JP3845053B2

JP3845053B2 - フローサイトメータ用標準粒子懸濁液

Info

Publication number: JP3845053B2
Application number: JP2002313388A
Authority: JP
Inventors: 雅之結城; 喜郎池内; 淳也井上
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2002-10-28
Filing date: 2002-10-28
Publication date: 2006-11-15
Anticipated expiration: 2022-10-28
Also published as: JP2004150832A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フローサイトメトリを利用した細菌検査装置の精度管理あるいはキャリブレーションに利用する粒子懸濁液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
尿中の細菌をフローサイトメトリにより検出する方法はすでに知られている。尿試料中の細菌を蛍光色素により染色し、フローサイトメータのフローセルに流して、フローセル中を流れる細菌に励起光を照射し、細菌より発せられる散乱光および／または蛍光を検出する。検出された散乱光信号および／または蛍光信号は、解析用アルゴリズムによって、測定試料中に共存する他の成分から弁別され計数される。
【０００３】
ところで、解析用アルゴリズムを用いて、細菌を正確に弁別計数するためには、フローサイトメータを測定に適した状態に恒常的に維持しておく必要がある。具体的には、光学系においては、散乱光や蛍光を受光する受光部の感度、光軸など、さらに測定用試料の調製も自動化されているものでは、試料や試薬の定量、反応温度や反応時間など、染色システムが適正に維持されていなければならない。したがって、測定に先立って、フローサイトメータが測定に適正な状態であるかをチェックし（精度管理）、必要であれば、装置を適切な状態にキャリブレーションしなければならない。
【０００４】
フローサイトメータのキャリブレーションを行うために、微小球または微小ビーズなどの人工粒子を用いる方法が知られている（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３参照）。
【０００５】
【特許文献１】
米国特許第4,704,891号明細書
【特許文献２】
米国特許第5,073,497号明細書
【特許文献３】
特開平9-196916号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
フローサイトメータの染色システムを管理するためには、精度管理やキャリブレーションに用いる粒子は、測定対象とする細菌と同程度の散乱光強度を有し、測定に使用する染色液で染色したときに細菌と同程度の蛍光強度を有することが好ましい。またキャリブレーションを行うには、フローサイトメーターから得られる各信号の分布が均一になっている事がより望ましい。
【０００７】
ところで、尿中の細菌を染色する際には、特開2001-258590号公報のように共存する夾雑物の影響を回避するために低いpHで染色する方が好ましい。しかし、低いpHにおいて細菌と同程度に染色され、かつ、細菌と同程度の散乱光強度を有する人工粒子は見出せていない。
【０００８】
本発明は、染色条件が低いpHにおいても精度管理やキャリブレーションが可能な標準粒子懸濁液を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明のフローサイトメータ用標準粒子懸濁液は、細菌と同程度の散乱光強度を有するポリスチレン系重合体粒子と、染色後に細菌と同程度の蛍光強度を有するポリ酢酸ビニル粒子とを含むことを特徴とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のポリスチレン系重合体粒子は、細菌と同程度の散乱光強度を有するもので、ポリスチレン粒子、ポリスチレン共重合体粒子等が使用できる。平均粒径は、0.5〜2.0μｍのものが好適に選択される。粒子の大きさは装置が設定する感度に合わせて、適宜選択され得る。また、装置のキャリブレーションを行うためには、粒子の粒径が均一で分布が単峰であり、粒子濃度は10個／μｌ以上あることが好ましい。
