JP6604989B2 - 細胞表面抗原のイムノバインダーを同定するための方法 - Google Patents
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Description
抗体、その結合体および誘導体を包含するイムノバインダー(immunobinde
r)は、治療剤および診断剤として、非常に産業的に重要である。抗体調製もしくはスク
リーニングのための伝統的な方法は、通常は、可溶性の抗原を利用する。しかし、特定の
膜結合タンパク質抗原について、上記抗原上のコンフォメーションエピトープ(conf
ormational epitope)は、上記抗原が、上記膜から可溶化される場合
に改変され、抗体調製もしくはスクリーニングの失敗を生じる。さらに、イムノブロッテ
ィング法およびアフィニティークロマトグラフィー法における1つの重要な問題は、上記
抗原に対して中程度のアフィニティーを有する抗体が選択されることである。このことは
、多くの交叉反応性もしくは粘着性の抗体の包含を許容してしまい、連続したスクリーニ
ング手順において負担を引き起こす。膜結合抗原を発現する細胞は、抗体調製に直接使用
されてきたが、細胞表面抗原に対する高アフィニティー抗体を検出しかつ富化し得る効率
的なスクリーニング方法はなお、不足している。
本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合し得るイムノバインダー(例えば、scFv抗
体)を同定するための方法を提供する。本発明の方法は、一般に、標識された抗原発現細
胞と、標識されたイムノバインダー発現細胞とを接触させる工程および上記抗原発現細胞
に結合するイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して単離する工程を包含す
る。これら方法は、内在性膜タンパク質(例えば、GPCR)に存在するコンフォメーシ
ョンエピトープに対するイムノバインダーの迅速かつ効率的な同定のために特に有用であ
る。本発明はまた、本発明の方法を使用して同定された、単離されたイムノバインダーお
よびイムノバインダーをコードする核酸を提供する。
を同定するための方法を提供する。上記方法は、第1のソート可能(sortable)
な標識に作動可能に連結した複数のイムノバインダー発現細胞を提供する工程;第2のソ
ート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここ
で上記目的の抗原は、上記抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程;上記抗原発
現細胞と、上記イムノバインダー発現細胞とを接触させる工程;および上記複数のイムノ
バインダー発現細胞から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る1個以上のイムノバイ
ンダー発現細胞を、セルソーター(例えば、蛍光細胞分析分離装置)を使用して分離する
工程であって、ここで単一の細胞複合体(例えば、抗原と、B細胞レセプターとの間で形
成される複合体)における上記第1のおよび第2のソート可能な標識の存在は、抗原発現
細胞へのイムノバインダー発現細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合する
イムノバインダーを同定する、工程を包含する。
的に単離される。いくつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、クロ
ーン性増殖に供される。他の実施形態において、上記イムノバインダーをコードする核酸
配列は、イムノバインダー発現細胞から単離される。上記イムノバインダーをコードする
核酸配列を単離するのに適した方法としては、PCR(例えば、単一細胞PCR(sin
gle−cell PCR))が挙げられる。上記イムノバインダーをコードする核酸配
列は、上記細胞がクローン的に単離された後および/もしくはクローン性増殖の後に、単
離され得る。
現細胞は、上記イムノバインダーを機能的に特徴付けるために、細胞ベースのアッセイに
供される。適切な細胞ベースのアッセイとしては、CELISAが挙げられる。
しては、マウス抗体、ウサギ抗体、ウサギ化抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ラクダ化
抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体が挙げられる。適切な抗体形式としては、
Fab、Dab、ナノボディーおよびscFvが挙げられるが、これらに限定されない。
実施形態において、上記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である。他の実施形態に
おいて、上記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である。適切な内在性膜タンパク質とし
ては、GPCR(例えば、CXCR2)もしくはイオンチャネルが挙げられるが、これら
に限定されない。
識である。適切な蛍光標識としては、蛍光タンパク質、抗体/蛍光体結合体(fluor
conjugate)および蛍光性細胞標識が挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、ヒト細胞)である。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、外因性
抗原を発現する。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、発現ベクターでト
ランスフェクトされる。
乳動物細胞である。適切な哺乳動物細胞としては、B細胞(例えば、ウサギB細胞)が挙
げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記B細胞は、免疫
化した動物(例えば、DNAワクチン接種によって免疫化した動物)から単離される。い
くつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現さ
れるイムノバインダーを含む。
ードする単離された核酸分子を提供する。
めの方法を提供し、上記方法は、本発明の方法によって同定されたイムノバインダーをコ
ードする核酸配列を、上記コードされたイムノバインダーが産生されるように、発現環境
に導入する工程を包含する。
供する。
ーンを同定するための方法を提供し、上記方法は、動物を、細胞表面抗原をコードするD
NAで免疫化する工程;上記免疫化した動物からB細胞を単離する工程;上記B細胞を、
第1のソート可能な標識で標識する工程;第2のソート可能な標識に作動可能に連結した
複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで上記目的の抗原は、上記抗原発現細
胞の表面にディスプレイされる、工程;上記抗原発現細胞と、上記B細胞とを接触させる
工程;および上記複数のB細胞から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る1個以上の
B細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体にお
ける上記第1のおよび第2のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのB細胞の結合
を示し、それによって、目的の抗原に結合するB細胞クローンを同定する、工程を包含す
る。
本発明の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
目的の細胞表面抗原に特異的に結合するイムノバインダーを同定するための方法であって
、該方法は、
(a)第1のソート可能な標識に作動可能に連結された複数のイムノバインダー発現細
胞を提供する工程;
(b)第2のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工
程であって、ここで該目的の抗原は、該抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程
;
(c)該抗原発現細胞と、該イムノバインダー発現細胞とを接触させる工程;および
(d)該複数のイムノバインダー発現細胞から、該抗原発現細胞に特異的に結合し得る
1個以上のイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって
、ここで単一の細胞複合体における該第1のソート可能な標識および該第2のソート可能
な標識の存在は、抗原発現細胞へのイムノバインダー発現細胞の結合を示し、それによっ
て、目的の抗原に結合するイムノバインダーを同定する、工程、
を包含する、方法。
(項目2)
前記工程(d)において得られたイムノバインダー発現細胞をクローン的に単離し、必要
に応じて、続いて、該クローン的に単離された細胞のクローン性増殖を行う工程をさらに
包含する、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記イムノバインダーをコードする核酸配列を、前記単離されたイムノバインダー発現細
胞から得る工程をさらに包含する、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記イムノバインダーをコードする核酸配列は、PCRによって得られる、項目3に記載
の方法。
(項目5)
前記PCRは、単一細胞PCRである、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記単離されたイムノバインダー発現細胞を、細胞ベースのアッセイに供して、前記イム
ノバインダーを機能的に特徴付ける工程をさらに包含する、項目2に記載の方法。
(項目7)
前記細胞ベースのアッセイが、CELISAである、項目6に記載の方法。
(項目8)
細胞複合体が、抗原と、B細胞レセプターとの間に形成される、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記イムノバインダーは抗体である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記抗体は、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗
体およびキメラ抗体からなる群より選択される、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記抗体は、全長免疫グロブリン、Fab、Dabおよびナノボディーからなる群より選
択される、項目9に記載の方法。
(項目12)
前記抗体は、scFvである、項目9に記載の方法。
(項目13)
前記目的の抗原は、外因性遺伝子から発現される、上記項目のいずれか1項に記載の方法
。
(項目14)
前記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である、上記項目のいずれか1項に記載の方
法。
(項目15)
前記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記内在性膜タンパク質は、GPCRである、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記GPCRは、CXCR2、CXCR1、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CC
R1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CI
C−1、CIC−2、CIC−4、CIC−5、CIC−7、CIC−Ka、CIC−K
b、Bestrophins、TMEM16A、GABAレセプター、グリシンレセプタ
ー、ABC輸送体、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV
1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、スフィンゴシン−
1−ホスフェートレセプター(S1P1R)およびNMDAチャネルからなる群より選択
される、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記内在性膜タンパク質は、イオンチャネルである、項目15に記載の方法。
(項目19)
前記第1のソート可能な標識もしくは前記第2のソート可能な標識は、蛍光標識である、
上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記蛍光標識は、蛍光タンパク質、抗体/蛍光体結合体および蛍光性細胞標識からなる群
より選択される、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記セルソーターは、蛍光細胞分析分離装置である、上記項目のいずれか1項に記載の方
法。
(項目22)
前記抗原発現細胞は、酵母細胞、酵母スフェロプラストもしくは哺乳動物細胞である、上
記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記抗原発現細胞は、ヒト細胞である、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記抗原発現細胞は、外因性抗原を発現する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
前記抗原発現細胞は、発現ベクターでトランスフェクトされる、上記項目のいずれか1項
に記載の方法。
(項目26)
前記イムノバインダー発現細胞は、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞である、上記項目のい
ずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記イムノバインダー発現細胞は、B細胞である、上記項目のいずれか1項に記載の方法
。
(項目28)
前記B細胞は、ウサギB細胞である、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記B細胞は、免疫化した動物から単離される、項目27または28のいずれか1項に記
載の方法。
(項目30)
前記動物は、DNAワクチン接種によって免疫化される、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現されるイムノバインダーを含む
、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
項目1〜31のいずれか1項に記載の方法によって選択されるイムノバインダーをコード
する、単離された核酸分子。
(項目33)
目的の抗原に結合し得るイムノバインダーを生成する方法であって、該方法は、項目32
に記載のイムノバインダーをコードする核酸配列を、該コードされたイムノバインダーが
生成されるように、発現環境に導入する工程を包含する、方法。
(項目34)
項目33に記載の方法によって生成される、イムノバインダー。
(項目35)
目的の細胞表面抗原に特異的に結合するB細胞クローンを同定するための方法であって、
該方法は:
(a)動物を、細胞表面抗原をコードするDNAで免疫化する工程、
(b)B細胞を、免疫化した該動物から単離する工程、
(c)該B細胞を、第1のソート可能な標識で標識する工程;
(d)第2のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工
程であって、ここで該目的の抗原は、該抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程
;
(e)該抗原発現細胞と、該B細胞とを接触させる工程;および
(f)複数の該B細胞から、該抗原発現細胞に特異的に結合し得る1個以上のB細胞を
