃ２に基づいて、受光部１１ａ，１２ａの感度を調整したり、Ａ／Ｄ変換器１１ｃ，１２ｃの出力を調整するようにしてもよい。

以下、本発明を具体例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されない。

［実施例１］
容器に、ポリスチレン粒子（スチレン由来の構成単位が９９質量％であり、マレイン酸由来の構成単位が１質量％である共重合体、粒子の重量平均分子量：３３万（分子量の測定は、東ソー株式会社製ＨＬＣ−８２２０ＧＰＣ型装置、東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌカラム（Ｇ２０００Ｈｘｌ，Ｇ３０００Ｈｘｌ，Ｇ４０００Ｈｘｌ）、溶媒ＴＨＦ、流量１．０ｍＬ／ｍｉｎの条件にて行った。）、体積平均粒子径：０．６７３μｍ、粒子径変動係数（ＣＶ）：１８．７％（体積平均粒子径および粒子径変動係数（ＣＶ）の測定は、Ｂｅｃｋｍａｎ社製、レーザー回折散乱光粒度分布測定装置、ＬＳ１３３２０型にて行った。））１０質量％スラリー（分散媒：水）を１ｍＬ、水を２ｍＬ、界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７、ＢＡＳＦ社製）２質量％水溶液を１ｍＬ添加し、ポリスチレン粒子分散液を得た。

次に、ＴＰＰ（テトラフェニルポルフィリン、東京化成工業株式会社製）のＴＨＦ（テトラヒドロフラン、和光純薬工業株式会社製）色素溶液（ＴＰＰ濃度：０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を調製した。

前記で得られたポリスチレン粒子分散液４ｍＬに対して、色素溶液２ｍＬを速やかに加え、２５℃で２０分間撹拌した。ポリスチレン粒子１ｇに対する色素の仕込み量は１０μｍｏｌ／ｇに相当する。この色素吸収時（２５℃で２０分間撹拌時）のＴＨＦ濃度は３３体積％であった。色素吸収終了後（２５℃で２０分間撹拌後）、得られた蛍光粒子を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ７、ＭＷＣＯ ５０ｋＤ）を用いて回収し、得られた蛍光粒子溶液の３００倍量の水を外液として６時間（３時間×２回）透析を行い、ＴＨＦの除去を行った。その後、遠心洗浄を繰り返し、界面活性剤の除去を行った。以上の浸潤法により蛍光粒子を得た。

得られた蛍光粒子の、蛍光粒子１ｇあたりの色素含有量は、１０．２μｍｏｌ／ｇであった。蛍光粒子中の色素含有量は、蛍光粒子の乾燥重量０．５〜１．０ｍｇを、Ｎ−メチルピロリドン１．０ｍＬにて溶解し、得られた溶解液の４２０ｎｍの吸光度を測定し、別途測定したＴＰＰの濃度検量線から溶解液中の色素の濃度を算出することで測定した。

［実施例２〜６］
ＴＰＰ色素溶液の色素溶液濃度を表１に記載の通りに変更した以外は、実施例１と同様にして蛍光粒子を作製した。結果を表１に示す。

［実施例７］
容器に、実施例１で用いたスラリーと同じポリスチレン粒子１０質量％スラリー（分散媒：水）を１ｍＬ、水を３．４ｍＬ、界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７、ＢＡＳＦ社製）２質量％水溶液を１ｍＬ添加し、ポリスチレン粒子分散液を得た。そこに、実施例１と同様にして作成したＴＰＰ色素溶液（ＴＰＰ濃度：１．６７ｍｍｏｌ／Ｌ）０．６ｍＬを速やかに加え、２５℃で２０分間撹拌した。ポリスチレン粒子１ｇに対する色素の仕込み量は１０μｍｏｌ／ｇに相当する。この色素吸収時（２５℃で２０分間撹拌時）のＴＨＦ濃度は１０体積％であった。以降、実施例１と同様にして蛍光粒子を作製した。得られた蛍光粒子の、蛍光粒子１ｇあたりの色素含有量は、２．２μｍｏｌ／ｇであった。