【００１１】
また本発明のポリ酢酸ビニル粒子は、染色後、細菌に近い蛍光強度を示すもので、平均粒径は５〜８μｍのものが好適に選択される。粒子の大きさは装置が設定する感度に合わせて、適宜選択され得る。また、上記のポリスチレン系重合体粒子同様、粒径分布は均一であり、粒子濃度は10個／μｌ以上あることが好ましい。なお、細菌の染色に用いられる蛍光色素は、分子中に陽電荷を有し、pH2.5〜4.5で使用でき、好適には、特開2001-258590号公報に記載されているものが使用できる。この陽電荷とポリ酢酸ビニル粒子表面の負電荷官能基とが反応して、蛍光を帯びるようになる。
【００１２】
本発明のフローサイトメータ用標準粒子懸濁液には、計数値を正確に出すための工夫として、粒子凝集を防止する事が望ましい。このため懸濁液には粒子凝集防止剤を添加することが好ましい。粒子凝集防止剤としては、ポリビニルアルコール、界面活性剤が挙げられ、ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤が好ましい。使用濃度範囲は、0.05〜0.5％（w/v）が好適である。
【００１３】
なお、赤色レーザーを光源とするフローサイトメータで、尿中の細菌を測定する場合には、尿試料の屈折率が高いので、フローセルに流すシース液の屈折率も尿試料に合わせて高くすることが好ましい。こうすることによって、散乱光信号の揺らぎが抑えられ、正確な測定が可能になる。したがって、このような装置では、精度管理やキャリブレーションに用いる粒子懸濁液もシース液に合わせて屈折率を調整することが好ましい。
【００１４】
屈折率を調整するには、水溶液中で溶解し且つ非電解質の有機物が好ましい。例えば、糖類、尿素、グリコール類など挙げられるが、中でもグリコール類が粒子懸濁液の屈折率調節剤として好適である。特にエチレングリコールが好ましい。使用濃度範囲は、測定するサンプルの希釈倍率や測定温度によって、適宜最適な濃度に調整しても良いが、好ましくは、６〜１２％（w/v）が良い。エチレングリコールは粒子凝集防止剤を長期間安定させる増粘剤として効果がある点で優れている。
【００１５】
本発明のフローサイトメータ用粒子懸濁液を用いて、フローサイトメータの精度管理あるいはキャリブレーションを行うには、複数の計数値及び感度パラメータの値を確認する必要がある。装置が安定した状態である事を証明するには、これら粒子懸濁液の計数値及び感度パラメーターを継続して管理し、ある一定の範囲にある事を確認する必要がある。
【００１６】
ところで、細菌を測定するフローサイトメータは、臨床サンプル中の細菌数だけでなく、白血球数を計数することで、感染の状態をより詳細に把握できる。細菌の大きさは、菌種やサンプルの状態によっても様々に変化するが、一般的に０．５μｍから２，３μｍと小さく、白血球は７〜８μｍと大きい。したがって、細菌と白血球を同時に計数する場合において、細菌を検出するには、前方散乱光の感度を白血球測定時よりも15〜20倍程度高くするのが好ましい。
【００１７】
細菌を捉える二次元分布図（スキャッタグラム）で使用するパラメータは、図１及び図２に示すように▲１▼高感度の前方散乱光強度、高感度の前方散乱光強度幅及び、▲３▼蛍光強度が好ましい。白血球を捉えるスキャッタグラムで使用するパラメーターは、図３及び図４に示すように▲１▼低感度の前方散乱光強度、▲２▼低感度の前方散乱光強度幅及び▲３▼蛍光強度が好ましい。このように複数のパラメータが存在するため、これらの感度に変化がないか、又は変化があった場合に、装置の状態を一定にするために調整する必要が生じる。
【００１８】
【実施例】
（粒子懸濁液）
平均粒径1μｍポリスチレン粒子 500個／μl
平均粒径約6μｍポリ酢酸ビニル粒子 500個／μl
グリシン 50mM
HCl 1.2mM
エチレングリコール 10.6w/v%
レオドールTW-O120 0.1w/v%
（ポリエチレングリコール(20)ソルビタンエステル）
溶媒（精製水）
（希釈液）
クエン酸 92.3mM
NaOH 0.75g/l
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド 0.1w/v%
Na₂SO₄ 90mM
スルファミン酸ナトリウム 100mM
溶媒（精製水）
（染色液）
以下の蛍光色素Ａ 40ppm（エチレングリコール溶液）
【化１】