、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体における該第
1のソート可能な標識および該第2のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのB細
胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するB細胞クローンを同定する、工程
、
を包含する、方法。
本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合し得るイムノバインダー(例えば、scFv抗
体)を同定するための方法を提供する。本発明の方法は、一般に、標識した抗原発現細胞
と、標識したイムノバインダー発現細胞とを接触させる工程、および上記抗原発現細胞に
結合するイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して単離する工程を包含する
。これら方法は、内在性膜タンパク質(例えば、GPCR)に存在するコンフォメーショ
ンエピトープに対するイムノバインダーの迅速かつ効率的な同定のために特に有用である
。本発明はまた、本発明の方法を用いて同定された、単離されたイムノバインダーおよび
イムノバインダーをコードする核酸を提供する。
を同定するための方法を提供する。上記方法は、第1のソート可能な標識に作動可能に連
結した複数のイムノバインダー発現細胞を提供する工程;第2のソート可能な標識に作動
可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで上記目的の抗原は、
上記抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程;上記抗原発現細胞と、上記イムノ
バインダー発現細胞とを接触させる工程;ならびに上記複数のイムノバインダー発現細胞
から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る1個以上のイムノバインダー発現細胞を、
セルソーター(例えば、蛍光細胞分析分離装置)を使用して分離する工程であって、ここ
で単一の細胞複合体(例えば、抗原と、B細胞レセプターとの間で形成される複合体)に
おける上記第1のおよび第2のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのイムノバイ
ンダー発現細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するイムノバインダーを
同定する、工程を包含する。
的に単離される。
当業者に周知の方法を使用して、クローン性増殖に供される。
ダー発現細胞から単離される。上記核酸配列の単離は、クローン性単離の後もしくはクロ
ーン性増殖の後に起こり得る。上記イムノバインダーをコードする核酸配列の単離に適し
た方法としては、PCR(例えば、単一細胞PCR)が挙げられる。
現細胞は、上記イムノバインダーを機能的に特徴付けるために、細胞ベースのアッセイに
供される。適切な細胞ベースのアッセイとしては、CELISAが挙げられる。
としては、マウス抗体、ウサギ抗体、ウサギ化抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ラクダ
化抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体が挙げられる。適切な抗体形式として
は、Fab、Dab、ナノボディーおよびscFvが挙げられるが、これらに限定されな
い。
実施形態において、上記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である。他の実施形態に
おいて、上記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である。適切な内在性膜タンパク質とし
ては、Gタンパク質共役レセプター(GPCR(例えば、CXCR2))もしくはイオン
チャネルが挙げられるが、これらに限定されない。
識である。適切な蛍光標識としては、蛍光タンパク質、抗体/蛍光体結合体および蛍光性
細胞標識が挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、ヒト細胞)である。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、外因性
抗原を発現する。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、発現ベクターでト
ランスフェクトされる。
乳動物細胞である。適切な哺乳動物細胞としては、B細胞(例えば、ウサギB細胞)が挙
げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記B細胞は、免疫
化した動物(例えば、DNAワクチン接種によって免疫化した動物)から単離される。い
くつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現さ
れたイムノバインダーを含む。
ードする単離された核酸分子を提供する。
めの方法を提供し、上記方法は、本発明の方法によって同定されたイムノバインダーをコ
ードする核酸配列を、上記コードされたイムノバインダーが産生されるように、発現環境
に導入する工程を包含する。
供する。
ーンを同定するための方法を提供し、上記方法は、動物を、細胞表面抗原をコードするD
NAで免疫化する工程;B細胞を、上記免疫化した動物から単離する工程;上記B細胞を
、第1のソート可能な標識で標識する工程;第2のソート可能な標識に作動可能に連結し
た複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで上記目的の抗原は、上記抗原発現
細胞の表面にディスプレイされる、工程;上記抗原発現細胞と、上記B細胞とを接触させ
る工程;ならびに上記複数のB細胞から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る1個以
上のB細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体
における上記第1のおよび第2のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのB細胞の
結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するB細胞クローンを同定する、工程を包
含する。
本発明が、より容易に理解され得るように、特定の用語が、以下のとおりに定義される
。さらなる定義は、詳細な説明全体に記載される。
結合部分」、「抗原結合ポリペプチド」、もしくは「イムノバインダー」)またはその一
本鎖をいう。「抗体」とは、ジスルフィド結合で相互に連結されている少なくとも2個の
重(H)鎖および2個の軽(L)鎖を含む糖タンパク質、またはこれらの抗原結合部分を
いう。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書においてVHと省略される)および重鎖定常領
域から構成される。上記重鎖定常領域は、3個のドメイン(CH1、CH2およびCH3
)から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書においてVLと省略される)およ
び軽鎖定常領域から構成される。上記軽鎖定常領域は、1個のドメイン、CLから構成さ
れる。上記VHおよびVL領域は、超可変領域(相補性決定領域(CDR)といわれる)
にさらに分けられ得、超可変領域の間により保存された領域(フレームワーク領域(FR
)といわれる)が散在している。各VHおよびVLは、3個のCDRおよび4個のFRか
ら構成され、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと並べられる:FR1、CD
R1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。上記重鎖および軽鎖の可変領域は
、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。上記抗体の定常領域は、宿主組織もしくは宿
主因子(免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第1成
分(Clq)が挙げられる)への上記免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
変化したクラス、エフェクター機能および/もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に
新たな特性を付与する全く異なる分子(例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物
など)に連結されるように、上記定常領域もしくはその一部が、改変されているか、置換
されているか、もしくは交換されている抗体分子;あるいは(b)上記可変領域もしくは
その一部が、異なるかもしくは変化した抗原特異性を有する可変領域で改変されているか
、置換されているかもしくは交換されている抗体分子をいう。
)に特異的に結合する能力を保持している抗体の1種以上のフラグメントに言及する。あ
る抗体の抗原結合機能が全長抗体のフラグメントによって発揮され得ることが示された。
用語、抗体の「抗原結合部分」内に含まれる結合フラグメントの例としては、(i)Fa
bフラグメント(VLドメイン、VHドメイン、CLドメインおよびCH1ドメインから
なる一価のフラグメント);(ii)F(ab’)2フラグメント(ヒンジ領域でジスル
フィド結合によって連結された2個のFabフラグメントを含む二価のフラグメント);
(iii)Fdフラグメント(VHドメインおよびCH1ドメインからなる);(iv)
Fvフラグメント(抗体の単腕のVLドメインおよびVHドメインからなる);(v)d
Abフラグメントのような1個のドメイン(Wardら,(1989)Nature 3
41:544−546)(これは、VHドメインからなる);ならびに(vi)単離され
た相補性決定領域(CDR)または(vii)2個以上の単離されたCDRの組み合わせ
(これは、合成リンカーによって必要に応じて結合され得る)が挙げられる。さらに、上
記Fvフラグメントの2個のドメイン(VLおよびVH)は別個の遺伝子によってコード
されるものの、それらは、上記VL領域およびVH領域が、一価の分子を形成するように
対になった1個のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって
、組換え法を使用して結合され得る(一本鎖Fv(scFv)として公知;例えば、Bi
rdら(1988)Science 242:423−426;およびHustonら(
1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883
を参照のこと)。このような一本鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合部分」内に含ま
れることが意図される。これら抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を使用し
て得られ、上記フラグメントは、インタクトな抗体と同じ様式で、有用性についてスクリ
ーニングされる。抗原結合部分は、組換えDNA技術によって、またはインタクトな免疫
グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって、産生され得る。抗体は、異なるアイソ
タイプ(例えば、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4サ
ブタイプ)、IgA1、IgA2、IgD、IgE、もしくはIgM抗体)のものであり
得る。
ば、上記重鎖可変ドメインおよび/もしくは軽鎖可変ドメインのうちの全てもしくは一部
)を含む分子に言及し、そのため上記イムノバインダーは、標的抗原を特異的に認識する
。イムノバインダーの非限定的例としては、全長免疫グロブリン分子およびscFv、な
らびに抗体フラグメント((i)Fabフラグメント(VLドメイン、VHドメイン、C
LドメインおよびCH1ドメインからなる一価のフラグメント);(ii)F(ab’)
2フラグメント(ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された2個のFabフラグ
メントを含む二価のフラグメント);(iii)Fab’フラグメント(これは、本質的
に、ヒンジ領域の一部を有するFabである)(FUNDAMENTAL IMMUNO
LOGY(Paul ed.,3.sup.rd ed.1993)を参照のこと);(
iv)Fdフラグメント(VHドメインおよびCH1ドメインからなる);(v)Fvフ
ラグメント(抗体の単腕のVLドメインおよびVHドメインからなる);(vi)単一ド
メイン抗体、例えば、Dabフラグメント(Wardら,(1989)Nature 3
41:544−546)(これは、VHドメインもしくはVLドメインからなる)、ラク
ダ科の動物の抗体(Hamers−Castermanら,Nature 363:44
6−448(1993)、およびDumoulinら,Protein Science
11:500−515(2002)を参照のこと)またはサメ抗体(例えば、サメIg
−NARs ナノボディー(登録商標));ならびに(vii)ナノボディー(1個の可
変ドメインおよび2個の定常ドメインを含む重鎖可変領域)が挙げられるが、これらに限
定されない)が挙げられる。
チドと比較して)が当業者にとって望ましいおよび/もしくは有利である(例えば、上記
ポリペプチドの製造特性もしくは治療効力を改善するために)、ポリペプチド(例えば、
イムノバインダー)の特性である。一実施形態において、上記機能的特性は、改善された
安定性(例えば、熱安定性)である。別の実施形態において、上記機能的特性は、改善さ
れた溶解度(例えば、細胞条件下で)である。なお別の実施形態において、上記機能的特
性は、非凝集性である。さらに別の実施形態において、上記機能的特性は、発現における
改善(例えば、原核生物細胞における)である。なお別の実施形態において、上記機能的
特性は、封入体精製プロセス後の再折りたたみ収率における改善である。特定の実施形態
において、上記機能的特性は、抗原結合アフィニティーにおける改善ではない。
該分野で認識された部分である。このようなフレームワーク領域は、代表的には、フレー
ムワーク1〜4(FR1、FR2、FR3、およびFR4)といわれ、三次元空間におい
て、上記CDRが、抗原結合表面を形成し得るように、重鎖抗体可変領域もしくは軽鎖抗
体可変領域において見いだされる3個のCDRを保持するための足場を提供する。このよ
うなフレームワークはまた、足場と言及され得る。なぜなら、それらは、より多様なCD
Rの提示のための支持物を提供するからである。上記免疫グロブリンスーパーファミリー
の他のCDRおよびフレームワーク(例えば、アンキリン反復およびフィブロネクチン)
は、抗原結合分子として使用され得る(例えば、米国特許第6,300,064号、同第
6,815,540号および米国特許出願公開第20040132028号もまた参照の
こと)。
的に結合する抗原上の部位をいう。エピトープは、代表的には、特有の空間的コンフォメ
ーション中に、少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個
、12個、13個、14個、もしくは15個のアミノ酸を含む。例えば、Epitope
Mapping Protocols in Methods in Molecul
ar Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996)を参
