CN109652407A - 一种微藻细胞总rna的提取方法 - Google Patents

一种微藻细胞总rna的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种微藻细胞总RNA的提取方法。本发明通过将微藻置于含有石英砂的植物RNA提取辅助液中进行研磨，实现了一步快速完成微藻的研磨与去多糖处理，对微藻菌体量的需求大大降低，大大简化了实验操作，降低实验耗时。本发明将微藻细胞壁的破碎与多糖的去除相结合，可在5min内完成细胞破壁与多糖去除，通过整体提取方法的创新与改良，使得微藻RNA提取时间缩短至30min以内，在此基础上，实现了微藻RNA提取的所有操作可在一般实验室环境中进行，无需去除RNA酶的特殊提取环境。实验用品也均无需DEPC水去RNA酶处理。在减轻前期准备工作的同时免去了DEPC水对研究人员健康的损害，保护了实验人员的安全。

Description

一种微藻细胞总RNA的提取方法
技术领域
本发明属于RNA提取领域，具体涉及了一种微藻细胞总RNA的提取方法。
背景技术
微藻是一类含有叶绿素，能进行光合作用自养生长的一类微小生物的总称。由于其细胞富含藻多糖、蛋白质、脂肪酸等营养物质，而其又具有可以利用光合作用快速生长等特点而受到人们的广泛关注，在食品、保健、医疗等领域有着广阔的应用前景。微藻也由于其光合效率高、生长周期短、油脂含量高以及微藻生物柴油的物理和化学特性与传统柴油相似等特点，成为第三代生物柴油，作为现在最有希望实现工业化的生物柴油。
微藻虽然具有很高的价值和良好的应用前景，但是其实现工业化的产品却很少，其中一个很重要的原因是其基础研究的薄弱。基于微藻RNA的功能基因相对荧光定量分析，转录组测序及分析在微藻的基础及前沿研究中扮演了非常重要的作用。而微藻RNA提取的便捷性也直接影响到整体实验工作的进展速度。但是目前关于微藻RNA的提取仍存在几个问题：
1，微藻RNA提取时样品量需求量大：传统微藻RNA提取第一步通常是液氮研磨，所以较大的样品量，使得动态监测微藻RNA水平变得困难。
2，微藻多糖严重影响RNA提取：藻细胞中富含藻多糖，而多糖会在微藻破壁后结合RNA一起沉淀，使得RNA的提取质量严重下降，而且微藻培养到后期其多糖的含量增加，更加增加了RNA提取的困难。
3，DEPC水的危害：一般提取RNA时，所有的实验用品，实验产所都要经过DEPC水去RNA酶处理，而DEPC水是致癌的，严重影响研究者的人身安全。
4，微藻RNA提取耗时长：由于提取微藻RNA的所有实验用品、工作台要经过去RNA酶处理，微藻要液氮研磨，Trizol提取RNA的基础耗时等因素的影响，使得一般的微藻RNA提取方法耗时长，一方面会影响RNA的得率及完整性，另一方面更不利于整体实验的顺利开展。
因此，研究一种安全、有效、快速的微藻细胞总RNA提取方法，对微藻的研究有着重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种微藻细胞总RNA的提取方法。该方法具有安全、有效、快速的特点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种微藻细胞总RNA的提取方法，包括如下步骤：
(1)将2～6mL藻液离心浓缩收集的微藻细胞置于2mL离心管中；加入0.5～1.0mL植物RNA提取辅助液和0.3～0.8g石英砂，振荡破碎细胞后离心，收集上清液，用于后续的RNA提取；
还包括如下步骤：
(2)将上清液置于1.5mL离心管中，加入0.5mL Trizol混匀，加入200μL氯仿，剧烈振荡，待溶液充分乳化后，离心，上清液转移至新的1.5mL离心管中；
(3)加入等体积异丙醇，0.8～1μL核酸助沉剂，上下颠倒离心管充分混匀后，室温静置，离心，弃上清；
(4)加入75％乙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，离心，弃上清，室温干燥，加入20～30μL的RNase-free水溶解沉淀，得到总RNA。
优选的，所述的微藻包括Chlorella sacchrarophila、Chlorella pyrenoidosa、Scenedesmus obliquus、Chlamydomonas reinhardtii和Chlorella luteorividis中的至少一种，但本方法的应用不限于这些微藻，适用于所有微藻。
优选的，步骤(1)中所述的藻液的体积为4mL。
优选的，步骤(1)中，加入0.5mL植物RNA提取辅助液和0.5g石英砂。
优选的，步骤(1)中所述的离心浓缩的转速为10000～12000rpm；更优选为12000rpm。
优选的，步骤(1)中所述的植物RNA提取辅助液为TaKaRa公司的Fruit-mateTM。
优选的，步骤(1)中所述的石英砂的大小为5～20目；更优选为10目。
优选的，步骤(1)中所述的振荡的时间为3～8min；更优选为5min。
优选的，步骤(1)中所述的振荡破碎细胞后离心的条件为10000～12000rpm离心1min；更优选为12000rpm离心1min。
优选的，步骤(2)中所述的离心的条件为10000～12000rpm离心1min；更优选为12000rpm离心1min。
优选的，步骤(3)中所述的核酸助沉剂的用量为1μL。
优选的，步骤(3)中所述的核酸助沉剂为糖原(Glycogen，20mg/mL)。
优选的，步骤(3)中所述的室温静置的时间为8～10分钟；更优选为10分钟。
优选的，步骤(3)中所述的离心的条件为10000～12000rpm离心2min；更优选为12000rpm离心2min。
