JP6605500B2 - 原料の生産増加のために使用する機能的dyrkp−1遺伝子を欠損する緑微細藻類 - Google Patents
原料の生産増加のために使用する機能的dyrkp−1遺伝子を欠損する緑微細藻類 Download PDFInfo
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Description
(i)DYRKP−1タンパク質の発現および/または活性が変更されている緑微細藻類細胞を培養するステップ;および
(ii)前記微細藻類による貯蔵蓄積および/またはバイオマス生産の増加を誘導するステップ
を含む、バイオマス原料を製造するための方法である。
例えば、この照射は、1日当たり8〜24時間の間、例えば、25と2000μmol光子m−2s−1の間に含まれる、少なくとも25μmol光子m−2s−1、または少なくとも100μmol光子m−2s−1の強度で実施することができる。当業者は、光強度の効果は、実際には、微細藻類によって実際に受信される強度に依存し、したがって、細胞密度および光バイオリアクターの形状等のようないくつかのパラメーターに依存し、特定の遭遇する条件に照射強度を適合させ得ることをよく知っている。
本発明は、後続のさらなる記載からより明らかに理解され、これは、添付図面と同様に、栄養欠乏に対するDYRKP−1活性を欠く微細藻類の応答を説明する実施例を指す。
灰色の配列は、アラインメントのために利用されなかった。明らかに不完全な遺伝子モデルが示される。アミノ酸の予測された番号が2つの比較ゲノムデータベースで異なった場合、通常、より長いバージョンが選択された。いくつかの遺伝子は、遺伝子座で3つの転写産物をかくまう異なるスプライス変異体、例えば、「ZmDYRKP3」を有する。ゼブラフィッシュ(Danio rerio)およびアフリカツメガエル(Xenopus laevis)の場合、全ての既存のDYRK遺伝子は、アラインメントのために提供されなかった。
方法
株および培養条件
Chochoisら, 2010年に記載されるように、株CC125(mt−nit1 nit2)は、異性体生成のための遺伝的背景として選択され、この研究において野生型株として使用された。変異株std1は、パロモマイシン耐性カセットAphVIIIを有するKpnI直線化プラスミドpSL−Xとの形質転換によって生成された。std1の場合、約4800bp−pSL−Xの約1900のbp断片のみは、ゲノム中に挿入された。細胞は、約100μEm−2秒−1連続光の下で、25℃のインキュベーターシェイカー中、トリス−酢酸―リン酸(TAP)培地(Harris, 2009年)において、混合栄養的に増殖された。欠乏実験のために、前培養は、空気中で2〜5×106細胞mL−1の密度に、TAP培地において混合栄養的に、またはMOPS緩衝最小培地(Harris, 2009年)および空気中2%CO2で光合成独立栄養的に増殖された。t=0でサンプルを採取した後、培養物を4分間25℃および1789gで遠心分離し、細胞ペレットを1度洗浄し、NまたはS欠乏培地中で再懸濁した。培養物の理想的に同一の細胞密度は、全ての研究株について比較可能なデータを取得するために重要であることに留意すべきである。std1のパルメロイド(palmelloid)形成により、mLあたりの総細胞体積またはクロロフィル含有量が飢餓前に培養物を調整するために比較された。
挿入DNAの組み込み頻度を確認するために、サザンブロット分析が野生型およびstd1変異体細胞を用いて行われた。ゲノムDNAは、前記(Tolleterら、2011年)のように準備され、NotIで制限された4、6または8μgゲノムDNAは、0.8%アガロースゲル中で分離され、ナイロン膜上にブロットされ、挿入耐性カセットのAphVIII遺伝子の部分に相補的なジゴキシゲニン標識プローブでハイブリダイズされた。PCR DIGプローブ合成キット(Roche)は、プライマー5’−CGAAGCATGGACGATGCGTT−3’(配列暗号4)および5’−CGAGACTGCGATCGAACGGACA−3’(配列番号5)を使用するプローブ標識のために使用された。