照のこと。
する」とは、抗体が所定の抗原上のエピトープに結合することに言及する。代表的には、
上記抗体は、ほぼ10−7M未満のアフィニティー(KD)(例えば、ほぼ10−8M未
満、10−9M未満もしくは10−10M未満もしくはさらにそれを下回る)で結合する
。
発明の抗体は、例えば、BIACORE機器において表面プラズモン共鳴(SPR)技術
を使用して決定される場合、ほぼ10−7M未満の解離平衡定数(KD)(例えば、ほぼ
10−8M未満、10−9M未満もしくは10−10M未満もしくはさらにそれを下回る
)で抗原に結合する。
2個の核酸の間の配列マッチングをいう。上記2個の比較される配列の両方における一部
が、同じ塩基もしくはアミノ酸のモノマーサブユニットによって占有されている場合(例
えば、2個のDNA分子のうちの各々におけるある位置が、アデニンによって占有される
場合、または2つのポリペプチドのうちの各々におけるある位置がリジンによって占有さ
れる場合)、それぞれの分子が、その位置において同一である。2個の配列の間の「パー
センテージ同一性」は、上記2個の配列によって共有されるマッチング位置の数を、比較
される位置の数で除算して、それを×100する関数である。例えば、2個の配列におけ
る位置10個のうちの6個がマッチしている場合、上記2個の配列は、60%同一性を有
する。例示すると、DNA配列CTGACTとCAGGTTは、50%同一性(6個の合
計位置のうちの3個がマッチしている)を共有する。一般に、比較は、2個の配列が最大
同一性を与えるように整列される場合に行われる。このようなアラインメントは、例えば
、Needlemanら(1970) J.Mol.Biol.48:443−453の
方法を使用して提供され得、Alignプログラム(DNAstar,Inc.)のよう
なコンピュータープログラムによって従来通り実行され得る。上記2個のアミノ酸配列の
間の%同一性はまた、PAM120重み付け残基表、ギャップ長ペナルティー12、およ
びギャップペナルティー4を使用するALIGNプログラム(version 2.0)
へ組み込まれたE.MeyersおよびW.Miller(Comput.Appl.B
iosci.,4:11−17(1988))のアルゴリズムを使用して、決定され得る
。さらに、2個のアミノ酸配列の間の%同一性は、Blossum 62マトリクスもし
くはPAM250マトリクスのいずれか、ならびにギャップ重み付け16、14、12、
10、8、6、もしくは4、および長さ重み付け1、2、3、4、5、もしくは6を使用
するGCGソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで入手可能)におけるGA
Pプログラムへと組み込まれたNeedleman and Wunsch(J.Mol
.Biol.48:444−453(1970))アルゴリズムを使用して決定され得る
。
であり、ここで類似の残基は、整列された参照配列における対応するアミノ酸残基につい
ての保存的置換である。この点において、参照配列における残基の「保存的置換」は、例
えば、類似の大きさ、形状、電荷、化学的特性(共有結合もしくは水素結合などを形成す
る能力を含む)を有する、上記対応する参照残基に物理的にもしくは機能的に類似の残基
による置換である。従って、「保存的置換で改変された」配列は、1個以上の保存的置換
が存在するという点で、参照配列もしくは野生型配列とは異なるものである。2個の配列
の間の上記「パーセンテージ類似性」は、上記2個の配列によって共有されるマッチする
残基もしくは保存的置換を含む位置の数を、比較される位置の数で除算して、それを×1
00する関数である。例えば、2個の配列における位置の10個のうちの6個がマッチし
、10個の位置のうちの2個が、保存的置換を含む場合、上記2個の配列は、80%陽性
類似性を有する。
結合特徴にネガティブに影響しないかもしくは上記結合特徴を改変しないアミノ酸改変に
言及することが意図される。このような保存的配列改変としては、ヌクレオチドおよびア
ミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。例えば、改変は、当該分野で公知の標準的
技術(例えば、部位指向性変異誘発およびPCR媒介性変異誘発)によって導入され得る
。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置
換されているものが挙げられる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該
分野で既に定義されている。これらファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸(
例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アス
パラギン酸、グルタミン酸)、非荷電性の極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン
、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトフ
ァン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイ
シン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β分枝側鎖を有するアミノ酸(例え
ば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、
チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられる。従って、所
定の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換され得る。抗
原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定するための方法は、当
該分野で周知である(例えば、Brummellら,Biochem.32:1180−
1187(1993);Kobayashiら Protein Eng.12(10)
:879−884(1999);およびBurksら Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 94:412−417(1997)を参照のこと)。
よび好ましくは、より多くの整列されたアミノ酸配列のマトリクスを使用し、各位置にお
ける最も頻度の高いアミノ酸残基を決定することが可能になるようにアラインメントにお
けるギャップを可能にして、生成され得るアミノ酸配列に言及する。上記コンセンサス配
列は、最も頻繁に各位置において現れるアミノ酸を含む配列である。2個以上のアミノ酸
が単一の位置において等しく現れる事象において、上記コンセンサス配列は、それらアミ
ノ酸の両方もしくは全てを含む。
変動性は、上記単一の残基レベル、複数の残基レベル、ギャップを有する複数の残基など
で示され得る。残基は、同一の残基の保存を示し得るか、またはクラスレベルで保存され
得る。アミノ酸クラスの例としては、極性であるが、非荷電性のR基(セリン、スレオニ
ン、アスパラギンおよびグルタミン);正に荷電したR基(リジン、アルギニン、および
ヒスチジン);負に荷電したR基(グルタミン酸およびアスパラギン酸);疎水性R基(
アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、
バリンおよびチロシン);ならびに特別のアミノ酸(システイン、グリシンおよびプロリ
ン)が挙げられる。他のクラスは、当業者に公知であり、置換可能性を評価するために、
構造的決定もしくは他のデータを使用して定義され得る。その意味において、置換可能な
アミノ酸は、置換され得かつその位置において機能的な保存を維持し得る任意のアミノ酸
に言及し得る。
り得ることは、認識される。例えば、特定の疎水性R基(例えば、アラニン)は、他の疎
水性R基(例えば、バリンもしくはロイシン)より親水性である(すなわち、親水性が高
いかもしくは疎水性が低い)ことが認識される。相対的な親水性もしくは疎水性は、当該
分野で認識される方法を使用して決定され得る(例えば、Roseら,Science,
229:834−838(1985)およびCornetteら,J.Mol.Biol
.,195:659−685(1987)を参照のこと)。
L配列)が、1個以上のさらなるアミノ酸配列(例えば、データベース中の1個以上のV
H配列もしくはVL配列)とアラインされる場合、1個の配列(例えば、上記第1のVH
配列もしくはVL配列)におけるアミノ酸位置は、上記1個以上のさらなるアミノ酸配列
における「対応する位置」に対して比較され得る。本明細書で使用される場合、上記「対
応する位置」は、比較されている配列(複数可)が最適にアラインされる場合に、すなわ
ち、上記配列が、最高の%同一性もしくは%類似性を達成するようにアラインされる場合
に、比較されている配列における等価な位置を表す。
であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは、二本鎖DNAである。核酸は、別の核
酸配列と機能的な関係に配置されている場合に、「作動可能に連結」されている。例えば
、プロモーターもしくはエンハンサーは、それらがコード配列の転写に影響を及ぼす場合
に、上記配列に作動可能に連結されている。
ターの1つのタイプは「プラスミド」であり、プラスミドは、さらなるDNAセグメント
が連結され得る環状の二本鎖DNAループをいう。ベクターの別のタイプは、ウイルスベ
クターであり、ここでさらなるDNAセグメントは、上記ウイルスゲノムへと連結され得
る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的に複製し得る(例え
ば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性の哺乳動物ベクター)。他
のベクター(例えば、非エピソーム性の哺乳動物ベクター)は、宿主細胞に導入されると
、上記宿主細胞のゲノムへと組み込まれ得、それによって、宿主ゲノムとともに複製され
る。
菌細胞、微生物細胞、植物細胞もしくは動物細胞が挙げられ得る。細菌(これは、形質転
換しやすい)としては、腸内細菌科(例えば、Escherichia coliもしく
はSalmonellaの株);Bacillaceae(例えば、Bacillus
subtilis);Pneumococcus;Streptococcus、および
Haemophilus influenzaeのメンバーが挙げられる。適切な微生物
としては、Saccharomyces cerevisiaeおよびPichia p
astorisが挙げられる。適切な動物宿主細胞株としては、CHO(チャイニーズ・
ハムスター卵巣株)およびNS0細胞が挙げられる。
treatment)」とは、本明細書で記載される治療的手段もしくは予防的手段をい
う。「処置」方法は、障害もしくは再発している障害の1個以上の症状を予防するため、
治癒させるため、遅延させるため、、もしくはその重篤度を軽減するためか、またはそれ
ら症状を改善するために、あるいはこのような処置(本発明の抗体)の非存在下で予測さ
れるものを超えて被験体の生存を長期化するために、このような処置(本発明の抗体)を
必要とする被験体(例えば、GPCR媒介性障害を有する被験体もしくはこのような障害
を最終的に獲得し得る被験体)に投与することを使用する。
くとも部分的に達成するに十分な量をいう。用語「治療上有効な用量」とは、上記疾患に
既に罹患している患者において、上記疾患およびその合併症を治癒させるかもしくは少な
くとも部分的に抑えるに十分な量として定義される。この使用に有効な量は、処置されて
いる障害の重篤度および患者自身の免疫系の全般的な状態に依存する。
よび組成物は、GPCR媒介性障害を有する被験体を処置するために使用され得る。
oridae)のファミリーに属する動物をいう。
分離するための任意の手段に言及する。このような手段としては、蛍光細胞分析分離装置
が挙げられるが、これらに限定されない。任意の細胞標識が、ソート可能な標識として使
用され得る。上記標識としては、蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質)、抗体
/蛍光体結合体および蛍光性細胞標識(例えば、蛍光性カルシウムイオンイオノフォア)
が挙げられるが、これらに限定されない。
抗原発現細胞に言及し、ここで上記結合は、上記抗原発現細胞の表面上の抗原によって媒
介される。いくつかの実施形態において、イムノバインダー発現細胞への抗原発現細胞の
結合は、上記抗原発現細胞の表面上の抗原と、上記イムノバインダー発現細胞の表面上の
イムノバインダーとの間の直接相互作用からなる。
の任意の手段に言及する。適切な手段としては、各ウェルが1個を超えない細胞のみを含
むようにする、複数ウェルプレートへの細胞の限界希釈および移動が挙げられるが、これ
らに限定されない。
現細胞によって発現されるイムノバインダーの核酸配列を得るための任意の手段に言及す
る。適切な手段としては、上記イムノバインダー発現細胞からの、イムノバインダーをコ
ードする核酸配列の核酸単離、PCR増幅およびDNA配列決定が挙げられるが、これら
に限定されない。いくつかの実施形態において、イムノバインダーをコードする核酸配列
は、1個の細胞からのPCR(すなわち、単一細胞PCR)によって増幅される。
例えば、外因性抗原は、上記宿主細胞とは異なる界、門、綱、目、属もしくは種に由来し
得る(例えば、酵母細胞において発現されるヒト抗原)。さらにもしくは代わりに、外因
性抗原は、同じ種に由来するが、その宿主細胞において不適切に発現され得る(例えば、
脳細胞において発現される肺特異的抗原)。「外因性抗原」はまた、正常な細胞において
通常見いだされない変異抗原(例えば、肺細胞において発現されるがん特異的変異抗原)
に言及する。
原に言及し、キメラであるか、または点変異、欠失および/もしくは挿入を含む抗原を包
含する。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は
、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明
細書に記載されるものに類似もしくは等価な方法および材料は、本発明の実施もしくは試
験において使用され得るが、適切な方法および材料が、以下に記載される。矛盾する場合
は、定義を含め、本明細書が優先する。さらに、上記材料、方法および例は、例示に過ぎ
ず、限定することを意図しない。
形態、選択および範囲は、随意に組み合わされ得ることが理解される。さらに、特定の実
施形態に依存して、選択された定義、実施形態もしくは範囲は、当てはまらない可能性が
ある。
よび分離するために、FACSを使用するスクリーニング法を提供する。特定の実施形態
において、上記イムノバインダーは、抗体である。
抗体調製のための標的抗原は、可溶性であるか、もしくは細胞表面上に発現されるか、
もしくは形質膜に結合されている任意のタンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、炭水化物
、脂質、および他の分子であり得る。抗原は、天然抗原であっても合成抗原であってもよ
い。好ましくは、標的抗原は、タンパク質もしくはペプチドである。標的抗原の非限定的
例としては、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1
、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC−
1、CIC−2、CIC−4、CIC−5、CIC−7、CIC−Ka、CIC−Kb、
Bestrophins、TMEM16A、GABAレセプター、グリシンレセプター、
ABC輸送体、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.
