JP6645737B2 - 自己免疫疾患のバイオマーカー - Google Patents
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Description
項1. 生体体液中に含まれるミトコンドリアDNAからなる、自己免疫疾患のバイオマーカー。
項2. ミトコンドリアDNAが生体体液中の細胞外膜小胞内に含まれる、項1に記載のバイオマーカー。
項3. ミトコンドリアDNAが生体体液中のエキソソーム内に含まれる、項1又は2に記載のバイオマーカー。
項4. 前記自己免疫疾患が、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、多発性筋炎/皮膚筋炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病(MCTD)、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択されるいずれか1種である、項1〜3のいずれかに記載のバイオマーカー。
項5. 前記自己免疫疾患が、ベーチェット病である、項1〜4のいずれかに記載のバイオマーカー。
項6. ミトコンドリアDNAを検出可能な試薬を含む、自己免疫疾患の診断キット。
項7. 前記ミトコンドリアDNAを検出可能な試薬が、シトクロムb、COXI、COXII、COXIII、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット1、NADHデヒドロゲナーゼブユニット2、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット3、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4L、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット6、ATPase第6サブユニット及びATPase第8サブユニットからなる群より選択される少なくとも1種を検出することが可能な試薬である、項6に記載の診断キット。
項8. 前記自己免疫疾患が、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、多発性筋炎/皮膚筋炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病(MCTD)、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択されるいずれか1種である、項6又は7に記載の自己免疫疾患の診断キット。
項9. 前記自己免疫疾患が、ベーチェット病である、項6〜8のいずれかに記載の自己免疫疾患の診断キット。
項10. 下記工程を含む自己免疫疾患の罹患の有無の検出方法:
(i)被検動物から体液試料を得る工程;
(ii)前記体液試料中のミトコンドリアDNAを測定する工程;及び
(iii)前記工程(ii)の結果に基づいて自己免疫疾患の罹患の有無を検出する工程。
項11. 前記工程(iii)が、被験動物について得られる工程(ii)の結果を、正常対照について得られる工程(ii)の結果と対比して、ミトコンドリアDNA量が増加していることを指標として行われる、項10に記載の検出方法。
項12. 前記自己免疫疾患が、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、多発性筋炎/皮膚筋炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病(MCTD)、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択されるいずれか1種である、項10又は11に記載の自己免疫疾患の検出方法。
項13. ミトコンドリアDNAの体液中への分泌を抑制する又はミトコンドリアDNAの機能を抑制する物質を有効成分とする、自己免疫疾患の予防又は治療剤。
項14. ミトコンドリアDNAの体液中への分泌を抑制する又はミトコンドリアDNAの機能を抑制する物質の、自己免疫疾患の予防又は治療剤の製造のための使用。
項15. 自己免疫疾患の予防又は治療に使用される、ミトコンドリアDNAの体液中への分泌を抑制する又はミトコンドリアDNAの機能を抑制する物質。
本発明の自己炎症性疾患のバイオマーカーは、生体体液中に含まれるミトコンドリアDNA(mtDNA)からなることを特徴とする。本発明においては、mtDNAが自己免疫疾患患者の生体体液中(例えば血清、尿、髄液中)に高濃度で存在することに基づき、これを自己免疫疾患の評価指標として用いる。
