JP6710253B2 - Ａｐｊ受容体アゴニストおよびその使用 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１２月２０日出願の米国仮出願第６１／７４０，４０９号および２０１３年３月１３日出願の米国仮出願第６１／７７９，９８５号の利益を主張する国際ＰＣＴ出願である。これらの出願の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで本明細書に添付して提出され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１３年１２月１７日に作成された本配列表は、Ａ−１７１６−ＷＯ−ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ．ｔｘｔと題されたファイルとして提供され、サイズは１，０４５，６６６バイトである。
発明の分野
本出願は、天然アペリンと比較して増加した安定性、循環半減期、および／または効力を有するＡＰＪ受容体のアゴニストに関する。
アペリンは、ＡＰＪ（ＡＰＬＮＲ、アンジオテンシン受容体様−１）のための内因性リガンドである。ＡＰＪ受容体は、ロドプシン様Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーの一員である。アペリン／ＡＰＪ系は、心臓、腎臓、膵臓、肺、および中枢神経系などの多くの組織で観察されている。このことは、哺乳動物の生理学および病理学におけるこの系の幅広い役割を示す。
アペリンペプチドは、７７残基のプレプロ形態から、より小さい生物活性断片、主に３６残基の形態（アペリン４２〜７７、アペリン−３６とも称される）およびより小さい１３残基ポリペプチド（アペリン６５〜７７、アペリン−１３とも称される）へと処理される（Ｈｏｓｏｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２１０６１−２１０６７，２０００）。アペリンペプチドは、７回膜貫通Ｇタンパク質共役受容体スーパーファミリーの一員である、オーファンＡＰＪ受容体のための内因性リガンドであることが以前に決定された。Ｔａｔｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５１：４７１−４７６，１９９８。特定されたより短くより活性なアイソフォームの１つであるピログルタミン酸化アペリン−１３（［ＰＥ６５］アペリン−１３（６５〜７７）は、心臓組織において最も強力かつ豊富な形態のアペリンであることが報告されている。Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ５４：５９８−６０４，２００９。インビトロおよび前臨床モデルにより、アペリン／ＡＰＪ系が心血管恒常性および代謝において役割を持つことが示されている。Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ ９６：１０１１−１０１６，２０１０。循環アペリンレベルは一時的であり、アペリン−１３は５分未満の短い血漿半減期を有することから、心血管効果は短命である。
インビトロにおいて、外因性アペリンは、心房片およびラットの全心臓においてサブナノモル濃度で収縮性を増加させ、単離心筋細胞において筋節短縮を最大１４０％増加させる。Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ ９６：１０１１−１０１６，２０１０。アペリンはまた、エクスビボの単離心臓アッセイにおいて強力な変力効果を有する。インビボにおいて、急激なアペリン注入は、慢性心不全を持つラットにおいて、駆出率を回復させ、心拍出量を増加させ、左心室拡張末期圧を減少させる。Ｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１０：１８７−１９３，２００４。外因性アペリンは、心室前負荷および後負荷の減少に伴う左心室肥大を誘発することなく、心筋収縮性を強力に増進する。Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ ９６：１０１１−１０１６，２０１０。
アペリンペプチドについて報告された構造活性相関（ＳＡＲ）研究は、極めて限られている。限られたＳＡＲ研究は、インビトロの親和性および／または効力増進に集中している。ＡＰＪアゴニストの効力を改善または維持しながらのタンパク質分解増加した安定性および循環半減期の延長に集中したＳＡＲに関する報告はない。
ＫａｗａｍａｔａらおよびＨｏｓｏｙａらの研究は、より短いペプチドのアペリン−１３が、アペリン−３６よりもおよそ３．５倍高いＡＰＪ受容体へのインビトロの親和性を有したことを示した。Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＡ １５３８：１６２−１７１，２００１、Ｈｏｓｏｙａ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２７５：２１０６１−２１０６７。アペリン−１３類似体は、標準または非標準アミノ酸のいずれかによる単一置換を有することが報告された。著者らはまた、二重および三重置換がアペリン６６〜７７およびアペリン６３〜７７中にはあるが、アペリン−１３中にはないことも報告した。アプレイン−１３より高いインビトロの親和性および効力を有すると報告されるペプチドに重点が置かれた。Ｎｉｓｈｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｔ．Ｓｈｉｏｉｒｉ（ｅｄ．），Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ３７ｔｈ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，ｐｐ．１５１−１５４。これらの修飾ペプチドの全てではないがいくつかが、後の研究で報告される。米国第７，６３５，７５１号。
２００３年の研究（Ｍｅｄｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８４：１１６２−１１７２，２００３）では、アペリン−３６、アペリン−１７、およびアペリン−１３のインビトロの活性が比較された。３つ全てのペプチドはほぼ同等の効力であったと結論付けられた。Ｃ末端アミド化は、親和性の約１４倍の減少をもたらした。より最近の研究（Ｈａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２２：５４７−５５２，２００８）は、アペリン−１３の環状類似体を報告した。インビトロ活性について試験したとき、３つ全ての類似体は官能活性を維持したが、効力はアペリン−１３と比較して減少した。
ＡＰＪに対してリガンド活性を有する１２アミノ酸−アペリンペプチドが、２００９年の特許（米国第７，６３５，７５１号）において報告された。ペプチドは、１個の非標準アミノ酸の置換を有し得た。
別の研究は、注目の分子のＣ末端側終端での非標準アミノ酸によるアミノ酸置換を用いるが、ＮもしくはＣ末端または別の部位特異的位置でのＰＥＧ化はしない、アペリン−１３の類似体の合成を報告した。しかしながら、内部ＰＥＧスペーサー（短いＰＥＧ（ｎ＝４または６））の使用は、アペリン−１３よりも少ないアミノ酸残基を含有する配列の半ばにおける欠失を伴う、より低い活性のペプチド類似体においても報告された。Ｍｕｒｚａ ｅｔ ａｌ．ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ ７：３１８−３２５，２０１２。
研究は、生理学的機能に影響を与えるためにアペリン受容体を修飾する試みも報告した。国際公開第ＷＯ２０１０／０５３５４５号。本発明は、概して、ＡＰＪ受容体アロステリック調節因子である化合物に関する。アロステリック調節因子は、ＡＰＪ受容体の細胞内ループおよびドメインに由来する。
本出願は、新規のアペリン治療剤およびそれら治療薬の使用を提供する。
米国特許第７，６３５，７５１号明細書 国際公開第２０１０／０５３５４５号
Ｈｏｓｏｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２１０６１−２１０６７，２０００ Ｔａｔｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５１：４７１−４７６，１９９８ Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ５４：５９８−６０４，２００９ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ ９６：１０１１−１０１６，２０１０ Ｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１０：１８７−１９３，２００４ Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＡ １５３８：１６２−１７１，２００１ Ｎｉｓｈｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｔ．Ｓｈｉｏｉｒｉ（ｅｄ．），Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ３７ｔｈ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，ｐｐ．１５１−１５４ Ｍｅｄｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８４：１１６２−１１７２，２００３ Ｈａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２２：５４７−５５２，２００８ Ｍｕｒｚａ ｅｔ ａｌ．ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ ７：３１８−３２５，２０１２
ＡＰＪアゴニスト活性を有する治療剤を提供する。アゴニストは、有利な薬学的特徴（例えば、半減期または効力）を有し得る。そのような化合物は、合理的設計、ペプチドスクリーニング、酵母系スクリーニング、ファージディスプレイ法、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、または他のスクリーニング技法によって、ＡＰＪ受容体結合ドメインまたはそれ由来の配列を含むことができる。ドメインは、極めて少ないアンタゴニスト活性を有するか、またはアンタゴニスト活性を有しない可能性がある。化合物はまた、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）、タンパク質（例えば、ＡｂまたはＦｃドメイン）、またはビヒクルがＡＰＪアゴニストドメインに共有結合する別のペプチド配列（例えば、標的化ドメイン）などの、ビヒクルを含み得る。ビヒクルおよびＡＰＪアゴニストドメインは、ＮもしくはＣ末端、またはポリペプチドの任意の他の部位を通して連結されてもよい。ビヒクルは、ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。
ＡＰＪアゴニストドメインは、合理的設計、酵母分泌スクリーニング、合理的設計、タンパク質構造分析、ファージディスプレイ法、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、および当技術分野で既知の他の技法によって生成することができる。
種々の実施形態は、野生型アペリン−１３（配列番号２）と比較して増加した安定性を有するＡＰＪアゴニストを対象とし、本アゴニストは、少なくとも１個の非標準アミノ酸によって修飾される。ＡＰＪアゴニストはまた、Ｎ末端、Ｃ末端、またはアゴニストの他の残基で、半減期を延長する基を含んでもよい。ＡＰＪアゴニストは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはアゴニストの他の残基で、ＰＥＧ、Ｆｃドメイン、ＩｇＧ、ＨＳＡ、ＰＥ、Ａｂ、ペプチド、脂質、コレステロール、ナノ構造体、または当技術分野で既知の他の半減期を延長する部分からなる、半減期を延長する基を有することができる。アゴニストは、Ｎ末端でピログルタミン酸化され得る、および／またはＮ末端もしくはアゴニスト中の他の場所でＰＥＧ化若しくは複合体化され得る。種々の実施形態において、アゴニストは、ＡＰＪ受容体に結合することができる。他の実施形態では、ＡＰＪアゴニストは、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個超のアミノ酸長、例えば、１３個以上のアミノ酸長であり、半減期を延長する基は、分子中のどの場所にもあることができる。また他の実施形態では、ＡＰＪアゴニストは、野生型アペリン−１３と比較して増加した効力を有することができる。
種々の実施形態において、ＡＰＪアゴニストは、非標準アミノ酸によって置換された少なくとも２個のアミノ酸残基を有することができる。あるいは、少なくとも２個の非標準アミノ酸残基は、３個、４個、または５個のアミノ酸残基であり得る。
種々の実施形態において、増加した安定性を持つＡＰＪアゴニストは、増加したインビトロ半減期を有する。増加した安定性を提供する部分は、この目的を達成するいかなる基でもあり得、例えば、アミノ酸置換または化学的修飾である。他の実施形態では、増加した安定性を持つＡＰＪアゴニストは、増加したインビボ半減期を有する。増加したインビボ半減期は、増加したタンパク質分解もしくは代謝安定性、および／または半減期を延長する部分の組み込みの結果であり得る。増加したインビボ半減期を提供する部分は、この目的を達成するいかなる基でもあり得、例えば、ＡＰＪアゴニストは、チオプロピオニル（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）、Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）、ＮＰｅｇ１１、もしくはＡｔｚ（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）によってＰＥＧ化され得るか、または代替的にタンパク質と複合体化され得る。
非標準アミノ酸の例。 ＰＥＧおよびリンカーの例。 ＰＥＧおよびリンカーの例。 ＡＰＪアゴニストの例。 ＡＰＪアゴニストの例。 ＡＰＪアゴニストの例。 血漿中のＡＰＪアゴニストのインビトロ安定性。 血漿中のＡＰＪアゴニストのインビトロ安定性。 ２０ｋＤａのＰＥＧ化ペプチドのアゴニスト活性。ペプチド｛チオプロピオニル（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）｝ＬＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］｛遊離酸｝（配列番号１２２）、｛チオプロピオニル（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）｝ＫＦＲＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］｛遊離酸｝（配列番号１２３）、｛チオプロピオニル（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）｝ＬＬＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］｛遊離酸｝（配列番号１２４）、｛水素｝［Ａｔｚ（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）］ＫＦＲＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］｛遊離酸｝（配列番号１２６）、および｛水素｝［Ａｔｚ（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）］ＬＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］｛遊離酸｝（配列番号１２７）は、［ＰＥ］ＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ（ｐｙｒアペリン−１３）（配列番号１２８）と比較して、強力であり、完全なアゴニストとして作用する。 ５２５ダルトンのＰＥＧ化ペプチド（配列番号２３）とｐｙｒアペリン１３（配列番号１２８）との比較。 単離したラットのランゲンドルフ灌流心におけるアゴニスト（配列番号２４）の内在負荷非依存性変力効果を示す。 アゴニスト（配列番号２４）が、単離したランゲンドルフ灌流心において収縮機能および拡張機能を増加させることを示す。 正常ラットおよび心不全ラットにおける心筋収縮性に対するペプチド（配列番号２３）の影響。ＭＩ＝心不全ラット。 インビトロ活性に対するＰＥＧサイズの影響。 インビトロ活性に対するペプチド原子価の影響。 ビス−およびテトラキス−２０ｋＤａのＰＥＧペプチドの構造。 インビトロ活性に対するペプチド原子価の影響。 ビス−１．７および２．２ｋＤａのＰＥＧペプチドの構造。 ラットおよびヒトＧＴＰγアッセイにおけるアペリン−１３およびアペリン−１７に対するＦｃ複合体の影響。 ヒトＧＴＰγアッセイにおけるＦｃ複合体の影響。
前述の概要は、本発明の全ての態様または実施形態を定義することは意図せず、追加の態様が他の節に記載され得る。文書全体は１つの開示として関係することを意図し、本明細書に記載の特徴の全ての組み合わせは、特徴の組み合わせがこの文書の同一の文、または段落、または節中で共に見出されないとしても、企図され得ることを理解されたい。
前述のものに加えて、追加の態様として、本明細書の特定の段落によって定義される変形形態よりもいかなる形においても狭い範囲の全て実施形態は、本開示中に含まれる。例えば、ある特定の態様は属として記載され、属の全要素が個別に実施形態となり得ることを理解されたい。また、属として記載される態様または属の要素の選択は、属の２つ以上の要素の組み合わせを包含することを理解されたい。本明細書中の種々の実施形態は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という表現を使用して提示されるが、種々の状況下で、関連する実施形態もまた「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を使用して記載されてもよいことも、理解されたい。
本明細書の記載は、単に例示的および説明的であり、特許請求される発明を限定するものではないことが理解されるであろう。本明細書において、単数形の使用は、別途記載のない限り複数形を含む。本明細書において、「または（ｏｒ）」の使用は、別途記載のない限り「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。更に、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態と並んで、限定的ではない。また、「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」または「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」などの用語は、別途記載のない限り、１単位を含む要素および成分と、２以上の亜単位を含む要素および成分との両方を包含する。また、「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」という用語の使用は、部分（ｍｏｉｅｔｙ）の一部または部分（ｍｏｉｅｔｙ）全体を含み得る。
本明細書で別途定義されない限り、本明細書に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。更に、文脈によって求められない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含むものとする。故に、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈が別のことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「１つのタンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、複数のタンパク質を含み、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞の集団を含む。
値の範囲を記載する場合、記載される特徴が、範囲内で見出される個別の値であり得ることも、理解されたい。例えば、「約ｐＨ４〜約ｐＨ６のｐＨ」は、ｐＨ４、４．２、４．６、５．１、５．５など、およびそのような値の間の一切の値であり得るが、これらに限定されない。加えて、「約ｐＨ４〜約ｐＨ６のｐＨ」は、問題のｐＨが、ｐＨ４〜ｐＨ６の間で２ｐＨ単位異なるのではなく、値が、溶液のｐＨについて２ｐＨ範囲内から選ばれ得ることを意味するように解釈されるべきある。
いくつかの実施形態では、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語が使用される場合、挙げられる数字のプラスマイナス５％、１０％、１５％、またはそれ以上を意味する。意図される実際の変動は、文脈から決定される。
本明細書で使用される節の表題は、構成的目的のためのみであり、記載される主題を限定するように解釈されるべきではない。特許、特許出願、論説、書籍、および論文を含むがこれらに限定されない、本出願において引用される全ての文書または文書の部分は、一切の目的のためにそれらの全体が参照によりここに明示的に組み込まれる。本開示に従って利用される場合、以下の用語は、別途記載のない限り、以下の意味を有するように理解されるべきである。
「酸性残基」または「酸性アミノ酸」という用語は、酸性基を含む側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型にあるアミノ酸残基を意味するように理解されたい。例示的な酸性残基としては、ＤおよびＥが挙げられる。
「アミノ酸」または「残基」という用語は、アミノ基（ＮＨ２）、カルボン酸基（ＣＯＯＨ）、および、基本式ＮＨ２ＣＨＲＣＯＯＨを有し、ペプチド結合によって共に連結してタンパク質を形成する、種々の側基のうち任意のものを含有する化合物を意味することを理解されたい。アミノ酸は、例えば、酸性、塩基性、芳香族、極性であり得るか、または誘導体化され得る。非標準（ｎｏｎ−ｓｔａｎｄａｒｄ）アミノ酸は、「非標準（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」アミノ酸と称され得る。
自然発生のペプチドおよびタンパク質中に概して組み込まれる２０個の「標準」アミノ酸残基の素性を指定するために、１文字の省略形体系が頻繁に適用される（表１）。そのような１文字の省略形は、３文字の省略形または省略されていないアミノ酸名と意味において全面的に交換可能である。本明細書で使用される１文字の省略形体系内では、大文字はＬ−アミノ酸を示し、小文字はＤ−アミノ酸を示す。例えば、省略形「Ｒ」は、Ｌ−アルギニンを指定し、省略形「ｒ」はＤ−アルギニンを指定する。
Figure 0006710253
アミノ酸配列中のアミノ酸置換は、特定の位置にあるアミノ酸残基について１文字の省略形、その後に対象の天然配列に対する数字上のアミノ酸位置、その後に置換が行われるアミノ酸残基について１文字の記号によって本明細書で指定され得る。例えば、「Ｔ３０Ｄ」は、対象の天然配列に対するアミノ酸位置３０でのアスパラギン酸塩残基によるトレオニン残基の置換を表す。
アミノ酸残基は、異なる化学的および／または物理的特徴に従って一般に分類される。「酸性アミノ酸残基」という用語は、酸性基を含む側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型にあるアミノ酸残基を指す。例示的な酸性残基としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基が挙げられる。「アルキルアミノ酸残基」という用語は、線状、分岐、または環状であってもよいＣ１−６アルキル側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型にあるアミノ酸残基を、プロリン中にあるようなアミノ酸アミンを含んで指し、ここでＣ１−６アルキルは、Ｃ１−４ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、−ＮＲａＣ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、−ＯＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−ＯＣ２−６アルキルＮＲａＲａ、−ＯＣ２−６アルキルＯＲａ、−ＳＲａ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ、−ＮＲａＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｂ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ、−ＮＲａＣ２−６アルキルＮＲａＲａ、および−ＮＲａＣ２−６アルキルＯＲａから選択される、０個、１個、２個、または３個の置換基によって置換され、Ｒａは独立して、各出現で、ＨまたはＲｂであり、Ｒｂは独立して、各出現で、ハロ、Ｃ１−４アルク、Ｃ１−３ハロアルク、−ＯＣ１−４アルク、−ＮＨ２、−ＮＨＣ１−４アルク、および−Ｎ（Ｃ１−４アルク）Ｃ１−４アルクから選択される、０、１、２、または３個の置換基によって置換されるＣ１−６アルキルであるか、または、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン、グルタミン、システイン、メチオニン、ヒドロキシプロリン、シクロへキシルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、２−アミノ酪酸を含むが、その残基がアリールまたは芳香族基を含有しない、任意のそのプロトン化形態である。「芳香族アミノ酸残基」という用語は、芳香族基を含む側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型にあるアミノ酸残基を指す。例示的な芳香族残基としては、トリプトファン、チロシン、３−（１−ナフチル）アラニン、ヒスチジン、またはフェニルアラニン残基が挙げられる。「塩基性アミノ酸残基」という用語は、塩基性基を含む側鎖を有する、Ｄ−形態またはＬ型にあるアミノ酸残基を指す。例示的な塩基性アミノ酸残基としては、ヒスチジン、リジン、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、およびホモアルギニン（ｈＲ）残基が挙げられる。「親水性アミノ酸残基」という用語は、極性基を含む側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型にあるアミノ酸残基を指す。例示的な親水性残基としては、システイン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、グルタミン、およびシトルリン（Ｃｉｔ）残基が挙げられる。「親油性アミノ酸残基」という用語は、非荷電性基、脂肪族基、または芳香族基を含む側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型にあるアミノ酸残基を指す。例示的な親油性側鎖としては、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。アラニン（Ａ）は、親水性または親油性（すなわち、疎水性）残基として作用可能な両親媒性である。したがってアラニンは、「親油性」（すなわち、「疎水性」）残基と「親水性」残基との両方の定義内に含まれる。「非官能性」または「中性」アミノ酸残基という用語は、酸性基、塩基性基、または芳香族基を欠く側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型にあるアミノ酸残基を指す。例示的な中性アミノ酸残基としては、メチオニン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、およびノルロイシンが挙げられる。
ポリペプチドはアミノ酸置換を有してもよい。所望のアミノ酸置換（保存的か非保存的か）は、当業者によって決定され得る。アミノ酸置換を使用して、ポリペプチド配列の重要な残基を特定するか、または本明細書に記載のペプチドもしくはビヒクルペプチド分子の親和性（前出の式を参照）を増加もしくは減少させることができる。
ある特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、生体系における合成ではなく化学的ペプチド合成によって典型的に組み込まれる、非自然発生アミノ酸残基を包含することができる。
保存的修飾は、そこからそのような修飾が行われる複合体化された（例えば、ＰＥＧ複合体化された）ペプチドのものに類似した、機能的、物理的、および化学的特徴を有する半減期を引き延ばす部分複合体化ペプチドをもたらすことができる。対照的に、ペプチドの機能的および／または化学的特徴の大幅な修飾は、（ａ）例えばα−らせん構造としての置換領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）分子サイズを維持することに対するそれらの影響が著しく異なる、アミノ酸配列中の置換を選択することによって達成され得る。