5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、スフィンゴシン−1−
ホスフェートレセプター(S1P1R)、NMDAチャネルなどが挙げられる。一実施形
態において、上記標的抗原は、膜貫通タンパク質である。別の実施形態において、上記標
的抗原は、マルチスパン(multispan)膜貫通タンパク質(例えば、Gタンパク
質共役レセプター(GPCR)、イオンチャネルなど)である。
FASEB J.,9:745−754,1995;Straderら Annu.R
ev.Biochem.,63:101−32,1994)。ヒト遺伝子のうちの1%は
、GPCRをコードし得ると推測されてきた。GPCRは、広く種々のリガンド(光子、
低分子の生体アミン(すなわち、エピネフリンおよびヒスタミン)、ペプチド(すなわち
、IL−8)から、大きな糖タンパク質ホルモン(すなわち、副甲状腺ホルモン)に及ぶ
)に結合する。リガンド結合の際に、GPCRは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質
(Gタンパク質)を活性化することによって細胞内シグナル伝達経路を調節する。興味深
いことに、GPCRは、ヒトサイトメガロウイルスおよびヘルペスウイルスにおいて機能
的ホモログを有し、このことは、GPCRが、ウイルス病因の展開の間に獲得され得たこ
とを示唆する(Straderら,FASEB J.,9:745−754,1995;
Arvanitakisら Nature,385:347−350,1997;Mur
phy,Annu.Rev.Immunol.12:593−633,1994)。
クラスタが、1次構造に位置し、その各領域において細胞膜を貫通する(横切る)ことで
ある。上記ドメインは、3個の細胞内ループ、3個の細胞外ループ、ならびにアミノ末端
ドメインおよびカルボキシル末端ドメインによって接続された膜貫通α−ヘリックスを表
すと考えられている(K.Palczewskiら,Science 289,739−
45(2000))。大部分のGPCRは、機能的タンパク質構造を安定化させると考え
られるジスルフィド結合を形成する最初の2個の細胞外ループの各々に、1個の保存され
たシステイン残基を有する。上記7個の膜貫通領域は、TM1、TM2、TM3、TM4
、TM5、TM6、およびTM7と称される。上記で詳述されるこれら構造は、Gタンパ
ク質共役レセプタータンパク質の中で共通しており、上記タンパク質が膜を貫通する上記
領域(膜を横切る領域もしくは膜貫通領域)に対応するアミノ酸配列、および上記膜を横
切る領域付近のアミノ酸配列は、しばしば、上記レセプターの中で高度に保存されている
ことは、周知である。従って、GPCRにおける高い相同性の程度に起因して、新規GP
CRの同定、ならびにこのような新規メンバーの細胞内部分および細胞外部分両方の同定
は、当業者によって容易に達成される。例示であるが、Watson and Arki
nstall(1994)の書籍(本明細書に参考として援用される)は、50個より多
くのGPCRの配列を提供する。上記書籍は、各配列について、上記膜貫通ドメインの各
々を含む正確な残基をさらに記載する。
かついくつかのGタンパク質共役レセプター膜貫通ドメインによって形成される親水性ソ
ケット(このソケットは、上記Gタンパク質共役レセプターの疎水性残基が取り囲んでい
る)を含むと考えられている。各Gタンパク質共役レセプター膜貫通ヘリックスの親水性
側が、内側へ向き、極性リガンド結合部位を形成すると仮定される。TM3は、リガンド
結合部位(例えば、TM3アスパラギン酸残基を含む)を有するとして、いくつかのGタ
ンパク質共役レセプターに影響を与えてきた。さらに、TM5 セリン、TM6アスパラ
ギンおよびTM6もしくはTM7フェニルアラニンもしくはチロシンはまた、リガンド結
合に関わっている。ペプチドホルモンレセプターおよび他のより大きなリガンド、例えば
、糖タンパク質(LH、FSH、hCG、TSH)を有するレセプター、ならびにレセプ
ターのCa2+/グルタミン酸/GABAクラスのリガンド結合部位は、上記細胞外ドメ
インおよびループにあるようである。
るヘリックスを有する上記GPCRの膜貫通ヘリックス3(TM3)および6(TM6)
のリガンド誘導性コンフォメーション変化である(U.Gether, and B.K
.Kolbilka,J.Biol.Chem.273,17979−17982(19
98))。これらヘリックスの動きは、続いて、上記レセプターの細胞内ループのコンフ
ォメーションを変化させて、会合ヘテロトリマーGタンパク質の活性化を促進する。変異
誘発研究(S.Cotecchia, J.Ostrowski, M.A.Kjels
berg, M.G.Caron and R.J.Lefkowitz,J.Biol
.Chem.267,1633−1639(1992);E.Kostenis, B.
R.Conklin and J.Wess,Biochemistry 36,148
7−1495(1997);M.A.Kjelsberg, S.Coteechia,
J.Ostrowski, M.G.Caron, and R.J.Lefkowi
tz,J.Biol.Chem.267,1430−1433(1992))は、第3の
細胞内ループ(i3)が、レセプターとGタンパク質との間の共役の大部分を媒介するこ
とを示した。ミニ遺伝子として発現されるI3ループはまた、Gq結合についてアドレナ
リン作動性レセプターと直接的に競合することが示され(L.M.Luttrell,
J.Ostrowski, S.Cotecchia, H.Kendal and R
.J.Lefkowitz,Science 259,1453−1457(1993)
)、または、無細胞条件下で可溶性ペプチドとしてGタンパク質を活性化し得る(T.O
kamotoら,Cell 67,723−730(1991))。
供給源のものであり得る。あるいは、外因性分子は、細胞へと導入されて、上記抗原を発
現し得る。細胞への上記抗原の導入は、当業者に公知の任意の方法によって行われ得る。
一実施形態において、上記抗原をポリペプチドとしてコードするポリヌクレオチドは、イ
ンビトロでベクターに挿入され得る。上記ベクターは、発現のために、標的細胞にさらに
導入され得る。上記ポリヌクレオチドは、上記標的抗原のcDNA配列、DNA配列、も
しくは当該分野で公知の他の配列を含み得る。上記ベクターは、プラスミド、コスミド、
リポソーム、または当該分野で公知の他の天然のもしくは人工のベクターであり得る。上
記導入は、トランスフェクション、形質転換、感染、物質の直接マイクロインジェクショ
ン、微粒子銃粒子送達(biolistic particle delivery)、
エレクトロポレーション、もしくは当該分野で公知の他の方法のプロセスであり得る。上
記抗原を発現する標的細胞は、当該分野で公知の任意の細胞(例えば、動物から直接採取
された細胞(例えば、がん細胞、非がん細胞、初代細胞など)、または分子操作された細
胞(例えば、培養細胞、例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO)細胞、HEK
293細胞など)、不死化細胞、トランスフェクトされた/感染させられた細胞、T細胞
などが挙げられる)であり得る。あるいは、上記標的細胞は、非動物供給源(例えば、細
菌、昆虫など)に由来し得る。一実施形態において、上記標的抗原を発現する細胞は、酵
母細胞、好ましくは、酵母スフェロプラスト(spheroblast)である。あるい
は、上記標的「細胞」は、人工細胞様体(artificial cell−like
body)もしくは構造(例えば、リポソーム、単層膜体など)であり得る。上記標的細
胞もしくは細胞様体における上記抗原の発現は、一過性であり得(すなわち、上記発現は
、比較的短期間(例えば、数分から数日)の後に弱まるかもしくは止まる)、または安定
であり得る(すなわち、上記発現は、比較的長期間(例えば、数日後もしくは細胞の数世
代後)にわたって比較的安定なレベルを維持する)。1つの好ましい実施形態において、
上記抗原は、上記標的細胞の形質膜の細胞外表面上に発現される。別の好ましい実施形態
において、上記抗原は、内在性膜抗原もしくはマルチスパン膜抗原である。形質膜上のそ
の位置に達するために、上記抗原は、これら位置で直接発現され得るか、または上記標的
細胞の細胞質におけるその発現後に、これら位置へとその位置が変えられ得る。この位置
移動は、上記標的細胞の天然のプロセスであり得、あるいは、上記抗原発現の前もしくは
その後に、その位置移動をもたらす、例えば、シグナル/タグ分子(例えば、ゴルジソー
ティングシグナル、特定の膜結合分子に対する抗体など)を結合させること、グラフト(
graft)を固定すること(anchoring)(例えば、グリコシルホスファチジ
ルイノシトール(GPI)アンカー)、もしくは上記抗原に化学架橋をすること、上記抗
原を変異させること、または当該分野で公知の他の方法による、操作されたプロセスであ
り得る。
一実施形態において、本明細書に記載される方法によって選択されるべきイムノバイン
ダー発現細胞は、哺乳動物B細胞、好ましくは、ウサギB細胞である。
上記動物の免疫化は、当業者に公知の任意の方法によって実施され得る。代表的には、上
記B細胞は、免疫化した動物のリンパ器官(例えば、脾臓もしくはリンパ節)から単離さ
れる。
種によって行われる。あるいは、上記標的抗原を発現する細胞は、免疫化のために、動物
(例えば、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなど)へと注
射される。この免疫化工程のために好ましい動物は、ウサギである。DNA免疫化/ワク
チン接種は、急激な免疫応答を誘導し、ならびに、標的抗原の天然の発現(通常、天然の
発現のみ)を可能にする。このことは、組換えタンパク質の発現および取り扱いを要しな
いので、このプロセスは、組換えタンパク質を用いた従来の免疫化より効率的かつ費用効
果的である。さらに、より重要なことには、上記インビボで発現された抗原は、その天然
の状況における標的タンパク質と同じ二次構造を有し、同じ翻訳後修飾を有しさえし得る
。このことは、上記標的抗原に対する調製された抗体による認識の正確さを改善する。例