本発明の自己免疫疾患の診断キットは、上記mtDNAを検出可能な試薬を含む。mtDNAを検出することが可能な試薬としては、mtDNAの検出をmtDNAにコードされる遺伝子又は遺伝子断片に基づいて行う場合であれば、当該遺伝子又は遺伝子断片を特異的に増幅するプライマー、又は当該遺伝子又は遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブが試薬として含まれる。本発明のキットに含まれる試薬として具体的には、配列番号1〜6に示されるプライマーが例示される。これらのプライマー及びプローブについては、上記「バイオマーカー」に記載の通りである。
本発明は、前述のバイオマーカーである生体体液中のmtDNAを利用した、下記工程を含む自己免疫疾患の罹患の有無の検出方法を提供する。
(i)被検動物から体液試料を得る工程;
(ii)前記体液試料中のミトコンドリアDNAを測定する工程;及び
(iii)前記工程(ii)の結果に基づいて自己免疫疾患の罹患の有無を検出する工程。
本発明は、ミトコンドリアDNAの体液中への分泌を抑制する又はミトコンドリアDNAの機能を抑制する物質を有効成分とする、自己免疫疾患の予防又は治療剤を提供する。
全ての試験は、大阪大学大学院医学研究科治験審査委員会の承認を得て行われた。試料として、日本厚生労働省ベーチェット病研究班による診断基準、アメリカリウマチ学会による全身性エリテマトーデス(SLE)診断基準、アメリカリウマチ学会による改訂慢性関節リウマチ(RA)診断基準、日本厚生労働省研究班による全身性強皮症(SSc)診断基準、ならびに厚生省特定疾患調査研究班による多発性筋炎/皮膚筋炎(Polymyositis/Dermatomyositis:PM/DM)診断基準に基づいて診断された患者から採取された血清を用いた。下記試験例及び比較試験例において使用されたミトコンドリアDNAは、36名のベーチェット病患者、22名のSLE患者、28名のRA患者、14名のSSc患者、8名のPM/DM患者から採取されたものを使用した。コントロールとして、10名の健康なボランティア(健常者又はコントロールと表記することがある)から採取されたものを使用した。但し、参考試験例1に関しては、ベーチェット病患者75名、健康なボランティア9名より採取されたエキソソームを用いて評価を行った。また、下記試験例おいて使用した血球画分は、ベーチェット病患者6名、健常ボランティア6名より採取されたものを用いて評価を行った。
DNA Extractor SP Kit(和光純薬工業(株)製)を用いて、添付のプロトコルに従って血清(100μl)から血清DNAを調製した。具体的には、100μlの血清試料を5μlのタンパク質分解酵素で消化(56℃、10分間)し、300μlのヨウ化ナトリウム溶液で処理して血清中からタンパク質を除去した。DNAを100容量%エタノールを用いて沈殿させ、上清を除去して得られたDNAペレットに70容量%エタノールを添加して精製した。得られた血清DNAを、DNaseを含まない水(20μl)に再度懸濁した。
SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)(タカラバイオ(株)製)を使用し、添付のプロトコルに従ってABI PRISM 7700(Life Technologies Japan)により、SYBR Green Iを用いたインターカレーター法によるリアルタイムPCRを行った。PCR条件は以下の通りである。
Stage 1(1サイクル):95℃ 30秒;
Stage 2(40サイクル):95℃ 5秒、60℃ 30秒;
Stage 3(1サイクル):95℃ 15秒、60℃ 1分、95℃ 15秒
(ヒトチトクロームCオキシダーゼサブユニットIII:COXIII)
フォワードプライマー(配列番号1):
5’−ATGACCCACCAATCACATGC−3’
リバースプライマー(配列番号2):
5’−ATCACATGGCTAGGCCGGAG−3’
(ヒトNADHデヒドロゲナーゼ:NADH)
フォワードプライマー(配列番号3):
5’−ATACCCATGGCCAACCTCCT−3’
リバースプライマー(配列番号4):
5’−GGGCCTTTGCGTAGTTGTAT−3’
(市販キットを用いた分離)
ExoQuickTM Exosome precipitation溶液(System Biosciences社製)を用い、添付のプロトコルに従って、血漿(100μl)からエキソソームを分離した。具体的には、血清(100μl)及びExoQuick溶液(25μl)を穏やかに混合し、30分間冷却した後、1500×gで30分間遠心分離に供した。その後、完全に上清を除去し、ペレット(エキソソーム画分を含んだ細胞外膜小胞)を得た。また、上清は下記試験例3において非エキソソーム画分として使用した。下記試験例に使用するため、このペレットを100μlのPBS溶液に再懸濁してエキソソーム懸濁液を得た。得られたエキソソーム懸濁液より、上記2.に記載の方法に準じてmtDNAを分離した。