［実施例８］
容器に、実施例１で用いたスラリーと同じポリスチレン粒子１０質量％スラリー（分散媒：水）を１ｍＬ、水を２．８ｍＬ、界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７、ＢＡＳＦ社製）２質量％水溶液を１ｍＬ添加し、ポリスチレン粒子分散液を得た。そこに、実施例１と同様にして作成したＴＰＰ色素溶液（ＴＰＰ濃度：０．８３ｍｍｏｌ／Ｌ）１．２ｍＬを速やかに加え、２５℃で２０分間撹拌した。ポリスチレン粒子１ｇに対する色素の仕込み量は１０μｍｏｌ／ｇに相当する。この色素吸収時（２５℃で２０分間撹拌時）のＴＨＦ濃度は２０体積％であった。以降、実施例１と同様にして蛍光粒子を作製した。得られた蛍光粒子の、蛍光粒子１ｇあたりの色素含有量は、８．４μｍｏｌ／ｇであった。

［実施例９］
容器に、実施例１で用いたスラリーと同じポリスチレン粒子１０質量％スラリー（分散媒：水）を１ｍＬ、水を１．６ｍＬ、界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７、ＢＡＳＦ社製）２質量％水溶液を１ｍＬ添加し、ポリスチレン粒子分散液を得た。そこに、実施例１と同様にして作成したＴＰＰ色素溶液（ＴＰＰ濃度：０．４２ｍｍｏｌ／Ｌ）２．４ｍＬを速やかに加え、２５℃で２０分間撹拌した。ポリスチレン粒子１ｇに対する色素の仕込み量は１０μｍｏｌ／ｇに相当する。この色素吸収時（２５℃で２０分間撹拌時）のＴＨＦ濃度は４０体積％であった。以降、実施例１と同様にして蛍光粒子を作製した。得られた蛍光粒子の、蛍光粒子１ｇあたりの色素含有量は、１０．３μｍｏｌ／ｇであった。

［実施例１０］
容器に、実施例１で用いたスラリーと同じポリスチレン粒子１０質量％スラリー（分散媒：水）を１ｍＬ、水を１ｍＬ、界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７、ＢＡＳＦ社製）２質量％水溶液を１ｍＬ添加し、ポリスチレン粒子分散液を得た。そこに、実施例１と同様にして作成したＴＰＰ色素溶液（ＴＰＰ濃度：０．３３ｍｍｏｌ／Ｌ）３ｍＬを速やかに加え、２５℃で２０分間撹拌した。ポリスチレン粒子１ｇに対する色素の仕込み量は１０μｍｏｌ／ｇに相当する。この色素吸収時（２５℃で２０分間撹拌時）のＴＨＦ濃度は５０体積％であった。以降、実施例１と同様にして蛍光粒子を作製した。得られた蛍光粒子の、蛍光粒子１ｇあたりの色素含有量は、８．６μｍｏｌ／ｇであった。

［実施例１１］
容器に、実施例１で用いたスラリーと同じポリスチレン粒子１０質量％スラリー（分散媒：水）を１ｍＬ、水を０．４ｍＬ、界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７、ＢＡＳＦ社製）２質量％水溶液を１ｍＬ添加し、ポリスチレン粒子分散液を得た。そこに、実施例１と同様にして作成したＴＰＰ色素溶液（ＴＰＰ濃度：０．２８ｍｍｏｌ／Ｌ）３．６ｍＬを速やかに加え、２５℃で２０分間撹拌した。ポリスチレン粒子１ｇに対する色素の仕込み量は１０μｍｏｌ／ｇに相当する。この色素吸収時（２５℃で２０分間撹拌時）のＴＨＦ濃度は６０体積％であった。以降、実施例１と同様にして蛍光粒子を作製した。得られた蛍光粒子の、蛍光粒子１ｇあたりの色素含有量は、５．５μｍｏｌ／ｇであった。

［実施例１２］
容器に、実施例１で用いたスラリーと同じポリスチレン粒子１０質量％スラリー（分散媒：水）を１ｍＬ、界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７、ＢＡＳＦ社製）２質量％水溶液を１ｍＬ添加し、ポリスチレン粒子分散液を得た。そこに、実施例１と同様にして作成したＴＰＰ色素溶液（ＴＰＰ濃度：０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ）４ｍＬを速やかに加え、２５℃で２０分間撹拌した。ポリスチレン粒子１ｇに対する色素の仕込み量は１０μｍｏｌ／ｇに相当する。この色素吸収時（２５℃で２０分間撹拌時）のＴＨＦ濃度は６７体積％であった。以降、実施例１と同様にして蛍光粒子を作製した。得られた蛍光粒子の、蛍光粒子１ｇあたりの色素含有量は、３．０μｍｏｌ／ｇであった。