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、非天然残基による天然アミノ酸残基の置換を伴い、その位置でのアミノ酸残基の極性もしくは荷電に対して影響が少ないか、または影響がないようにしてもよい。更に、ペプチド中の一切の天然残基はまた、「アラニン系統的変異導入法」についてこれまでに説明されているように（例えば、アラニン系統的変異導入法について考察する、ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．，６４３：５５−６７（１９９８）、Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４（１９９８）を参照）、アラニンによって置換されてもよい。
所望のアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、そのような置換が所望されるときに、当業者によって決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用して、ペプチド配列の重要な残基を特定するか、あるいは本明細書に記載の、ペプチド、またはビヒクルと複合体化されたペプチド分子の親和性を増加もしくは減少させることができる。
自然発生残基は、一般的な側鎖特性に基づいてクラスに分けることができる。
１）疎水性：ノルロイシン（ＮｏｒまたはＮｌｅ）、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つの成員を同一クラスの別の成員と交換することを伴い得る。保存的アミノ酸置換は、生体系における合成ではなく化学的ペプチド合成によって典型的に組み込まれる、非自然発生アミノ酸残基を包含してもよい。これらは、アミノ酸部分のペプチド模倣体および他の逆転形態または反転形態を含む。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つの成員を別のクラスの成員と交換することを伴い得る。
そのような変更を行う際、ある特定の実施形態に従うと、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および荷電特徴に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／システイン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸塩（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸塩（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。
生物学的相互機能をタンパク質に付与することにおける疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当技術分野で理解されている（例えば、Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１を参照されたい）。ある特定のアミノ酸は、類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸に置換され、それでも類似の生物学的活性を保持し得ることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変更を行う際、ある特定の実施形態では、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。ある特定の実施形態では、±１以内であるものが含まれ、ある特定の実施形態では、±０．５以内のものが含まれる。
同類のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行なうことができる。ある特定の実施形態では、その隣接アミノ酸の親水性に支配されるタンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性と、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関する。
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸塩（＋３．０±１）、グルタミン酸塩（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変更を行う際、ある特定の実施形態では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある特定の実施形態では、±１以内であるものが含まれ、ある特定の実施形態では、±０．５以内のものが含まれる。
保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、ノルロイシン、アラニン、もしくはメチオニンなどの１個の非極性（疎水性）アミノ酸残基の別のものへの置換、アルギニン−リジン間、グルタミン酸塩−アスパラギン酸塩間、グリシン−セリン間などの、１個の極性（親水性）アミノ酸残基の別のものへの置換、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの１個の塩基性アミノ酸残基の別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１個の酸性残基の別のものへの置換が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」という表現はまた、非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化された残基を、そのようなポリペプチドが必須の生物活性を示すことを条件に、使用することも含む。有用であり得る他の例示的なアミノ酸置換を以下の表２に記述する。
Figure 0006710253
「アゴニスト」という用語は、プロセスに正の影響を及ぼす、例えば、プロセスを活性化または刺激することができるものを指し、プロセスとしては、化学的、生化学的、細胞的、または生理学的プロセスが挙げられるが、これらに限定されないことを理解されたい。「ＡＰＪアゴニスト」は、ＡＰＪ受容体を活性化することができる分子を指すと理解されたい。ＡＰＪアゴニストは、ＡＰＪ受容体に結合し得る。アゴニストの例は、以下のいくつかの表中、ならびにいくつかの図、例えば、図３および４中で提供する。それは、自然発生アペリンに少なくとも相当する生物学的活性を有するポリペプチドを指し得る。本用語は、自然発生分子の影響を増強するペプチドを更に含む。
一実施形態では、ＡＰＪアゴニスト配列は、以下の式を有する。
Ｎｘ１ｘ２ｘ３ｘ４ｘ５ｘ６ｘ７ｘ８ｘ９ｘ１０ｘ１１ｘ１２ｘ１３ｘ１４ｘ１５ｘ１６ｘ１７（配列番号６１）であって、
配列中、
Ｎは、拡大または結合リンカーであり、
ｘ１は、不在であるか、アミノ酸残基（例えば、塩基性または極性）であるか、または結合リンカーであり、
ｘ２は、不在であるか、アミノ酸残基（例えば、非官能性または疎水性）であるか、または結合リンカーであり、
ｘ３は、不在であるか、アミノ酸残基（例えば、塩基性または極性）であるか、または結合リンカーであり、
ｘ４は、不在であるか、アミノ酸残基（例えば、塩基性または極性）であるか、または結合リンカーであり、
ｘ５は、不在であるか、または非官能性、疎水性、もしくは極性残基（例えば、ｐＥ、Ｑ、Ｃｉｔ、Ｌ、Ｖ、Ｇ、Ｈ、またはＰ）であるか、または結合リンカーであり、
ｘ６は、不在であるか、または極性もしくは塩基性残基（例えば、ＫもしくはＣｉｔ、Ｒ、ＮＭｅＡｒｇ、またはｈＡｒｇ）であり、
ｘ７は、非官能性または疎水性残基（例えば、Ｐ、Ｏｉｃ、またはＧ）であり、
ｘ８は、塩基性または極性残基（例えば、ＱもしくはＣｉｔ、Ｒ、ＮＭｅＡｒｇ、またはｈＡｒｇ）であり、
ｘ９は、非官能性または疎水性残基（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｌが好ましい、ＮＭｅＬｅｕもしくはＣｈａ）であり、
ｘ１０が、非官能性、極性、もしくは疎水性残基であるか、または結合リンカー（例えば、Ｓ、Ｆ、および４Ｆ−Ｐｈｅ）であり、
ｘ１１は、非官能性、極性、塩基性、もしくは疎水性残基であるか、または結合リンカーであり、
ｘ１２は、非官能性、疎水性、極性、または塩基性残基であり、
ｘ１３は、非官能性または芳香族残基（例えば、Ｇ）であり、
ｘ１４は、非官能性または親水性残基（例えば、ＰおよびＯｉｃ）であり、
ｘ１５は、非官能性、極性、または疎水性残基（例えば、脂肪族、芳香族、疎水性残基）であり、
ｘ１６は、非官能性または疎水性残基（例えば、Ｆ、４Ｉ−Ｐｈｅ、４Ｃｌ−Ｐｈｅ、Ｂｉｐ、Ｐ、Ｏｉｃ）であり、
ｘ１７は、不在であるか、または疎水性残基（例えば、芳香族残基）である。
前述の通り、アゴニストは生理学的プロセスに影響することができる。故に、修飾ペプチドは、例えば、ｄｐ／ｄｔまたは心拍数などの収縮性の種々の態様を増加させることによって、心臓に対してアゴニスト活性を有し得る。
「−アンタゴニストペプチド」、「ペプチドアンタゴニスト」、および「阻害剤ペプチド」という用語は、対象の受容体の生物学的活性を阻止もしくは何らかの形でそれに干渉するか、または対象の受容体の既知のアンタゴニストもしくは阻害剤と同等の生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドを意味すると理解されたい。アペリンに拮抗するペプチドについては、対象の受容体はＡＰＪ受容体である。
「芳香族残基」または「芳香族アミノ酸」という用語は、芳香族基を含む側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型にあるアミノ酸残基を意味すると理解されたい。例示的な芳香族残基としては、Ｆ、Ｙ、およびＷが挙げられる。
「塩基性残基」という用語は、塩基性基を含む側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型にあるアミノ酸残基を指す。例示的な塩基性残基としては、Ｈ、Ｋ、およびＲが挙げられる。
「誘導化する（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ）」および「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」または「誘導体化された（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）」という用語は、親分子またはビヒクルの一部分が化学的に修飾されている、それぞれプロセスおよび得られる化合物を意味すると理解されたい。例としては、（１）環状部分、例えば、化合物内での残基間の架橋を有する化合物、（２）架橋された、または架橋部位を有する化合物、例えば、化合物がシステイニル残基を有する故に架橋された二量体を形成すること、（３）１つ以上のペプチジル連結が、非ペプチジル連結によって置換されること、（４）Ｎ末端が、アミノ基と反応することができる薬剤によって修飾されること、（５）Ｃ末端が、アミドまたはエステルによって置換され得ること、（６）個別のアミノ酸部分が、選択された側鎖または末端残基と反応することができる薬剤を用いた処理を通して修飾される化合物、が挙げられる。
種々の実施形態において、化合物のポリペプチドおよび／またはビヒクル部分は誘導体化されてもよい。そのような誘導体は、化合物の溶解度、吸収性、安定性、生物学的半減期などを改善し得る。本部分は、代替的に、化合物の任意の所望されない影響を除去するまたは減衰させ得る。
「融合タンパク質」という用語は、タンパク質が、２つ以上の親タンパク質または親ポリペプチド由来のポリペプチド成分を含むことを意味すると理解されたい。典型的に、融合タンパク質は融合遺伝子から発現し、本融合遺伝子中で、１個のタンパク質からのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、異なるタンパク質からのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列をインフレームで付加され、かつ任意にそのヌクレオチド配列からリンカーによって分離される。融合遺伝子はその後、単一タンパク質として組み換え宿主細胞によって発現され得る。
「内因性アペリンペプチド」という用語は、配列ＭＮＬＲＬＣＶＱＡＬ ＬＬＬＷＬＳＬＴＡＶ ＣＧＧＳＬＭＰＬＰＤ ＧＮＧＬＥＤＧＮＶＲ ＨＬＶＱＰＲＧＳＲＮ ＧＰＧＰＷＱＧＧＲＲ ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳ ＨＫＧＰＭＰＦ（配列番号１３８）を有する完全長アペリンプレプロタンパク質を意味すると理解されたい。アペリン（４２〜７７）は、配列ＬＶＱＰＲＧＳＲＮＧＰＧＰＷＱＧ ＧＲＲＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ（配列番号１）を有するアペリン−３６とも称され、アペリン（６５〜７７）は、配列ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ（配列番号２）または完全長アペリンの断片を有するアペリン−１３とも称される。短縮したアペリンペプチドはまた、分子のアイソフォームとも称され得る。
「単離ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの天然源において通常伴う少なくとも１個の汚染ポリペプチド分子から精製または分離されるポリペプチド分子を意味すると理解されたい。単離ポリペプチド分子は、自然に見出される形態または環境にはない。
「ＡＰＪリガンド」という用語は、ＡＰＪに結合するか、またはＡＰＪと複合体を形成する分子を意味すると理解されたい。リガンドはシグナル誘発分子であってもよいが、必須ではない。一部の例では、「リガンド」という用語は、アゴニストと交換可能に使用することができる。
「非標準」または「非天然」アミノ酸という用語は、概して自然発生タンパク質に組み込まれる２０個の標準アミノ酸の中にはない、Ｄ型またはＬ型にあるアミノ酸残基を意味すると理解されたい。非標準アミノ酸の例は、図１および表３中で見出すことができる。非標準アミノ酸残基は、組み換えによる発現細胞を使用する、タンパク質工学の既知の技法を用いることで、ペプチド中に組み込むことができる。（例えば、Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（６）：６０３−６０９（２００３）を参照されたい）。非標準アミノ酸の更なる例としては、例えば、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸、および誘導体化側鎖を持つアミノ酸が挙げられる。更なる例としては、（Ｌ型またはＤ型にある）β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプリオイック酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎα−エチルグリシン、Ｎα−エチルアスパルギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、ω−メチルアルギニン、Ｎα−メチルグリシン、Ｎα−メチルイソロイシン、Ｎα−メチルバリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎα−アセチルセリン、Ｎα−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、および他の類似のアミノ酸、ならびに以下の表３に列挙するもの、ならびに任意の本明細書に記載のものの誘導体化形態が挙げられる。表３および図１は、有用であり得るいくつかの例示的な非標準アミノ酸残基および関連の省略形を含むが、当業者は、異なる省略形および命名法が同一の物質に適用可能であり、本明細書に交換可能に記載され得ることを理解するであろう。本明細書に列挙する一部のアミノ酸配列は、Ｎ末端アミノ基を表すＮ末端での「｛Ｈ｝−」を含むことができ、および／またはＣ末端カルボキシ基を表すＣ末端での「−｛遊離酸｝」を含んでもよい。
表３に挙げる省略形が本明細書の他の箇所に開示の同一物質に対する別の省略形と異なる場合には、両方の省略形が適用可能であると理解される。表３に挙げるアミノ酸は、別途記載のない限り、Ｌ型またはＤ型であり得る。
Figure 0006710253
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「非官能性残基」または「非官能性アミノ酸」という用語は、酸性、塩基性、または芳香族基を欠く側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型にあるアミノ酸残基を意味すると理解されたい。例示的な非官能性アミノ酸残基としては、Ｍ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびノルロイシン（Ｎｌｅ）が挙げられる。
「高分子ナノ構造体」という用語は、ナノ粒子、例えば、アミリンからの５０：５０のポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーを含有するミクロスフェア製剤を意味すると理解されてもよい（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：１１４５−１１５４，２０１１；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｊ．５６：９５１−９６２，２００９、またはＭｅｄｉｎｃｅｌ（国際公開第ＷＯ２０１２０９００７０Ａ２号）。
「生理学的に許容される塩」という用語は、ＡＰＪアゴニストの製剤のために薬学的に許容されることが知られているか、または後に発見される、いかなる塩をも意味すると理解されたい。いくつかの特定の例としては、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩および臭化水素などのハロゲン化水素、硫酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、ならびにシュウ酸塩が挙げられる。種々の実施形態では、ポリペプチドおよび組成物の生理学的に許容される塩が企図される。
「血清タンパク質結合部分」という用語は、一般に血液中に豊富に見出される内因性（天然）タンパク質との結合を指すと理解されたい。ヒト血清アルブミンは、そのようなタンパク質の例である。そのような分子との結合により、薬物は、有利な特性となり得る血清結合タンパク質の薬物動態を取り入れることが可能となる。
「膜タンパク質結合部分」という用語は、細胞の脂質二重層に埋め込まれるまたは広がるタンパク質との結合を指すと理解されたい。
「極性残基」または「極性アミノ酸」という用語は、極性基を含む側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型にあるアミノ酸残基を指すと理解されたい。例示的な極性残基としては、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、およびＱが挙げられる。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、２つ以上のヌクレオチド残基を含有する一本鎖および二本鎖両方のヌクレオチドポリマーを含むと理解されたい。ポリヌクレオチドを含有するヌクレオチド残基は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの型のヌクレオチドの修飾形態であり得る。該修飾としては、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体などの塩基修飾、２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホラニラデート、およびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間連結修飾が挙げられる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、ペプチド結合によって共有的に連結した２つ以上のアミノ酸を含む。これらの用語は、生成物の特定の長さを指さない。故に、「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、ポリペプチドの定義内に含まれる。用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、ビオチニル化、４−ペンチノイル化、ＰＥＧ化、リン酸化などを含む。加えて、タンパク質断片、類似体、突然変異または異型タンパク質、融合タンパク質などが、ポリペプチドの意味の内に含まれる。用語はまた、既知のタンパク質工学技法を使用した組み換えによって発現させることができる、１個以上のアミノ酸類似体または非標準もしくは非天然アミノ酸が含まれる分子を含む。加えて、融合タンパク質は、公知の有機化学技法によって、本明細書に記載のように誘導体化することができる。
リンカー部分によって直接的または間接的に、別のペプチドもしくはポリペプチドとまたは半減期を引き延ばす部分と、共有的に連結（ｌｉｎｋｅｄ）、結合（ａｔｔａｃｈｅｄ）、または束縛（ｂｏｕｎｄ）されたペプチドまたはポリペプチドを含む組成物は、化学的手法（例えば、翻訳後または合成後に）または組み換え融合によって複合体化されるかに関わらず、「複合体」または「複合体化された」分子である。
「ポリペプチド類似体」または「ペプチド類似体」という用語は、少なくとも１個のアミノ酸残基置換、少なくとも１個のアミノ酸の内部付加もしくは内部欠失、および／またはアミノもしくはカルボキシ末端側終端の短縮化もしくは付加、および／またはカルボキシ末端のアミド化によって自然に存在するポリペプチド配列とは異なる配列を有するポリペプチドを意味すると理解されたい。「内部欠失」は、自然に存在する配列から、ＮまたはＣ末端以外の位置で、アミノ酸が不在であることを指す。同様に、「内部付加」は、自然に存在する配列において、ＮまたはＣ末端以外の位置で、アミノ酸が存在することを指す。
「残基」は、「アミノ酸」という用語と交換可能に使用することができる。
「組み換え」という用語は、物質（例えば、核酸またはポリペプチド）が、人間の介入によって人工的または合成的に（すなわち、非自然的に）改変されていることを意味すると理解される。改変は、その自然的環境もしくは状態内の物質またはそこから除去した物質に対して行うことができる。例えば、「組み換え核酸」は、例えば、クローン化、ＤＮＡシャッフリング、または他の公知の分子生物学的手段の間に、核酸を組み換えることによって作製されるものである。そのような分子生物学的手段の例は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）中に見出される。「組み換えＤＮＡ分子」は、そのような分子生物学的技法を用いて共に結合させたＤＮＡのセグメントからなる。本明細書で使用する「組み換えタンパク質」または「組み換えポリペプチドという用語」は、組み換えＤＮＡ分子を使用することで発現されるタンパク質分子を指す。「組み換え宿主細胞」は、組み換え核酸を含有および／または発現する細胞である。
「ビヒクル」という用語は、とりわけ、分解を防止する、および／もしくは半減期を増加させる、毒性を減少させる、免疫原性を減少させる、または治療用分子の生物学的活性を増加させる分子を意味すると理解されたい。例示的なビヒクルとしては、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、脂質、コレステロール基（ステロイドなど）、炭水化物もしくはオリゴ糖（例えば、デキストラン）、任意の天然もしくは合成タンパク質（例えば、ＡｂまたはＦｃドメイン）、またはサルベージ受容体に結合する任意のポリペプチドもしくはペプチドが挙げられる。
種々の実施形態では、ＡＰＪアゴニストポリペプチドが、化学的修飾によって、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、骨格、または側鎖を介してビヒクルに結合し得る、組成物を提供する。故に、ビヒクル−ペプチド分子は、以下の式Ｉ
Figure 0006710253
 によって記述することができ、式中、
Ｖ１はビヒクル（例えば、ＰＥＧ）であり、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は各々独立して、−（Ｌ１）ｅ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｅ−Ｐ１−（Ｌ２）ｆ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｅ−Ｐ１−（Ｌ２）ｆ−Ｐ２−（Ｌ３）ｇ−Ｐ３、−（Ｌ１）ｅ−Ｐ１−（Ｌ２）ｆ−Ｐ２−（Ｌ３）ｇ−Ｐ３−（Ｌ４）ｈ−Ｐ４、およびそれらのより高次の多量体から選択され、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は各々独立して、ＡＰＪアゴニストドメインの配列であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は各々独立してリンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、およびｈは各々独立して、０または１であるが、但し、ａ、ｂ、およびｃのうちの少なくとも１個は１である。
故に、化合物ＩＩは、式
Figure 0006710253
 およびその多量体を含むことができ、式中、Ｖ１はＰＥＧであり、Ａ１のＮ末端で、リンカーによってまたはリンカーによらずに結合し、
化合物ＩＩＩは、式
Figure 0006710253
 およびその多量体を含むことができ、式中、Ｖ１はＰＥＧであり、Ａ２の骨格または側鎖で、リンカーによってまたはリンカーによらずに結合し、
化合物ＩＶは、式
Figure 0006710253
 およびその多量体を含むことができ、式中、Ｖ１はＰＥＧであり、Ａ３のＣ末端で、リンカーによってまたはリンカーによらずに結合し、
化合物Ｖは、式
Figure 0006710253
 およびその多量体を含むことができ、式中、Ｖ１はＰＥＧであり、Ａ１およびＡ２の任意の位置で、リンカーによってまたはリンカーによらずに結合し、
化合物ＶＩは、式
Figure 0006710253
 およびその多量体を含むことができ、式中、Ｖ１はＰＥＧであり、Ａ１、Ａ２、Ａ３、またはＡ４の任意の位置で、リンカーによってまたはリンカーによらずに結合し、
化合物ＶＩＩは、式
Figure 0006710253
 およびその多量体を含むことができ、式中、Ｖ１およびＶ２はＰＥＧであり、Ａ１の任意の位置で、リンカーによってまたはリンカーによらずに結合する。
組み換えＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ媒介タンパク質発現ならびにタンパク質工学技法、またはペプチドを調製する任意の他の方法が、本明細書に開示のポリペプチドの作製に適用可能である。例えば、ペプチドは、形質転換宿主細胞中で作製することができる。簡潔には、ペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子または構築物を調製する。そのようなＤＮＡ分子の調製方法は、当技術分野で公知である。例えば、ペプチドをコードする配列は、好適な制限酵素を使用して、ＤＮＡから切除することができる。種々の実施形態の実践において、多数の利用可能かつ公知の宿主細胞のうち任意のものを使用し得る。特定の宿主の選択は、当業者が認識するいくつかの要因に依存する。これらには、例えば、選択した発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子がコードするペプチドの毒性、形質転換の速度、ペプチド回収の容易性、発現特徴、生体安全性、および費用が挙げられる。これらの要因の均衡は、全ての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に等しく有効であるわけではないという理解の下で決定するべきである。これらの一般的な指針内で、有用な培養下の微生物宿主細胞としては、細菌（大腸菌属など）、酵母菌（サッカロミセス属など）、ならびに他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物（ヒトを含む）細胞、例えば、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。修飾は、ＤＮＡレベルでも行うことができる。ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、選択した宿主細胞により適合するコドンに変更してもよい。大腸菌については、最適化コドンが当技術分野で既知である。コドンは、制限部位を除去するか、またはサイレント制限部位を含むように置換することができ、それにより選択した宿主細胞におけるＤＮＡの処理を支援し得る。次に、形質転換宿主を培養し、精製する。宿主細胞を従来の発酵条件下で培養して、所望の化合物を発現させることができる。そのような発酵条件は、当技術分野で公知である。加えて、ＤＮＡは、任意に更に、融合タンパク質をコードする領域の５’側、発現されたペプチド類似体と動作可能に連結したシグナルペプチド配列（例えば、分泌シグナルペプチド）をコードする。二量体Ｆｃ融合タンパク質（「ペプチボディ」）またはキメラ免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）−Ｆｃヘテロ三量体（「ヘミボディ」）を含む、哺乳動物細胞による組成物の組み換え発現に有用な、適切な組み換え方法および例示的なＤＮＡ構築物の更なる例については、例えば、共にその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓｕｌｌｉｖａｎらによる「Ｔｏｘｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」米国第２００７／００７１７６４号、および国際公開第ＷＯ２００８／０８８４２２号として公開されたＳｕｌｌｉｖａｎらによる「Ｔｏｘｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」ＰＣＴ／米国第２００７／０２２８３１号を参照されたい。