エキソソームは超遠心法により単離した。具体的には、1.5mlの血清を2000×gで10分間遠心し細胞断片を除去した後、上清を4℃のもと10000×gにて30分間の遠心により細胞破砕断片を除去した。その後上清を0.22μmのフィルターにて濾過し、その濾過液を4℃のもと110000×gにて更に2.5時間遠心した。得られたペレットを9mlのPBSに溶解し、30%スクロース溶液の上にレイヤーし、4℃のもと100000×gにて更に2.5時間遠心に供した。エキソソームを含んだスクロース溶液を回収し、4℃のもと100000×gにて更に2.5時間遠心に供し、エキソソームからなるペレットを得た。下記試験例に使用するため、このペレットをPBS溶液に懸濁して高純度のエキソソーム懸濁液を得た。
前記4.において調製されたエキソソーム懸濁液をSystem Bioscience社のExoELISA Kitのエキソソーム結合緩衝溶液(exosome binding buffer)に5000倍希釈になるように懸濁した。この懸濁液(100μl)を用いて37℃の条件下で16時間に亘って96ウェルプラスチックプレートにコーティングした(固相化)。5容量%BSA(溶媒:PBS)によるブロッキングの後、0.5μg/mlの抗ヒトCD9モノクローナル抗体を用いて37℃で2時間インキュベートし、その後HRP(セイヨウワサビペルオキシダーゼ)で標識された抗ウサギIgG(1万倍希釈で100μl)を添加して室温で30分間インキュベートした。ヒトCD9はエキソソームに存在するマーカータンパク質として知られている。基質としてR&D社のsubsrate regent kitを100μl添加し、酵素反応による発光を、perkinelmer社製ARVOを用いて425nmで検出した。
末梢血液画分に関しては、被験者より30mlの血液を採取し、polymorphprep(Axis−Sheild)を用いて添付の推奨プロトコールに従って単核球及び多核球に分離し、多核球分画は好中球として評価した。単核球分画は更に磁気ビーズ付き抗CD14抗体(Miltenyi Biotec)を用いてCD14陽性単球を単離した。残りの単球分画をリンパ球分画として評価した。
mtDNAに関しては、検量線に基づいて得られた相対値を対数処理した後、student’s t−testにより統計学的検討を行った。エキソソームに関しては、検量線に基づいて得られた相対値に対しstudent’s t−testにより統計学的検討を行った。その以外のin vivo及びin vitroにおける炎症反応に関する検討は、Mann―Whitney U−testにより統計学的検討を行った。
ベーチェット病患者、SLE患者、SSc患者及びPM/DM患者の自己免疫疾患の患者における血清DNA濃度については上記「2.血清DNAの分離」に記載の方法で得られた懸濁液を、分光光度計(NanoDrop:Thermo社製)を用い測定し、血清mtDNA値を上記「3.リアルタイムPCR」に記載の方法に従って測定した。結果を図3及び4に示す。
ベーチェット病患者又は健康なボランティア(コントロール群)から採取された血清DNA濃度と血清中のmtDNA量を測定した。血清DNA濃度及び血清mtDNA値の測定については、前記試験例1と同様に行った。結果を図5に示す。
医療記録によりベーチェット病患者の臨床症状を調査し、血清mtDNA値と臨床的特徴について後ろ向き検討により検討した。図6のa)に示されるように、ベーチェット病患者の中でも、検査時に活動期ブドウ膜炎の臨床症状を呈する症例(Uveitis)でmtDNA値が高いことが示された。また、患者を無治療ないしコルヒチンのみによる治療群(Non)、ステロイド等の標準的な免疫抑制剤による治療群(Conv)、及び抗TNF−α抗体による治療群(Mab)に分類し、血清mtDNA値を比較すると、図6のb)に示すように、抗TNF−α抗体投与群で血清mtDNA値の上昇が認められた。このことから、急性活動期及び治療難渋例において血清mtDNAが高い可能性が示唆され、ベーチェット病の疾患活動性のモニタリングや予後予測に有効である可能性が示された。
ベーチェット病患者におけるmtDNAが血清中のどの画分に局在するかを評価するため、ベーチェット病患者又はコントロール群から採取された血清を用い、「上記4.エキソソーム分離(市販キットを用いた分離)」に記載の方法に従って、エキソソーム画分と非エキソソーム画分をそれぞれ得た。各画分について、「上記3.リアルタイムPCR」に記載の方法に従って、COXIII及びNADHを検出した。結果を図7(a)及び(b)に示す。図7(a)の縦軸の単位は%であり、(各分画に含まれるmtDNA量)/(血清中(両分画の和)に含まれるmtDNA量)×100より与えられる。また、図7(b)の縦軸に記載される相対的発現量は、健常者のPBMC(末梢血単核球)から得られたDNA抽出液を5倍ずつ6段階希釈したDNA溶液をテンプレートとしてPCRを行って検量線を作成し、それに対する相対値により示される。また、ベーチェット病患者末梢血由来単球のMVB内におけるDNA断片の局在を、抗DNA抗体を用いた免疫電子顕微鏡解析により検討した。図7(c)に示される環状構造がMVBを、その中の小胞がエキソソームを示す。また、矢印の先の黒点が抗DNA抗体により染色されるDNA断片を示し、白バーは500nmである。