［実施例１３］
ＴＰＰ色素溶液の代わりに、クロロフィルａ（有限会社クロロフィル研究所製）のＴＨＦ（和光純薬工業株式会社製）色素溶液（クロロフィルａ濃度：０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いた以外は、実施例１と同様にして蛍光粒子を作製した。結果を表１に示した。

［実施例１４〜２０］
クロロフィルａ色素溶液の色素溶液濃度を表１に記載の通りに変更した以外は、実施例１３と同様にして蛍光粒子を作製した。結果を表１に示した。

［比較例１］
＜ポリスチレン粒子の官能基をカルボキシ基からアミノ基に変換＞
実施例１で用いたスラリーと同じポリスチレン粒子１０質量％スラリーを３ｍＬ採取し、０．５ｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）２．４ｍＬと混合した。そこに、アミン化合物（ポリアリルアミン塩酸塩、ニットーボーメディカル株式会社製）５質量％溶液０．３ｍＬ、及び、縮合剤（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、株式会社同仁化学研究所製）１０質量％溶液０．３ｍＬを添加し、５０℃で６時間撹拌した。その後、遠心洗浄を繰り返し、余剰アミン化合物の除去を行った。さらに超音波分散機にて単一分散の状態とした。以上より、表面にアミノ基を有するアミノ化粒子１０質量％スラリーを得た。

＜色素溶液の調整＞
ＴＰＰの代わりにＴＣＰＰ（テトラキス（４−カルボキシフェニル）ポルフィリン、東京化成工業株式会社製）を使用し、１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＯＨ色素溶液（ＴＣＰＰ濃度：２質量％）を調製した。

＜アミノ化粒子にＴＣＰＰを結合＞
前記アミノ化粒子１０質量％スラリーを２ｍＬ採取し、０．５ｍｏｌ／ＬＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate）緩衝液（ｐＨ６）５ｍＬと混合した。次いで、別容器に調製した縮合剤２種（１質量％１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及び１質量％Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド、和光純薬工業株式会社製）混合溶液２ｍＬを添加し、さらに、２質量％色素溶液１ｍＬを添加し、２５℃で１４〜１６時間撹拌した。その後、遠心洗浄を繰り返し、余剰色素の除去を行った。以上の化学結合法により蛍光粒子を得た。

得られた蛍光粒子の色素含有量を測定したところ、１４．５μｍｏｌ／ｇであった。蛍光粒子中の色素含有量は、色素種を変更した以外は実施例１と同様の方法にて測定した。実施例６よりも高濃度な色素溶液を使用して染色を試みたが、化学結合法で作成した蛍光粒子は、浸潤法で作製した蛍光粒子より色素含有量が少なく、さらに容器（特にガラス）への吸着が確認され、吸着による装置の測定流路を汚染することが確認された。

［比較例２］
＜ポリスチレン粒子の官能基をカルボキシ基からアミノ基に変換＞
得られる蛍光粒子の容器（特にガラス）への吸着回避を目的として、比較例１とは異なるアミン化合物の使用を検討した。
実施例１で用いたスラリーと同じポリスチレン粒子１０質量％スラリーを３ｍＬ採取し、そこに、エチレンジアミン（和光純薬工業株式会社製）６ｍｇ、及び４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（和光純薬工業株式会社製）３ｍｇを添加し、２５℃で１４〜１６時間撹拌した。その後、遠心洗浄を繰り返し、余剰アミン化合物の除去を行った。さらに超音波分散機にて単一分散の状態とした。以上より、表面にアミノ基を有するアミノ化粒子１０質量％スラリーを得た。

得られたアミノ化粒子１０質量％スラリーを用いた以外は比較例１と同様にして、蛍光粒子を作製した。実施例６よりも高濃度な色素溶液を使用して染色を試みたが、得られた蛍光粒子の色素含有量を測定したところ、色素含有量はわずか５．１μｍｏｌ／ｇであった。