示的DNA免疫化は、カナダ国特許出願CA2350078およびWO04/08721
6に示される。具体的には、上記標的抗原として上記ポリペプチドをコードするDNAは
、遺伝子銃法を通じて動物に直接導入され、上記動物においてポリペプチドの発現を生じ
、その発現は、上記ポリペプチドに対する抗体の形成を引き起こす。より強い抗体の形成
を達成するために、いわゆる遺伝子アジュバントを、上記ポリペプチドをコードするDN
Aと同時に適用する。これら遺伝子アジュバントは、サイトカイン(例えば、GM−CS
F、IL−4およびIL−10)を発現しかつ実験動物の体液性免疫応答を刺激するプラ
スミドである。好ましい一実施形態において、上記標的抗原に対する抗体は、B細胞レセ
プター(BCR)としてB細胞の細胞表面上に発現される。別の好ましい実施形態におい
て、上記抗体発現細胞は、いかなるIgMもその表面に存在しないことによって特徴付け
られ、通常のB細胞とは区別される記憶B細胞である。
バインダーは、好ましくは、抗体フラグメント、より好ましくは、scFvである。
免疫化工程の後、上記標的抗原に特異的に結合するB細胞上の膜結合抗体は、非特異的
抗体を発現する他の細胞から区別される必要がある。好ましい一実施形態において、上記
抗原−抗体結合を通じて、その形質膜上に上記特異的抗体を発現するB細胞は、上記抗原
を発現する標的細胞に付着する。もう一つの好ましい実施形態において、他のもしくはよ
り多くの相互作用(例えば、同じもしくは異なる抗原−抗体相互作用、化学的架橋、リガ
ンド−レセプター相互作用など)は、B細胞と標的細胞との間で起こり得る。上記B細胞
は、種々の抗体を発現するB細胞のプール中に、または上記免疫動物から直接、免疫化し
た/免役状態にしていない動物のプールから、もしくはインビトロ操作プロセス(例えば
、V(D)J遺伝的組み換え技術により異なる抗体を発現するB細胞のライブラリー)か
ら集められる他の免疫細胞と組み合わせて存在し得る。
の方法で行われ得る。これらとしては、抗原上でのパニング、限界希釈、アフィニティー
精製、または上記発現された抗体もしくは上記抗体生成B細胞の特徴を利用する他の方法
が挙げられるが、これらに限定されない。
出および/もしくは単離のために有用なタグで標識される。上記タグは、架橋剤(cro
sslinker)、抗原/抗体、低分子(例えば、グルタチオン(GSH)、ビオチン
/アビジンなど)、磁性粒子、蛍光タグなどであり得る。好ましい一実施形態において、
上記抗原発現細胞は、蛍光タンパク質/ペプチドで標識される。別の実施形態において、
上記抗体生成B細胞はまた、タグ、好ましくは、異なる蛍光タンパク質/ペプチドで標識
される。なお別の実施形態において、上記抗原発現細胞に付着した上記B細胞は、B細胞
上で標識された上記蛍光タンパク質/ペプチドからの蛍光放出によって検出され得る。さ
らに別の実施形態において、上記B細胞および上記付着した抗原発現細胞は、それらの上
で標識された2種の異なる蛍光タンパク質/ペプチドからの蛍光放出によって検出され得
る。好ましい一実施形態において、上記標的抗原に対して特異的な抗体を発現するB細胞
は、それらの上でおよび付着したAPC上で標識された蛍光タンパク質/ペプチドから、
両方の蛍光の放出によって、検出され得、かつ他の抗体生成B細胞とはさらに分離され得
る。好ましくは、この検出および分離は、蛍光活性化セルソーティング(FACS)技術
によって行われ得る。
anklin Lakes,NJ)が所有している。本明細書で使用される場合、用語F
ACSは、フローサイトメトリーベースのセルソーティングの任意の形態を表すものとす
る。
、各細胞の特異的光散乱および蛍光特徴に基づいて、2個以上の容器の中に、一度に1細
胞、生物学的細胞の不均一な混合物をソートするための方法を提供する。それは、個々の
細胞からの蛍光シグナルの迅速で、客観的かつ定量的な記録、ならびに特に目的の細胞の
物理的分離を提供するので、有用な科学機器である。
の中心に運ばれる。その流れは、それらの直径に対して細胞間で大まかな分離がされるよ
うに、調整される。振動機構は、細胞のストリームを、個々の液滴へとばらばらにする。
上記システムは、1個より多くの細胞が液滴中に存在する可能性を低くするように調節さ
れる。上記ストリームが液滴へとばらばらになる直前に、上記流れは、各細胞の目的の蛍
光特徴が測定される蛍光測定ステーションを通る。電荷をかける環(electrica
l charging ring)が、上記ストリームが液滴へとばらばらになるちょう
どその地点に配置される。電荷は、直前の蛍光強度測定値に基づいて上記環にかけられ、
その逆の電荷が、上記ストリームからばらばらになるにつれて、上記液滴上に捕捉される
。上記荷電した液滴は、次いで、それらの電荷に基づいて、容器の中へと液滴をそらす静
電的偏向システムを通って落ちる。いくつかのシステムにおいて、上記電荷は、上記スト
リームに直接印加され、ばらばらになっている液滴は、上記ストリームと同じ符号の電荷
を保持する。次いで、上記ストリームは、上記液滴がばらばらになった後に、中性に戻さ
れる。
はレーザー、および利用可能な検出器に依存する。最も一般に利用可能な、シングルレー
ザー機械のレーザーは、青色アルゴンレーザー(488nm)である。この種のレーザー
で機能できる蛍光標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:1)緑色
蛍光(通常、FL1で表される):FITC、Alexa Fluor 488、GFP
、CFSE、CFDA−SE、およびDyLight 488;2)橙色オレンジ蛍光(
通常、FL2):PE、およびPI;3)赤色蛍光(通常、FL3):PerCP、PE
−Alexa Fluor 700、PE−Cy5(TRI−COLOR)、およびPE
−Cy5.5;ならびに4)赤外蛍光(通常、FL4;いくつかのFACS機械において
):PE−Alexa Fluor 750、およびPE−Cy7。他のレーザーおよび
それらの対応する蛍光標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:1)
赤色ダイオードレーザー(635nm):アロフィコシアニン(APC)、APC−Cy
7、Alexa Fluor 700、Cy5、およびDraq−5;ならびに2)紫色
レーザー(405nm):Pacific Orange、Amine Aqua、Pa
cific Blue、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)、
およびAlexa Fluor 405。
染色され、上記抗IgG抗体でのみ陽性染色されるが、抗IgM抗体で染色されない記憶
B細胞を優先的に選択する。IgGは、一般に、IgMより高いアフィニティーを有する
;表面にIgGを発現するが、IgMを発現しない(これは、記憶B細胞に特徴的である
)陽性B細胞は、それによって選択される。上記目的のために、マルチカラー染色が、好
ましくは使用され、ここでIgGに対して特異的な抗体およびIgMに対して特異的な抗
体が、別々に、例えば、APCおよびFITCでそれぞれ標識される。好ましくは、上記
標的抗原および/もしくは上記標的抗原を発現する標的細胞はまた、標識される。一実施
形態において、上記標的抗原は、上記標的抗原を発現する細胞を、細胞内蛍光色素で染色
することによって、間接的に染色される。
、ここでB細胞は、目的の標的抗原に特異的に結合する抗体を生成するB細胞を同定しか
つさらに単離するために、上記標的抗原を発現する細胞に付着し得る。好ましくは、上記
B細胞は、蛍光標識で標識され、上記標的抗原を発現する細胞は、異なる蛍光標識で別個
に標識される。これら標識は、細胞内、細胞外、もしくは形質膜中に組み込まれるかのい
ずれかで存在し得る。免疫化および抗体の生成後に、全てのB細胞は一緒にプールされ、
FACSシステムを通り抜ける。上記標的抗原に対して特異的な抗体を生成するB細胞の
みが、上記抗原発現細胞に付着する。それらの付着は、他の個々の細胞の間での大まかな
分離と比較して、上記流れ中のこれら2種の細胞の間の距離を短くし、このことは、それ
らが走査レーザービームを同時に通る間に検出可能な「バイカラー事象」をもたらす。従
って、上記目的の抗体を生成するB細胞は、同定され得、次いで、他の非特異的B細胞と
は異なる収集チューブへとソートされ得る。
作用が、細胞特徴の特定の改変(例えば、脱分極、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)
など)をもたらす場合、より多くの蛍光標識が、このような改変を可能にする細胞へと添
加され得る。従って、B細胞および接触した抗原発現細胞は、「トリカラー」事象もしく
は同時にさらに3色より多くの色を含む事象を表す。
い。一実施形態において、上記細胞−細胞相互作用は、いずれか細胞においても機能的変
化をもたらす。別の実施形態において、これら機能的変化は、上記標的抗原に特異的に結
合する抗体を生成するB細胞を同定しさらに分離するために使用され得る。例えば、上記
細胞−細胞相互作用は、何れの細胞においてもレセプターシグナル伝達を機能的にブロッ
クもしくは活性化し得、このことは、上記FACSシステムによって検出可能な細胞変化
(例えば、Ca2+流出変化など)をもたらす。従って、これら検出可能な機能的変化を
モニターすることによって、目的のB細胞はまた、同定されかつ分離され得る。レセプタ
ーシグナル伝達を機能的にブロックするかもしくは活性化する1つの特定の実施形態は、
B細胞を、GPCR(Gタンパク質共役レセプター)を機能的に発現する細胞とインキュ
ベートすることである。GPCRを介してシグナル伝達するアゴニストは、小胞体(en
doplasmatic reticulum)からGPDR媒介性Ca2+流出を誘導
するために、上記混合物に添加され得る。B細胞上に提示される抗体がアゴニストシグナ
ル伝達を機能的にブロックする場合、Ca2+流出もまた、この細胞−細胞相互作用によ
って結果的にブロックされる。Ca2+流出は、例えば、フローサイトメトリーによって
定量的に測定され得る。従って、Ca2+流出の増大もしくは低下のいずれかを示すB細
胞/標的細胞集団(conglomerate)のみが、ソートされる。
特定の実施形態において、B細胞は、抗体が培養培地へと分泌されるように、適切な条