ベーチェット病患者の血清中のエキソソーム画分の量が、コントロール群(健康なボランティア)に比べて上昇しているかどうかを確認した。ベーチェット病患者又はコントロール群から採取された血清を用い、「上記5.ELISA」に記載される方法に従ってCD9タンパク質を検出した。結果を表1に示す。相対的発現量については、健常者の血清から得られたエキソソーム懸濁液を3倍ずつ10段階希釈した溶液を用いて検量線を作成し、これに基づく相対値として表される。
上記試験例1〜4より、ベーチェット病患者では血清中(より具体的にはエキソソーム中)のmtDNAが異常高値を示すことが明らかとなった。そこで、本発明者らは、ミトコンドリアストレスにより細胞質中に放出されたmtDNAは、エキソソームに取り込まれることにより細胞外に放出されているのではないかとの仮説(例えば図8を参照)を立て、以下について検討した。
ヒトの単球系細胞株であるTHP−1細胞(ATCC Cat. No.TIB−202)にミトコンドリア特異的にGFPを発現するmito−GFP vector(invitrogen製)をトランスフェクションした翌日、ガラスボトムディッシュ(IWAKI製)に2×104個の細胞を播種し、マクロファージ様細胞に分化させるために、10%FCS入りのRPMI1640培地に100nMのPMA(ホルボールミリステートアセテート)を加えて3日間培養した。その後、5mMのATP及び15μMのナイジェリシン(Nigericin)を添加して、30分間刺激した。ここで、ATPはDAMPsとして作用し、ナイジェリシンはPAMPsとして作用する。その後、細胞を4容量%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定した。そして、30容量%NGS(Normal Goat Serum)でブロッキングを行い、100倍希釈したエキソソームのマーカーである抗CD63抗体(abcam製)と、蛍光標識した抗ラビットIgG抗体(invitrogen製)の1000倍希釈液を用いて染色し、共焦点レーザ顕微鏡で観察した。また、細胞内局在の変化がミトコンドリア由来活性酸素種(mROS)によるかを検討する目的で、あらかじめmROSのキレート剤であるmito−TEMPO(Alexis製)500μMで1時間前処理したTHP−1細胞でも同様の実験を行った。結果を図9に示す。
2×106個のヒトの単球系細胞株であるTHP−1を6ウェルディッシュに播種し、100nMのPMA存在下で3日間培養した後、5mMのATP及び15μMのナイジェリシンを培地に添加して60分間刺激した。細胞上清中に放出されたエキソソームをExoquick−TC(System Bioscience製)を用いて回収し、エキソソーム画分よりDNAを抽出して、リアルタイムPCR法によりmtDNAの量を検討した。エキソソーム画分からのDNAの抽出は、「4.エキソソーム分離(キットを用いた分離)」で調製されたエキソソーム画分より、「2.血清DNAの分離」の方法に準じてDNA Extractor SP Kit(和光純薬工業(株)製)を用いて行った。また、リアルタイムPCR法は、「3.リアルタイムPCR」に記載の方法に従って行った。また、前記(5−1)と同様に、これらの変化がmROSによるかを検討する目的で、500μMのmito−TEMPOを培地に添加して1時間前処理した細胞でも同様の実験を行った。結果を図10に示す。また、図10の縦軸は、試験例1.と同様、健常者由来の末梢血単核球由来のDNAを段階希釈した溶液をテンプレートとしてPCRを行い、その値に対する相対的発現量である。
以上の試験例及び参考試験例の結果を総合すると、ベーチェット病患者において血清mtDNA値が高いのはエキソソームの量そのものが多いのではなく、エキソソーム中に取り込まれているmtDNA量がコントロールに比べて多いことが示された。そこで本発明者らは、ベーチェット病患者においてエキソソーム中のmtDNA量が多い理由に関して、ベーチェット病由来単球では、PAMPs/DAMPs刺激によりダメージを受けたミトコンドリアの分解処理過程に障害を認めるのではないか、との仮説を立て、ベーチェット病患者及び健常者から末梢血単球を得て比較検討によりその検証を行った。
ドナー細胞から放出されたエキソソームは、細胞膜融合やエンドサイトーシスによりアクセプター細胞に取り込まれ、ドナー細胞の様々な生物学的活性がアクセプター細胞に伝えられる。免疫系においてもこれまでに、ペプチド/MHC複合体がエキソソームにより運ばれ抗原の伝播に寄与していることや、エキソソーム中のmRNAやmicroRNAにより、アクセプター細胞がジェネティック、エピジェネティックな制御を受けていることが報告されている(例えば、Clotilde Thery, Matias Ostrowski and Elodie Segura. Membrane vesicles as conveyors of immune responses.Nat Rev Immunol:9,581−93,2009を参照)。また、上記試験例5の結果より、ミトコンドリアにストレス負荷がかかると、エキソソーム中へmtDNAが取り込まれることが示唆された。自己免疫疾患患者においては、mtDNAがエキソソーム内に存在するため、細胞外に放出されてもDNase等の影響を受けず、血清等で比較的安定に存在することができると予測される。そこで、「mtDNA及びmtDNAを含むエキソソームは免疫反応を亢進させるのではないか」との仮説を立て、以下について検討した。