［比較例３］
色素溶液の使用量を４ｍＬに変更した以外は、比較例２と同様にして蛍光粒子を作製した。
実施例６よりも約６倍高濃度な色素溶液を使用して染色を試みたが、得られた蛍光粒子の色素含有量を測定したところ、わずか３．１μｍｏｌ／ｇであった。
化学結合法では、色素含有量、蛍光強度ともに浸潤法で作製した蛍光粒子を超える粒子は作製できなかった。

［参考例］
参考例として、前記ポリスチレン粒子（母粒子）の蛍光強度を測定した。

図２（Ａ）は、体積平均粒子径：０．６７３μｍの標準粒子の蛍光色素含有量の値と、該蛍光色素含有量の値に対応する第１信号の基準電圧値（ここでは、蛍光強度となる第１信号の波高値）との関係の一例を示す図（図１の基準データ３１）である。図２（Ａ）に示すように、第１信号の基準電圧値は、蛍光色素含有量の値に対して単調増加している。第１信号の校正では、第１信号の基準電圧値Ｖ１ｒが、使用する校正用粒子の蛍光強度に対応するので、蛍光剤パラメータの値に基づいて、第１信号の基準電圧値Ｖ１ｒを一意に特定することができる。

また、図２（Ｂ）は、粒径０．７μｍの標準粒子の蛍光色素含有量の値と、該蛍光色素含有量の値に対応する第２信号の基準電圧値（ここでは、散乱光強度となる第２信号の波高値）との関係の一例を示す図（図１の基準データ３１）である。図２（Ｂ）に示すように、第２信号の基準電圧値は、蛍光色素含有量の値に対して単調減少している。このように、実施例１、３、４では、何れも同じポリスチレン粒子を用いているにもかかわらず、蛍光色素の含有量により散乱光強度が変化している。第２信号の校正では、第２信号の基準電圧値Ｖ２ｒが、使用する校正用粒子の散乱光強度に対応するので、蛍光剤パラメータの値に基づいて、第２信号の基準電圧値Ｖ２ｒを一意に特定することができる。

本発明は、例えば、生物粒子計数器の校正に適用可能である。

１： 生物粒子計数器
２： 校正装置
１１： 第１回路
１２： 第２回路
１３： 計数処理部
１４： インターフェイス
１５： 制御部
２１： インターフェイス
２２： 計測値取得部
２３： 回路調整部
２４： 記憶装置
２５： 入力装置
２６： 表示装置
２７： 制御部
３１： 基準データ

Claims (7)

1. 樹脂製粒子を、生物粒子と同程度の吸収波長及び生物粒子が発する自家蛍光と同程度の蛍光波長を有する蛍光色素を含む有機溶媒中で膨潤させ、少なくとも該蛍光色素を樹脂製粒子中に取り込むことで標準粒子を形成する工程を含むことを特徴とする、
   生物粒子計数器校正用の標準粒子懸濁液の製造方法。
2. 前記樹脂製粒子が、該粒子の質量１００質量％に対し、スチレンに由来する構成単位を８０質量％以上含む、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記標準粒子１ｇあたりの蛍光色素の含有量が２．０μｍｏｌ／ｇ以上である、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 前記標準粒子の体積平均粒子径が０．１〜２μｍである、請求項１〜３のいずれか１つに記載の製造方法。
5. 前記蛍光色素としてテトラピロール環を有する化合物を含む、請求項１〜４のいずれか１つに記載の製造方法。
6. 前記標準粒子が、生物粒子と同程度の粒径、およびそれに対応した散乱光強度を有する、請求項１〜５のいずれか１つに記載の製造方法。
7. 生物粒子に光を照射することで生じる蛍光に応じて信号（電圧）を生成する回路、及び、前記信号（電圧）に基づき前記生物粒子の数を計数可能な部位を有する生物粒子計数器を用い、請求項１〜６のいずれか１つに記載の製造方法で得られる標準粒子懸濁液に光を照射することで生じる蛍光に応じて信号（電圧）を生成する信号生成ステップと、
   前記信号生成ステップで用いた標準粒子懸濁液に含まれる標準粒子と同程度の蛍光色素含有量の粒子を用いて予め前記信号生成ステップと同様の方法で測定しておいた基準信号値を特定し、前記信号生成ステップで生成した信号値が該基準信号値になるように、前記回路を調整する調整ステップとを含む、
   生物粒子計数器の校正方法。
   
   

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