ペプチド組成物はまた、合成方法によっても作製することができる。固相合成は、最も費用効率の高い小ペプチドの作製方法であるため、個別のペプチドの作製技法として使用することができる。例えば、公知の固相合成技法は、保護基、リンカー、および固相支持物の使用、また特定の保護および脱保護反応条件、リンカー開裂条件、スカベンジャーの使用、ならびに固相ペプチド合成の他の態様を含む。好適な技法は、当技術分野で公知である。（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３），Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｐ．３３５−６１（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ ａｎｄ Ｐａｎａｙｏｔｉｓ ｅｄｓ．）、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４−４１４、Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ（１９６９），Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、米国特許第３，９４１，７６３号、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９７６），Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ ｅｄ．）２：１０５−２５３、およびＥｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７６），Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ ｅｄ．）２：２５７−５２７、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔａｌｏｇ，２０００、“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，”Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９２、“Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ＆Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｗ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８、“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，”Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３、“Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，”Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，”Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４、“Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ，２０００，Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，１９９０，７７−１８３）。組成物の作製に適用可能である当技術分野で既知の合成および精製の更なる例については、例えば、共にその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓｕｌｌｉｖａｎらによる米国第２００７／００７１７６４号、および国際公開第ＷＯ２００８／０８８４２２ Ａ２号として公開されたＳｕｌｌｉｖａｎらによるＰＣＴ／米国第２００７／０２２８３１号を参照されたい。
ペプチドドメインへの１つ以上の有用な修飾としては、既知の化学的技法によって達成される、アミノ酸付加もしくは挿入、アミノ酸欠失、ペプチド短縮化、アミノ酸置換、および／またはアミノ酸残基の化学的誘導体化が挙げられる。例えば、このようにして修飾したアミノ酸配列は、対象の天然配列のアミノ酸配列と比較して、そこで挿入または置換された少なくとも１個のアミノ酸残基を含み、その中で、挿入または置換されたアミノ酸残基は、ペプチドを、リンカーおよび／または半減期を引き延ばす部分に共有的に複合体化する求核または求電子反応性官能基を含む側鎖を有する。そのような求核または求電子反応性官能基の有用な例としては、チオール、第１級アミン、セレノ、ヒドラジド、アルデヒド、カルボン酸、ケトン、アミノオキシ、マスク化（保護）アルデヒド、またはマスク化（保護）ケト官能基が挙げられるが、これらに限定されない。求核反応性官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基の例としては、リジン残基、ホモリジン、α、β−ジアミノプロピオン酸残基、α、γ−ジアミノ酪酸残基、オルニチン残基、システイン、ホモシステイン、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、またはセレノシステイン（「ＳｅＣｙｓ」）残基が挙げられるが、これらに限定されない。
組成物のペプチド部分はまた、既知の有機化学技法によって、１つ以上のアミノ酸残基において化学的に誘導体化することができる。「化学的誘導体」または「化学的に誘導体化された」は、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された１個以上の残基を有する対象のペプチドを指す。そのような誘導体化された分子としては、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩を形成する分子、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基が挙げられる。遊離カルボキシル基を誘導体化して、塩、メチル、およびエチルエステル、または他の型のエステルもしくはヒドラジドを形成することができる。遊離ヒドロキシル基を誘導体化して、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化して、Ｎ−イム−ベンジルヒスチジンを形成することができる。Ｌ型にあるかＤ型にあるかに関わらず、２０個の標準アミノ酸の１個以上の自然発生アミノ酸誘導体を含有するペプチドも、化学的誘導体に含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンと置換してもよく、５−ヒドロキシリジンはリジンと置換してもよく、３−メチルヒスチジンはヒスチジンと置換してもよく、ホモセリンはセリンと置換してもよく、オルニチンはリジンと置換してもよい。
有用な誘導体化としては、いくつかの実施形態では、ペプチドのアミノ末端を化学的に阻止して、ビヒクルとの複合体化がＮ末端遊離アミノ基で起こるのを防止するものが挙げられる。そのような修飾の他の有益な影響、例えば、酵素的タンパク質分解に対するペプチド類似体の感受性の減少があり得る。Ｎ末端は、置換アミンにアシル化もしくは修飾するか、または、芳香族部分（例えば、インドール酸、ベンジル（ＢｚｌまたはＢｎ）、ジベンジル（ＤｉＢｚｌまたはＢｎ２）、もしくはベンジルオキシカルボニル（ＣｂｚまたはＺ））、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、もしくはクレアチンなどの別の官能基によって誘導体化することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ホルミル、アセチル（Ａｃ）、プロパノイル、ブタニル、ヘプタニル、ヘキサノイル、オクタニル、またはノナノイルなどであるがこれらに限定されない、アシル部分は、ペプチドのＮ末端終端に共有的に連結されて、ビヒクルのペプチドとの複合体化中の所望されない副反応を防止することができる。他の例示的なＮ−末端誘導体基としては、−ＮＲＲ１（−ＮＨ２以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシンイミド、またはベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（Ｃｂｚ−ＮＨ−）が挙げられ、式中、ＲおよびＲ１は各々独立して、水素または低級アルキルであり、フェニル環は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、クロロ、およびブロモから選択される１〜３個の置換基によって置換され得る。
いくつかの実施形態では、アミノ酸残基間の１個以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］連結（結合）は、非ペプチジル連結によって置換することができる。例示的な非ペプチジル連結は、−ＣＨ２−カルバメート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホネート、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２−第２級アミン、およびアルキル化ペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−、式中、Ｒ６は低級アルキル］である。
いくつかの実施形態では、１個以上の個別のアミノ酸残基を誘導体化することができる。種々の誘導体化剤は、例として以下で詳細に記載するように、選択した側鎖または末端残基と特異的に反応することが知られている。
リジニル残基およびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させることで、リジニル残基の荷電を逆転させることができる。アルファアミノ含有残基を誘導体化するために好適な他の試薬としては、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシル酸とのアミノ基転移酵素触媒反応が挙げられる。
アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンを含む従来の試薬のうちの１つまたは組み合わせとの反応により修飾し得る。アルギニル残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａにより、反応をアルカリ条件で行なうことを必要とする。更に、これらの試薬は、リジンの基、およびアルギニンイプシロンアミノ基と反応し得る。
チロシル残基の特定の修飾は、芳香族ジオゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることによりチロシル残基にスペクトル標識を導入することに特に関心を寄せて、広く研究されている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（ｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）およびテトラニトロメタンを使用して、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成する。
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド、または１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどの、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾し得る。更に、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換することができる。
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミノ化することができる。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、種々の実施形態の範囲内に含まれる。
システイニル残基は、アミノ酸残基もしくは他の部分を用いて置換して、ジスルフィド結合を除去するか、または架橋を安定化することができる。（例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：３８１４−３８１９（１９９６）を参照されたい）。
二官能性剤を用いた誘導体化は、ペプチドまたはその官能性誘導体を、不水溶性の支持マトリックス、または所望の場合には他の高分子ビヒクルに架橋するために有用である。一般に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸を持つエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなど二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生み出す。あるいは、臭化シアンで活性化される炭水化物などの反応性不水溶性マトリックスおよび反応性基質、例えば、米国特許第３，９６９，２８７号、同第３，６９１，０１６号、同第４，１９５，１２８号、同第４，２４７，６４２号、同第４，２２９，５３７号、および同第４，３３０，４４０号に記載のものが、タンパク質固定化に用いられる。
他の修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓにおける硫黄原子の酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアルファアミノ基のメチル化が挙げられる。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），７９−８６（１９８３）。
誘導体化の上記の例は、網羅的な扱いではなく、単に例示説明の目的であると意図される。
種々の実施形態では、ＡＰＪアゴニストポリペプチドの薬物動態プロファイルを調節することが望まれる場合がある。治療的必要性を満たすように薬物動態プロファイルを調節するために、種々の実施形態は、半減期を延長する部分または複数の部分がポリペプチドに共有的に融合、結合、連結、または複合体化され得る種々の質量および配置の１個以上の半減期を引き延ばす部分を含むことができる。「半減期を引き延ばす部分」は、ポリペプチド類似体の非複合体化形態と比較して、タンパク質分解もしくは他の活性を減退させる化学的修飾による分解をインビボで防止もしくは緩和する、腎クリアランス率もしくは肝クリアランス率の率の減少、吸収率の増加などであるがこれらに限定されない、半減期または他の薬物動態特性をインビボもしくはインビトロで増加させる、毒性を減少させる、免疫原性を減少させる、溶解度を改善する、対象の標的に関するペプチド類似体の生物学的活性および／もしくは標的選択性を増加させる、ならびに／または製造可能性を増加させる、分子を指す。半減期を引き延ばす部分は、薬学的に許容されるものであり得る。
半減期を引き延ばす部分は、本明細書に記載のポリペプチドまたは組成物が、十分な流体力学的サイズを達成し、インビボでの腎臓濾過によるクリアランスを防止するように選択し得る。例えば、実質的に直鎖、分岐鎖（ｂｒ）、または樹状形態の高分子である半減期を引き延ばす部分を選択してもよい。あるいは、半減期を引き延ばす部分は、インビボで、本ポリペプチドまたは組成物が血清タンパク質に結合して複合体を形成し、そのように形成された複合体が実質的な腎クリアランスを回避するように、選択してもよい。半減期を引き延ばす部分は、例えば、脂質、コレステロール基（ステロイドなど）、炭水化物もしくはオリゴ糖、ポリマー、またはサルベージ受容体に結合する任意の天然もしくは合成タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドが挙げられる。
使用できる例示的な半減期を引き延ばす部分としては、免疫グロブリンＦｃドメインもしくはその一部分、または生物学的に好適なポリマーもしくはコポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール化合物が挙げられる。他の適切なポリアルキレングリコールとしては、以下の型の荷電または中性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない：デキストラン、ポリリジン、コロミン酸または他の炭水化物系ポリマー、アミノ酸のポリマー、およびビオチン誘導体。一部の単量体融合または複合体化タンパク質の実施形態では、免疫グロブリン（軽鎖および重鎖を含む）またはその一部分は、半減期を引き延ばす部分として使用することができ、ヒト起源の免疫グロブリンであることが好ましく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４などであるがこれらに限定されない、免疫グロブリンのうちの任意のものを含む。
半減期を引き延ばす部分の他の例としては、エチレングリコールのコポリマー、プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジンまたはポリオルニチン）、デキストランｎ−ビニルピロリドン、ポリｎ−ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモポリマー、酸化プロピレンポリマー、酸化エチレンポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、線状もしくは分岐グリコシル化鎖、ポリアセタール、長鎖脂肪酸、長鎖疎水性脂肪族基、またはポリシアル酸（例えば、ＰｏｌｙＸｅｎ（商標）技術、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄｓ，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３００：１２５−３０（２００５））が挙げられる。
他の実施形態では、半減期を引き延ばす部分は、ペプチド類似体のＮ末端に共有的に連結された、陰イオンで荷電された化学的実体であり、陰イオンで荷電された化学的実体としては、任意にＡＥＥＡリンカーまたは本明細書に記載の他のリンカーを介して間接的に、ペプチド類似体のＮ末端に共有的に連結され得る、ホスホチロシン、ホスホセリン、ｐ−ホスホノ（ジフルオロ−メチル）−フェニルアラニン（Ｐｆｐ）、ｐ−ホスホノ−メチル−フェニルアラニン（Ｐｍｐ）、ｐ−ホスファチジル−フェニルアラニン（Ｐｐａ）、またはｐ−ホスホノ−メチルケト−フェニルアラニン（Ｐｋｐ）が挙げられる。（Ｃｈａｎｄｙ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。
半減期を引き延ばす部分の他の実施形態としては、温度、ｐＨ、およびイオン強度の生理学的条件下で長い半減期の血清タンパク質に対する結合親和性を有するペプチドリガンドまたは小（有機）分子リガンドを含むことができる。例としては、アルブミン結合ペプチドもしくは小分子リガンド、トランスサイレチン結合ペプチドもしくは小分子リガンド、サイロキシン結合グロブリン結合ペプチドもしくは小分子リガンド、抗体結合ペプチドもしくは小分子リガンド、または長い半減期の血清タンパク質に対する親和性を有する別のペプチドもしくは小分子が挙げられる。（例えば、Ｂｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｂｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌｉｇａｎｄｓ，米国特許第５，７１４，１４２号、Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｉｅｔｉｅｓ，米国第２００３／００６９３９５ Ａ１号、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，米国特許第６，３４２，２２５号を参照されたい）。
「長い半減期の血清タンパク質」は、哺乳動物の血漿中に溶解した何百もの異なるタンパク質のうちの１つであり、いわゆる「担体タンパク質」（アルブミン、トランスフェリン、およびハプトグロビンなど）、フィブリノゲンおよび他の血液凝固因子、補体成分、免疫グロブリン、酵素阻害剤、アンジオテンシンおよびブラジキニンなどの物質の前駆体、ならびに他の型のタンパク質を含む。種々の実施形態は、本明細書に記載のものなどであるがこれに限定されない、薬学的に許容される半減期を引き延ばす部分の任意の単一種の使用、または、ＦｃのＣＨ２ドメイン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、例えば、Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｂｕｍｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，米国特許第６，９２６，８９８号および米国第２００５／００５４０５１号、Ｂｒｉｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，米国第６，８８７，４７０号を参照されたい）、トランスサイレチン（ＴＴＲ、例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ／ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｉｏｎｓ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ／ｐｒｏｔｅｉｎｓ，米国第２００３／０１９５１５４ Ａ１号、同第２００３／０１９１０５６ Ａ１号を参照されたい）、もしくはサイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）などの、ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃドメインまたはその一部分（例えば、Ｆｅｉｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ，米国特許第６，６６０，８４３号を参照されたい）など、２個以上の異なる半減期を引き延ばす部分の組み合わせ、または免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）およびＦｃドメインなどの組み合わせ（ヘテロ三量体の組み合わせ、いわゆる「ヘミボディ」）、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００８／０８８４２２号として公開された、Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ，ＰＣＴ／米国第２００７／０２２８３１号に記載のものの、使用を包含する。
ペプチド類似体（複数可）の半減期を引き延ばす部分または複数の部分との複合体化は、ペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端を介するか、またはＦ１がペプチド類似体のＮ末端により接近して連結されるその第１級アミノ酸配列に関しては、介在性であることができる。
特に有用な半減期を引き延ばす部分としては、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４を含む、ヒト免疫グロブリン）が挙げられる。「免疫グロブリン」という用語は、各々軽鎖（ＬＣ）に共有的に連結された２個の二量体化された重鎖（ＨＣ）、単一の二量体化されていない免疫グロブリン重鎖および共有的に連結された軽鎖（ＨＣ＋ＬＣ）、またはキメラ免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）−Ｆｃヘテロ三量体（いわゆる「へミボディ」）を含む、完全な抗体を包含する。
非分解ＡＰＪアゴニストの半減期を引き延ばすことは、「安定性」の増加とも言及され得る。種々の状況において、ペプチドの修飾、例えば、ＰＥＧ分子の付加が、内因性アペリン分子の分解した断片の半減期を引き延ばす可能性があり、それが必ずしも生物活性アペリンの増加した安定性に繋がるわけではないことが想像できる。増加した安定性はまた、アゴニストのクリアランスの減少、または、アゴニスト、もしくは非修飾アゴニストと比較して代謝分解の速度を減少させる修飾もしくは修飾の組み合わせを持つアゴニストの曝露の全体的な増加を意味すると理解することができる。増加した安定性は、インビトロの血漿および組織ホモジネートなどの生物学的マトリックスにおけるアゴニストの半減期を延長し、インビボの血漿滞留時間を延長することができる。インビボの血漿滞留時間は、動物に投与される無傷ペプチド薬物実体の循環寿命を意味すると理解されたい。インビトロの血漿滞留時間は、生物媒体中に付加された後の無傷ペプチド薬物実体の寿命を意味すると理解されたい。
ＡＰＪアゴニストの修飾はまた、分子の「効力」の増加、例えば、分子のファーモキネティックまたは薬力学的特性を改善することにもつながる。効力の増加はまた、非修飾アゴニストと比較して代謝低下の速度を減少させる、修飾または修飾の組み合わせを持つアゴニストを意味すると理解することができる。増加した安定性は、インビトロの血漿および組織ホモジネートなどの生物学的マトリックスにおけるアゴニストまたは半減期を延長し、インビボの血漿滞留時間を延長することができる。効力の増加は、親和性および／または受容体の有効性の増加を意味すると更に理解し得る。
「Ｆｃ領域」、または本明細書で交換可能に使用される「Ｆｃドメイン」もしくは「免疫グロブリンＦｃドメイン」は、完全な抗体が抗体のＣＨ１およびＣＨ２を含む、２個の重鎖断片を含有する。２個の重鎖断片は、２個以上のジスルフィド結合によって、およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって、共に結び付く。
上述の通り、ポリマーの半減期を引き延ばす部分を使用することもできる。半減期を引き延ばす部分として有用な化学部分を結合するための種々の手法が、現在利用可能であり、それについては、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、特許協力条約（「ＰＣＴ」）国際公開第ＷＯ９６／１１９５３号、題「Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」を参照されたい。このＰＣＴ出願は、中でも、水溶性ポリマーのＡＰＪリガンドへの選択的結合を開示する。
いくつかの実施形態では、ポリマーの半減期を引き延ばす部分は、ＡＰＪアゴニストのＮ末端、Ｃ末端、または１個以上の介在側鎖において共有的に連結する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、組成物は、非ＰＥＧの半減期を引き延ばす部分もしくはＡＰＪアゴニスト、またはこれらのうち任意のものの任意の組み合わせと複合体化される、１個以上のＰＥＧ部分を更に含むことができる。例えば、Ｆｃドメインまたはその部分は、共有結合的複合体化のプロセスによって、モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化、またあるいはマルチＰＥＧ化することができる。
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とのタンパク質およびペプチドの共有結合的複合体化は、インビボの循環半減期を著しく引き延ばすことができる。ＰＥＧ化は、ＰＥＧ部分が分子に大幅な流体力学的半径を付加するため、主に腎クリアランスを遅延させることによってこの効果を達成する。（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｓ ｆｏｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．，ｉｎ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．，３４７−３７０（１９９２））。タンパク質およびペプチドのＰＥＧ化によって多くの場合に授けられる更なる利益としては、増加した溶解度、タンパク質分解への耐性、および治療的ポリペプチドの減少した免疫原性が挙げられる。タンパク質ＰＥＧ化の価値は、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ（Ａｄａｇｅｎ（商標）／Ｅｎｚｏｎ Ｃｏｒｐ．）、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ（商標）／Ｅｎｚｏｎ Ｃｏｒｐ．）、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（商標）／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ／Ｅｎｚｏｎ）、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（商標）／Ｒｏｃｈｅ）、およびＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（商標）／Ａｍｇｅｎ）、ならびに臨床試験中の多くの他のものを含む、いくつかのＰＥＧ化タンパク質の商業化から明らかである。