件下で培養される。生成された抗体は、例えば、モノクローナル抗体である。上記培養は
、ヘルパー細胞株(例えば、胸腺腫ヘルパー細胞株(例えば、EL4−B5(Zuble
rら,1985,J.Immunol.,134(6):3662−3668を参照のこ
と))の使用を伴い得る。
成される抗体の選択性およびリガンドと競合する能力を評価するために、さらなる処理の
前に行われ得る。これらアッセイとしては、細胞ベースのアッセイ(例えば、細胞ELI
SA(CELISA)(これは、細胞全体がコーティングに使用される改変ELISAプ
ロセスである)が挙げられるが、これに限定されない。CA2350078において議論
されるように、CELISAは、実施例において以下に記載されるとおりに行われ得る。
上記確認工程は、上記標的に特異的に結合することについて、例えば、上記標的タンパク
質以外の細胞表面に発現されるタンパク質に対して指向される抗体を排除することについ
て、生成された抗体を試験するために、行われ得る。
直接試験され得、上記B細胞は、処理の前に、付着した抗原発現細胞から分離させられ得
る。
上記同定されかつ単離された(必要に応じて、アフィニティーアッセイ(例えば、CE
LISA)によって試験された)B細胞は、目的のイムノバインダーを生成するためにさ
らに処理され得る。伝統的なハイブリドーマ技術が、例えば、使用され得る。これは、上
記イムノバインダーを精製し、それらのアミノ酸配列および/もしくは核酸配列を解明す
るような工程を伴い得る。
の目的のために、ソートされたB細胞上に発現されるバインダーのCDR配列が、培養さ
れ、ソートされた細胞から、もしくは単一細胞から直接のいずれかで、RT−PCRによ
って回収される。一方のオリゴヌクレオチドプールが上記CDRをコードし、第2のプー
ルが適切なscFv足場のフレームワーク領域をコードする部分的に重複するオリゴヌク
レオチドの2個のプールの組み合わせは、1工程のPCR手順で、ヒト化scFvの精製
を可能にする。HT配列決定、クローニングおよび生成は、細胞培養上清中の分泌IgG
を特徴付ける代わりに、上記生成されたヒト化scFvの性能に基づいて、クローン選択
を行うことを可能にする。任意のウサギ抗体由来のCDRを受容するに適したscFv足
場が、同定されかつ特徴付けられてきた(「ウサギ化」ヒトFWもしくはウサギアクセプ
ターRabTor;WO09/155726を参照のこと(これは、その全体が本明細書
に参考として援用される))。いくつかの場合において、上記ウサギ特異的CDR間ジス
ルフィド結合をさらに含む種々のCDRの概念の証明が、示された。
本発明の方法を用いて同定されたイムノバインダーの抗原結合領域もしくはCDRは、
アクセプター抗体フレームワークへとグラフト化され得る。このようなグラフト化は、例
えば、イムノバインダーの免疫原性を低下させ得るか、またはその機能的特性を改善し得
る(例えば、熱力学的安定性を改善し得る)。
特許第5,225,539号(これは、その全体が本明細書に参考として援用される)に
おいてWinterによって開示された。
は、米国仮特許出願第61/075,697号および同第61/155,041号(これ
らは、その全体が本明細書に参考として援用される)に開示されている。これらストラテ
ジーは、Winterのものに関連するが、上記アクセプター抗体フレームワークが、全
てのヒトもしくは非ヒトのドナー抗体についての普遍的アクセプターとして特に適してい
るという点で、異なっている。特に、上記ヒト一本鎖フレームワークFW1.4(配列番
号1(WO03/097697においてa43と称される)および配列番号2(WO03
/097697)においてKI27と称される)の組み合わせ)は、ウサギ抗体の抗原結
合部位と非常に適合していることが示された。従って、上記FW1.4は、ウサギループ
のグラフト化に由来する安定なヒト化scFv抗体フラグメントを構築するための適切な
足場を表す。
ことによって、および/またはFW1.4の軽鎖中の1個の位置を置換することによって
最適化され得ることが、見いだされた。それによって、上記VH中の非常に種々のウサギ
CDRのループコンフォメーションが、上記ドナーフレームワークの配列とはほとんど無
関係に、完全に維持され得ることが、驚くべきことに見いだされた。FW1.4の重鎖中
の5個もしくは6個の残基およびFW1.4の軽鎖中の1個の位置は、ウサギ抗体におい
て保存されている。上記重鎖中の5個もしくは6個の位置のコンセンサス残基、ならびに
上記軽鎖中の1個の位置は、ウサギレパートリーから導き出され、ヒトアクセプターフレ
ームワークの配列へ導入された。結果として、改変フレームワーク1.4(そこでは、r
FW1.4もといわれる)は、実質的に任意のウサギCDRと適合性である。ウサギ野生
型一本鎖とは対照的に、異なるウサギCDRを含むrFW1.4は、十分に発現され、本
来のドナーウサギ抗体のアフィニティーをほとんど完全に保持する。
(i)配列番号1に対して少なくとも70%同一性、好ましくは、少なくとも75%、
80%、85%、90%、より好ましくは、少なくとも95%同一性を有する可変重鎖フ
レームワーク;および/または
(ii)配列番号2に対して少なくとも70%同一性、好ましくは、少なくとも75%
、80%、85%、90%、より好ましくは、少なくとも95%同一性を有する可変軽鎖
フレームワーク。
(T)を含む。
下を含む:
(i)配列番号1、配列番号4および配列番号6からなる群より選択される可変重鎖フ
レームワーク;および/または
(ii)配列番号2もしくは配列番号9の可変軽鎖フレームワーク。
鎖フレームワークに連結される。上記リンカーは、任意の適切なリンカー(例えば、配列
GGGGS(配列番号10)の1〜4回反復、好ましくは、(GGGGS)4ペプチド(
配列番号8)を含むリンカー、またはAlfthanら(1995)Protein E
ng.8:725−731に開示されるリンカー)であり得る。
、配列番号3に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、より好まし
くは、少なくとも95%の同一性を有する配列である。より好ましくは、上記イムノバイ
ンダーアクセプターフレームワークは、配列番号3を含むか、または配列番号3である。
、配列番号5に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、より好まし
くは、少なくとも95%の同一性を有する配列である。より好ましくは、上記イムノバイ
ンダーアクセプターフレームワークは、配列番号5を含むか、または配列番号5である。
、配列番号7に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、より好まし
くは少なくとも95%の同一性を有する配列である。より好ましくは、上記イムノバイン
ダーアクセプターフレームワークは、配列番号7を含むか、または配列番号7である。
に、ウサギイムノバインダーに由来するCDRのコンフォメーションを支持する1個以上
のアミノ酸残基をさらに含む。特に、上記残基は、24H、25H、56H、82H、8
4H、89Hおよび108H(AHo番号付け)からなる群より選択される1個以上のア
ミノ酸位置に存在する。これら位置は、CDRコンフォメーションに影響を与えることが
証明されているので、ドナーCDRに適合させるための変異が企図される。好ましくは、
上記1個以上の残基は、24位のスレオニン(T)、25位のバリン(V)、56位のグ
リシンもしくはアラニン(G/A)、82位のリジン(K)、84位のスレオニン(T)
、89位のバリン(V)および108位のアルギニン(R)(AHo番号付け)からなる
群より選択される。
番号6を含むか、または配列番号4もしくは配列番号6である。両方の可変重鎖フレーム
ワークは、例えば、任意の適切な軽鎖フレームワークと組み合わされ得る。
従って、Winterの一般的方法とは異なって、本発明のヒト化方法に使用される上
記フレームワーク配列は、必ずしも、上記ドナーCDRが由来する非ヒト(例えば、ウサ
ギ)抗体の配列に対して最大の配列類似性を示すフレームワーク配列ではない。さらに、
CDRコンフォメーションを支持するための上記ドナー配列からグラフト化するフレーム
ワーク残基は、必要とされない。
号(これは、その全体が本明細書に参考として援用される)に記載されている安定性増強
変異のうちの1個以上を含み得る。上記重鎖フレームワークにおける例示的な溶解度増強
置換は、12位、103位および144位(AHo番号付け)で見いだされる。より好ま
しくは、上記重鎖フレームワークは、(a)12位にセリン(S);(b)103位にセ
リン(S)もしくはスレオニン(T)、および/または(c)144位にセリン(S)も
しくはスレオニン(T)を含む。さらに、安定性増強アミノ酸は、上記可変軽鎖フレーム
ワーク(AHo番号付け)の1位、3位、4位、10位、47位、57位、91位、およ
び103位の1個以上の位置で存在し得る。より好ましくは、上記可変軽鎖フレームワー
クは、1位にグルタミン酸(E)、3位にバリン(V)、4位にロイシン(L)、10位
にセリン(S);47位にアルギニン(R)、57位にセリン(S)、91位にフェニル
アラニン(F)および/もしくは103位にバリン(V)を含む。
一般に、本発明の実施は、別段示されなければ、化学、分子生物学、組換えDNA技術
、免疫学の従来技術(特に、例えば、抗体技術)、およびポリペプチド調製の標準的技術
を使用する。例えば、Sambrook,Fritsch and Maniatis,
Molecular Cloning:Cold Spring Harbor Lab
oratory Press(1989);Antibody Engineering
Protocols(Methods in Molecular Biology)
,510,Paul,S.,Humana Pr(1996);Antibody En
gineering:A Practical Approach(Practical
Approach Series,169),McCafferty,Ed.,Irl
Pr(1996);Antibodies:A Laboratory Manual
,Harlowら,C.S.H.L.Press,Pub.(1999);およびCur
rent Protocols in Molecular Biology,eds.