得られた400bp−PCR断片とのハイブリダイゼーションは、DIG EASY Hyb緩衝液(Roche)を使用して50℃で一晩実施された。基質としての抗ジゴキシゲニンAPおよびCSPD(Roche)は、G:BOXChemin(Syngene)を使用してシグナルを検出するために使用された。パロモマイシン耐性カセットの組み込みの部位を決定するために、ゲノムウォ−キングは、ClontechからのGenomeWalkerキットにより実施された。菌株std1のゲノムDNAは、FspIを用いて消化され、製造業者の指示に適切に処理された。
アミノ酸配列は、MAFFTバージョン6ソフトウェアを使用して、アラインされた(Katohら、2002年)。次に、得られたアラインメントは、SeaViewバージョン4を使用して手動で、洗練され(Gouyら、2010年)、相同性が疑わしい領域は、さらなる分析から除外された。313アミノ酸位置の合計は、DYRKタンパク質の系統発生解析のために保持された。系統発生解析は、Phylogenetic Inference Package Phylipバージョン3.69で近隣結合(Neighbour−Joining(NJ))、最尤推定(Maximum Likelihood(ML))およびParsimony(Pars)アプローチを使用して実施された(Folensteinら、2005年)。PROTMLプログラムは、ML分析のために使用され、その配列入力順序は、無作為化された(20ジャンブル)。SEQBOOTおよびCONSENSEプログラムは、それぞれ100複製およびコンセンサスツリー再構成に対するブートストラップ値計算のために使用された。ノードの信頼性を調べるために、NJおよびPars分析は、NEIGHBORおよびPROTPARSプログラムを使用して行われた。NJ分析のために使用された距離マトリクスは、PROTDISTプログラムを用いて作成された。系統樹は、MEGA5で描かれた(Tamuraら、2011年)。
総RNAは、Liuら、2005年で記載されるように、単離された。RT−PRC反応のために、1μgのDNアーゼI処理された総RNAは、OneStep RT−PCRキット(Qiagen)の適用のために使用された。完全な転写DYRKP−1/STD1遺伝子の配列情報を得るために、3つの重複RT−PCRは、プライマー対5’−CATAGTGCTCAGCAGGGGACAAGGC−3’(配列番号10)(Std1UTR1)および5’−AGCGTGCCAGAGGTTTCGCCGTC−3’(配列番号11)(Std1P3rev)、5’−CCGCGGACGGCGAAACCTCTGGCAC−3’(配列番号12)(Std1FW2)および5’−GATCTCGTCCAGCGACTGGTCAAAGTAG−3’(配列番号13)(G4rev14)、および5’−GCGGATCCGACGAGCAGGGCAACGTGCTG−3’(配列番号14)(ACG4_FW3)および5’−CGGCAAGCTTCTACATGCTGTCGAGCGAGG−3’(配列番号15)(ACG4_Rev1)を使用して実施され、後者のプライマー対は、抗原として対応する領域を発現するために最初に作成された。野生型、変異体よび相補株での転写物レベルの比較のために、プライマー対Std1FW2およびG4rev14は、DYRKP−1転写産物の一部を増幅するために使用された。特異的プライマーは、構成的に発現されるコントロール遺伝子(5’--AATCGTGCGCGACATCAAGGAGAA−3’(配列番号16)および5’−TTGGCGATCCACATTTGCTGGAAGGT−3’(配列番号17))として役目を果たす、アクチン(遺伝子座名Cre13. g603700、タンパク質ID515031)のために設計された。