健常者からpolymorphprep(AKIS製)を用いて濃度勾配を利用して調製した2×104個のヒト好中球を、0.1%BSA入りRPMI1640メディウムに懸濁してガラスボトムディッシュ(Matsunami製)に播種し、ベーチェット病(BD)患者及び健常者由来の血清70μl相当量のエキソソーム又はmtDNAを加え、好中球の運動能についてNIKON蛍光顕微鏡Biostationを用いて1時間にわたり経時的観察行った。mtDNA及びエキソソームの調製はそれぞれ、上記「2.血清DNAの分離」及び「4.エキソソーム分離」に従って行った。好中球の移動速度、移動距離についてソフトウェアMetaMorph(Molecular Divices製)を用いて評価した。結果を図13に示す。また、好中球の経時的運動変化をトラッキングした結果について、図14に健常者とベーチェット病患者由来のエキソソーム又はmtDNAを添加した場合の代表例を示す。
C57BL/6マウス(チャールズリバー製)の骨髄を50ng/mlのM−CSF(Peprotec製)入りコンプリートRPMI1640メディウムで5日間培養して得られた骨髄由来マクロファージ(1×106個)、L929細胞の培養上清を20%含有したDMEM培地で7日間培養して得られた骨髄由来マクロファージ、50ng/mlのGM−CSF(R&D製)入りコンプリートRPMI1640培地で6日間培養して得られた骨髄由来樹状細胞(1×106個)、又はpolymorphprep(Axis−Sheild製)を用いて添付された使用方法に基づいて単離したヒト末梢血由来PBMC(1×106個)に、上記「4.エキソソーム分離」に記載の方法に従って、ベーチェット病(BD)患者又は健常者から採取した100μl相当の血清から超遠心法によって調整されたエキソソーム、又は70μl相当の血清からExoquickを用いて調製されたエキソソームをふりかけ、24時間培養後、培養上清中のIL−1β、TNFα、IL−12p40/IL−23p35、及びIL−23p19の炎症性サイトカインの産生をELISA法により検討した。
上記「4.エキソソームの分離」に従って調製されたベーチェット病(BD)患者及び健常者由来のエキソソームを6〜8週齢のC57BL/6マウス(日本クレア製)の腹腔内に投与(血清100μl相当量の超遠心法にて調整したエキソソーム、および血清70μl相当量のExoquickで調製したエキソソーム)し、3時間後に5mlのPBSを腹腔内に投与して腹腔内に浸潤してくる細胞を洗浄回収した。溶液を遠心後、総細胞数をGUAVA(ミリポア製)を用いて数えた。また、一部の細胞を100倍希釈した抗Gr−1(Ly6G)抗体(BD Bioscience製)及び抗Ly6C抗体(BD Bioscience製)で染色して、腹腔内に浸潤した細胞に含まれる好中球(Ly6G陽性Ly6C陽性)および炎症性単球(Ly6G陰性Ly6C陽性)の割合をFACS(Canto II(BD Bioscience製))にて解析し、総細胞数との積にて好中球の細胞数を評価した。結果を図19に示す。
また、NLRP3 inflammasome及びIL−1受容体の関与を明らかにする目的に、NLRP3欠損マウス及びIL−1受容体アンタゴニスト(Millipore)を用いて同様の実験を行った。結果を図21に示す。
近年、IL−17産生性細胞への分化誘導に、IL−1βとIL−23が重要であることが示されている(Sutton, C. E. et al. Interleukin-1 and IL-23 induce innate IL-17 production from gammadelta T cells, amplifying Th17 responses and autoimmunity. Immunity 31, 331-41 (2009)、Martin, B., Hirota, K., Cua, D. J., Stockinger, B. & Veldhoen, M. Interleukin-17-producing gammadelta T cells selectively expand in response to pathogen products and environmental signals. Immunity 31, 321-30 (2009))。また、ベーチェット病の病因としてIL−17産生細胞の関与が示唆されている。前記(7−2)の結果から、本発明者は、ベーチェット病患者由来エキソソームはIL−17産生性細胞への分化にも関与するとの仮説を立てて以下の検討を行った。