优选的，步骤(4)中所述的75％乙醇的用量为0.8～1mL；更优选为1mL。
优选的，步骤(4)中所述的离心的条件为10000～12000rpm离心1min；更优选为12000rpm离心1min。
优选的，步骤(4)中所述的室温干燥的时间为2～5min；更优选为2min。
所有操作可在一般实验室环境中进行，无需去除RNA酶的特殊提取环境，所用的离心管、枪头等实验用品均无需DEPC去RNA酶处理。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过引入石英砂对微藻进行振荡研磨，代替了微藻的液氮研磨，使得微藻RNA提取时对微藻菌体量的需求大大降低，并且简化了实验操作，降低了研磨耗时。
(2)本发明通过将微藻置于含有石英砂的植物RNA提取辅助液中进行研磨，实现了一步快速完成微藻的研磨与去多糖处理，大大简化了实验操作，降低实验耗时。
(3)本发明促进微藻RNA提取质量的同时还缩短了提取时间，免除了传统提取方法中DEPC水对人体的危害，对微藻的研究有着重要的意义。
(4)本发明将微藻细胞壁的破碎与多糖的去除相结合，可在5min内完成细胞破壁与多糖去除，通过整体提取方法的创新与改良，使得微藻RNA提取时间缩短至30min以内，在此基础上，实现了微藻RNA提取的所有操作可以在一般实验室环境中进行，无需去除RNA酶的特殊提取环境。实验中所用的离心管、枪头等实验用品也均无需DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水去RNA酶处理。在减轻前期准备工作的同时免去了DEPC水对研究人员健康的损害，保护了实验人员的安全。
附图说明
图1是Chlorella sacchrarophila FACHB-4不同RNA提取方法结果；其中，1：本发明方法(实验组1)；2：普通Trizol法(实验组2)；3：本发明方法，但所用实验用品经DEPC水去RNA酶处理，使用专门的提RNA场所(实验组3)。
图2是使用新方法提取不同微藻的RNA结果；其中，1：ChlorellaluteorividisFACHB-1(实施例二)；2：Chlorella pyrenoidosa FACHB-5(实施例三)；3：Chlamydomonas reinhardtii FACHB-265(实施例四)；4：Scenedesmus obliquusFACHB-416(实施例五)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例一：
实验组1为用本发明方法提取培养24h的小球藻ChlorellasacchrarophilaFACHB-4(购买自武汉中国科学院野生生物种质库—淡水藻种库)RNA，其步骤为12000rpm离心浓缩4mL藻液至2mL螺口离心管中；加入0.5mL植物RNA提取辅助液(TaKaRa公司的Fruit-mateTM)，加入0.5g石英砂(10目左右)振荡仪振荡5min，12000rpm，离心1min吸取上清至新的1.5mL离心管中；加入0.5mL Trizol，混匀，加入200μL氯仿，剧烈振荡，待溶液充分乳化后，12000rpm，离心1min，吸取上清液转移至另一新的1.5mL离心管中；加入等体积异丙醇，1μL糖原(核酸助沉剂，Glycogen，20mg/mL)，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温静置10分钟，12000rpm，离心2min，弃上清；加入1mL 75％乙醇，上下颠倒离心管充分混匀后12000rpm，离心1min，弃上清；用10μL移液枪将离心管中液体小心吸干净，室温干燥2min，加入20μL的RNase-free水溶解沉淀。
实验组2为普通Trizol提RNA方法，其步骤为：离心收集20mL藻液，液氮充分研磨；加入2mL Trizol Reagent，反复抽吸，直至抽提液中无结团细胞；将Trizol混合液吸入离心管中，于4℃，12,000g转速下离心10min；上清转移至2mL离心管中，于室温下放置5min；加入0.2mL氯仿，用手大力摇15s，室温下放置2～3min，可观察到分层现象；于4℃，12,000g转速下离心15min；转移上层水相至1.5mL离心管，加入0.5mL异丙醇，充分混匀，可观察到液体变浑浊或微量沉淀，于室温下放置15min；于4℃，12,000g转速下离心10min；弃上清，加入1mL无水乙醇，混匀洗涤沉淀，于4℃，12,000g转速下离心10min；重复一次步骤9；弃上清，倒置晾干5～10min；加入30μL RNase-free水重溶RNA。
实验组3为使用本发明方法，且实验用品经DEPC水去RNA酶处理，并使用专门的提RNA场所。
RNA提取结束后经电泳检测，结果如图1所示，使用本发明方法提取的C.sacchrarophila FACHB-4三条条带(6S、18S、28S)清晰，说明RNA提取结果良好，可以满足后续实验要求。使用普通液氮研磨Trizol法提取的RNA 6S条带非常亮，但18S和28S非常淡，说明其RNA总量高，但降解非常严重。DEPC水处理的结果中，RNA三条条带都比在普通环境中提取的结果要亮，但差别不是很大。
综合上述结果可知，使用本发明方法，可在30min以内提取得到微藻RNA，并且其中的所有操作可以在一般实验室环境中进行，无需去除RNA酶的特殊提取环境。实验中所用的离心管、枪头等实验用品也均无需DEPC水去RNA酶处理。在减轻前期准备工作的同时免去了DEPC水对研究人员健康的损害。
实施例二：
用本发明方法提取培养24h的小球藻Chlorella luteorividis FACHB-1(购买自武汉中国科学院野生生物种质库—淡水藻种库)RNA，其具体步骤同实施例一。提取结果如图2，结果显示三条条带(6S、18S、28S)清晰，说明RNA提取结果良好，可以满足后续实验要求。