RNA抽出のために、相対的な時点での15mLの細胞培養物は、氷上に回収され、1分間、1789gで遠心分離され、500μL細胞懸濁液は、氷上で1.5mLチューブに移され、500μLのRNA溶解緩衝液と混合された。RNA抽出、ホルムアルデヒドアガロースゲル上での分離およびノーザンブロットは、Liuら、2005年で記載されるように実施された。膜は、ローディグコントロールとしてSTD1遺伝子またはCBLP2遺伝子の断片を含むDNAプローブを用いてハイブリダイズされた。A1.pAC−STD1プラスミドは、BamHI−HindIII制限ベクターpQE−30(Qiagen)とDYRKP−1の3’部分をコードするBamHI−HindII制限RT−PCR産物の連結反応によって得られた。RT−PCRは、プライマー5’−GCGGATCCGACGAGCAGGGCAACGTGCTG−3’(配列番号14)(ACG4_FW3)および5’−CGGCAAGCTTCTACATGCTGTCGAGCGAGG−3’(配列番号15)(ACG4_Rev1)を使用して実施され、a 1116 pb生成物を生じさせた。このpAC−STD1プラスミドからの1−kb BamHI−HindIII断片、およびCBLP2の1−kb cDNAは、ハイブリダイゼーションのために使用された。放射性シグナルは、BAS−IP MS2040 ホスホイメージャー(phosphorimager)プレート(Raytest; http://www. raytest. de)を使用して検出され、Molecular Imager FX(Bio−Rad; http://www.biorad.com/)を用いてスキャンされ、Quantity One−4. 5. 1プログラム(Bio−Rad)を使用して画像化された。
窒素欠乏時間経過実験中のゲノムDNA濃度を決定するために、平均で1.2mm3総細胞体積に相当する細胞は、遠心分離によって採取され、−80℃で保存された。各時点に対する2つの複製サンプルのゲノムDNAは、前記のようなフェノール−クロロホルム抽出によって調製された(Tolleterら、2011年)。DNA濃度は、NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific)を使用して測定された。
DYRKP−1の検出のために、可溶性細胞溶解物を次のように調製した:対数期における100mLの緑藻クラミドモナス細胞培養物(5×106細胞/mLまたは0.8mm3/mLに相当する)は、1789gで2分間の遠心分離によって採取され、1mLの溶解緩衝液(20mM HEPES−KOH pH 7. 2, 10 mMKCl, 1 mMMgCl2、154 mMNaCl, 0. 1×プロテアーゼ阻害剤カクテル;Sigma P9599)中で再懸濁された。細胞は、1秒パルス/1秒中断の設定で、90秒間、氷上で超音波処理された。溶解物は、スクロースクッション(20mM HEPES−KOH pH 7. 2, 0. 6 Mスクロース)にロードされ、151 300gおよび4℃で30分間、MLA−55ローター(Beckman Coulter)で遠心分離された。可溶性タンパク質は、2×サンプル(緩衝液Schulz−Raffeltら、2007年)または2×LSDサンプル緩衝液(Invitrogen)の1体積と混合され、8%SDSポリアクリルアミドゲル上での負荷前に5分間、95℃または10分間、70℃で加熱された。ウエスタンブロットは、精製されたペプチド抗体(www. proteogenix−antibody. com)を使用して、ECL(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo Scientific)によるDYRKP−1の発現を検出するために、1:45h間実施された。
でんぷんおよびクロロフィル含有量は、Chochoisら、2010年によって測定された。1mLの培養物が採取され、10分間、約20,000gで遠心分離され、クロロフィル抽出物のために1mLのメチルアルコール中に再懸濁され、−80℃で保存された。ペレットは乾燥され、400μLの水を加えた。でんぷんを可溶化するために、サンプルは、「乾燥サイクル」を設定してオートクレーブされた。その後、でんぷんは、200μLのアミログリコシド溶液(1U/mL、Roche)を添加し、55℃で1〜2時間インキュベーションによって、グルコースに分解された。自動化された糖分析器(Ysiモデル2700セレクト、イエロースプリングス、OH、USA)を使用して、グルコース濃度が決定された。クロロフィルは、メタノールによって抽出され、クロロフィルaおよびbは、UV−VIS分光光度計(ソフトウェアSP2000を用いるSAFAS UVmc2)を使用して、653、666および750nmで吸光度を測定することによって決定された。