【００１９】
上記粒子懸濁液、大腸菌含有試料、白血球含有試料各50μlに、上記の希釈液340μl及び染色液を色素Ａの最終濃度が1ppmになるようにそれぞれ添加し、40℃、20秒間反応させ、赤色半導体レーザーを光源とするフローサイトメータで散乱光及び蛍光の測定を行った（分析容量6.0μl）。細菌を検出するために、前方散乱光感度を白血球測定時より17倍高くして測定を行った。
【００２０】
測定の結果得られた各パラメータのスキャッタグラム及び粒度分布を図１から図６に示す。
【００２１】
大腸菌は、高感度前方散乱光強度が約15〜70chの範囲、蛍光強度が約50〜200chの範囲、高感度前方散乱光強度幅は、約25〜80chの範囲で分布していた（図１及び図２参照）。これらの範囲が含まれるように蛍光強度−高感度前方散乱光強度スキャッタグラム及び高感度前方散乱光強度幅−高感度前方散乱光強度スキャッタグラム上でウインドウをそれぞれ作成し、次に両方のウインドウ内に入るという条件を満たす粒子数を計数し、細菌数とする。
【００２２】
また、白血球は、低感度前方散乱光強度が約50〜120chの範囲、蛍光強度がほぼ255chで飽和状態、低感度前方散乱光強度幅は、約50〜80chの範囲で分布していた（図３及び図４参照）。これらの範囲が含まれるように蛍光強度−低感度前方散乱光強度スキャッタグラム及び低感度前方散乱光強度幅−低感度前方散乱光強度スキャッタグラム上でウインドウを作成し、次に両方のウインドウ内に入るという条件を満たす粒子数を計数し、白血球数とする。
【００２３】
一方、このとき、1μｍポリスチレン粒子は、高感度前方散乱光強度が約85〜95chの範囲で分布し、ピーク値は89chであり、また、高感度前方散乱光強度幅は約60〜64chの範囲で分布し、ピーク値は62chであった（図５参照）。また、粒度分布は単峰を示した。
【００２４】
また、約6μｍポリ酢酸ビニル粒子は、低感度前方散乱光強度が約195〜210chの範囲で分布し、ピーク値は202chであり、低感度前方散乱光強度幅は約85〜95chの範囲で分布し、ピーク値は91chであった。蛍光強度は45〜75chの範囲で分布し、ピーク値は60chであった（図６参照）。粒度分布は単峰を示した。
【００２５】
精度管理やキャリブレーションは、あらかじめ上記の各ピーク値に対して、ある一定の許容幅を設定しておき、その設定値範囲内であるかどうかを確認することによって実施することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、１回の測定で、各計数値と測定パラメーター値を一度に得る事ができ、装置の状態をより簡便に把握できる。また、たとえ装置の状態が悪いことが判明しても、本発明の粒子懸濁液を測定することによって、予め期待される値に感度を合わせることが容易である。
【図面の簡単な説明】
【図１】細菌を含む試料を測定したときの蛍光強度−高感度前方散乱光強度を示すスキャッタグラムである。
【図２】細菌を含む試料を測定したときの高感度前方散乱光強度幅−高感度前方散乱光強度を示すスキャッタグラムである。
【図３】白血球を含む試料を測定したときの蛍光強度−低感度前方散乱光強度を示すスキャッタグラムである。
【図４】白血球を含む試料を測定したときの低感度前方散乱光強度幅−低感度前方散乱光強度を示すスキャッタグラムである。
【図５】本発明の粒子懸濁液を測定したときの高感度前方散乱光強度幅−高感度前方散乱光強度を示すスキャッタグラム、高感度前方散乱光強度ヒストグラム及び高感度前方散乱光強度幅ヒストグラムである。
【図６】本発明の粒子懸濁液を測定したときの蛍光強度−低感度前方散乱光強度スキャッタグラム、低感度前方散乱光強度幅−低感度前方散乱光強度スキャッタグラム、蛍光強度ヒストグラム、低感度前方散乱光強度ヒストグラム及び低感度前方散乱光強度幅ヒストグラムである。

Claims

細菌と同程度の散乱光強度を有するポリスチレン系重合体粒子と、染色後に細菌と同程度の蛍光強度を有するポリ酢酸ビニル粒子とを含むことを特徴とするフローサイトメータ用標準粒子懸濁液。
さらに粒子凝集防止剤を含む請求項１記載のフローサイトメータ用標準粒子懸濁液。
粒子凝集防止剤が、少なくともノニオン系界面活性剤から１つ以上選ばれた請求項２記載のフローサイトメータ用標準粒子懸濁液。
ノニオン系界面活性剤がポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤である請求項３記載のフローサイトメータ用標準粒子懸濁液。
粒子懸濁液の屈折率調節剤を含む請求項１〜４記載のフローサイトメータ用標準粒子懸濁液。
屈折率調節剤が非電解質の有機物である請求項５記載のフローサイトメータ用標準粒子懸濁液。
非電解質の有機物がグリコール類である請求項６記載のフローサイトメータ用標準粒子懸濁液。