「ＰＥＧ化ペプチド」、「ＰＥＧ化ポリペプチド」、または「ＰＥＧ化タンパク質」は、ペプチド自体のアミノ酸残基に共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、または別のリンカー部分を介して直接的または間接的にペプチドの残基に共有結合したペプチジルもしくは非ペプチジルリンカーに共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を有するペプチドを意味する。非限定的な例は、３−（１−（１−ブロモ−２−オキソ−６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ウンデカオキサ−３−アザオクタトリアコンタン−３８−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロパノイル（本明細書では省略形「｛ブロモアセトアミド−ＰＥＧ１１−トリアゾール｝−」によって指定する）を用いたペプチドのＮ末端複合体化である。
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、カップリング剤、またはカップリングするもしくは活性化する部分による（例えば、アルデヒド、ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジド、チオール、トリフレート、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アジルジン（ａｚｉｒｄｉｎｅ）、オキシラン、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド、またはマレイミド部分による）誘導体化を有するまたは有しない、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を意味する。種々の実施形態に従うと、有用なＰＥＧとしては、実質的に線状の直鎖ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ（ｂｒＰＥＧ）、または樹状ＰＥＧが挙げられる。（例えば、Ｍｅｒｒｉｌｌ，米国特許第５，１７１，２６４号、Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉａｒｍｅｄ，ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ，ｐｏｌｙｍｅｒ ｆｏｒ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅｓ，米国特許第５，９３２，４６２号、Ｓｈｅｎ，Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌ ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，米国特許第６，６０２，４９８号を参照されたい）。
簡潔には、ＰＥＧ基は概して、アシル化またはアルキル化（または還元的アミノ化）によって、ＰＥＧ部分上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）から、化合物上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）まで、組成物のペプチド部分に結合することができる。合成ペプチドのＰＥＧ化のための有用な方策は、各々が他方に対して相互に反応する特別な官能性を持つペプチドとＰＥＧ部分とを、溶液中で複合体連結を形成させることによって、組み合わせることからなる。ペプチドは、従来の固層合成によって容易に調製できる。ペプチドは、特定の部位で、適切な官能基によって「事前活性化（ｐｒｅａｃｔｉｖａｔｅ）」することができる。前駆体は、ＰＥＧ部分による反応の前に、精製し、十分特徴付ける。ＰＥＧによるペプチドのライゲーションは、通常は水相において起こり、逆相分析的ＨＰＬＣによって容易にモニターできる。ＰＥＧ化ペプチドは、容易に、分取ＨＰＬＣによって精製し、分析的ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、およびレーザー脱離質量分析によって特徴付けることができる。
ＰＥＧは、市販されているか、または当技術分野で公知の方法に従うエチレングリコールの開環重合によって調製することができる、周知の水溶性ポリマーである（Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ １３８−１６１）。本明細書では、「ＰＥＧ」という用語は、サイズ、またはＰＥＧの終端での修飾に関係なく、単官能性、二官能性、または多官能性形態にある一切のポリエチレングリコール分子を包含するように広範に使用され、式
Figure 0006710253
 によって表すことができ、
式中、ｎは３〜２３００であり、Ｘは、Ｈまたは末端修飾、例えば、メチルまたはＣ１−４アルキルであり、Ｒは、共有結合に使用される反応性部分である。
いくつかの実施形態では、一端がヒドロキシまたはメトキシで終結する、すなわち、ＸがＨまたはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である、ＰＥＧを使用することができる。Ｒで終結するように式（Ｉ）中で示されるＰＥＧのもう一方の終端は、エーテル酸素結合、アミン連結、またはアミド連結によって活性化部分に共有結合することに注意する。化学構造中で使用する場合、用語「ＰＥＧ」は、示したヒドロキシル基の水素を持たないことで、酸素がリンカーの遊離炭素原子を反応してエーテル結合を形成できるようにする、上の式（Ｉ）を含む。より具体的には、ＰＥＧをペプチドと複合体化させるためには、ペプチドを「活性化した」形態のＰＥＧと反応させる必要がある。活性化したＰＥＧは、式
Figure 0006710253
 によって表すことができ、
式中、ＰＥＧ（上に定義）は、活性化部分（Ａ）の炭素原子に共有結合して、エーテル結合、アミン連結、またはアミド連結を形成し、（Ａ）は、ペプチドのアミノ酸残基、またはペプチドに共有結合したリンカー部分上で、アミノ、アジド、アルキン、イミノ、マレイミド、Ｎ−スクシンイミジル、カルボキシル、アミノオキシ、セレノ、またはチオール基と反応し得る反応性基、例えば、ＡＰＪアゴニストを含有する。
種々のＰＥＧの例は以下である。
アミノアルキルＰＥＧ
Figure 0006710253
 チオールＰＥＧ
Figure 0006710253
 カルボン酸ＰＥＧ
Figure 0006710253
 ヒドラジドＰＥＧ
Figure 0006710253
 アジドＰＥＧ
Figure 0006710253
 メシラートおよびトシラートＰＥＧ
Figure 0006710253
 マレイミドＰＥＧ
Figure 0006710253
 ｐ−ニトロフェニル炭酸塩ＰＥＧ
Figure 0006710253
 ＮＨＳ炭酸塩ＰＥＧ
Figure 0006710253
 ＮＨＳ活性エステル
Figure 0006710253
 アルデヒドＰＥＧ
Figure 0006710253
 アミノオキシＰＥＧ
Figure 0006710253
 ヨードアセトアミドＰＥＧ
Figure 0006710253
 オルトピリジルジスルフィドＰＥＧ
Figure 0006710253
 アルキンＰＥＧ
Figure 0006710253
活性化ＰＥＧの調製およびその生物学的に活性なペプチドとの複合体化のための技法は、当技術分野で公知である。（例えば、米国特許第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号、同第５，９３２，４６２号、および同第５，９９０，２３７号、Ｋｉｎｓｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ，米国特許第５，９８５，２６５号および同第５，８２４，７８４号、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＥＰ ０５７５５４５ Ｂ１、Ｐｅｔｉｔ，Ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，米国特許第６，４５１，９８６号および同第６，５４８，６４４号、Ｓ．Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｗｉｔｈ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｅｎｄｇｒｏｕｐｓ：Ｉ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１０：１４５−１８７（１９９５）、Ｙ．Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ＩＩＩ：Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ＰＥＧｙｌａｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｏｆ ｖａｒｙｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｙ ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：２２１−２２９（１９９４）、Ａ．Ｍ．Ｆｅｌｉｘ ｅｔ ａｌ．，ＰＥＧｙｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ＩＶ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ＧＲＦ ａｎａｌｏｇｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，４６：２５３−２６４（１９９５）、Ａ．Ｍ．Ｆｅｌｉｘ，Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ６８０（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））：２１８−２３８（１９９７）、Ｙ．Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ｔｈｅｉｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅｍ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＥＰ ０４７３０８４ Ｂ１、Ｇ．Ｅ．Ｍｅａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎｓ，ｉｎ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｏｌｄｅｎ Ｄａｙ，Ｉｎｃ．，２１９（１９７１）を参照されたい）。
ＰＥＧアルデヒドまたはＰＥＧアルデヒド水和物などの活性化ＰＥＧは、既知の手法によって化学的に合成するか、または商業的供給源、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌ）またはＥｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）から入手することができる。
有用な活性化ＰＥＧの例は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌ）から市販されているＰＥＧプロピオンアルデヒドなどのＰＥＧアルデヒド化合物（例えば、メトキシＰＥＧアルデヒド）であり得る。ＰＥＧプロピオンアルデヒドは、式ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯによって表される。（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号を参照されたい）。ＰＥＧアルデヒド水和物、例えば、ＰＥＧアセトアルデヒド水和物およびＰＥＧビスアルデヒド水和物も「ＰＥＧアルデヒド化合物」の意味に含まれ、後者は二官能的に活性化された構造を生み出す。（例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ａｌｄｅｈｙｄｅ ｈｙｄｒａｔｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ａｍｉｎｅｓ，米国特許第５，９９０，２３７号を参照されたい）（例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ａｌｄｅｈｙｄｅ ｈｙｄｒａｔｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ａｍｉｎｅｓ，米国特許第５，９９０，２３７号を参照されたい）。活性化多分岐ＰＥＧアルデヒド化合物を使用することができる（二価、三価、四価、八価構築物を含むＰＥＧ誘導体）。４腕ＰＥＧ誘導体を使用して、４個の（４）ＡＰＪアゴニストは、各ＰＥＧ分子に結合し得る。例えば、ＡＰＪアゴニストは、ＰＥＧの１個、２個、３個、または４個のアミノ官能化部位で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合体化し得る。
複合体化する際は、本明細書に記載のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ペプチド中に存在するチオールのアルキル化によって共有結合するか、またはＰＥＧおよびペプチド中に存在するアジド部分とアルキン部分との間のシクロ付加反応によって共有結合する。あるいは、ＰＥＧは、還元的アミノ化によって、ＡＰＪアゴニストそれ自体のアミノ酸残基の少なくとも１個の溶媒曝露した遊離アミン部分と、直接的に共有結合し得る。いくつかの実施形態では、ＡＰＪアゴニストは、ペプチド類似体上の１個以上の第１級または第２級アミンでＰＥＧと、またはペプチド類似体上の単一の第１級アミン部位で２個のＰＥＧ基と、複合体化することができる（これは、還元的アミン化反応が過剰ＰＥＧアルデヒド化合物の存在を伴うときに起こる）。還元的アミノ化によるＰＥＧ化がペプチド上の第１級アミンにおいてあるときは、分子ごとにＰＥＧが２個以上存在するＰＥＧ反応産生物の量（１〜１００％の範囲）を有することは珍しくなく、所望のＰＥＧ化産生物が、分子ごとのＰＥＧが１個のみのものである場合には、この「過ＰＥＧ化」は所望されなくてもよいことが、観察されている。ＰＥＧ化産生物分子ごとに１個のＰＥＧを持つＰＥＧ化産生物を所望するときは、分子ごとに１個のみのＰＥＧ基が還元的アミン化反応中に移動されるため、薬理学的に活性なペプチドの第２級アミンを使用するＰＥＧ化を伴う実施形態を用いることができる。
第１級アミン部分を提供し得るアミノ酸残基としては、リジン、ホモリジン、オルニチン、α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、およびα，γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、およびα−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）が挙げられる。ポリペプチドＮ末端もまた、ＰＥＧ化に有用なα−アミノ基を提供する。第２級アミン部分を提供し得るアミノ酸残基としては、アルキルがＣ１〜Ｃ６である、ε−Ｎ−アルキルリジン、α−Ｎ−アルキルリジン、δ−Ｎ−アルキルオルニチン、α−Ｎ−アルキルオルニチン、またはＮ末端プロリンが挙げられる。
ＰＥＧ化類似体の生成に有用な別の活性化ＰＥＧは、ＰＥＧ複合体化ペプチドの生成に特に有用なマレイミドモノメトキシＰＥＧなどのメトキシＰＥＧ−マレイミドなどであるがこれに限定されない、ＰＥＧ−マレイミド化合物である。（例えば、Ｓｈｅｎ，Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌ ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，米国特許第６，６０２，４９８号、Ｃ．Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｕｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＰＥＧ−ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，９：２４９−３０４（１９９２）、Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｓ ｆｏｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｉｎ：Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３４７−３７０（１９９２）、Ｓ．Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｗｉｔｈ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｅｎｄｇｒｏｕｐｓ：Ｉ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１０：１４５−１８７（１９９５）、Ｐ．Ｊ．Ｓｈａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒ ｔｏ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−１，米国特許第４，８４７，３２５号、Ｇ．Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｄｄｅｄ ｖａｒｉａｎｔｓ ＩＬ−３ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｈｅｒｅｏｆ，米国特許第５，１６６，３２２号およびＥＰ ０４６９０７４ Ｂ１、Ｇ．Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｄｄｅｄ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ＥＰＯ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｈｅｒｅｏｆ，ＥＰ ０６６８３５３ Ａ１、Ｇ．Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｄｄｅｄ ｖａｒｉａｎｔｓ Ｇ−ＣＳＦ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｈｅｒｅｏｆ，ＥＰ ０６６８３５４ Ａ１、Ｎ．Ｖ．Ｋａｔｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｍｕｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ，米国特許第５，２０６，３４４号、Ｒ．Ｊ．Ｇｏｏｄｓｏｎ ａｎｄ Ｎ．Ｖ．Ｋａｔｒｅ，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ａｔ ｉｔｓ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：３４３−３４６（１９９０））。
ポリ（エチレングリコール）ビニルスルホンは、チオール化アミノ酸残基での、例えば、Ｃ残基での複合体化によってＰＥＧ複合体化ＡＰＪアゴニストを生成するために有用な別の活性化ＰＥＧである。（例えば、Ｍ．Ｍｏｒｐｕｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｖｉｎｙｌ ｓｕｌｆｏｎｅ，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，７：３６３−３６８（１９９６）、ｓｅｅ ａｌｓｏ Ｈａｒｒｉｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｆｏｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｌｆｏｎｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ ＰＥＧ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，米国特許第５，４４６，０９０号、同第５，７３９，２０８号、同第５，９００，４６１号、同第６，６１０，２８１号、および同第６，８９４，０２５号も参照、ならびにＨａｒｒｉｓ，Ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｌｆｏｎｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ），国際公開第ＷＯ９５／１３３１２ Ａ１号）。種々の実施形態に従い有用であるＰＥＧの別の活性化形態は、ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物、例えば、メトキシＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルである。
ヘテロ二官能的活性形態のＰＥＧも有用である。（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒｍｅｄ ｔｈｅｒｅｗｉｔｈ，米国特許第６，５５２，１７０号を参照されたい）。
組成物を産生するまた他の実施形態では、ＡＰＪアゴニストを、既知の化学的技法によって、チオール活性化ＰＥＧ化合物、ジオール活性化ＰＥＧ化合物、ＰＥＧヒドラジド化合物、ＰＥＧオキシアミン化合物、またはＰＥＧブロモアセチル化合物などであるがこれらに限定されない、活性化ＰＥＧ化合物と反応させる。（例えば、Ｓ．Ｈｅｒｍａｎ，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｗｉｔｈ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｅｎｄｇｒｏｕｐｓ：Ｉ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１０：１４５−１８７（１９９５）、Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６：１５７−１８２（１９９５）、Ｒ．Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｒｕｇｓ：ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１７：１０１−１６１（２０００）を参照されたい）。
別の実施形態では、ＰＥＧ複合体化ＡＰＪアゴニストを生成するための活性化ＰＥＧは、２個以上の活性化残基を有する多価ＰＥＧであることができる。多価ＰＥＧ部分は、表４中で以下に示すものを含み得るが、これらに限定されない。
Figure 0006710253
また他の実施形態では、ＡＰＪアゴニストは、既知の化学的技法によって、ペンタエリスリトールテトラポリエチレングリコールエーテルなどであるがこれに限定されない、活性化多分岐ＰＥＧ化合物（二価、三価、四価、八価構築物を生むために複数の腕を含むＰＥＧ誘導体）と反応させることができる。Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）プロピル、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル、（−ＣＯ２−ｐ−Ｃ６Ｈ４ＮＯ２）、３−（Ｎ−マレイミド）プロパンアミド、２−スルファニルエチル、および３−アミノプロピルなどであるがこれらに限定されない、官能化および活性化誘導体。４腕ＰＥＧ誘導体を使用して、４個のペプチド類似体は、各ＰＥＧ分子に結合し得る。例えば、ＡＰＪアゴニストは、
（ａ）１個、２個、３個、もしくは４個のＰＥＧのアミノ官能化部位、
（ｂ）１個、２個、３個、もしくは４個のＰＥＧのチオール官能化部位、
（ｃ）１個、２個、３個、もしくは４個のＰＥＧのマレイミド官能化部位、
（ｄ）１個、２個、３個、もしくは４個のＰＥＧのＮ−スクシンイミジル官能化部位、
（ｅ）１個、２個、３個、もしくは４個のＰＥＧのカルボキシル官能化部位、
（ｆ）１個、２個、３個、もしくは４個のＰＥＧのｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル官能化部位、
（ｇ）１個、２個、３個、もしくは４個のＰＥＧのアジド官能化部位、
（ｈ）１個、２個、３個、もしくは４個のＰＥＧのアルケンもしくはアルキン官能化部位、または
（ｉ）１個、２個、３個、もしくは４個のＰＥＧのハロゲン化物もしくはハロゲン化アセチルアミド官能化部位で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合体化し得る。
実用的に最小のＰＥＧのサイズは約５００ダルトン（Ｄａ）であり、それを下回るとＰＥＧは有毒となる。約５００Ｄａを上回ると、ＰＥＧのいかなる分子量も、実用的に所望のように使用することができる（例えば、約５００ダルトン（Ｄａ）〜１００，０００Ｄａ（ｎは１０〜２３００））。ＰＥＧモノマーの数（ｎ）は、各単量体に対してＭＷ＝４４Ｄａを使用して、平均分子量から概算する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ複合体化ＡＰＪアゴニスト中で使用されるＰＥＧの合わせたまたは合計した平均分子量は、約５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ（合計したｎは１０〜２３０）、または約１０，０００〜４０，０００Ｄａ（合計したｎは２３０〜９１０）、または約４０，０００〜１００，０００Ｄａ（合計したｎは９１０〜２３００）であり得る。
種々の他の実施形態では、ＰＥＧ分子の合わせた分子量は、約１００，０００Ｄａを超過すべきではない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ複合体化ＡＰＪアゴニスト中で使用されるＰＥＧの合わせたまたは合計した平均分子量は、約３，０００Ｄａ〜６０，０００Ｄａ（合計したｎは７０〜１，４００）、約１０，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａ（合計したｎは約２３０〜約９１０）であり得る。他の実施形態では、ＰＥＧの合わせた質量は、約２０，０００Ｄａ〜３０，０００Ｄａ（合計したｎは約４５０〜約６８０）である。
組成物の「多量体」は、ＡＰＪアゴニストの複合体化のために用いる半減期を引き延ばす部分（介入するリンカー部分を持つまたは持たない）が、半減期を引き延ばす部分が複合体化する場所であるアミノ酸残基の数に関して多価（例えば、二価、三価、四価、またはより高次の原子価）であり得るために、作製できることを理解されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、多価（例えば、二価、三価、四価、またはより高次の原子価）であり得るため、一部の「多量体」は、２個以上の半減基を引き延ばす部分を有してもよい。このため、多様な複合体化した半減期を引き延ばす部分のペプチド構造を産生することが可能なのである。例として、一価の半減期を引き延ばす部分および一価のペプチドは、１：１複合体を産生することができ；二価のペプチドおよび一価の半減期を引き延ばす部分は複合体を形成し得、ここでペプチド複合体が２個の半減期を引き延ばす部分部分を持つ一方で、二価の半減期を引き延ばす部分および一価のペプチドは、２個のペプチド実体が単一の半減期を引き延ばす部分と連結する種を産生し；より高次の原子価の半減期を引き延ばす部分を使用することによって、単一の半減期を引き延ばす部分に結合するペプチド実体のクラスターが形成される一方で、より高次の原子価のペプチドは、複数の半減期を引き延ばす部分部分で覆われる。更なる例として、多価の半減期を引き延ばす部分のＡＰＪアゴニストへの複合体化の部位がシステインまたは他のアミノチオールである場合、Ｄ’Ａｍｉｃｏらが開示した方法を用いてもよい（出願全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国第２００６／０１９９８１２号として公開された、Ｄ’Ａｍｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏｔｈｉｏｌ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ｖｅｈｉｃｌｅｓ，ｗｈｉｃｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｓ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｈｅｒｅｉｎ ｂｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｉｔｓ ｅｎｔｉｒｅｔｙ）。