Ausubelら,John Wiley & Sons(1992)を参照のこと。
以下の実施例は、CXCR2を発現する細胞を分析するためのCELISAの使用を記
載する:
CXCR2を発現するCHO細胞を、96ウェルの半分の面積のプレートに、50,0
00細胞/ウェルの密度で播種し得る。37℃で一晩インキュベートした後、細胞を、P
BS中1% ホルムアルデヒドで30分間、室温で固定し得る。細胞層を3回洗浄し得、
非特異的結合部位を、1時間にわたって室温で、細胞培養培地でブロックし得る。次に、
3回の洗浄工程の後、その上清を、培養培地で1:1に希釈し得、上記ウェルに添加し得
る。3個のコントロールウェル中、市販のウサギ抗CXCR2抗体を、上清中において添
加し得る。次いで、上清を、1時間半にわたって、室温で、上記細胞層上でインキュベー
トし得る。最後に、ウサギIgGを、HRPに結合させたヤギ抗ウサギIgG Fc抗体
で検出する。ペルオキシダーゼ基質(Rocheの青色POD基質)を添加して、比色反
応を行い、これを、1M HClで25分後に停止させ得る。吸光度を、450nmにお
いて測定し得る。
本発明において記載されるFACS(蛍光活性化セルソーティング)ベースのスクリー
ニングシステムをここで例示し、このシステムは、B細胞レセプター(BCR)を介して
目的の標的(特に、可溶性タンパク質)に結合し得るB細胞を選択し得る。この実施例に
おいて、上記標的は、蛍光色素(PEおよびPerCP)で標識した一本鎖抗VEGF抗
体ESBA903であった。リンパ球懸濁物を、組換え標的で免疫化したウサギの脾臓か
ら調製した。次いで、細胞を、PEおよびPerCPで標識したscFvと、ならびにI
gGに特異的な抗体(APC標識)もしくはIgMに特異的な抗体(FITC標識)と、
インキュベートした。表面にIgGを発現するが、IgMを発現しないESBA903陽
性B細胞をソートし、96ウェルプレート中に選択した(図2)。図2のパネルAに示さ
れるように、リンパ球を、前方散乱および側方散乱に従ってゲート制御した。それらの中
で、IgG+IgM−細胞(おそらく、記憶B細胞)を選択した(パネルB)。scFv
−PEおよびscFv−PerCPで二重染色された細胞を、上記scFvに対する高ア
フィニティーIgGをコードすると予測した(パネルC)。最も明るい蛍光を示す細胞を
、パネルDにおいて列挙したソーティング統計を用いて、96ウェルプレートにソートし
た。胸腺腫ヘルパー細胞株(EL4−B5:Zublerら,1985,J.Immun
ol.134(6):3662−3668を参照のこと)によって、選択されたB細胞を
増殖させ、形質細胞へと分化させ、次いで、抗体を分泌させた。これらIgG分子の標的
タンパク質に対するアフィニティーを、ELISAおよびBiacore測定によって確
認した。動力学的パラメーターを、7個の選択されたクローンについて表1に示す。これ
らクローン(約200個のソートした細胞のプールに由来)は、低nM〜pM範囲で高い
結合アフィニティーを示す。最後に、分泌IgG分子のmRNAを、6個の目的のクロー
ンから単離し、そのCDRを、ESBATech 一本鎖フレームワーク RabTor
(フレームワーク rFW1.4ともいわれる)にグラフト化した。
(選択された文献:)
Zuberら Mutant EL−4 thymoma cells polycl
onally activate murine and human B cells
via direct cell interaction. J Immunol.
1985;134(6):3662−3668。
上記で記載されたスクリーニングシステムは、上記標的が可溶性である場合、および組
換えタンパク質が利用可能である場合に効率的に機能する。しかし、いくつかの目的の標
的は、マルチスパン膜貫通タンパク質(例えば、GPCRおよびイオンチャネル)である
。組換えタンパク質での伝統的な免疫化は、これらの場合において、得策ではないか、ま
たは不可能である。さらに、B細胞のFACS選択は、上記抗原が内在性膜タンパク質で
ある場合に、精製され標識されたタンパク質の結合に基づいて行うことができない。これ
らの課題に対処するために、上記の手順の以下の改善を行った。
DNAワクチン接種は、ネイティブ(native)抗原に対して迅速な免疫応答を誘
導する。組換えタンパク質が必要とされないので、この技術は、一方で非常に費用効率的
であり、他方で、より重要なことには、この方法は、内在性膜複合体および/もしくはマ
ルチスパン膜タンパク質のネイティブ発現を可能にする。
フローサイトメトリーは、通常、単一の細胞がレーザービームを横切るときに、上記単
一の細胞によって発せられる蛍光を測定する。しかし、いくらかの研究者らは、細胞−細
胞相互作用(例えば、カドヘリンによって媒介される接着(Panorchanら,20
06,J.Cell Science,119,66−74;Leong et Hib
ma,2005,J.Immunol.Methods,302,116−124)もし
くはインテグリンによって媒介される接着(Gawazら,1991,J.Clin.I
nvest,88,1128−1134))を調査するために血球計算器を既に使用して
きた。しかし、このような研究は、このような細胞−細胞相互作用がセルソーティングの
物理的工程の間に損なわれないままであるか否かを実証しなかった。さらに、B細胞レセ
プターの、別の細胞の表面に存在するその標的への結合が、このような物理的ソーティン
グを許容にするのに十分強いことを決して示さなかった。
EK293細胞)を、選択した標的で一過性にもしくは優先的に安定にトランスフェクト
し得るか、または上記選択した標的を天然に発現する細胞を、使用し得る。このような標
的細胞を、細胞内蛍光色素(例えば、カルセイン)で染色し、免疫化したウサギの記憶B
リンパ球とインキュベートする。Bリンパ球を、細胞表面特異的マーカーに結合する蛍光
性の抗体で染色する。従って、BCR−標的相互作用を通じて、本来互いに付着する2つ
の細胞にあるバイカラー「事象」の選択(図1を参照のこと)が、達成され得る。
えば、IgGもしくはscFv形式において)がもたらされる.これら抗体の上記標的に
対する親和性を推測するために、CELISA(ELISA(ここで、コーティング工程
は、細胞全体を用いて行われる))を行う。この方法を用いると、抗体の選択性および上
記リガンドと競合する能力が、評価され得る。最後に、目的のクローンのCDRを、オリ
ゴ伸長法での遺伝子合成によって、本発明者らのウサギ化フレームワーク(RabTor
)へとクローニングする。
の相互作用がレセプターシグナル伝達を機能的にブロック/活性化する能力を選択するた
めにも使用され得る。例えば、B細胞を、GPCRを機能的に発現する細胞とインキュベ
ートし得る。GPCRを通じてシグナル伝達するアゴニストを、小胞体からのGPCR媒
介性Ca2+流出を誘導するために、上記混合物へ添加し得る。B細胞上に提示された抗
体がアゴニストシグナル伝達を機能的にブロックする場合、Ca2+流出はまた、結果的
にこの細胞−細胞相互作用によってブロックされ得る。Ca2+流出を、フローサイトメ
トリーによって定量的に測定し得る。従って、Ca2+流出を示さないB細胞/標的細胞
集団のみが、ソートされる。
CHO細胞との間の相互作用の検出)
膜貫通タンパク質に対するB細胞スクリーニングを始める前に、細胞−細胞相互作用(
および、特に、BCRと、標的細胞上の膜貫通タンパク質との間の相互作用)が、FAC
Sで確かに選択され得ることを実証しなければならない。フローサイトメトリーストリー
ムにおける高圧が、2個の細胞の間の非共有結合を壊すか否かを決定するために、以下の
実験を行った。
ACE切断部位に点変異を含む変異体膜結合TNFαを含む;例えば、Scallonら
J Pharmacol Exp Ther 2002;301:418〜26を参照
のこと)で安定にトランスフェクトしたCHO細胞(B−220細胞)を、PE標識抗T
NFα抗体でコーティングしたビーズとインキュベートした。この設定において、上記ビ
ーズは、記憶B細胞を模倣する。陰性コントロールとして、トランスフェクトしていない
CHO細胞を使用し、同様に、APC標識した非関連抗体(抗CD19)でコーティング
したビーズも使用した。撹拌しながら4℃で2時間にわたってインキュベートした後、上
記細胞−ビーズ懸濁物を、FACS(130μmノズルを使用する)によって分析した。
図3は、抗TNFαビーズとTNFαトランスフェクトしたCHO細胞との間の特異的結
合が、FACSで明らかに検出可能であったことを示す。実際に、このサンプル(上部パ
ネル)において、上記ビーズの約2/3が、細胞に結合した(585結合 対 267非
結合)。対照的に、上記コントロールサンプル(中央パネルおよび下部パネル)において
、ほとんどのビーズは、CHO細胞に結合しなかった。さらに、両方のビーズ集団(抗T
NFα−PEおよび抗CD19−APC)を、TNFαトランスフェクトしたCHO細胞
と一緒に混合した。図4は、抗TNFαビーズのうちの約1/2がCHO細胞に結合した
のに対して、上記抗CD19ビーズのうちの大部分が、結合しないままであったことを示
す。各サンプルにおける上記細胞に結合するビーズの割合を、表2に詳述する。従って、
内在性標的膜タンパク質にそれらのB細胞レセプターを通じて結合する単一のB細胞の特
異的選択が、フローサイトメトリーを使用して可能であったことが実証された。
(実施例3:抗TNFα抗体で免疫化したウサギから単離されたB細胞と、抗TNFα
抗体で飽和状態にした膜結合TNFαを発現するCHO細胞との間の相互作用の検出)
図5に示される実験については、リンパ球を、抗TNFα抗体(ESBA105,内部
で生成)で免疫化したウサギの脾臓もしくは免疫化していないウサギの脾臓のいずれかか
ら単離した。それらを、抗ウサギIgG−APCおよび抗ウサギIgM−FITC(Ab
D serotec)で染色し、その後、記憶B細胞(IgG+/IgM−)の純粋な集
団を得るために、予めソートした。並行して、TNFα発現CHO細胞(Dr.P Sc
heurich(Univ.of Stuttgart)によって寄付)に、1μg/m
L カルセイン−レッド(Invitrogen)(生細胞を蛍光染色する細胞質色素)
を添加した。次いで、これら細胞を、1回洗浄し100μg/mLのESBA105と(
あるいは陰性コントロールについては、なし)インキュベートし、最後に、PBSで再び
3回洗浄した。記憶B細胞を、約1:10の比率で上記CHO細胞と最終的に混合し、回
転プレート上で、4℃で2時間の間インキュベートした(濃度:3×107細胞/mL)
。
1)CHO−TNFα細胞+ESBA105+ESBA105で免疫化したウサギの記
憶B細胞
2)CHO−TNFα細胞+ESBA105+免疫化していないウサギの記憶B細胞
3)CHO−TNFα細胞+ESBA105で免疫化したウサギの記憶B細胞 。
CSによって測定した。表3aに示される集団階層によれば、ESBA105で免疫化し
た細胞のうちの5%は、「ESBA105でコーティングした」TNFαトランスジェニ
ックCHO細胞に結合する。比較すると、ほんの0.5%の免疫化していないB細胞が、
これら「ESBA105でコーティングした」TNFαトランスジェニックCHO細胞に