緑藻クラミドモナス細胞(2mm3総細胞体積に相当する)は、(4℃で)2分間、1000gで、遠心分離によって採取された。細胞は、−80℃の下ですぐに凍結されるか、または即時脂質抽出のための熱イソプロパノール中でクエンチ(quench)された。総細胞脂質は、ヘキサンおよびイソプロパノールの混合物を使用して抽出された(Li−Beissonら、2010年)。総細胞脂質を含む有機溶媒相を回収し、窒素気流下で乾燥させ、次に、200μLのクロロホルム:メタノール(2:1v/v)中に、再懸濁させた。トリアシルグリセロール(TAG)は、薄層クロマトグラフ上で、他の脂質クラスから最初に分離され、水中8%H3PO4中で溶解された2%CuSO4で炭化され、次にTAG含有量は、C17:0TAG標準を用いて生じた標準曲線と比較された後、デンシトメトリー法に基づいて計算された(Siautら、2011年)。
クロロフィル蛍光は、Dual Pam−100(Heinz Walz)を使用して測定された。サンプルは、室温で一定の撹拌下で、キュベットに入れ、測定前の5〜10分間、暗所適用された。光曲線は、15〜715μmolm−2s−1PARの範囲で10の照射ステップで記録され、各光強度は、Fm’を測定するための飽和フラッシュ後30秒間維持された。ETRは、前記Rumeauら、2005年に記載されるように計算された。
培養物のバイオマス蓄積を決定するために、各時点で、3つの5mLサンプルが、使い捨てのアルミニウム皿(VWR、Ref.611−0739および−0741)上にガラス繊維フィルター上で滴下され、80℃のオーブン中で一晩乾燥された。培地の3つの10mLサンプルは、同等に処理された。紙フィルターは、細胞を添加前および後に秤量され、培地に対する平均値が差し引かれた。
光学顕微鏡について、ライカ(Leica)DMRXA顕微鏡が使用された(Leica Microsystems、ドイツ)。必要に応じて、細胞は、培地中で、0.25%グルタルアルデヒドで固定された。容易に細胞濃度を比較するために、Neubauerチャンバが使用された。画像は、Spot Insight4ソフトウェア(Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, USA; www. spotimaging. com)で記録された。
でんぷん分解変異体std1の同定および遺伝的特性評価
パロモマイシン(AphVIII)耐性カセットとの緑藻クラミドモナス野生株CC125の形質転換によって作成されるDNA挿入ライブラリーのスクリーニングから、でんぷん分解で影響を受けたいくつかの変異体が、以前に単離された(Chochoisら、2010年)。でんぷん分解1のためにstd1と呼ばれるこれらの変異体の1つは、野生型前駆体と比較して、暗所で、でんぷん分解のより遅い速度を示した(図1A)。サザンブロット分析は、変異体ゲノム中へのパロモマイシンカセットの単一統合を示した(図2A)。DNA隣接領域のシークエンシングは、遺伝子の第3のエクソン内で、AphVIIIカセットの挿入を示し、二重特異性チロシンリン酸化たんぱく質キナーゼDYRK2(クラミドモナスゲノムバージョン4.0)として注釈を付け、ここでDYRKP−1と改名した(図1B)。クラミドモナスDYRKP−1遺伝子モデルは、RT−PCRによって産生された3つの重複するcDNA断片をシークエンシングすることによって確認された(図1B)。クラミドモナスDYRKP−1は、14のエクソンおよび13のイントロン、3834のヌクレオチドを含むコード領域から構成される。遺伝子モデルCre07. g337300 (Phytozomev 9. 0)に関して、開始コドンは、51ヌクレオチド上流に位置する。