ペプチド部分は、活性化した半減期を引き延ばす部分と反応する２個以上の反応性基を有し得るため、複合体構造を形成する可能性を常に考慮に入れる必要があり、半減期を引き延ばす部分とペプチドとの１：１付加物などの単純な構造を形成させたい場合、または二価の半減期を引き延ばす部分を使用してペプチド：半減期を引き延ばす部分：ペプチドの付加物を形成させたい場合には、記載の産生物の割合を形成させて、その後、記載の産生物を他の反応産生物から単離するために、活性化した半減期を引き延ばす部分とペプチド物質との所定の比率、その所定の濃度を使用すること、および所定の条件（期間、温度、ｐＨなど）下で反応を実施することが有益であろう。試薬の反応条件、割合、および濃度は、必要に応じて適切なスケールアップを用いた当業者の能力の範囲内である、比較的簡単な試行錯誤による実験によって得ることができる。産生物の精製および分離は、当業者に公知の従来技法によって同様に達成される。
加えて、ＡＰＪアゴニストに融合または複合体化した半減期を引き延ばす部分の生理学的に許容される塩もまた、この中に記載の種々の実施形態に包含される。
上記の半減期を引き延ばす部分および本明細書に記載の他の半減期を引き延ばす部分は、単独でも組み合わせでも有用であり、当技術分野において、例えば、共にその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ，米国第２００７／００７１７６４号、および国際公開第ＷＯ２００８／０８８４２２号として公開されたＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ，ＰＣＴ／米国第２００７／０２２８３１号中で、更に説明される通りである。種々の実施形態は、ペプチド類似体との併用による、本明細書に記載のものなどであるがこれに限定されない、薬学的に許容される半減期を引き延ばす部分の任意の１種の使用、または２個以上の同様のもしくは異なる半減期を引き延ばす部分の組み合わせの使用を包含する。
「リンカー」または「リンカー部分」は、本明細書に記載のポリペプチドおよび／または組成物中で任意である。存在する場合には、それは主にＡＰＪアゴニストのビヒクルへの共有結合の手段として働くため、その化学構造は重要ではない。リンカーは、例えば、チオエーテル、アミン、イミン、アミド、トリアゾール、ジスルフィド、または炭素間結合からなり得る。故に、種々の実施形態では、例えばチオエーテルは、ビヒクルをＡＰＪアゴニストに繋ぐことができる。
「リンカー」または「リンカー部分」は、リンカー部分が、ペプチド類似体または他のポリペプチド鎖を、組成物中の別のペプチドもしくはポリペプチド鎖、または半減期を引き延ばす部分に共有結合または複合体化させる、組成物に含有される、ＡＰＪアゴニストまたは他のポリペプチド鎖（例えば、免疫グロブリンＨＣもしくはＬＣまたは免疫グロブリンＦｃドメイン）のアミノ酸残基に共有結合する、生物学的に許容されるペプチジルまたは非ペプチジル有機基であることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の半減期を引き延ばす部分は、ＡＰＪアゴニストそれ自体のアミノ酸残基と、または任意にペプチド類似体のアミノ酸残基に共有結合するペプチジルもしくは非ペプチジルリンカー部分（芳香族またはアリールリンカーを含むがこれらに限定されない）と複合体化する、すなわち、直接的に共有結合する。一切のリンカー部分の存在は任意である。存在する場合には、それは、種々の実施形態において、１個の官能性部分の提示または位置を、分子の１個以上の他の官能性部分と関連して、位置付ける、結合する（ｊｏｉｎ）、接続する（ｃｏｎｎｅｃｔ）、または最適化するためのスペーサーとして主に働くため、その化学構造は重要ではない。
リンカー部分の存在は、いくつかの実施形態の薬理学的活性の最適化に有用であり得る。リンカーは、ペプチド結合によって共に連結したアミノ酸で構成されてもよい。存在する場合には、リンカー部分は独立して、組成物中に存在し得る任意の他のリンカーもしくは複数のリンカーと同一であるか、またはそれらとは異なり得る。上述の通り、存在する場合には（ペプチド類似体の第１級アミノ酸配列内にか、あるいは半減期を引き延ばす部分をペプチド類似体に結合させるためのリンカーとしてか）、リンカー部分は、「ペプチジル」の性質を有し得（すなわち、ペプチド結合によって共に連結したアミノ酸で構成される）、好ましくは長さにして１〜約４０個のアミノ酸残基、１〜約２０個のアミノ酸残基、または１〜約１０個のアミノ酸残基で構成され得る。リンカー中のアミノ酸残基は、２０個の標準アミノ酸の中からのもの、例えば、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、および／またはセリンである。種々の実施形態では、ペプチジルリンカーは、ペプチド結合によって連結した、グリシン、セリン、およびアラニンなどの、立体障害のないアミノ酸から大部分が構成され得る。存在する場合には、インビボでの循環にあるタンパク質分解の急速な代謝回転を回避するペプチジルリンカーを選択することが望ましいこともある。当業者であればよく理解しているように、これらのアミノ酸のうちの一部はグリコシル化されていてもよい。例えば、シアリル化部位を構成する有用なリンカー配列は、Ｘ１Ｘ２ＮＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号７６）であり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は各々独立して、任意のアミノ酸残基である。存在する場合には、ペプチジルリンカーは、インビトロおよび／もしくはインビボの急速なタンパク質分解代謝回転を回避するか、または減少させるように選択した、任意の非標準アミノ酸、または非標準および標準アミノ酸の組み合わせからなり得ることが望ましいこともある。
他の実施形態では、ペプチジルリンカー部分の１〜４０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択することができる。リンカーは、グリシンおよびアラニンなどの、立体障害のないアミノ酸から大部分が構成され得る。故に、リンカーとしては、ポリグリシン、ポリセリン、およびポリアラニン、またはこれらのうち任意のものの組み合わせが挙げられる。一部の例示的なペプチジルリンカーは、ポリ（Ｇｌｙ）１−８（配列番号７７）、特に（Ｇｌｙ）３（配列番号７８）、（Ｇｌｙ）４（配列番号７９）、（Ｇｌｙ）５（配列番号８０）、および（Ｇｌｙ）７（配列番号８１）、ならびに「Ｌ１５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号８３）などのＧｌｙＳｅｒおよびポリ（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ（配列番号８２）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）２−４（配列番号６２）、およびポリ（Ａｌａ）１−８（配列番号８４）である。ペプチジルリンカーの他の特定の例としては、（Ｇｌｙ）５Ｌｙｓ（配列番号８５）、および（Ｇｌｙ）５ＬｙｓＡｒｇ（配列番号８６）が挙げられる。有用なペプチジルリンカーの他の例は、有用なペプチジルリンカーの他の例は、
（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号８７）、
（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号８８）、
（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号８９）、
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号９０）である。
上の命名法を説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号９１）は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号９１）を意味する。ＧｌｙおよびＡｌａの他の組み合わせも有用である。
他のリンカーは、「Ｌ５」（ＧＧＧＧＳまたは「Ｇ４Ｓ」、配列番号９２）、「Ｌ１０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号９３）、「Ｌ２０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号９４）、「Ｌ２５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号９５）として本明細書で識別するもの、および下文の実施例中で使用する任意のリンカーである。
ペプチドリンカー部分を含むいくつかの実施形態では、酸性残基、例えば、グルタミン酸塩またはアスパラギン酸塩残基は、リンカー部分のアミノ酸配列中に置かれる。例としては、以下のペプチドリンカー配列が挙げられる。
ＧＧＥＧＧＧ（配列番号９６）、
ＧＧＥＥＥＧＧＧ（配列番号９７）、
ＧＥＥＥＧ（配列番号９８）、
ＧＥＥＥ（配列番号９９）、
ＧＧＤＧＧＧ（配列番号１００）、
ＧＧＤＤＤＧＧ（配列番号１０１）、
ＧＤＤＤＧ（配列番号１０２）、
ＧＤＤＤ（配列番号１０３）、
ＧＧＧＧＳＤＤＳＤＥＧＳＤＧＥＤＧＧＧＧＳ（配列番号１４１２）、
ＷＥＷＥＷ（配列番号１０４）、
ＦＥＦＥＦ（配列番号１０５）、
ＥＥＥＷＷＷ（配列番号１０６）、
ＥＥＥＦＦＦ（配列番号１０７）、
ＷＷＥＥＥＷＷ（配列番号１０８）、または
ＦＦＥＥＥＦＦ（配列番号１０９）。
他の実施形態では、リンカーは、リン酸化部位、例えば、Ｘ１Ｘ２ＹＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号１１０）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は各々独立して、任意のアミノ酸残基である）、Ｘ１Ｘ２ＳＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号１１１）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は各々独立して、任意のアミノ酸残基である）、またはＸ１Ｘ２ＴＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号１１２）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は各々独立して、任意のアミノ酸残基である）を構成する。
ここで示すリンカーは例示的であり、ペプチジルリンカーは、はるかに長くてもよく、他の残基を含んでもよい。ペプチジルリンカーは、例えば、システイン、別のチオール、または半減期を引き延ばす部分との複合体化のための求核試薬であり得る。別の実施形態では、リンカーは、マレイミド、ヨードアセタアミド（ｉｏｄｏａｃｅｔａａｍｉｄｅ）またはチオエステル、官能化された半減期を引き延ばす部分への複合体化のための、システインもしくはホモシステイン残基、または他の２−アミノ−エタンチオールもしくは３−アミノ−プロパンチオール部分を含有することができる。
別の有用なペプチジルリンカーは、無作為のＧｌｙ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列、例えば、約１ｋＤａのサイズのＰＥＧ分子であると推定される、ＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴＨ（配列番号１１３）またはＨＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴ（配列番号１１４）を含む、大きな可動性リンカーである。あるいは、有用なペプチジルリンカーは、強固なヘリックス構造を形成する、当技術分野で既知のアミノ酸配列（例えば、−ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧ（配列番号１１５）という強固なリンカー）からなってもよい。加えて、ペプチジルリンカーはまた、式−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−の６個の炭素の脂肪族分子などの非ペプチジルセグメントも含み得る。ペプチジルリンカーは、本明細書に記載のような誘導体を形成するよう改変することができる。
任意に、非ペプチジルリンカー部分はまた、半減期を引き延ばす部分を、半減期を引き延ばす部分に複合体化したペプチドのペプチド部分に複合体化するためにも有用である。例えば、式中、ｓ＝２〜２０である、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−などのアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどの任意の立体障害のない基によってさらに置換され得る。例示的な非ペプチジルリンカーはＰＥＧリンカー（例えば、以下に示すもの）である。
Figure 0006710253
 式中、ｎは、リンカーが約１００〜約５０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有するものである。
リンカーはまた、アミノヘンキサン酸などの非天然アミノ酸、またはコハク酸（ブタン二酸）などのジカルボヒリック酸などの有機基でもあり得る。
Figure 0006710253
Figure 0006710253
一実施形態では、非ペプチジルリンカーはアリールである。リンカーを改変して、本明細書に記載のものと同一の様式で誘導体を形成し得る。加えて、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧアルデヒドを使用する還元的アルキル化またはＰＥＧのヒドロキシスクシンイミドもしくは炭酸エステルを使用するアシル化のいずれかによって、あるいはチオ複合体化によって、Ｎ末端アミンまたは選択した側鎖アミンに結合し得る。
「アリール」は、フェニル、または飽和、部分的飽和、もしくは不飽和の３、４、もしくは５員の炭素橋と隣接融合するフェニルであり、フェニルまたは橋は、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、またはハロから選択される、０、１、２、または３個の置換基によって置換される。「ヘテロアリール」は、不飽和の５、６、もしくは７員の単環式環、または部分的飽和もしくは不飽和の６、７、８、９、１０、もしくは１１員の二環式環であり、少なくとも１個の環は不飽和であり、単環式環および二環式環は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される、１、２、３、または４個の原子を含有し、その環は、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、およびハロから選択される、０、１、２、または３個の置換基で置換される。非ペプチジルリンカーまたは非ペプチドの半減期を引き延ばす部分などの非ペプチド部分は、従来の有機化学反応によって合成することができる。
上記は、種々の実施形態に従って任意に採用することができるリンカーの種類の網羅的な扱いではなく、単に例証目的である。
種々の実施形態はまた、疾患、障害、もしくは他の医学的症状、例えば、心臓障害の治療または予防のための薬剤の製造における、記載の組成物のうちの１個以上の使用に関連する。心臓障害は、例えば、心臓の収縮性または他の心臓機能に影響するいかなる疾患をも含み得る。加えて、種々の実施形態は、心疾患、例えば、肥大、高血圧、心不全、鬱血性心不全、または心筋症のいかなる形態にも関連する。心不全は、鬱血性心不全であり得る。他の実施形態は、肺動脈高血圧、癌、糖尿病、肥満、転移性疾患、およびＨＩＶを含む、高血圧に起因する心臓の障害を治療するための、本明細書に記載のＡＰＪアゴニストの使用に関係する。他の実施形態は、脂質およびグルコース代謝と関連付けられる障害の治療、ＧＩ管の調節および機能と関連付けられる障害の治療、ＨＩＶ細胞侵入に対する保護、ならびに細胞アポトーシスからの保護などであるがこれらに限定されない、種々の他の障害または疾患の治療および予防のための、ＡＰＪアゴニストの使用に関係する。
薬学的組成物は、多種多様な送達経路、例えば、注射もしくは点滴などによる血管内送達経路、皮下（「ｓ．ｃ．」）、静脈内（「ｉ．ｖ．」）、筋肉内、腹腔内（「ｉ．ｐ．」）、硬膜外、または髄腔内送達経路による患者への投与に対して、あるいは経口、経腸、肺内（例えば、吸入）、鼻腔内、経粘膜（例えば、舌下投与）、経皮、もしくは他の送達経路、および／または当技術分野で既知の投与形態に対して、構成することができる。ＡＰＪアゴニストを含有する薬物または薬学的組成物の送達は、最も正確な投薬および最も安定した血漿曝露レベルを達成するために、充填済みシリンジを使用する自己投与であるか、もしくは病院内であるかに関わらず、標準的な注射法を介して、または、自動注射器、パッチポンプ、もしくは大容量注射器などの送達ポンプを介しても、行われ得る。薬学的組成物は、液体形態で調製するか、または凍結乾燥形態などの乾燥粉末形態、もしくは結晶形態であってもよい。経口または経腸使用のためには、薬学的組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬もしくは軟カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤、または経腸製剤として構成することができる。
概して、種々の実施形態は、ＡＰＪアゴニストおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。そのような薬学的組成物は、多種多様な送達経路、例えば、注射もしくは点滴などによる血管内送達経路、皮下、筋肉内、腹腔内、硬膜外、または髄腔内送達経路による患者への投与に対して、あるいは経口、経腸、肺内（例えば、吸入）、鼻腔内、経粘膜（例えば、舌下投与）、経皮、もしくは他の送達経路、および／または当技術分野で既知の投与形態に対して、構成することができる。薬学的組成物は、液体形態で調製するか、または凍結乾燥形態などの乾燥粉末形態であってもよい。経口または経腸使用のためには、薬学的組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬もしくは軟カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤、または経腸製剤として構成することができる。
増進された薬学的特性は、改善した薬物動態、薬力学、および／または薬物有効性に対する改善した投与回数、例えば、数時間おきではない投与回数を持つ分子を指し得る。
実践では、「薬学的に許容される担体」は、任意の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、分散剤、結合剤、充填剤、流動促進剤、減摩剤、圧縮補助剤、錠剤崩壊剤（ｔａｂｌｅｔ−ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ））、懸濁剤、滑沢剤、香味剤、付臭剤、甘味料、透過および浸透促進剤、防腐剤、界面活性剤、可溶化剤、乳化剤、増粘剤、補助剤、染料、コーティング、カプセル化材料（複数可）、ならびに／または単独もしくは組み合わせでの他の添加剤を含む、薬学的組成物の製剤化に有用な、当業者に既知である任意の生理学的に認められる物質であり得る。そのような薬学的組成物としては、種々の緩衝液内容物（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ、およびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）などの添加剤；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）；防腐剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ（登録商標）、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの高分子化合物の微粒子調製物へのまたはリポソームへの物質の組み込みが挙げられる。ヒアルロン酸を使用することもでき、これは、循環の持続期間を促進する効果を有し得る。そのような組成物は、本タンパク質および誘導体の、物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響し得る。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４２）ｐａｇｅｓ １４３５−１７１２を参照されたい。組成物は、液体形態で調製するか、または凍結乾燥形態などの乾燥粉末であることができる。埋め込み型持続放出製剤もまた有用であり、経皮または経粘膜製剤も同様である。加えて（またはあるいは）、種々の実施形態は、当業者に既知である種々の遅延もしくは持続放出製剤または微粒子製剤のうちの任意のもの、例えば、肺内、鼻腔内、または皮下送達経路を介して投与することができる持続放出微粒子製剤における使用のための組成物を提供する。（例えば、Ｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ，米国特許第６，８８７，４８７号、Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｉｎ ａｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｏｗｄｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ，米国特許第５，７７０，５５９号および同第５，９８１，４７４号、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｍｉｎｅｒａｌ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，米国特許第５，００２，９３６号、Ｇｅｎ，Ｆｏｒｍａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ，米国第２００２／０１１９９４６ Ａ１号、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，国際公開第ＷＯ２００５／１０５０５７ Ａ１号を参照されたい）。
不活性物質を用いて、組成物を希釈するか、または薬学的組成物の体積を増加させることができる。そのような希釈剤としては、炭水化物、特に、マンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストラン、およびデンプンが挙げられる。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、および塩化ナトリウムを含むある特定の無機塩類も、充填剤として使用することができる。一部の市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ １５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ、およびＡｖｉｃｅｌｌである。
アルギン酸塩、キサンタンゴム、またはペトロラタムなどであるがこれらに限定されない多様な従来の増粘剤は、薬学的組成物のクリーム、軟膏、座薬、およびゲル構成において有用であり、薬学的組成物の種々の構成において用いることもできる。
種々の実施形態では、滅菌溶液または懸濁液である液体薬学的組成物は、注射、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、血管内（例えば、静脈内または動脈内）、腹腔内、または皮下注射で、患者に投与することができる。（例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，米国特許第６，２４５，７４０号および国際公開第ＷＯ００／３８６５２ Ａ１号を参照されたい）。滅菌溶液は、静脈内点滴によっても投与することができる。組成物は、滅菌水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、または他の適切な滅菌注射用媒体を使用して、患者への投与前の都合の良い時間に溶解または懸濁することができる、凍結乾燥粉末などの滅菌固形薬学的組成物中に含むことができる。
埋め込み型持続放出製剤もまた、本薬学的組成物の有用な実施形態である。例えば、ヒトまたは非ヒト脊椎動物の体内または皮下に埋め込まれる生分解性マトリックスである薬学的に許容される担体は、上記のものに類似したヒドロゲルであり得る。あるいは、ポリアルファアミノ酸成分から形成されてもよい。（Ｓｉｄｍａｎ，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ，ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｄｅｖｉｃｅ，ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｉｎｇ ｓａｍｅ，米国特許第４，３５１，３３７号）。薬物の送達のための移植物を作製するための他の技法も、既知かつ有用である。
粉末形態では、薬学的に許容される担体は、本化合物を含む、微粉化活性成分（複数可）との混合にある微粉化固体である。例えば、いくつかの実施形態では、粉末形態は、薬学的組成物を吸入剤として構成する場合に有用である。（例えば、Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，国際公開第ＷＯ２００４／０１７９１８号、Ｔｒｕｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓａｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＧＲＰ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ＢＩＢＮ４０９６ ａｎｄ ｉｎｈａｌａｂｌｅ ｐｏｗｄｅｒｅｄ ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅｍ，米国特許第６，９００，３１７号を参照されたい）。
不活性物質を用いて、化合物を希釈するか、または化合物の体積を増加させることができる。これらの希釈剤としては、炭水化物、特に、マンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストラン、およびデンプンが挙げられる。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、および塩化ナトリウムを含むある特定の無機塩類も、充填剤として使用することができる。一部の市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ（商標）、Ｅｍｄｅｘ（商標）、ＳＴＡ−Ｒｘ（商標）１５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ（商標）、およびＡｖｉｃｅｌｌ（商標）である。
治療薬をまとめて、硬質錠剤を形成し、アラビアゴム、トラガカントゴム、デンプン、およびゼラチンなどの天然産物由来の物質を含めるために、結合剤を使用することができる。他のものとしては、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は共に、治療薬を粒状にするためにアルコール溶液中で使用し得る。減摩剤を治療薬中に含めて、製剤プロセス中の付着を防止することができる。潤滑剤は、治療薬とダイ壁との間の層として使用することができ、これらとしては、ステアリン酸（そのマグネシウムおよびカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油、およびワックスが挙げられるがこれらに限定されない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ ４０００および６０００などの可溶性潤滑剤も使用することができる。
経口剤形も、種々の実施形態において有用である。必要であれば、組成物を化学的に修飾して、経口送達が有効であるようにし得る。概して、企図される化学的修飾は、少なくとも１個の部分の分子それ自体への結合であり、該部分は、（ａ）たんぱく質分解の阻害、および（ｂ）胃または腸から血流への取り込みを可能にする。化合物の全体的な安定性の増加、および体内の循環時間の増加も所望される。共有結合した半減期を引き延ばす部分として有用な部分は、この目的のためにも使用することができる。そのような部分の例としては、ＰＥＧ、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ならびにポリプロリンが挙げられる。例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ（１９８１），Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ Ａｄｄｕｃｔｓ，Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ（Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ３６７−８３、Ｎｅｗｍａｒｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８２），Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−９を参照されたい。使用し得る他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）である。上に示したとおり、薬学的用途に好ましいものは、ＰＥＧ部分である。