实施例三：
用本发明方法提取培养24h的小球藻Chlorella pyrenoidosa FACHB-5(购买自武汉中国科学院野生生物种质库—淡水藻种库)RNA，其具体步骤同实施例一。提取结果如图2，结果显示三条条带(6S、18S、28S)清晰，说明RNA提取结果良好，可以满足后续实验要求。
实施例四：
用本专利方法提取培养24h的莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtiiFACHB-265(购买自武汉中国科学院野生生物种质库—淡水藻种库)RNA，其具体步骤同实施例一。提取结果如图2，结果显示三条条带(6S、18S、28S)清晰，说明RNA提取结果良好，可以满足后续实验要求。
实施例五：
用本发明方法提取培养24h的斜生栅藻Scenedesmus obliquus FACHB-416(购买自武汉中国科学院野生生物种质库—淡水藻种库)RNA，其具体步骤同例一。提取结果如图2，结果显示三条条带(6S、18S、28S)清晰，说明RNA提取结果良好，可以满足后续实验要求。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微藻细胞总RNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将2～6mL藻液离心浓缩收集的微藻细胞置于2mL离心管中；加入0.5～1.0mL植物RNA提取辅助液和0.3～0.8g石英砂，振荡破碎细胞后离心，收集上清液，用于后续的RNA提取。
2.根据权利要求1所述的微藻细胞总RNA的提取方法，其特征在于：
还包括如下步骤：
(2)将上清液置于1.5mL离心管中，加入0.5mL Trizol混匀，加入200μL氯仿，剧烈振荡，待溶液充分乳化后，离心，上清液转移至新的1.5mL离心管中；
(3)加入等体积异丙醇，0.8～1μL核酸助沉剂，上下颠倒离心管充分混匀后，室温静置，离心，弃上清；
(4)加入75％乙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，离心，弃上清，室温干燥，加入20～30μL的RNase-free水溶解沉淀，得到总RNA。
3.根据权利要求1或2所述的微藻细胞总RNA的提取方法，其特征在于：
所述的微藻包括但不限于Chlorella sacchrarophila、Chlorella pyrenoidosa、Scenedesmus obliquus、Chlamydomonas reinhardtii和Chlorella luteorividis中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的微藻细胞总RNA的提取方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的藻液的体积为4mL；
步骤(1)中，加入0.5mL植物RNA提取辅助液和0.5g石英砂；
步骤(3)中所述的核酸助沉剂的用量为1μL。
5.根据权利要求1或2所述的微藻细胞总RNA的提取方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的离心浓缩的转速为10000～12000rpm；
步骤(1)中所述的石英砂的大小为5～20目；
步骤(1)中所述的振荡的时间为3～8min；
步骤(1)中所述的振荡破碎细胞后离心的条件为10000～12000rpm离心1min。
6.根据权利要求5所述的微藻细胞总RNA的提取方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的离心浓缩的转速为12000rpm；
步骤(1)中所述的石英砂的大小为10目；
步骤(1)中所述的振荡的时间为5min；
步骤(1)中所述的振荡破碎细胞后离心的条件为12000rpm离心1min。
7.根据权利要求2所述的微藻细胞总RNA的提取方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的离心的条件为10000～12000rpm离心1min；
步骤(3)中所述的室温静置的时间为8～10分钟；
步骤(3)中所述的离心的条件为10000～12000rpm离心2min。
8.根据权利要求7所述的微藻细胞总RNA的提取方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的离心的条件为12000rpm离心1min；
步骤(3)中所述的室温静置的时间为10分钟；
步骤(3)中所述的离心的条件为12000rpm离心2min。
9.根据权利要求2所述的微藻细胞总RNA的提取方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的75％乙醇的用量为0.8～1mL；
步骤(4)中所述的离心的条件为10000～12000rpm离心1min；
步骤(4)中所述的室温干燥的时间为2～5min。
10.根据权利要求9所述的微藻细胞总RNA的提取方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的75％乙醇的用量为1mL；
步骤(4)中所述的离心的条件为12000rpm离心1min；
步骤(4)中所述的室温干燥的时间为2min。
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