Interphotoreceptor retinoid−binding protein(IRBP)特異的T細胞を得るために、コンプリートアジュバンドであるCFA(Sigma製)とIRBP1-20ペプチド(ANASPEC製)を混ぜ合わせたエマルジョン液200μlを、C57BL/6マウス(日本クレア製)のマウスの皮下に免疫し、同時に0.2μgの百日咳毒素を腹腔内投与した。12日後に脾臓及びリンパ節から細胞を調整し磁気ビーズ付きCD4抗体(MACS)を用いてCD4細胞を単離した。それらを、10μg/mlのIRBP1-20ペプチド及び10ng/mlのIL−23存在下に、放射線照射した脾臓細胞と供に72時間共培養した。増殖した細胞から、磁気ビーズ付きCD11c抗体(MACS)により陰性分画を単離し、IRBP特異的T細胞を得た。その後、IRBP特異的T細胞1×107個の細胞をC57BL/6マウスの静脈内に投与し、ベーチェット病の動物モデルの一つである実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)の誘導を行った。このモデルマウスに、上記「4.エキソソームの分離」に従って調製されたベーチェット病(BD)患者及び健常者由来のエキソソーム(血清30μl相当量のExoquickで調整したエキソソーム)を合計4回(0,1、2、7日目)静脈内投与し、13日目にマウスを安楽死させた後、眼球を取り出して4%PFAにて固定し、H&E染色を行った。結果を図23のaに示す。また、ブドウ膜炎の組織学的重症度について、論文(Agarwal, R. K., Silver, P. B. & Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 900, 443-69 (2012))の評価方法に基づいて評価した。結果を図23のbに示す。
自己免疫疾患患者においては、健常者に比べて血清中のmtDNA量が顕著に高く、これをバイオマーカーとして疾患の検出に利用することができることが示された。更に、自己免疫疾患患者においては、血清中の細胞外膜小胞、とりわけエキソソーム画分に特に多くのmtDNAが含まれていることが示された。また、mtDNAを多く含む患者由来エキソソームは炎症反応を亢進させることが示された。これらの知見により、ネクローシスやアポトーシスによらない新しいDAMPsの伝播様式が示唆されたとともに、エキソソームの脂質二重膜によってmtDNAがDNase等の影響を受けずに安定に存在するために、免疫反応の増強又は遷延化をもたらすと考えられ、血中エキソソームに存在するmtDNAが自己免疫疾患の主たる病因である可能性が示された。即ち、エキソソーム画分に含まれるmtDNAは自己免疫疾患のバイオマーカーとしてより一層高い精度を有し、病態を直接的に反映するとともに治療ターゲットとして有用であることが示された。
配列番号2はCOXIIIに対するリバースプライマーである。
配列番号3はNADHデヒドロゲナーゼに対するフォワードプライマーである。
配列番号4はNADHデヒドロゲナーゼに対するリバースプライマーである。
配列番号5はシトクロムbに対するフォワードプライマーである。
配列番号6はシトクロムbに対するリバースプライマーである。
Claims (4)
- 血清又は血漿中に含まれるミトコンドリアDNAの、ベーチェット病のバイオマーカーとしての使用であり、
血清又は血漿中のミトコンドリアDNA濃度を指標とする、使用。 - ミトコンドリアDNAが血清又は血漿中の細胞外膜小胞内に含まれる、請求項1に記載の使用。
- ミトコンドリアDNAが血清又は血漿中のエキソソーム内に含まれる、請求項1又は2に記載の使用。
- 下記工程を含むベーチェット病の罹患の有無の検出するために、ミトコンドリアDNAを測定する方法であって、
被検動物から得られた血清又は血漿中のミトコンドリアDNAをバイオマーカーとして測定する工程を含み、
前記ミトコンドリアDNAの測定が、シトクロムb、COXI、COXII、COXIII、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット1、NADHデヒドロゲナーゼブユニット2、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット3、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4L、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット6、ATPase第6サブユニット及びATPase第8サブユニットからなる群より選択される少なくとも1種のDNAに対するプライマー、又は当該DNAにハイブリダイズするプローブを用いて行われる、測定方法。
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