経口送達剤形については、治療用化合物の吸収を増進するための担体として、Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）などの修飾脂肪族アミノ酸の塩を使用することも可能である。ＳＮＡＣを使用するヘパリン製剤の臨床的有効性は、Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが実施した第ＩＩ相試験で実証されている。米国特許第５，７９２，４５１号「Ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ」を参照されたい。
一実施形態では、薬学的に許容される担体は液体であることができ、薬学的組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、または加圧組成物の形態で調製される。活性成分（複数可）（例えば、本組成物）は、水、有機溶媒、その両方の混合物、または薬学的に許容される油もしくは脂肪などの、薬学的に許容される液体担体中に溶解、希釈、または懸濁することができる。液体担体は、界面活性剤および／もしくは可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）、乳化剤、適切なｐＨの緩衝液（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、補助剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）、甘味料、香味剤、懸濁剤、増粘剤、増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）、着色料、粘性調節剤、安定剤、電解質、オスモリュート（ｏｓｍｏｌｕｔｅ）、または浸透圧調節剤などの、他の好適な薬学的添加物を含有し得る。添加剤はまた、組成物の取り込みを増進するためにも製剤に含むことができる。この特性を有する可能性がある添加物は、例えば、脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。
その全体が参照により本明細書に組み込まれる、上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）の８９章に概して記載される経口固形剤形も、有用である。固形剤形としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤もしくは舐剤、カシェ剤、またはペレット剤が挙げられる。また、リポソームまたはプロテノイドカプセル化を使用して、本組成物を製剤化することもできる（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号で報告されたプロテノイドミクロスフェアとして）。リポソームカプセル化を使用することができ、リポソームは、種々のポリマーによって誘導体化することができる（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。有力な治療薬のための固形剤形の説明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇ．Ｓ．ＢａｎｋｅｒおよびＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ編集の、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（１９７９）、１０章で付与される。概して、製剤は、化合物、および胃環境に対する保護を可能にする不活性成分を含み、腸内で生物学的に活性な物質を放出する。
錠剤形態では、活性成分（複数可）は、好適な割合で必要な圧縮特性を有する薬学的に許容される担体と混合され、所望の形状およびサイズに固められる。
粉末剤および錠剤は、最大９９％の活性成分（複数可）を含有し得る。好適な固形担体としては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、糖類、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス、およびイオン交換樹脂が挙げられる。
放出制御製剤が望ましいことがある。種々の実施形態では、組成物は、拡散または浸出機構のいずれかによって放出を可能にする不活性マトリックス、例えばゴム中に組み込むことができる。ゆっくりと変性するマトリックス、例えば、アルギン酸塩、多糖類も、製剤中に組み込むことができる。組成物の放出制御の別の形態は、Ｏｒｏｓ（商標）治療体系（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）、すなわち、薬物が、浸透圧効果により、水を侵入させ薬物を１つの小型の開口部を通して押し出す半透膜中に封入されることに基づく方法による。一部の腸溶性コーティングも、放出遅延効果を有する。
組成物の肺送達も有用であり得る。タンパク質（または誘導体）は、吸入中に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮層を横切って血流に移動する。（この他の報告書としては、Ａｄｊｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．（１９９０）７：５６５−９、Ａｄｊｅｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ６３：１３５−４４（酢酸ロイプロリド）、Ｂｒａｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３（ｓｕｐｐｌ．５）：ｓ．１４３−１４６（エンドセリン−１）、Ｈｕｂｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ａｎｎａｌｓ Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．３：２０６−１２（α１−アンチトリプシン）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−６（α１−プロテイナーゼ）、Ｏｓｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｒｃｈ １９９０），”Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｓｐ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ（組み換えヒト成長ホルモン）、Ｄｅｂｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２−８（インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α）、およびＰｌａｔｚ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）が挙げられる）。
症状の治療方法に含まれる投与計画は、薬物作用を修正する種々の要因、例えば、患者の年齢、症状、体重、性別、および食生活、一切の感染の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的要因を考慮して担当医によって決定されるであろう。概して、毎日の処方は、体重１キログラム当たり０．１〜１０００マイクログラム、好ましくは、１キログラム当たり０．１〜１５０マイクログラムの範囲内の化合物であるべきである。
更なる例示として、以下の番号付けした実施形態を提示する。
１．野生型アペリン−１３（配列番号２）と比較して増加した安定性を有するＡＰＪアゴニストであって、アゴニストが、アゴニストのＮ末端またはＣ末端または他の残基で半減期を延長する基によって修飾され、かつ少なくとも１個のアミノ酸が、非標準アミノ酸によって置換される、ＡＰＪアゴニスト。
種々の実施形態では、実施形態１のＡＰＪアゴニストは、半減期を延長する基（例えば、ＰＥＧまたはＦｃ）を有しない場合があるが、それでも増加した安定性および少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、もしくは８個の非標準アミノ酸置換またはアペリン−１３に付加されたアミノ酸を有する。
２．半減期を延長する基が、ＰＥＧ、Ｆｃドメイン、ＩｇＧ、ＨＳＡ、ＰＥ、Ａｂ、ペプチド、脂質、ポリ（Ｏ−２−ヒドロキシエチル）デンプン（ＨＥＳ）、およびナノ構造体からなる群から選択される、実施例１に記載のＡＰＪアゴニスト。
３．アゴニストが、Ｎ末端でピログルタミン酸化され、かつ任意に、アゴニスト中の他の場所でＰＥＧ化される、実施形態１に記載のＡＰＪアゴニスト。
４．少なくとも２個のアミノ酸残基が、非標準アミノ酸によって置換される、実施形態１に記載のＡＰＪアゴニスト。
５．少なくとも２個のアミノ酸残基が、３個、４個、または５個のアミノ酸残基である、実施形態４に記載のＡＰＪアゴニスト。
６．増加した安定性が、増加したインビトロ半減期である、実施形態１に記載のＡＰＪアゴニスト。
７．ＡＰＪ受容体に結合する、実施形態１に記載のＡＰＪアゴニスト。
８．アゴニストが、チオプロピオニル（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）、Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）、ＮＰｅｇ１１、またはＡｔｚ（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）によってＰＥＧ化される、実施形態１に記載のＡＰＪアゴニスト。
９．野生型アペリン−１３（配列番号２）と比較して増加した効力を有するＡＰＪアゴニストであって、アゴニストが、アゴニストのＮ末端、Ｃ末端、または他の場所で、半減期を延長する基によって修飾され、かつ少なくとも１個のアミノ酸が、非標準アミノ酸によって置換される、ＡＰＪアゴニスト。
１０．半減期を延長する基が、ＰＥＧ、Ｆｃドメイン、ＩｇＧ、ＨＡＳ、ＰＥ、Ａｂ、ペプチド、脂質、ポリ（Ｏ−２−ヒドロキシエチル）デンプン（ＨＥＳ）、およびナノ構造体からなる群から選択される、実施形態９に記載のアゴニスト。
１１．少なくとも２個のアミノ酸残基が、非標準アミノ酸によって置換される、実施形態９に記載のＡＰＪアゴニスト。
１２．少なくとも２個のアミノ酸残基が、３個、４個、または５個のアミノ酸残基である、実施形態１１に記載のＡＰＪアゴニスト。
１３．ＡＰＪ受容体に結合する、実施形態９に記載のＡＰＪアゴニスト。
１４．アゴニストが、チオプロピオニル（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）、Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）、ＮＰｅｇ１１、またはＡｔｚ（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）によってＰＥＧ化される、実施形態９に記載のＡＰＪアゴニスト。
１５．アミノ酸配列［ｚ］ＫＦＲＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＫＧＸ４［Ｎｌｅ］ＰＸ５（配列番号１１６）を含む単離ポリペプチドであって、
ａ．式中、ｚが、リンカーを介して結合した、ＰＥ、ＰＥＧ、もしくは半減期を延長する誘導体であるか、または誘導体が、リンカーによらずに結合してもよく、
ｂ．Ｘ１が、［Ｃｈａ］または［ＮＭｅＬｅｕ］であり、
ｃ．Ｘ２が、ＰＥＧまたは半減期を延長する誘導体を伴うまたは伴わないＳであり、誘導体が、リンカーによってまたはリンカーによらずに結合し、
ｄ．Ｘ３が、ＰＥＧまたは半減期を延長する誘導体を伴うまたは伴わないＨであり、誘導体が、リンカーによってまたはリンカーによらずに結合し、
ｅ．Ｘ４が、Ｐもしくは［Ｏｉｃ］、または他の第２級アミノ酸であり、
ｆ．Ｘ５が、Ｆ、［４−Ｃｌ−Ｆ］、脂肪族もしくは芳香族アミノ酸であるか、または不在である、単離ポリペプチド。
１６．ｚがＰＥまたはＰＥＧであるアミノ酸配列［ｚ］ＫＦＲＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号１１７）を含む、実施形態１５に記載の単離ポリペプチド。
１７．ｚがチオプロピオニル（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）である、実施形態１５に記載の単離ポリペプチド。
１８．アミノ酸配列［ｚ］ＲＰ［ｈＡｒｇ］Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＫＧＸ４［Ｎｌｅ］ＰＸ５（配列番号１１８）を含む単離ポリペプチドであって、
ａ）ｚが、リンカーを介して結合した、Ｑ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ａ、［ＰＥ］、ＰＥＧ、もしくは半減期を延長する誘導体であるか、または誘導体が、リンカーによらずに結合してもよく、
ｂ）Ｘ１が、非標準アミノ酸［Ｃｈａ］、［ＮＭｅＬｅｕ］、もしくはリンカーを介して結合した半減期を延長する誘導体であるか、または誘導体が、リンカーによらずに結合してもよく、
ｃ）Ｘ２が、Ｓであるか、もしくはリンカーを介して結合したＰＥＧ誘導体を有し得るか、または誘導体が、リンカーによらずに結合してもよく、
ｄ）Ｘ３が、Ｈであるか、またはリンカーを介して結合したＰＥＧもしくは半減期を延長する誘導体を有してもよく、あるいは誘導体が、リンカーによらずに結合してもよく、
ｅ）Ｘ４が、Ｐ、［Ｏｉｃ］、または他の第２級アミノ酸であり、
ｆ）Ｘ５が、Ｆ、［４−Ｃｌ−Ｆ］、他の脂肪族もしくは芳香族アミノ酸であるか、または不在である、単離ポリペプチド。
１９．ｚがＰＥである、実施形態１８に記載の単離ポリペプチド。
２０．アミノ酸配列［ｚ］Ｘ２ＲＰ［ｈＡｒｇ］Ｘ１Ｘ３Ｘ４ＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４Ｃｌ−Ｆ］（配列番号１１９）を含む単離ポリペプチドであって、式中、
ａ）ｚが、リンカーを介して結合した、ＰＥ、ＰＥＧ、もしくは半減期を延長する誘導体であるか、または誘導体が、リンカーによらずに結合してもよく、
ｂ）Ｘ１が、非標準アミノ酸［Ｃｈａ］または［ＮＭｅＬｅｕ］であり、［ＣｈａまたはＮＭｅＬｅｕ］が、リンカーを介して結合したＰＥＧ誘導体を有する場合も、有しない場合もあるか、または誘導体が、リンカーによらずに結合してもよく、
ｃ）Ｘ２が、Ｌであるか、またはアミノ酸不在であり、Ｌが、リンカーを介して結合したＰＥＧ誘導体、またはリンカーによらずに結合し得る誘導体を有する場合も、有しない場合もあり、
ｄ）Ｘ３が、Ｓであるか、またはリンカーを介して結合した任意のＰＥＧもしくは半減期を延長する誘導体であるか、あるいはＰＥＧ誘導体がリンカーによらずに結合してもよく、
ｅ）Ｘ４が、Ｈであるか、またはリンカーを介して結合した任意のＰＥＧもしくは半減期を延長する誘導体であるか、あるいはＰＥＧ誘導体がリンカーによらずに結合してもよい、単離ポリペプチド。
２１．アミノ酸配列
［ｚ］ＬＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｘ１］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４Ｃｌ−Ｆ］（配列番号６３）を含み、式中、
ａ）ｚが、リンカーを介して結合した、ＰＥＧもしくは半減期を延長する誘導体であるか、または誘導体がリンカーによらずに結合してもよく、
ｂ）Ｘ１が、非標準アミノ酸［Ｃｈａ］または［ＮＭｅＬｅｕ］であり、
ｃ）Ｓが、リンカーを介して結合したＰＥＧ誘導体を有する場合も、有しない場合もあり、または誘導体が、リンカーによらずに結合してもよい、単離ポリペプチド。
２２．アミノ酸配列
ｚＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｐ［ｈＡｒｇ］Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＫＧＸ１０［Ｎｌｅ］ＰＸ１１（配列番号１２０）を含み、
ａ）ｚが、リンカーを介して結合した、ＰＥＧもしくは半減期を延長する誘導体であるか、または誘導体が、リンカーによらずに結合してもよく、
ｂ）Ｘ１が、非標準アミノ酸［Ｃｈａ］または［ＮＭｅＬｅｕ］であり、
ｃ）Ｘ２が、Ｓであるか、またはリンカーを介して結合したＰＥＧもしくは半減期を延長する誘導体を有し得るか、あるいは誘導体が、リンカーによらずに結合してもよく、
ｄ）Ｘ３が、Ｈであるか、またはリンカーを介して結合したＰＥＧもしくは半減期を延長する誘導体を有し得るか、あるいは誘導体が、リンカーによらずに結合してもよく、
ｅ）Ｘ４が、Ｋ、［Ｏｒｎ］であるか、またはアミノ酸不在であり、
ｆ）Ｘ５が、Ｆ、芳香族アミノ酸であるか、またはアミノ酸不在であり、
ｇ）Ｘ６が、Ｒ、Ｋ、Ｑ、［ｈＡｒｇ］、［ＮＭｅ−Ａｒｇ］、［Ｃｉｔ］であるか、またはアミノ酸不在であり、
ｈ）Ｘ７が、Ｒ、Ｋ、Ｑ、［ｈＡｒｇ］、［ＮＭｅ−Ａｒｇ］、［Ｃｉｔ］であるか、またはアミノ酸不在であり、
ｉ）Ｘ８が、Ｑ、Ｉ、Ｖ、［Ｎｌｅ］、［Ｎｖａ］、またはＬであり、
ｊ）Ｘ９が、Ｒ、Ｋ、Ｑ、［ｈＡｒｇ］、［ＮＭｅ−Ａｒｇ］、［Ｃｉｔ］であるか、またはアミノ酸不在であり、
ｋ）Ｘ１０が、Ｐ、［Ｏｉｃ］、または他の第２級アミノ酸であり、
ｌ）Ｘ１１が、Ｌ光学配置もしくはＤ光学配置のいずれかにある、Ｆ、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｉ−Ｆ］、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［Ｂｉｐ］、［Ｄｉｐ］、［Ｔｉｃ］、またはＬ光学配置もしくはＤ光学配置のいずれかにある他の芳香族アミノ酸である、単離ポリペプチド。
２３．アミノ酸配列
ｚＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７（配列番号１２１）を含み、
ａ）ｚが、循環半減期を引き延ばすためのＰＥＧまたは他の部分であり、
ｂ）Ｘ１が、Ｋ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４Ｐａｌ］、［Ｏｒｎ］、［Ｄｐｒ］、［Ｄａｂ］であるか、アミノ酸不在であるか、または循環半減期を引き延ばすためのＰＥＧもしくは他の部分であり、
ｃ）Ｘ２が、Ｆ、Ｙ、Ｗであるか、アミノ酸不在であるか、または循環半減期を引き延ばすためのＰＥＧもしくは他の部分であり、
ｄ）Ｘ３が、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ａ、Ｐ、Ｓ、Ｌ、Ｉ、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４Ｐａｌ］、［Ｏｒｎ］、［Ｄｐｒ］、［Ｄａｂ］、［ｈＡｒｇ］、［ＮＭｅ−Ａｒｇ］、［Ｃｉｔ］であるか、アミノ酸不在であるか、または循環半減期を引き延ばすためのＰＥＧもしくは他の部分であり、
ｅ）Ｘ４が、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ａ、Ｐ、Ｓ、Ｌ、Ｉ、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４Ｐａｌ］、［Ｏｒｎ］、［Ｄｐｒ］、［Ｄａｂ］、［ｈＡｒｇ］、［ＮＭｅ−Ａｒｇ］、［Ｃｉｔ］であるか、アミノ酸不在であるか、または循環半減期を引き延ばすためのＰＥＧもしくは他の部分であり、
ｆ）Ｘ５が、Ｑ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ａ、［ＰＥ］であるか、アミノ酸不在であるか、または循環半減期を引き延ばすためのＰＥＧもしくは他の部分であり、
ｇ）Ｘ６が、Ｒ、Ｋ、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４Ｐａｌ］、［Ｏｒｎ］、［Ｄｐｒ］、［Ｄａｂ］、［ｈＡｒｇ］、［ＮＭｅ−Ａｒｇ］、または［Ｃｉｔ］であり、
ｈ）Ｘ７が、Ｐ、Ｇ、［Ｏｉｃ］、または他の第２級アミノ酸であり、
ｉ）Ｘ８が、Ｒ、Ｋ、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４Ｐａｌ］、［Ｏｒｎ］、［Ｄｐｒ］、［Ｄａｂ］、［ｈＡｒｇ］、［ＮＭｅ−Ａｒｇ］、または［Ｃｉｔ］であり、
ｊ）Ｘ９が、非標準アミノ酸［Ｃｈａ］または［ＮＭｅＬｅｕ］であり、
ｋ）Ｘ１０が、Ｓであるか、あるいは、リンカーを介して結合した循環半減期を引き延ばすためのＰＥＧもしくは他の部分、またはリンカーによらずに結合し得る部分であり、
ｌ）Ｘ１１が、Ｈであるか、あるいは、リンカーを介して結合した循環半減期を引き延ばすためのＰＥＧもしくは他の部分、またはリンカーによらずに結合し得る部分であり、
ｍ）Ｘ１２が、Ｋ、別の塩基性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、または芳香族アミノ酸であり、
ｎ）Ｘ１３が、Ｇ、Ａ、またはＰであり、
ｏ）Ｘ１４が、Ｐ、［Ｏｉｃ］、［ｈＰｒｏ］、［Ｔｉｃ］、［Ｔｉｑ］、または他の第２級アミノ酸であり、
ｐ）Ｘ１５が、Ｍ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、［Ｎｌｅ］、［Ｃｈａ］、または他の脂肪族アミノ酸であり、
ｑ）Ｘ１６が、Ｐ、［Ｏｉｃ］、［ｈＰｒｏ］、［Ｔｉｃ］、［Ｔｉｑ］、または任意の他の脂肪族もしくは芳香族アミノ酸であり、
ｒ）Ｘ１７が、Ｌ光学配置もしくはＤ光学配置のいずれかにある、Ｆ、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｉ−Ｆ］、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［Ｂｉｐ］、［Ｄｉｐ］、［Ｔｉｃ］、またはＬ光学配置もしくはＤ光学配置のいずれかにある他の芳香族アミノ酸であるか、あるいは不在である、単離ポリペプチド。
２４．Ｌ、Ｒ、Ｐ、［ｈＡｒｇ］、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｇ、または［４Ｃｌ−Ｆ］が、対応するアミノメチルアミノ酸、アルファメチルアミノ酸によって置換されるか、またはＳ−Ｈ、Ｈ−Ｋ、もしくはＧ−［Ｏｉｃ］のアミド結合が、アミド結合代用物によって置換される、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
２５．ＰＥＧが、チオプロピオニル（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）、Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）、ＮＰｅｇ１１、またはＡｔｚ（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）である、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
２６．配列番号１の少なくとも１３個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドであって、
ａ）ポリペプチドのＮまたはＣ末端でＰＥＧ誘導体を含み、
ｂ）配列番号１の残基６８であろうところでｈＡｒｇを含み、
ｃ）配列番号１の残基６９であろうところでＣｈａを含み、
ｄ）配列番号１の残基番号７４であろうところでＯｉｃを含み、
ｅ）配列番号１の残基番号７５であろうところでＮｌｅを含み、
ｆ）配列番号１の残基番号７７であろうところでＯｉｃを含む、単離ポリペプチド。
２７．ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸番号６５〜７７を少なくとも含む、実施形態２６に記載の単離ポリペプチド。
２８．少なくともアミノ酸番号６４〜７７、６３〜７７、６２〜７７、６１〜７７、６０〜７７、５９〜７７、５８〜７７、６５〜７８、６５〜７９、６５〜８０、および６５〜８１からなる群から選択される、実施形態２６に記載の単離ポリペプチド。
２９．配列
［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＸＸＸＸ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］（配列番号６４）を少なくとも含み、配列中、Ｘが、任意のアミノ酸であり、ポリペプチドが、ポリペプチドのＮまたはＣ末端でＰＥＧ誘導体またはＰＥを含有する、単離ポリペプチド。
３０．ポリペプチドが、配列［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号６５）を含む、実施形態２９に記載の単離ポリペプチド。
３１．ポリペプチドが、少なくとも１３個の残基を含む、実施形態２９に記載の単離ポリペプチド。
３２．単離ポリペプチドであって、
ａ．［ＰＥ］ＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］
Figure 0006710253
 ＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号３）、
ｂ．［ＰＥ］ＲＰ［ｈＡｒｇ］［ＮＭｅＬｅｕ］
Figure 0006710253
 ＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号４）、
ｃ．［ＰＥ］ＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］Ｓ
Figure 0006710253
 ＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号５）、
ｄ．［ＰＥ］ＲＰ［ｈＡｒｇ］［ＮＭｅＬｅｕ］Ｓ
Figure 0006710253
 ＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号６）、
ｅ．⇔ＬＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］
Figure 0006710253
 ＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号７）、
ｆ．⇔ＬＲＰ［ｈＡｒｇ］［ＮＭｅＬｅｕ］
Figure 0006710253
 ＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号８）、
ｇ．⇔ＬＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］Ｓ
Figure 0006710253
 ＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号９）、
ｈ．⇔ＬＲＰ［ｈＡｒｇ］［ＮＭｅＬｅｕ］Ｓ
Figure 0006710253
 ＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号１０）、
ｉ．⇔ＫＦＲＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号１１）、
ｊ．⇔ＫＦＲＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［ＮＭｅＬｅｕ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号１２）、
ｋ．⇔ＦＲＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号１３）、
ｌ．⇔ＦＲＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［ＮＭｅＬｅｕ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号１４）、
ｍ．⇔ＲＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号１５）、
ｎ．⇔ＲＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［ＮＭｅＬｅｕ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号１６）、
ｏ．⇔ＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号１７）、
ｐ．⇔ＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［ＮＭｅＬｅｕ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号１８）、
ｑ．⇔ＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［ＮＭｅＬｅｕ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号１９）、
ｒ．⇔ＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号２０）、
ｓ．⇔ＬＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号２１）、および
ｔ．⇔ＬＲＰ［ｈＡｒｇ］［ＮＭｅＬｅｕ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号２２）、
からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有し、配列中、ＰＥがピログルタミン酸塩であり、「⇔」または「
Figure 0006710253
 」が、任意のＰＥＧまたは他の半減期を延長する誘導体であってもよい、単離ポリペプチド。
３３．ＰＥＧ誘導体が、チオプロピオニル（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）、Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）、ＮＰｅｇ１１、またはＡｔｚ（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）である、実施形態３２に記載の単離ポリペプチド。
３４．単離ポリペプチドであって、
ａ．［ＰＥ］ＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］ＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号２３）、
ｂ．チオプロピオニル（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）−ＫＦＲＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号２４）、
ｃ．Ａｔｚ（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）−ＫＦＲＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号２５）、
ｄ．チオプロピオニル（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）−ＬＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号２６）、
ｅ．Ａｔｚ（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）−ＬＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号２７）、および
ｆ．ＮＰｅｇ１１−ＫＦＲＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］（配列番号２８）、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
配列中、ＰＥがピログルタミン酸塩である、単離ポリペプチド。
３５．式
ｚｘ１ｘ２ｘ３ｘ４ｘ５ｘ６ｘ７ｘ８ｘ９ｘ１０ｘ１１ｘ１２ｘ１３ｘ１４ｘ１５ｘ１６ｘ１７（配列番号６６）を有し、
式中、
ｚが、アミノ酸、ポリペプチド、または結合リンカーであり、
ｘ１〜ｘ４が、不在であるか、アミノ酸であるか、または結合リンカーであり、
ｘ５が、不在であるか、非官能性、疎水性、極性アミノ酸であるか、または結合リンカーであり、
ｘ６が、不在であるか、または極性もしくは塩基性アミノ酸であり、
ｘ７、ｘ９、およびｘ１６が、非官能性または疎水性アミノ酸であり、
ｘ８が、塩基性または極性アミノ酸であり、
ｘ１０が、非官能性、極性、もしくは疎水性残基であるか、または結合リンカーであり、
ｘ１１が、非官能性、極性、塩基性、もしくは疎水性残基であるか、または結合リンカーであり、
ｘ１２が、非官能性、疎水性、極性、または塩基性残基であり、
ｘ１３が、非官能性または芳香族残基であり、
ｘ１４が、非官能性または親水性残基であり、
ｘ１５が、非官能性、極性、または疎水性残基であり、
ｘ１７が、不在であるか、または疎水性残基である、単離ポリペプチド。
３６．式
Ｖ−（Ａ）を有し、
式中、
Ｖがビヒクルであり、
Ａが、−（Ｌ１）ａ−Ｐ１、−（Ｌ１）ａ−Ｐ１−（Ｌ２）ａ−Ｐ２、−（Ｌ１）ａ−Ｐ１−（Ｌ２）ａ−Ｐ２−（Ｌ３）ａ−Ｐ３、−（Ｌ１）ａ−Ｐ１−（Ｌ２）ａ−Ｐ２−（Ｌ３）ａ−Ｐ３−（Ｌ４）ａ−Ｐ４、またはそれらのより高次の多量体であり、式中、
ａが、１または０であり、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４が各々独立して、同一のまたは異なるＡＰＪアゴニストポリペプチドであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４が各々独立して、リンカーである、組成物。
３７．ビヒクルが、ＰＥＧまたはピログルタミン酸塩である、実施形態３６に記載の組成物。
３８．Ｖが、ＰＥＧ誘導体である、実施形態３７に記載の組成物。
３９．Ｖが、Ｆｃドメインである、実施形態３６に記載の組成物。
４０．Ｖが、Ａｂまたはその部分である、実施形態３６に記載の組成物。
４１．Ｖが、タンパク質である、実施形態３６に記載の組成物。
４２．Ｖが、ペプチドである、実施形態３６に記載の組成物。
４３．Ｖが、脂質である、実施形態３６に記載の組成物。
４４．Ｖが、高分子ナノ構造体である、実施形態３６に記載の組成物。
４５．Ｖ−（Ａ）が、独立してＶに結合する追加のＡ’を更に含む、実施形態３６に記載の組成物。
４６．２個、３個、または４個のＡ’が、独立してＶに結合する、実施形態４５に記載の組成物。
４７．心臓に対してアゴニスト活性を有する、実施形態１、９、１５、１８、２０、２２、２３、２４、２６、３２、３４、３５、３６、または５２のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
４８．アゴニスト活性が、心筋収縮性の増加をもたらす、実施形態４７に記載の単離ポリペプチド。
４９．アゴニスト活性が、ｄＰ／Ｄｔｍａｘ、ｄｐ／ｄｔｍｉｎ、または心拍数の増加をもたらす、実施形態４７に記載の単離ポリペプチド。
５０．アゴニスト活性が、収縮機能または拡張機能の改善をもたらす、実施形態４７に記載の単離ポリペプチド。
５１．実施形態１、９、１５、１８、２０、２２、２３、２４、２６、３２、３４、３５、または５２のいずれか１つに記載のポリペプチドを投与することを含む、心筋収縮性を改善する方法。
５２．配列番号５１〜７５または配列番号１２９〜１３６からなる配列群から選択される配列を有する、単離ポリペプチド。
５３．ＡＰＪアゴニストが、７個超、９個超、９個超、１０個超、１１個超、１２個超のアミノ酸長、例えば、１３個以上のアミノ酸長であり、半減期を延長する基が、分子中のどの場所にもあることができる、実施形態１に記載のＡＰＪアゴニスト。
５４．野生型アペリン−１３（配列番号２）と比較して増加した安定性を有するＡＰＪアゴニストであって、ＡＰＪアゴニストが、ペプチド中のＮ末端、Ｃ末端、または他の場所で、半減期を延長する基によって修飾され、少なくとも１個のアミノ酸が、非標準アミノ酸によって置換される、ＡＰＪアゴニスト。
５５．ＡＰＪ受容体に結合する、実施形態５４に記載のＡＰＪアゴニスト。
５６．半減期を延長する基が、ＰＥＧ、Ｆｃドメイン、ＩｇＧ、ＨＳＡ、ＰＥ、Ａｂ、ペプチド、タンパク質、脂質、コレステロール、ナノ構造体、または任意の他の半減期延長部分からなる群から選択される、実施形態５４に記載のＡＰＪアゴニスト。
５７．アゴニストが、ピログルタミン酸化、アシル化、アリール化、アルキル化されるか、またはＮ末端で結合リンカーを有し、かつ、任意にＰＥＧ化されるか、またはアゴニスト中のＮ末端または他の場所で任意の他の半減期延長部分を含む、実施形態５４に記載のＡＰＪアゴニスト。
実施形態５４〜５７の例は、配列番号１３９〜１６１を含む表５中で見出すことができる。表中、遊離酸はカルボン酸であることができ、アミドはアミド化されたＣ末端であることができる。
Figure 0006710253
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更なる番号付けした実施形態は以下を含み得る。
５８．増加した安定性が、増加したインビボまたはインビトロ半減期である、実施形態５４に記載のＡＰＪアゴニスト。
５９．野生型アペリン−１３（配列番号２）と比較して増加した安定性または効力を有するＡＰＪアゴニストであって、ＡＰＪアゴニストが、ペプチド中のＮ末端、Ｃ末端、または他の場所で、半減期を延長する基によって修飾され、少なくとも１個のアミノ酸が、非標準アミノ酸によって置換される、ＡＰＪアゴニスト。
６０．増加した効力が、増加したインビボまたはインビトロ効力である、実施形態５９に記載のＡＰＪアゴニスト。
６１．アゴニストが、チオプロピオニル（１Ｋ−ｍＰＥＧ）、チオプロピオニル（２Ｋ−ｍＰＥＧ）、チオプロピオニル（５Ｋ−ｍＰＥＧ）、チオプロピオニル（１０Ｋ−ｍＰＥＧ）、チオプロピオニル（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）、チオプロピオニル（４０Ｋ−ｍＰＥＧ）、Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）、ＮＰｅｇ１１、Ａｔｚ（１Ｋ−ｍＰＥＧ）、Ａｔｚ（２Ｋ−ｍＰＥＧ）、Ａｔｚ（５Ｋ−ｍＰＥＧ）、Ａｔｚ（１０Ｋ−ｍＰＥＧ）、またはＡｔｚ（２０Ｋ−ｍＰＥＧ）によってＰＥＧ化される、実施形態５４に記載のＡＰＪアゴニスト。
６２．アミノ酸配列［Ｚ］Ｘ−４Ｘ−３Ｘ２Ｘ１Ｘ１Ｘ２ＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＫＧＸ７Ｘ８ＰＸ９（配列番号１２５）を含み、配列中、
ａ）Ｚが、任意のアミノ酸、アシル、アリール、もしくはアルキル基、結合リンカー、ＮＰｅｇ１１、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、ＰＥＧ誘導体、または他の血清半減期を延長する基であるか、あるいは不在であり、Ｘ−４が、Ｋ、［Ｏｒｎ］、［ＭｅｒＰｒ］、［Ｐｒａ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｂ）Ｘ−３が、Ｆ、Ａ、［Ｐｒａ］、［ＭｅｒＰｒ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｃ）Ｘ−２が、Ｒ、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［Ｃｉｔ］、［ｈＡｒｇ］、［Ｏｒｎ］、［ＭｅｒＰｒ］、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、［ＮＭｅＡｒｇ］、［Ｐｒａ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｄ）Ｘ−１が、Ｒ、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［Ｃｉｔ］、［ｈＡｒｇ］、［Ｏｒｎ］、［Ｐｒａ］、［ＭｅｒＰｒ］、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、［ＮＭｅＡｒｇ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｅ）Ｘ１が、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｈ、Ｗ、Ｆ、Ｙ、Ａ、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｎｌｅ］、［Ｐｒａ］、［ＭｅｒＰｒ］、［ＰＥ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｆ）Ｘ２が、Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｑ、［Ｐｒａ］、［ＭｅｒＰｒ］、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４Ｐａｌ］、［Ｏｒｎ］、［Ｄｐｒ］、［Ｄａｂ］、［ｈＡｒｇ］、［ＮＭｅ−Ａｒｇ］、［Ｃｉｔ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｇ）Ｘ３が、Ｒ、Ｋ、Ｑ、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４Ｐａｌ］、［Ｏｒｎ］、［Ｄｐｒ］、［Ｄａｂ］、［ｈＡｒｇ］、［ＮＭｅ−Ａｒｇ］、［Ｃｉｔ］、［Ｐｒａ］、Ｌ、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｈ）Ｘ４が、Ｌ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｓ、［２−Ｎａｌ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｃｈｇ］、［ｐＩ−Ｐｈｅ］、［Ｐｒａ］、または［ＮＭｅＬｅｕ］であり、
ｉ）Ｘ５が、Ｓ、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｉ−Ｆ］、［４−Ｍｅ−Ｆ］、［Ａｂｕ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｃｈｇ］、［Ｃｉｔ］、［Ｃｐｇ］、［Ｄａｂ］、［Ｄａｐ］、［Ｄｉｐ］、［Ｎｌｅ］、［ＮＭｅ−Ｐｈｅ］、［Ｎｖａ］、［Ｏｒｎ］、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、［Ｐｒａ］、［Ｔｉｃ］、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
ｊ）Ｘ６が、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｉ−Ｆ］、［Ａｂｕ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｃｈｇ］、［Ｃｐｇ］、［Ｄａｂ］、［Ｄａｐ］、［Ｄｉｐ］、［Ｎｌｅ］、［ＮＭｅ−Ｐｈｅ］、［Ｎｖａ］、［Ｏｒｎ］、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、［Ｐｒａ］、［Ｔｉｃ］、Ａ、Ｆ、Ｇ、ｈ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｏ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
ｋ）Ｘ７が、Ｐ、［Ｏｉｃ］、［ｈＰｒｏ］、［Ｔｉｃ］、［Ｔｉｑ］、［Ｔｈｚ］、［１−Ｎａｌ］、［Ｐｒａ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｌ）Ｘ８が、Ｍ、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｍｅ−Ｆ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｎｌｅ］、［ＮＭｅＬｅｕ］、［ｐＩ−Ｐｈｅ］、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、［Ｐｒａ］、Ａ、Ｆ、Ｐ、またはＳであり、
ｍ）Ｘ９が、Ｌ光学配置もしくはＤ光学配置のいずれかにある、Ｆ、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｍｅ−Ｆ］、［４−ＮＯ２−Ｆ］、［Ｄ−１Ｎａｌ］、［Ｄ−Ｂｉｐ］、［ＮＭｅＰｈｅ］、［ｐＩ−Ｐｈｅ］、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、［Ｐｒａ］、Ａ、Ｋ、ｆ、Ｇ、Ｐ、ｗ、Ｗ、ｙ、Ｙ、Ｙ、［４−Ｆ−Ｆ］、［２−Ｎａｌ］、［Ｂｉｐ］、［Ｄｉｐ］、［Ｔｉｃ］であるか、またはＬ光学配置もしくはＤ光学配置のいずれかにある芳香族アミノ酸である、単離ポリペプチド。
６３．Ｘ位置にある少なくとも４個のアミノ酸残基が、野生型アペリン（配列番号１３８）の残基６１〜６６、６８〜７１、７４、７５、または７７に存在しないアミノ酸であり、ポリペプチドが、野生型アペリン−１３（配列番号２）と比較して、増加したタンパク質分解安定性および／または増加した血漿／血清滞留時間を有し、Ｚが、任意のアミノ酸、ポリペプチド鎖伸長部、アシル基、アリール基、ＮＰＥＧ１１、［Ａｔｚ（ＰＥＧ）１０］、ＰＥＧ誘導体、血清半減期を延長する基であるか、または存在しない、実施形態６２に記載の単離ポリペプチド。
６４．循環半減期を引き延ばすためのＰＥＧ誘導体または他の部分を含み、該誘導体または部分が、リンカーを介して結合する、またはしない、請求項６５に記載の単離ポリペプチド。
６５．配列番号１６２〜４３０からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＡＰＪアゴニスト。これらを以下表６中に示す。表中、遊離酸はカルボン酸であることができ、アミドはアミド化されたＣ末端であることができる。
Figure 0006710253
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更なる番号付けした実施形態を以下に示す。
６６．Ｘ−４、またはＸ−３、またはＸ−２、またはＸ−１、またはＸ１、またはＸ２、またはＸ９が、Ｚによって置換される、実施形態６２に記載の単離ポリペプチド。
６７．Ｚ、またはいずれのＸもが、リンカーを介して共有結合するＰＥＧ誘導体または血清半減期を延長する基を含み、あるいは誘導体がリンカーなしで結合してもよい、実施形態６２に記載の単離ポリペプチド。
６８．配列番号４３１〜５０７からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＡＰＪアゴニスト。以下の表は、実施形態６６〜６８の例を示す。表中、遊離酸は、カルボン酸であることができ、アミドは、Ｃ末端にあることができ、アゴニストは、ＰＥＧ誘導体または血清半減期を延長する基を含むことができる。
Figure 0006710253
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更なる番号付けした実施形態を以下に示す。
６９．アミノ酸配列［Ｚ］Ｘ−４Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（配列番号１２９）を含む単離ポリペプチドであって、式中、
ａ）Ｚが、任意のアミノ酸、結合リンカー、アシル基、アリール基、アルキル基、ＮＰｅｇ１１、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、ＰＥＧ誘導体、もしくは他の血清半減期を延長する基であるか、または不在であり、
ｂ）Ｘ−４が、Ｋ、［Ｏｒｎ］、［ＭｅｒＰｒ］、［Ｐｒａ］、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、またはＮＰｅｇ１１であり、
ｃ）Ｘ−３が、Ｆ、Ａ、［Ｐｒａ］、［ＭｅｒＰｒ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｄ）Ｘ−２は、Ｒ、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［Ｃｉｔ］、［Ｃｉｔ］、［ｈＡｒｇ］、［Ｏｒｎ］、［ＭｅｒＰｒ］、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、［ＮＭｅＡｒｇ］、［Ｐｒａ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｅ）Ｘ−１が、Ｒ、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［Ｃｉｔ］、［ｈＡｒｇ］、［Ｏｒｎ］、［Ｐｒａ］、［ＭｅｒＰｒ］、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、［ＮＭｅＡｒｇ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｆ）Ｘ１が、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｈ、Ｗ、Ｆ、Ｙ、Ａ、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｎｌｅ］、［Ｐｒａ］、［ＭｅｒＰｒ］、［ＰＥ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｇ）Ｘ２が、Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｑ、［Ｐｒａ］、［ＭｅｒＰｒ］、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４Ｐａｌ］、［Ｏｒｎ］、［Ｄｐｒ］、［Ｄａｂ］、［ｈＡｒｇ］、［ＮＭｅ−Ａｒｇ］、［Ｃｉｔ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｈ）Ｘ３が、Ｐ、［Ｏｉｃ］、［Ｔｉｃ］、Ａ、Ｒ、［Ａｉｂ］、Ｇ、［Ｐｒａ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｉ）Ｘ４が、Ｒ、Ｋ、Ｑ、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４Ｐａｌ］、［Ｏｒｎ］、［Ｄｐｒ］、［Ｄａｂ］、［ｈＡｒｇ］、［ＮＭｅ−Ａｒｇ］、［Ｃｉｔ］、［Ｐｒａ］、Ｌ、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｊ）Ｘ５が、Ｌ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｓ、［２−Ｎａｌ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｃｈｇ］、［ｐＩ−Ｐｈｅ］、［Ｐｒａ］、または［ＮＭｅＬｅｕ］であり、
ｋ）Ｘ６が、Ｓ、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｉ−Ｆ］、［４−Ｍｅ−Ｆ］、［Ａｂｕ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｃｈｇ］、［Ｃｉｔ］、［Ｃｐｇ］、［Ｄａｂ］、［Ｄａｐ］、［Ｄｉｐ］、［Ｎｌｅ］、［ＮＭｅ−Ｐｈｅ］、［Ｎｖａ］、［Ｏｒｎ］、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、［Ｐｒａ］、［Ｔｉｃ］、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
ｌ）Ｘ７が、Ｈ、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｉ−Ｆ］、［Ａｂｕ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｃｈｇ］、［Ｃｐｇ］、［Ｄａｂ］、［Ｄａｐ］、［Ｄｉｐ］、［Ｎｌｅ］、［ＮＭｅ−Ｐｈｅ］、［Ｎｖａ］、［Ｏｒｎ］、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、［Ｐｒａ］、［Ｔｉｃ］、Ａ、Ｆ、Ｇ、ｈ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｏ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
ｍ）Ｘ８が、Ｋ、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４ＡｍＰ］、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｉ−Ｆ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｃｈｇ］、［Ｃｐｇ］、［Ｄａｂ］、［Ｄａｐ］、［Ｄｉｐ］、［Ｄｐｒ］、［ｈＡｒｇ］、［Ｋ（Ｍｅ２）］、［ＬＹＳＩＰＲ］、［Ｎｌｅ］、［Ｎｖａ］、［Ｏｒｎ］、［Ｐｒａ］、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｎ）Ｘ９が、Ｇ、［ｂＡｌａ］、［Ｈｙｐ］、［Ｏｉｃ］、［Ｐｒａ］、［Ｓａｒ］、［Ｔｈｚ］、Ａ、Ｐ、［Ａｉｂ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｏ）Ｘ１０が、Ｐ、［Ｏｉｃ］、［ｈＰｒｏ］、［Ｔｉｃ］、［Ｔｉｑ］、［Ｔｈｚ］、［１−Ｎａｌ］、［Ｐｒａ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｐ）Ｘ１１が、Ｍ、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｍｅ−Ｆ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｎｌｅ］、［ＮＭｅＬｅｕ］、［ｐＩ−Ｐｈｅ］、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、［Ｐｒａ］、Ａ、Ｆ、Ｐ、またはＳであり、
ｑ）Ｘ１２が、Ｐ、［１−Ｎａｌ］、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｍｅ−Ｆ］、［Ｄ−１Ｎａｌ］、［Ｄ−Ｂｉｐ］、［Ｎｌｅ］、［ＮＭｅＰｈｅ］、［Ｏｉｃ］、［Ｔｉｃ］、ｆ、Ｆ、ｗ、ｙ、Ｇ、［Ｐｒａ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｒ）Ｘ１３が、Ｌ光学配置またはＤ光学配置のいずれかにある、Ｆ、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｍｅ−Ｆ］、［４−ＮＯ２−Ｆ］、［Ｄ−１Ｎａｌ］、［Ｄ−Ｂｉｐ］、［ＮＭｅＰｈｅ］、［ｐＩ−Ｐｈｅ］、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、［Ｐｒａ］、Ａ、Ｋ、ｆ、Ｇ、Ｐ、ｗ、Ｗ、ｙ、Ｙ、Ｙ、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［２−Ｎａｌ］、［Ｂｉｐ］、［Ｄｉｐ］、または［Ｔｉｃ］、Ｌ光学配置またはＤ光学配置のいずれかにある他の芳香族アミノ酸である、単離ポリペプチド。
７０．Ｘ位置にある少なくとも４個のアミノ酸残基が、野生型アペリン（配列番号１３８）の配列中の残基番号６１〜７７に存在しないアミノ酸であり、ポリペプチドが、野生型アペリン−１３（配列番号２）と比較して、増加したタンパク質分解安定性および／または増加した増加した血漿／血清滞留時間を有する、実施形態６９に記載の単離ポリペプチド。
７１．循環半減期を引き延ばすためのＰＥＧ誘導体または他の部分を含み、該誘導体または部分が、リンカーを介して結合する、またはしない、実施形態６９に記載の単離ポリペプチド。
７２．配列番号１３２、１３７、１９６〜１９９、３７７、４５５、５０８〜１０９５、１１５４、１１７２〜１１７７、１４２５、１４４０〜１４４９、および１５６０からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＡＰＪアゴニスト。以下の表は、実施形態６９〜７２の例を示す。表中、遊離酸はカルボン酸であることができ、アミドはＣ末端にあることができる。
Figure 0006710253
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更なる番号付けした実施形態を以下に示す。
７３．Ｘ−４、Ｘ−３、Ｘ−２、Ｘ−１、Ｘ１、Ｘ２、またはＸ１３が、Ｚによって置換される、実施形態６９に記載の単離ポリペプチド。
７４．Ｚ、またはＸ−４〜Ｘ１３のうちのいずれかが、リンカーを介して共有結合するまたはリンカーなしで結合する、ＰＥＧ誘導体または血清半減期を延長する基を含む、実施形態６９に記載の単離ポリペプチド。
７５．配列番号１０９６〜１２４０からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＡＰＪアゴニスト。表９は、実施形態７３〜７５の例を示す。例には、ＰＥＧ誘導体または血清半減期を延長する基が含まれ得る。表中、遊離酸はカルボン酸であることができ、アミドはＣ末端にあることができる。
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更なる番号付けした実施形態を以下に示す。
７６．アミノ酸配列
［Ｚ］Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号１５６１）を含み、
配列中、
ａ）Ｚが、任意のアミノ酸、アシル基、アリール基、アルキル基、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、ＰＥＧ誘導体、もしくは他の血清半減期を延長する基であるか、または不在であり、
ｂ）Ｘ１が、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｈ、Ｗ、Ｆ、Ｙ、Ａ、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｎｌｅ］、［Ｐｒａ］、［ＭｅｒＰｒ］、［ＰＥ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｃ）Ｘ２が、Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｑ、［Ｐｒａ］、［ＭｅｒＰｒ］、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４Ｐａｌ］、［Ｏｒｎ］、［Ｄｐｒ］、［Ｄａｂ］、［ｈＡｒｇ］、［ＮＭｅ−Ａｒｇ］、［Ｃｉｔ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｄ）Ｘ３が、Ｐ、［Ｏｉｃ］、［Ｔｉｃ］、Ａ、Ｒ、［Ａｉｂ］、Ｇ、［Ｐｒａ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｅ）Ｘ４が、Ｒ、Ｋ、Ｑ、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４Ｐａｌ］、［Ｏｒｎ］、［Ｄｐｒ］、［Ｄａｂ］、［ｈＡｒｇ］、［ＮＭｅ−Ａｒｇ］、［Ｃｉｔ］、［Ｐｒａ］、Ｌ、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｆ）Ｘ５が、Ｌ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｓ、［２−Ｎａｌ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｃｈｇ］、［ｐＩ−Ｐｈｅ］、［Ｐｒａ］、または［ＮＭｅＬｅｕ］であり、