DYRKP遺伝子ファミリーの系統発生解析は、4つの異なる枝を区別することができた:前記のDYRKP1、DYRKP2およびYakサブファミリー、および新規DYRKグループ、これはクラミドモナスDYRKP−1/STD1を含む緑系統(植物、コケおよび藻類)のメンバーだけを含むDYRKP(植物DYRKのこと)とここでは命名する(図3A)。藻類ゲノムは、DYRKPグループの1つのメンバーを有し、コケおよび高等植物は、2〜6の植物様ホモログを保持する。興味深いことに、植物および藻類ゲノムは、Yakホモログを含むが、DYRK1ホモログを含まず(Hanら、2012年)、DYRK2ホモログは、藻類およびコケにおいてのみ同定され,高等植物では同定されない。DYRKキナーゼは、保存された配列の特徴、特に、保存された触媒ドメインに先行するDYRKホモロジー(DH)−boxを示す(図3B)。DYRK1およびDYRK2サブグループに対するコンセンサス配列は、Yakグループについてわずかに異なるNxGYDD (D/E) (N/R)xDYである(図3B)。新規に同定されたDYRKPグループのDH−boxは、変更されたモチーフ:(N/H)(R/K)TGFEExK(D/E/N)(F/L)を示す。
次に、窒素欠乏の効果は、細胞内エネルギー状態およびでんぷん(Ralら、2006年)またはTAG(Goodsonら、2011年)などの貯蔵化合物の蓄積に特異的に影響を与えることが知られる異なる増殖条件(混合栄養対光合成独立栄養)で試験された。(酢酸と光の両方の存在下で)混合栄養条件において、でんぷん蓄積の違いは、N欠乏に応答するWTおよびstd1変異体の間で観察されなかったが(図4A)、油含量の増加は、飢餓の1〜3日後に変異体で観察された(図4B)。完全な光合成独立栄養条件において、はるかに高い、難分解性のでんぷん蓄積が、WTおよび両方の相補株と比較して、std1で観察され(図4B)、油含有量は、飢餓の3日後の変異体で増加した(図4B)。N欠乏がより低いフルエンス率(35μmol光子m−2s−1)で、光合成独立栄養条件で行われた場合、WTおよび相補変異体株は、低いでんぷんレベルのみを蓄積した一方、std1変異体は、高いでんぷん量を蓄積した(図5A〜D)。
バイオマス生産の強い増加は、N欠乏培地で培養の3および10日後に採取した細胞ペレットの大きさからstd1で観察された(図6A)。特に、野性型および相補株は、約6〜7μm直径の単一細胞粒子としてカウントされ、std1変異体は、母細胞壁によって囲まれた2、4および8細胞の凝集体からなり、10〜20μm直径の粒子として測定された(図7)。いくつかの緑藻クラミドモナス変異体で前に記載されたこの表現型の特徴は、パルメロイド(palmelloid)と呼ばれる(Harris、2009年)。細胞凝集にもかかわらず、総細胞体積は、N豊富な条件下、野生型および変異体培養で同様であった(図6B)。窒素欠乏に応答して、総細胞体積は、野生型および相補培養物でわずかな変動のみを示したが、std1で強く増加した(図6B)。窒素欠乏が、混合栄養条件(TAP−N)で行われた場合、std1変異体は、野生型細胞として同様の挙動を示した(図8)。乾燥重量として測定されたバイオマスは、N欠乏の6日後の野生株および相補株で1.7倍、std1で3倍超の増加が見られた(図6C)。
我々は、ここで、緑系統に特異的な、新規サブグループに属するDYRKキナーゼホモログ(DYRKPと呼ばれる)で影響を受けるstd1変異体の特性について報告する。std1変異体、これまでに報告された緑系統の最初のDYRK変異体は、高い細胞内でんぷんおよび油量を蓄積し、栄養飢餓に応答して、持続的な光合成活性を示す。