結合し(表3b)、0.6%の免疫化したB細胞が、CHO細胞上のESBA105の非
存在下で結合する(表3c)。これら結果は、BCR(B細胞レセプター)と、膜貫通標
的との間の特異的相互作用が、FACSによって検出され得ることを示す。
(実施例4:ESBA105で免疫化したウサギから単離されたB細胞と、ESBA1
05で飽和状態にした膜結合TNFαを発現するCHO細胞との間の相互作用の検出)
さらなる実験において、記憶B細胞の予備ソーティングは行わなかった。リンパ球集団
全体を、染色したCHO−TNFα−ESBA105細胞とインキュベートした。トラン
スジェニックCHO細胞を、上記のように調製した。しかし、96ウェルプレートにおけ
るソート後にB細胞培養培地中でのそれらの増殖を妨げるために、上記細胞を、カルセイ
ン染色の前にマイトマイシンC(M4287−2MG)処理することによって、細胞周期
を停止させた。ESBA105免疫化ウサギのリンパ球を3:1の比で、上記染色したC
HO細胞と混合し(細胞懸濁物の濃度:約3−107細胞/mL)、回転プレート上で、
4℃で2時間の間インキュベートした。その後、上記細胞懸濁物を、FACS分析し、C
HO−TNFα−ESBA105に結合している記憶B細胞を、図6に示されるゲートに
従ってソートした(表3に示されるように、1細胞/ウェル、10細胞/ウェルもしくは
100細胞/ウェルで)。ソートした細胞は、上記記憶B細胞集団のうちの5.5%(そ
れぞれ、合計事象のうちの0.2%)を表した。
培養した。その後、培養上清を集め、直接ELISAで試験して、ESBA105結合I
gGの存在について調べた。ELISA結果(表3)は、ESBA105特異的抗体が多
くのウェルにおいて検出でき、単一のB細胞をソートしたウェルにおいても検出できたこ
とを示す。これら上清のBiacore(GE Healthcare)分析(表4)は
、これら抗体がESBA105標的に実際に結合することを確認した。
(実施例5:CXCR2(ソート27/29)で免疫化したウサギのリンパ球のスクリ
ーニング)
3羽のウサギを、CXCR2発現ベクターで免疫化した。CXCR2−cDNAの数回
の皮内適用の後に、血清を採取し、CXCR2トランスフェクトした細胞で特異的抗体の
存在について試験した。次いで、リンパ節細胞を取り出し、各1.6×107細胞ずつ5
つのアリコートに分けて凍結し、液体窒素タンク中に保存した。
して特異的な抗体(FITC標識)で染色した。並行して、CXCR2発現CHO細胞を
、上記細胞を死滅させることなくさらなる増殖を妨げるために、マイトマイシンCで処理
し、1μg/mL カルセイン−レッドを添加した。次いで、両方の細胞調製物を、最終
濃度107細胞/mlの、CXCR2トランスフェクトしたCHO細胞の2倍程度のリン
パ球と混合した。4℃で穏やかに攪拌しながら2時間インキュベートした後、細胞懸濁物
を、50μmフィルタで濾過し、FACSにかけた。図6に記載されるようにゲート制御
を行った。1つの「事象」(CXCR2トランスフェクトしたCHO細胞に結合した記憶
B細胞)を、合計10×96ウェルプレート(合計900事象)で、1ウェルあたりにソ
ートした。ソートした事象は、上記記憶B細胞集団のうちの3.1%(それぞれ、上記サ
ンプル中の合計細胞量の0.035%)を表した。
、100μLの培養上清を上記ウェルから集め、新鮮な培地と交換した。この培養期間の
間、B細胞は増殖し、形質細胞へと分化し、抗体を分泌した。どの上清がCXCR2特異
的抗体を含んでいたかを可視化するために、CELISAを行った。このために、CXC
R2を発現するCHO細胞を、96ウェルの半分の面積のプレートに、50,000細胞
/ウェルの密度で播種した。37℃で一晩インキュベートした後、細胞を、PBS中1%
ホルムアルデヒドで、室温で30分間にわたって固定した。次いで、細胞層を、3回洗
浄し、非特異的結合部位を、室温で1時間、細胞培養培地でブロックした。次に、3回の
洗浄工程の後、上記上清を培養培地中で1:1希釈し、各ウェルに添加した。3個のコン
トロールウェルにおいて、市販のウサギ抗CXCR2抗体を、上清中に添加した。上清を
、室温で1時間半、上記細胞層上でインキュベートした。最後に、ウサギIgGを、HR
Pに結合させたヤギ抗ウサギIgG Fc抗体で検出した。ペルオキシダーゼ基質(Ro
cheの青色POD基質)を添加して、比色反応を行って、1M HClで25分後に停
止させた。吸光度を450nmで測定した。
。全ての陽性を、第2のCELISAで確認した。上清をまた、他の細胞株:CHO−K
1(野生型)に対して試験して、起こり得る非特異的結合クローン(CHO−ヒトCXC
R1およびCHO−マウスCXCR2)を明らかにして、密に関連するレセプターもしく
は種対応物に対する交叉反応性を実証した。最後に、上清を、48個のCXCR2 N末
端アミノ酸からなるペプチドへの結合について、直接ELISAにおいて試験した。結果
を表5に示す。全ての選択した上清は、CELISAにおいて、ヒトCXCR2に対して
強いOD450シグナルを生成した。それらのうちのいくつかはまた、CHO野生型細胞
を用いたコントロール実験において僅かに陽性であった。このことは、それらが非特異的
な様式で結合し得ることを意味する。上記クローンのうちのいずれも、ヒトCXCR1と
も、マウスCXCR2とも交叉反応しなかった。最後に、いくつかのクローン(しかし、
それらのうちの全てではない)は、上記CXCR2 N末端ペプチドに結合した。このこ
とは、CXCR2上のあり得る代替の結合部位を示す。Biacoreチップに細胞全体
を固定化することが不可能であるとすると、CXCR2レセプターに対する選択された抗
体の親和性を定量的に測定することは、現在不可能である。しかし、集められたデータは
、ヒトCXCR2に特異的な抗体が、上記の細胞−細胞相互作用ソーティングシステムを
使用して選択されたことを示すように収束している。
(等価物)
本発明に対する多くの改変および代替の実施形態は、前述の説明に鑑みれば、当業者に
明らかである。よって、この説明は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実
施するためのベストモードを当業者に教示する目的である。構造の詳細は、本発明の趣旨
から逸脱することなく実質的に変動し得、添付の特許請求の範囲内にある全ての改変の独
占的な使用は確保され得る。本発明は、添付の特許請求の範囲および適用可能な法の支配
によって必要とされる程度にのみ限定されることが意図される。
条約、論文、ウェブページ、図面および/もしくは付録を含む)は、このような文献およ
び類似の資料の形式に拘わらず、それらの全体が本明細書に参考として援用される。援用
される文献および類似の資料のうちの1つ以上が、定義された用語、擁護の使用法、記載
された技術などを含め、本願と異なるか矛盾する場合には、本願が優先する。
Claims (6)
- 目的の抗原に結合し得るヒト化イムノバインダーを生成する方法であって、以下:
(i)目的の抗原に特異的に結合するイムノバインダーを同定する工程であって、
(a)非ヒト動物由来の複数のB細胞を提供する工程;
(b)該複数のB細胞と、第1のソート可能な標識を含む該目的の抗原とを接触させ、かつ、該複数のB細胞を、第2のソート可能な標識を含む抗IgG抗体および第3のソート可能な標識を含む抗IgM抗体で染色する工程;ならびに
(c)セルソーターを使用して、該複数のB細胞から、該目的の抗原に特異的に結合し得る1個以上のB細胞を分離する工程であって、複合体において、該第1および第2のソート可能な標識が存在するが、該第3のソート可能な標識が存在しないことは、目的の抗原へのB細胞の結合を示し、それによって、該目的の抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖のCDRを有するイムノバインダーを同定する、工程
を含む、工程と;
(ii)工程(c)の該イムノバインダー由来の重鎖CDRを、配列番号4の可変重鎖フレームワークに導入する工程であって、該可変重鎖フレームワークが、24位のスレオニン(T)、25位のバリン(V)、56位のグリシンもしくはアラニン(G/A)、82位のリジン(K)、84位のスレオニン(T)、89位のバリン(V)および108位のアルギニン(R)(AHoの番号付け)からなる群より選択される1個以上のアミノ酸残基を有する、工程と;
(iii)工程(c)の該イムノバインダー由来の軽鎖CDRを、3個の軽鎖CDRと軽鎖フレームワーク配列を含む可変軽鎖に導入する工程と
を含む、方法。 - 前記ヒト化イムノバインダーが、全長免疫グロブリン、FabまたはscFvである、請求項1に記載の方法。
- 前記ソート可能な標識が蛍光標識である、請求項1に記載の方法。
- 前記目的の抗原が可溶性抗原である、請求項1に記載の方法。
- 前記B細胞がウサギ由来のB細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記ウサギが目的の抗原で免疫化された、請求項5に記載の方法。
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CN1396182A (zh) * | 2002-07-31 | 2003-02-12 | 陕西超英生物医学研究开发有限公司 | 人内皮生长因子受体2蛋白全人单克隆抗体及其制备方法 |
WO2004016740A2 (en) * | 2002-08-15 | 2004-02-26 | Epitomics, Inc. | Humanized rabbit antibodies |
WO2004044584A1 (en) * | 2002-11-13 | 2004-05-27 | Micromet Ag | Method for identifying antigen specific b cells |
JP4336812B2 (ja) * | 2003-03-07 | 2009-09-30 | 博夫 岩田 | 細胞に発現する表面抗原を迅速に同定するための分析方法 |
WO2004102198A2 (en) * | 2003-05-15 | 2004-11-25 | Cytos Biotechnology Ag | Selection of b cells with specificity of interest: method of preparation and use |
WO2005016950A1 (en) * | 2003-08-07 | 2005-02-24 | Epitomics, Inc. | Methods for humanizing rabbit monoclonal antibodies |
WO2007003041A1 (en) * | 2005-07-01 | 2007-01-11 | John Schrader | Methods of isolating cells and generating monoclonal antibodies |
US20070134249A1 (en) | 2005-12-08 | 2007-06-14 | Genitope Corporation | Combination therapy and antibody panels |
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