ｇ）Ｘ６が、Ｓ、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｉ−Ｆ］、［４−Ｍｅ−Ｆ］、［Ａｂｕ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｃｈｇ］、［Ｃｉｔ］、［Ｃｐｇ］、［Ｄａｂ］、［Ｄａｐ］、［Ｄｉｐ］、［Ｎｌｅ］、［ＮＭｅ−Ｐｈｅ］、［Ｎｖａ］、［Ｏｒｎ］、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、［Ｐｒａ］、［Ｔｉｃ］、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
ｈ）Ｘ７が、Ｈ、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｉ−Ｆ］、［Ａｂｕ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｃｈｇ］、［Ｃｐｇ］、［Ｄａｂ］、［Ｄａｐ］、［Ｄｉｐ］、［Ｎｌｅ］、［ＮＭｅ−Ｐｈｅ］、［Ｎｖａ］、［Ｏｒｎ］、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、［Ｐｒａ］、［Ｔｉｃ］、Ａ、Ｆ、Ｇ、ｈ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｏ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
ｉ）Ｘ８が、Ｋ、［１−Ｎａｌ］、［２−Ｎａｌ］、［２Ｐａｌ］、［３Ｐａｌ］、［４ＡｍＰ］、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｉ−Ｆ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｃｈｇ］、［Ｃｐｇ］、［Ｄａｂ］、［Ｄａｐ］、［Ｄｉｐ］、［Ｄｐｒ］、［ｈＡｒｇ］、［Ｋ（Ｍｅ２）］、［ＬＹＳＩＰＲ］、［Ｎｌｅ］、［Ｎｖａ］、［Ｏｒｎ］、［Ｐｒａ］、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｊ）Ｘ９が、Ｇ、［ｂＡｌａ］、［Ｈｙｐ］、［Ｏｉｃ］、［Ｐｒａ］、［Ｓａｒ］、［Ｔｈｚ］、ａ、Ａ、Ｐ、［Ａｉｂ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｋ）Ｘ１０が、Ｐ、［Ｏｉｃ］、［ｈＰｒｏ］、［Ｔｉｃ］、［Ｔｉｑ］、［Ｔｈｚ］、［１−Ｎａｌ］、［Ｐｒａ］、または［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であり、
ｌ）Ｘ１１が、Ｍ、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｍｅ−Ｆ］、［Ｂｉｐ］、［Ｃｈａ］、［Ｎｌｅ］、［ＮＭｅＬｅｕ］、［ｐＩ−Ｐｈｅ］、［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］、［Ｐｒａ］、Ａ、Ｆ、Ｐ、またはＳであり、
ｍ）Ｘ１２が、Ｌ光学配置もしくはＤ光学配置のいずれかにある、Ｐ、［１−Ｎａｌ］、［４−Ｃｌ−Ｆ］、［４−Ｆ−Ｆ］、［４−Ｍｅ−Ｆ］、［Ｄ−１Ｎａｌ］、［Ｄ−Ｂｉｐ］、［Ｎｌｅ］、［ＮＭｅＰｈｅ］、［Ｏｉｃ］、［Ｔｉｃ］、ｆ、Ｆ、ｗ、ｙ、Ｇ、［Ｐｒａ］、もしくは［Ａｔｚ（ＰＥＧ１０）］であるか、またはＬ光学配置もしくはＤ光学配置のいずれかにある他の芳香族アミノ酸である、単離ポリペプチド。
７７．Ｘ１〜Ｘ１２位置にある少なくとも４個のアミノ酸残基が、野生型アペリン（配列番号１３８）の配列中の残基番号６５〜７６に存在しないアミノ酸であり、ポリペプチドが、野生型アペリン−１３（配列番号２）と比較して、増加したタンパク質分解安定性および／または増加した血漿／血清滞留時間を有する、実施形態７６に記載の単離ポリペプチド。
７８．循環半減期を引き延ばすためのＰＥＧ誘導体または他の部分を含み、該誘導体または部分が、リンカーを介して結合する、またはしない、実施形態７７に記載の単離ポリペプチド。
７９．配列番号１２４１〜１３２６からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＡＰＪアゴニスト。表１０は、実施形態７６〜７９の例を示す。例には、カルボン酸であることができる遊離酸、およびＣ末端にあることができるアミドが含まれ得る。
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更なる番号付けした実施形態を以下に示す。
８０．Ｘ１、またはＸ２、またはＸ１２が、Ｚによって置換される、実施形態７６に記載の単離ポリペプチド。
８１．Ｚ、またはＸ１〜Ｘ１２のうちのいずれかが、リンカーを介して共有結合するＰＥＧ誘導体または血清半減期を延長する基を含み、あるいは誘導体がリンカーによらずに結合してもよい、実施形態７６に記載の単離ポリペプチド。
８２．配列番号１３２７〜１３７９からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＡＰＪアゴニスト。表１１は、実施形態８０〜８２の例を示す。例には、カルボン酸であることができる遊離酸、およびＣ末端にあることができるアミドが含まれ得、またＰＥＧ誘導体または血清半減基を延長する基も含まれ得る。
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更なる番号付けした実施形態を以下に示す。
８３．Ｃ末端が、カルボン酸、そのエステル、そのアミド、またはその塩である、実施形態５４〜８２のいずれか１つに記載のポリペプチドまたはアゴニスト。
８４．Ｃ末端がポリペプチド配列によって修飾される、実施形態５４〜８２のいずれか１つに記載のポリペプチドまたはアゴニスト。
８５．結合リンカーを介して、またはリンカーなしで共有結合する、ＰＥＧ誘導体または血清半減期を延長する基を含む、実施形態８４に記載のポリペプチド配列。
８６．結合リンカーが、ペプチドの薬学的特性を増進するために使用される、血清半減期を延長する基または別の部分に共有結合する、実施形態８５に記載のポリペプチドまたはアゴニスト。
８７．血清半減期を延長する基を含み、血清半減期を延長する基が、ＰＥＧ、Ｆｃドメイン、ＩｇＧ、ＨＳＡ、ＰＥ、Ａｂ、ペプチド、タンパク質、脂質、コレステロール、およびナノ構造体、または任意の他の血清半減期を延長する部分からなる群から選択される、実施形態５４〜８２に記載のポリペプチドまたはアゴニスト。
８８．血清半減期を延長する基が、血清タンパク質親和性を有する、血清タンパク質結合部分または分子である、実施形態８７に記載のポリペプチドまたはアゴニスト。
８９．血清半減期を延長する基が、膜タンパク質親和性を持つ、膜タンパク質結合部分または分子である、実施形態８７に記載のポリペプチドまたはリガンド。
９０．「Ｘ」にあるアミノ酸が、対応するＤ−アミノ酸、アミノメチルアミノ酸、アルファメチルアミノ酸、ベータアミノ酸、ガンマアミノ酸、アミノ酸等価物、または同等の生物学的等価物によって置換される、実施形態１５、２０、２２、２３、３５、６２、６９、または７６のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
９１．「Ｘ」のアミノ酸アミド結合が、別の共有結合によって置換される、実施形態１５、２０、２２、２３、３５、６２、６９、または７６に記載の単離ポリペプチド。
９２．共有結合が、ポリペプチド中に存在する任意の２個の原子を結合して、環状構造を形成する、実施形態１〜９１のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはアゴニスト。
９３．配列番号１３８０〜１４１１からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドまたはアゴニスト。
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９４．心臓に対してアゴニスト活性を有する、実施形態５４〜９３のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドまたはアゴニスト。
９５．アゴニスト活性が、心筋収縮性の増加をもたらす、実施形態９４に記載の単離ポリペプチド。
４９．アゴニスト活性が、ｄＰ／Ｄｔｍａｘ、ｄｐ／ｄｔｍｉｎ、または心拍数の増加をもたらす、実施形態９４に記載の単離ポリペプチド。
５０．アゴニスト活性が、収縮機能または拡張機能の改善をもたらす、実施形態９４に記載の単離ポリペプチド。
５１．実施形態５４、６２、６５、６８、６９、７２、７５、７６、７９、８０、８２、または９３のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはアゴニストを投与することを含む、心筋収縮性を改善する方法。
上に提示した種々の実施形態は、「ｚ」をＰＥＧまたはＰＥとして定義することができるペプチドに対する特定の式を提供する。しかしながら、「ｚ」が任意の半減期を延長する基であり得る同一の式を含む、これらのペプチドの他の実施形態があってもよい。
これまでの説明および以下の実施例は、例証目的であり、いかなる形でも本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
［実施例１］
ＡＰＪアゴニストとして作用する種々のポリペプチドを調製した。ポリペプチドの効力および代謝安定性をスクリーニングした。ペプチドの親和性、官能活性、または安定性を維持または改善しつつ１個以上のアミノ酸を変更し得る配列を、当技術分野で既知の技法によって無作為化した。Ｎｉｓｈｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７：１５１−１５７ ２００１、Ｍｕｒｚａ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅＤＣｈｅｍ．，７：３１８−３２５ ２０１２。
内因性リガンドｐｙｒアペリン−１３と比較した効力および代謝安定性に対して最適化するために、およそ８００個超の修飾ポリペプチドを構造活性相関アッセイにおいて使用した。全ての化合物を、陽性対照として使用したアペリン−１３と併せて、１０μＭまでスクリーニングした。全てのＳＡＲアッセイにおいて官能活性を示した化合物を陽性と見なし、再びスクリーニングした。反復プロセスを続行し、ポリペプチドを最適化のために更に修飾した。
いくつかのＡＰＪアゴニスト配列を、表１２および以下の表１３、ならびに図３および４で提供する。表１３中、括弧は、残基が非標準アミノ酸であることを示す。また、表１２中、記号「⇔」および「
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 」は、本明細書に記載のリンカーのうち任意のものを介してＡＰＪアゴニストに共有結合する任意のＰＥＧ誘導体であり得るか、または単純に通常のペプチド結合によって（すなわち、リンカーが存在しないように）結合してもよい。ＰＥはピログルタミン酸塩である。
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ＡＰＪアゴニストの更なる例を以下に提供する。
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表１２および１３、ならびに図３および４中で列挙するアゴニストに加えて、種々の実施形態は、ポリマー、ペプチド、またはタンパク質が異なるペプチド配列に連結する、例えば、ＦｃがＡＰＪアゴニスト配列に連結する、複合体を含むことができる。ＡＰＪアゴニストが化学的修飾によってポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、骨格、または側鎖を介してビヒクルに結合する、そのような組成物を調製してもよい。
ポリペプチドのうちのいかなるものも、リンカーによってまたはリンカーによらずに、相前後して（すなわち、連続して）結合し得る。本明細書に記載のいかなるペプチドも、モノマーとしてであっても多量体としてであっても、リンカーによってまたはリンカーによらずに、ビヒクルに共有的に繋ぐことができる。これらのペプチドのうちのいかなるものも、誘導体化することができる。
［実施例２］
マウス、ラット、イヌ、およびヒトを含む複数種にわたって、インビボ血漿安定性の評価、およびアペリンペプチドの主要インビトロ代謝の特定を行った。
アペリンペプチドを、新たに調製したマウス、ラット、イヌ、およびヒトＥＤＴＡ血漿中に混ぜ、最終濃度を５μＭとした。次に、血漿試料を４時間かけて３７℃でインキュベートした。最大８時点をサンプリングして、血漿マトリックス中のインビトロ半減基の推定を促進した。典型的な実験では、血漿の１００μＬのアリコートをインキュベーションバイアルから採取し、次いで内部標準物を含有する３００μＬのＭｅＯＨを添加した。クエンチした試料を、室温で１５分ボルテックスした後、１５分間５５００ｇで遠心分離機にかけた。次に、上清を高解像度ＬＣ−ＭＳで分析した。精密質量完全走査質量データを、４時間にわたる親ペプチドレベルの推定のために使用し、その後データを、血漿中のインビトロ半減基の推定のために使用した。同一のデータセットを使用し、精密質量完全走査ＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータに基づいて、主要代謝産物も特定した。（代謝産物データは図示せず）。インビトロの血漿安定性結果を、表１５中で以下に示す。
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表１５では、列挙したポリペプチドの全てが、天然のもの（１５分で０．１％）またはピログルタミン酸化アペリン１３（１５分で０．７％）のいずれよりもはるかに優れたインビトロ安定性を有することに注目されたい。更に試験したペプチドは、１時間で５０〜９６％を有した。更なる実験は、４つの異なる血漿種、すなわち、マウス、ラット、イヌ、およびヒト（図４）における相対的なインビトロ血漿安定性を提供した。これらの結果は、ＡＰＪアゴニストが、異なる種の前臨床モデルに使用できるはずであることを示した。
［実施例３］
ＡＰＪアゴニストの効力および代謝安定性を決定するためのアッセイを行った。
ｃＡＭＰアッセイには、ＡＰＪを発現している安定したＣＨＯ細胞系を使用した。細胞を、３７℃で４５分間、種々の濃度のペプチドの不在または存在下で、ハンクス緩衝液、ホルスコリン、および０．５ｍＭのＩＢＭＸを含有する刺激緩衝液を用いてインキュベートした。環状ＡＭＰキット（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を製造業者の取扱説明書に従って使用し、ｃＡＭＰレベルを決定した。
ＧＴＰのアッセイのために、安定した細胞形から膜を調製し、それを使用して、修飾ペプチドの有効性／効力を決定した。アッセイ緩衝液中のＧＤＰ、ＭｇＣｌ２、およびＮａＣｌ濃度の最適な実験条件を、まず決定した。膜を、アッセイ緩衝液中で修飾ペプチドとともにインキュベートした。ペプチドの不在または存在下で［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを添加することにより反応を開始し、それを室温で９０分間インキュベートした。非特異的結合を過剰な冷ＧＴＰγＳの存在下で決定すると、常に総結合の０．２％未満であった。結合した［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを、濾過により遊離放射性同位元素から分離した。フィルター結合した放射能を、液体シンチレーション計測によって決定した。
図５は、２０ｋＤａのＰＥＧ化ペプチドのアゴニスト活性を示す。（配列番号１２２）、（配列番号１２３）、（配列番号１２４）、（配列番号１２６）、および（配列番号１２７）は、２５４０４２１（ｐｙｒアペリン−１３）（配列番号１２８）と比較して強力であり、完全なアゴニストとして作用する。加えて、ヒトまたはラットどちらかのＡＰＪの安定した細胞系を使用すると、ｃＡＭＰの刺激が見られ得る。
図６は、５２５ダルトンのＰＥＧ化ペプチド（配列番号２３）とｐｙｒアペリン１３（配列番号１２８）との比較を示す。ｐｙｒアペリン−１３に対して、５２５ダルトンのペプチドは、類似のインビトロ効力および有効性を示し、このことは、ペプチドが高度に修飾されるにもかかわらず、それが内因性ＡＰＪリガンドに類似したＡＰＪ活性を保持することを示す。非標準アミノ酸を導入することまたはＰＥＧの導入による天然アペリンペプチドの修飾は、ｃＡＭＰおよびＧＴＰγＳアッセイにおいて、官能活性に影響しなかった。
［実施例４］
ペプチドの血行動態的心臓機能を評定するために、単離したランゲンドルフ灌流心システムを使用した。ラットから単離した心臓は、生化学的、代謝的、形態学的、および生理学的指標を含み得る、広範囲の測定値を提供する。方法の限界／利点としては、神経ホルモンの影響、神経調節、および高い冠血流量の不在が挙げられる。しかしながら、そのような限界は、体循環および多数の末梢相互作用なく、直接的な心臓効果を研究できることで補われる。
薬物のプロファイリングについてのインビボ研究に対しての、測定値の再現性および精度、ならびに比較的低い費用は、この方法のいかなる限界にも勝る。したがって、この方法は、卓越した用量反応関係を提供し、対象の分子の薬理学的および生理学的特性に重要な洞察を与える。
腹腔内経路によってラットに用量５０〜１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムを投与する際、動物には麻酔をかけた。心臓を切除し、損傷を回避するように指の間にそっと載せ、次にわずかに持ち上げた後、大動脈、大静脈、および肺血管を切開した。大動脈を伴う心臓の切除の直後に、心臓を、大動脈を介してランゲンドルフ装置中のカニューレ上に取り付けた。心臓を、ｐＨ７．５の修飾した含酸素クレブスヘンゼライト緩衝液によって灌流し、３７℃で９５％のＯ２／５％のＣＯ２によって平衡化した。灌流は、１０ｍｌ／分の一定流量で行い、３００ｂｐｍで速度調整した。圧力を、ＬＶ内腔中に挿入した圧力検出バルーンカテーテルによって測定した。心臓の内在変力性（筋収縮力）および心筋弛緩（心臓の弛緩）効果を、ｄｐ／ｄｔｍａｘおよびｄｐ／ｄｔｍｉｎによって評定した。
単離ランゲンドルフ系を使用して、図７および８は、ｄｐ／ｄｔｍａｘの用量依存的な増加、およびｄｐ／ｄｔｍｉｎの減少、併せて、対照ラットにおける２個の異なるペプチド、（配列番号２３）および（配列番号２４）についての収縮期圧の増加を示す。これらの図は、配列番号２３および２４のペプチドによる正常な心臓の収縮機能および拡張機能の両方の改善を解説する。
［実施例５］
修飾ペプチド配列番号２３のインビボ心臓効果を、対照ラットおよび心不全ラットにおいて評定した。健康なラットおよびＭＩ（心筋梗塞）誘発性心不全を有するラットの心臓機能を、ＭｉｌｌａｒのＰＶループシステムによって測定し、大腿動脈圧カテーテルを検査した。
研究には、生後２〜３ヶ月の雄のＬｅｗｉｓラットを使用した。ＭＩを左前下行枝（ＬＡＤ）のライゲーションによって誘発した。動物の登録のために、ＭＩ後１週間に心エコー検査を行った。駆出率（ＥＦ）が４０％を超え、梗塞が心エコー画像から特定されない場合、これらの動物は研究から除外した。心血管血行動態評定のため、ＭｉｌｌａｒのＰＶループカテーテルを右総頚動脈に挿入し、次に左心室（ＬＶ）に進めた。末梢血圧モニタリングのため、動脈圧カテーテルを大腿動脈に挿入した。
実験を、ＭＩ後６〜７週間のラットと健康なラットとのどちらにも行った。各実験におけるラットを、ペプチド配列番号２３治療、ビヒクル、および陽性対照としてドブタミンの３つのグループに分けた。被験物質を、頸静脈を介して静注し、３組のペプチド投与を実験で使用した。配列番号２３を有するペプチドを、各注入期間、１０分間５．５、２７．５、および５５ｍｇ／ｋｇで継続的に投与した。実験の終わりに、ＭＩラットを実験に使用した場合は、梗塞のサイズを肉眼形態によって検証した。
ＭＩグループの動物は、グループ間で極めて類似した梗塞サイズ（ＬＶの３８〜３９％）を有した（結果は図示せず）。図９は、それぞれ健康なラットおよびＭＩラットにおいて３２％および２４．５％増加した平均ｄｐ／ｄｔ ｍａｘを示す。心拍数（ＨＲ）は、蓄積用量８８μｇ／ｋｇのペプチド２７０４１２１の静脈内注入で、ＭＩラットにおいて最大１０．６％増加した。他の心臓血行動態は、５．５〜８８μｇ／ｋｇの範囲の用量では観察されなかった。平均動脈圧などの末梢血管抵抗測定値の著しい変化は、５．５〜８８μｇ／ｋｇの範囲の用量では見られなかった。
［実施例６］
ラットにおけるアペリンペプチドのインビボ薬物動態プロファイルの評価を開始した。アペリンペプチド薬物動態プロファイルを、急速静脈内投与（ＩＶ）および皮下（ＳＣ）投与を通して、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット中で評価した。典型的なＩＶ実験中、アペリンペプチドＰＢＳ緩衝溶液を、最終用量０．５ｍｇ／ｋｇまで、頸静脈を介してマウスに投与した。２４時間かけて採血した血液試料を、カリウムＥＤＴＡを含む採血管に移し、処理まで氷上で保管した。遠心分離によって血漿を血液から採取した。９６ウェル容器に移した後、血漿試料を、およそ−８０℃に維持した冷凍庫中で保管した。ラット血漿試料におけるアペリンペプチドの定量分析を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム上で多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードを使用して達成した。ｐｙｒ−アペリン−ａ３と比較して増加した安定性を持つペプチドは、増進した薬物動態プロファイル、すなわち、増加した半減期を有する。ＰＥＧと複合体化したペプチドは、非複合体化ペプチドと比較して延長された循環半減期を有する。
［実施例７］
一連のＰＥＧ化ペプチドを調製し、インビトロでスクリーニングして、効力および有効性へのＰＥＧサイズおよびペプチド原子価の影響をＧＴＰγＳアッセイ中で調査した。アッセイでは、２０ｋＤＡおよび４０ｋＤＡのＰＥＧを比較した（図１０）。４０Ｋｄａ（配列番号４７４）の効力。ＰＥＧ化ペプチドは、２０ｋＤＡ（配列番号２４）と比較して５倍減少した（２０ｋＤａ ＥＣ５０＝０．２５２ｎＭ対４０ｋＤＡ ＥＣ５０＝１．３７ｎＭ）。４０ＫｄａのＰＥＧ化ペプチドの有効性も、２０ｋＤＡと比較して減少した（Ｅｍａｘ ４０ｋＤａ＝２０ｋＤａの８４％）。
加えて、モノ−および多価ビスならびにテトラキス−ペプチド複合体化ＰＥＧを調製して、ペプチド原子価を調査した。図１１は、生物学的アッセイにおいて２０ｋＤａのＰＥＧ化ペプチド（構造を図１２に示す）活性を使用したときの、インビトロ活性へのペプチド原子価の影響を示す。ペプチドを２０ｋＤａのＰＥＧと複合体化させたとき、ペプチド原子価の増加は、インビボ薬力学的応答への影響は評価していないが、インビトロ効力には著しく影響しなかった。図は、モノ−ビス（配列番号１３０）およびテトラキス−ペプチドを示す。（配列番号１３１）２０ｋＤａのＰＥＧ−モノ（配列番号１２９）、ビス、およびテトラキス（Ａｔｚ−ＫＦＲＲＱＲＰ［ｈＡｒｇ］［Ｃｈａ］ＳＨＫＧ［Ｏｉｃ］［Ｎｌｅ］Ｐ［４−Ｃｌ−Ｆ］）（配列番号１５６２）分子は、内因性ｐｙｒアペリン１３（配列番号１２８）よりも著しくより強力ではあるが、インビトロラットのＧＴＰγＳアッセイにおいて、ほぼ同等の効力である。
更にいくつかのＰＥＧ化ビスペプチドを、図１３に示すように探求した。４個のビス−ペプチドのうちの３個は、低分子量単分散ＰＥＧ誘導体と複合体化させたとき、モノ−ペプチドと比較して増加した効力を有した。最短のＰＥＧ複合体（約０．６ｋＤａのＰＥＧ（配列番号１３３）は、増加した効力を有したが、１（配列番号１３４）、１．７（配列番号１３５）、および２．２ｋＤａのＰＥＧ（配列番号１３６）複合体（図１４）は、モノペプチド（配列番号４９４）と比較して増加した効力を有した。最大のビス−ペプチド複合体は１６ｐＭである。
この実施例から、以下の結論を導くことができる。１）２０ｋＤａから４０ｋＤａへのＰＥＧ 分子量の増加は、ラットのＧＴＰγＳアッセイにおいて効力および有効性が減少した複合体をもたらした。２）２０ｋＤａのＰＥＧの多価性の増加は効力の増加をもたらさず、このことは、２０ｋＤａのＰＥＧと複合体化したときのペプチド間の距離が最適ではないことを示す。３）低ＭＷ単分散ＰＥＧと複合体化したビス−ペプチドの大部分は、モノ−複合体化ＰＥＧと比較して増加した効力を有した。
更にそれは、ａ）１．７または２．２ｋＤａどちらかのＰＥＧと複合体化したときのペプチド間の距離は最適であると思われること、ｂ）ビス−ペプチドＰＥＧ複合体は、モノ−ペプチド複合体と比較して１０倍より多い増加した効力を提供することができること、およびｃ）ビス−ペプチドＰＥＧ複合体は有益なＰＫ特性を有し得ることを示した。
［実施例８］
２個の離散ＡＰＪアゴニスト（配列番号１４１３および１４１４）を、ペプチドのブロモアセトアミド部分を遊離システイン残基と反応させることによるヒトＩｇＧの操作Ｆｃ領域への部位選択的複合体化に使用して、共有的チオエーテル連結を達成した。２個のペプチドの配列を表１６に示す。Ｆｃタンパク質配列を以下に示す。
Figure 0006710253
 下線付きのＣは、操作システインの部位およびＡＰＪアゴニストの共有結合の位置を示す。ホモ二量体中、Ｃ７−Ｃ７およびＣ１０−Ｃ１０は分子間ジスルフィドであるのに対し、Ｃ４２〜Ｃ１０２およびＣ１４８−Ｃ２０６は分子内ジスルフィドである。これに関する更なる情報は、米国公開第２０１２／０００９２０５号中で見出すことができる。
Figure 0006710253
Figure 0006710253
Figure 0006710253
Ｆｃタンパク質は、折り畳みの際にホモ二量体を形成するため、折り畳みタンパク質当たり２個の操作反応性部位を含有する。各Ｆｃ−ホモ二量体複合体は、２個のＡＰＪアゴニストコピーを含有するのが理想である。複合体は、ＦｃＥ５２Ｃ−ａｐ１３およびＦｃＥ５２Ｃ−ａｐ１７と命名した（１３および１７はペプチド中の残基の数であり、チオエーテル連結によってＦｃに共有結合する、１個のペプチドに対しては１×、２個のペプチドに対しては２×である）。
この実験の結果を、配列番号１２８に対するＦｃの複合体の活性を比較しながら図１５に示す。長さの異なる２個のペプチドＡＰＪアゴニストを、部位選択的な様式でシステイン操作Ｆｃタンパク質と複合体化させることに成功した。Ｆｃタンパク質当たり１個のペプチドおよび２個のペプチドを含有するＦｃ複合体を、クロマトグラフィーによって分離した。ペプチド−タンパク質複合体は、ヒトおよびラットＡＰＪ受容体において効力および有効性を維持する。複合体を、ヒトおよびラットＡＰＪの両方において野生型ｐｙｒ−アペリン−１３（配列番号１２８）と比較して、より高いか、または同等の効力および有効性を有することを見出した。
表１７のいくつかのタンパク質複合体を使用した別の実験の結果を、図１６に示す。この実験の結果は、配列番号１２８に対するＦｃ複合体の活性を比較しながら図１６に示す。ペプチド−結合リンカー間の様々な長さのスペーサーのペプチドＡＰＪアゴニストを、部位選択的な様式で２個の異なるシステイン操作Ｆｃタンパク質と複合体化させることに成功した。Ｆｃタンパク質当たり１個のペプチドおよび２個のペプチドを含有するＦｃ複合体を、クロマトグラフィーによって分離した。ペプチド−タンパク質複合体は、ヒトＡＰＪ受容体に対して試験すると、効力および有効性を維持していた。複合体を野生型ｐｙｒ−アペリン−１３（配列番号１２８）と比較して、より高いか、または同等の効力および有効性を有することを見出した。
Figure 0006710253
以下は、ｈｕＦｃ（Ｔ４８７Ｃ）（配列番号１４６２）の配列である。
Figure 0006710253
［実施例９］
アペリンアゴニストとして使用し得る更なるペプチドを、表１８に見出すことができる。
Figure 0006710253
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本明細書全体に渡り、種々の出版物、特許、および特許出願が参照された。これらの文書のその全体の開示は、ここに参照により本出願に組み込まれる。しかしながら、そのような文書への参照は、そのような文書が本出願に対する先行技術であるという承認として解釈されるべきではない。更に、単に文書が参照によって組み込まれ得るという理由で、必ずしも本出願がその文書の内容に完全に一致していることを示す訳ではない。

Claims (2)

  1. 配列番号１４１３又は１４１４のアミノ酸配列で表される、ＡＰＪアゴニストであって、該アミノ酸配列が、ヒトＩｇＧタンパク質のＦｃ領域に結合した、ＡＰＪアゴニスト。
  2. 請求項１に記載のＡＰＪアゴニスト及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
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