異なる栄養条件(混合栄養対光合成独立栄養)で実施された実験で示されるように、栄養条件に加えて、細胞エネルギー状態は、変異体でのでんぷんおよび油蓄積の制御において、中心的な役割を果たす。混合栄養条件(酢酸含有培地で増殖する照射された細胞)、エネルギー状態が高い条件において、高いでんぷんレベルは、N欠乏に応答してWTで蓄積するが、でんぷんの増加は、std1で観察されない。これらの条件において、油含有量の増加は、変異体で観察されたことに注意されたい。しかしながら、光合成独立栄養条件において、WTでのでんぷん蓄積は、照射の強度に依存する(低い光強度で低く、より高い光でより高い)。驚くべきことに、でんぷん蓄積のエネルギー状態への依存性は、std1で失われ、一方、異なる速度で、異なる栄養条件で、変異体細胞は、同様のでんぷん量を蓄積する(図4Aおよび図5A、E)。
微細藻類において、光合成活性の低下は、光合成による還元力の発生および代謝目的のためにそれを使用する能力との間のバランスを維持するのを助ける栄養欠乏に対する一般的な細胞応答の一部である(Grossman、2000年)。sac1変異体(Sacclimation応答の欠陥)が、光合成を下方制御することができないために、光でのS欠乏の2日で死亡が報告され、PSIIセンターを損傷する反応性酸素種(RDS)の過剰産生をもたらした(Daviesら、1996年;Wykoffら、1998年)。対照的に、std1変異体は、コントロール株で観察されるものに類似する減少非光合成複合体を示すが(図4D)、その光合成活性は、減少する一方で、光合成独立栄養条件でコントロール株中より高い状態を維持している(図4Cおよび図5B、F)。並行して、std1変異体は、コントロール株より多い貯蔵化合物を蓄積する。したがって、本発明者らは、std1で発生する顕著なでんぷん蓄積が、光合成により発生する還元力のためのシンクとして機能し、したがって、光合成のフィードバック阻害を低減することを提案する。代謝物プロファイリング研究は、でんぷんバイオマス生産の間の負の相関関係の高等植物での存在を示す(Sulpiceら、2009年)。そのような負の相関関係は、少なくとも栄養不足の状態で、並列でんぷんおよびバイオマス産生が観察される栄養制限の条件では、std1変異体で破壊される。
栄養欠乏の条件で増殖および貯蔵蓄積を制御する負の調節因子の発見は、微細藻類にとって、重要なバイオテクノロジー的な意味を有する。実際、これらの単細胞微生物は、ますます、期待できる次世代バイオ燃料の生産のためのバイオマス原料と考えられる。高等植物と比較した場合、微細藻類の主要な利点の1つは、高いでんぷんまたは脂質量を蓄積するそれらの能力であり、これらの化合物は、それぞれ、バイオエタノールまたはバイオディーゼルに転換可能である。しかしながら、テクノ経済分析は、貯蔵化合物の生産性が、経済的実現可能性に到達するために、増加される必要があることを示している。
実施例1は、変異体std1での長期窒素飢餓後の油およびでんぷんの大規模な蓄積を記載する。変異体遺伝子DYRKと炭素貯蔵形成において観察された表現型の間の分子機構(複数可)を詳細に分析するために、変異体std1の比較トランスクリプトミクスな、定量的プロテオミクス並びにリピドミック(lipidomic)分析が実施され、その野生型バックグラウンド株137AHと比較した。
変異体std1過剰蓄積酸化MGDG
実施例1において、本発明者らは、長期窒素飢餓後の変異体std1において、トリアシルグリセロール(TAG、油)の過剰蓄積を観察した(図4B)。変異体において、全体のリピドミック変化の全体像を得るために、本発明者らは、薄層クロマトグラフ(TLC)に基づいて脂質クラスを定量化し、最先端のLC−MS/MSを使用して、脂質分子種での変化を比較した。第1に、各脂質クラスは、TLCに基づいて定量化された。図10Aに示されるように、全ての株に存在する古典的な極性脂質(すなわち、MGDG、DGDG、DGTS、PG、PE)に加えて、新しいバンドがTLCプレート上で、変異体std1中でのみMGDGのちょうど下で検出された(矢印で指す)。バンドに存在する脂質は、クロロホルムおよびメタノール(2:1)の混合液で溶出することを介して回収され、LC−MS/MSによって同定に供された。質量分析は、不飽和度の異なるレベルを有するC16およびC18脂肪酸の組み合わせを有する酸化MGDG34の混合物の存在を明らかにした。分子種酸化MGDG34の1つについての質量分析:xを図10Bに示す。
STD1タンパク質を含む潜在的な調節ネットワークのより良い理解を得るために、IlluminaRNA配列シーケンス技術(Genoscope)に基づく比較トランスクリプトミクス研究が実施された。トランスクリプトミックなデータセットの予備解析は、独立栄養条件下でWT細胞と比較してCreLOX1転写産物の6 log倍超の増加(LogFC)を明らかにした(表2)。15N/14N標識化に基づく定量的プロテオーム解析は、WTよりも変異体でのCreLOX1タンパク質(最大30 logFC)の著しい増加を示した(表2)。変異体細胞でのCreLOX1タンパク質量のこの大きな増加は、SDS−PAGE上で増加したシグナル(約110kDa)の観察によってさらに支持される。このバンドは回収され、主にCreLOX1タンパク質を実際に含むものとして同定された。(図13および表3)。
現在の結果に基づいて、本発明者らは、キナーゼSTD1は、LOX1タンパク質の陰性の調節因子として働くと仮定した。実際に、リポキシゲナーゼの生成物、オキシリピンは、多くの発達並びにストレス応答シグナル伝達ネットワークにおいて役割を果たすシグナル分子の大きな配列に対する前駆体である。この仮説を試験するために、カテコール(シグマカタログ番号452637)が使用された。カテコールは、細胞反応性酸素種をクエンチングすることによりリポキシゲナーゼの活性を阻害する、既知のリポキシゲナーゼ阻害剤である。2つの異なるカテコール濃度(5mMおよび10mM)が最初に試験された。5mMカテコールの存在で、TAGおよびでんぷん蓄積の両方は、窒素飢餓下で6日後のstd1変異体において阻害された(図14)。カテコールはまた、WT株で窒素飢餓に応答してTAG蓄積を阻害したが、しかしながら、でんぷん蓄積に対する効果は観察されなかった。他の条件が試験される。
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Claims (11)
- 以下のステップを含む、バイオマス原料を製造するための方法:
(i)DYRKP−1タンパク質の発現および/または活性が損なわれている緑微細藻類細胞を培養するステップ;および
(ii)窒素、硫黄およびリンからなる群から選択される少なくとも1つの元素を欠損した培地(欠乏培地)において前記微細藻類細胞を光合成独立栄養条件でインキュベートすることによって、前記微細藻類による貯蔵化合物の蓄積および/またはバイオマス生産の増加を誘導するステップ。 - 前記微細藻類は、機能的DYRKP−1遺伝子を欠損する、請求項1に記載の方法。
- 前記微細藻類は、クラミドモナス(Chlamydomonas)である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記微細藻類は、緑藻クラミドモナス(Chlamydomonas reinhardtii)である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- ステップ(ii)は、微細藻類細胞を照射することを含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記照射は、1日当たり8〜24時間の間、25と2000μmol光子m−2s−1の間に含まれる強度で実施される、請求項5に記載の方法。
- 欠乏培地中で微細藻類細胞をインキュベートするステップは、少なくとも24時間続く、請求項4〜6のいずれかに記載の方法。
- 欠乏培地中で、微細藻類細胞をインキュベートするステップは、2〜8日、好ましくは3〜6日続く、請求項7に記載の方法。
- ステップ(ii)において、該細胞は、欠乏培地中で、光合成独立栄養条件において、少なくとも15時間の間、インキュベートされる、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 油を製造するための、請求項9に記載の方法の使用。
- でんぷんおよび/またはバイオマスを製造するための、請求項9に記載の方法の使用。
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