JP2022515611A - 二重特異性抗ｍｕｃ１６×抗ｃｄ２８抗体およびその使用 - Google Patents

二重特異性抗ｍｕｃ１６×抗ｃｄ２８抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒトＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＭＵＣ１６に特異的に結合する第２の抗原結合分子とを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。ある特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、卵巣腫瘍などのＭＵＣ１６を発現する腫瘍の成長を阻害することができる。本発明の抗体および二重特異性抗原結合分子は、上方調節または誘発された標的免疫応答が望ましい、および／または治療的に有益である疾患および障害の治療に有用である。

Description

関連出願
この出願は、２０１８年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／７８２，１４２号、および２０１９年３月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８１５，８６１号に関し、それらの優先権を主張する。前述の出願の内容全体は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年１２月１８日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、名称が１０４９３ＷＯ０１＿１１８００３＿４９３２０＿ＳｅｑＬｓｔ．ｔｘｔ、サイズが３８，３７２バイトである。
本発明はまた、ＣＤ２８およびＭＵＣ１６などの標的分子に結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにそれらの使用方法に関する。
ＣＤ２８は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、これは、ホモ二量体として組み立てられた単一の細胞外Ｉｇ－Ｖ様ドメインを有し、Ｔ細胞の表面上で発現される。ＣＤ２８は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）タンパク質の受容体であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現されるＣＤ８０またはＣＤ８６によって活性化される。ＣＤ２８のＣＤ８０またはＣＤ８６への結合は、Ｔ細胞の活性化および生存に重要な共刺激シグナルを提供する。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えてＣＤ２８を介したＴ細胞刺激は、様々なインターロイキンの産生に強力なシグナルを提供する。ＣＤ２８はまた、ＴＣＲ活性化後、ＮＦκＢ転写因子によって制御される経路などの細胞シグナルを増強する。ＣＤ２８共シグナルは、Ｔ細胞の分化、増殖、サイトカイン放出、および細胞死などの効果的なＴ細胞活性化に重要である。
抗ＣＤ２８抗体は、Ｔ細胞の活性化を含む治療目的のために提案されている。１つの特定の抗ＣＤ２８抗体であるＴＧＮ１４１２（抗ＣＤ２８スーパーアゴニスト）が、２００６年の臨床試験で使用された。６人の健康なボランティアに、０．１ｍｇ／ｋｇの用量でＴＧＮ１４１２（抗ＣＤ２８スーパーアゴニスト）を静脈内投与した。２時間以内に、６人の患者全員が重大な炎症反応（サイトカインストーム）を有し、全患者が１６時間以内に多臓器不全に陥った。対象をコルチコステロイドで治療したところ、サイトカインは、２～３日以内に正常に戻った。第１相試験での０．１ｍｇ／ｋｇの開始用量は、カニクイザルにおける５０ｍｇ／ｋｇの無毒性量（「ＮＯＡＥＬ」）の５００倍量に基づいた（非特許文献１）。残念ながら、ＴＧＮ１４１２によって誘発されたサイトカインストームは、カニクイザルの毒物学研究またはエクスビボでのヒトＰＢＭＣ研究では予測されなかった。
癌抗原１２５、細胞癌抗原１２５、炭水化物抗原１２５、またはＣＡ－１２５としても既知であるムチン１６（ＭＵＣ１６）は、高度にグリコシル化された膜内在性糖タンパク質である。ＭＵＣ１６は、３つの主要ドメイン、すなわち細胞外Ｎ末端ドメイン、ウニ***、エンテロキナーゼ、アグリン（ＳＥＡ）ドメインが点在する大きな縦列反復ドメイン、ならびに膜貫通領域のセグメントおよび短い細胞質テールを含むカルボキシル末端ドメインを含む。タンパク質分解的切断により、ＭＵＣ１６の細胞外部分が血流に流出するようになる。ＭＵＣ１６は、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、肝内胆管癌－腫瘤形成型、子宮頸部腺癌、および胃腸腺癌を含む癌、ならびに炎症性腸疾患、肝硬変、心不全、腹膜感染症および腹部手術を含む疾患および病態において過剰発現する。（非特許文献２）。ＭＵＣ１６の癌細胞上での発現は腫瘍細胞を免疫系から保護することが示されている。（非特許文献３）。
ＭＵＣ１６に対する抗体を使用して卵巣癌を治療するための方法が研究されている。しかしながら、モノクローナル抗体であるオレゴボマブおよびアブゴボマブの成功は限定的であった。（前出の非特許文献４）。したがって、癌を治療するための改良されたＭＵＣ１６抗体が当該技術分野で必要とされている。
さらに、ＣＤ２８とＭＵＣ１６などの標的抗原との両方に結合する二重特異性抗原結合分子は、標的抗原を発現する腫瘍細胞の特異的標的化およびＴ細胞媒介性殺滅が望まれる治療環境において有用である。
Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｓｔｏｒｍ ｉｎ ａ Ｐｈａｓｅ １ Ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉ－ＣＤ２８ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴＧＮ１４１２，ＮＥＪＭ ３５５：１０１８－１０２８（２００６） Ｈａｒｉｄａｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２８：４１８３－４１９９ Ｆｅｌｄｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ，１３：１２９ Ｆｅｌｄｅｒ、Ｄａｓ，Ｓ．ａｎｄ Ｂａｔｒａ，Ｓ．Ｋ．２０１５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７５：４６６０－４６７４
第１の態様では、本発明は、ＣＤ２８およびＭＵＣ１６に結合する二重特異性抗原結合分子を提供し、これは、本明細書において「抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性分子」とも呼ばれる。抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性分子の抗ＭＵＣ１６部分は、ＭＵＣ１６を発現する腫瘍細胞（例えば、卵巣腫瘍細胞）を標的化するのに有用であり、二重特異性分子の抗ＣＤ２８部分は、Ｔ細胞を活性化するのに有用である。腫瘍細胞上のＭＵＣ１６およびＴ細胞上のＣＤ２８の同時結合は、活性化Ｔ細胞によって標的腫瘍細胞の直接死滅（細胞溶解）を促進する。したがって、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性分子は、とりわけ、ＭＵＣ１６発現腫瘍（例えば、卵巣癌）に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患および障害を治療するために有用である。
本発明のこの態様による二重特異性抗原結合分子は、ヒトＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、およびＭＵＣ１６に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。本発明は、各抗原結合ドメインが、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と対をなす重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）を含む。本発明のある特定の例示的実施形態において、抗ＣＤ２８抗原結合ドメインおよび抗ＭＵＣ１６抗原結合ドメインはそれぞれ、共通のＬＣＶＲと対をなす異なる別個のＨＣＶＲを含む。
本発明は、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性分子を提供し、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、表３に記載されるＨＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含む。ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインはまた、表３に記載されるＬＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含んでもよい。ある特定の実施形態によると、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、表３に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対のうちのいずれかを含む。本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性分子を提供し、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、表３に記載される重鎖ＣＤＲ１－ＣＤＲ２－ＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれか、および／または表３に記載される軽鎖ＣＤＲ１－ＣＤＲ２－ＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかを含む。
ある特定の実施形態によると、本発明は、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性分子を提供し、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１８および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性分子を提供し、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１０および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性分子を提供し、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１８／１０および４２／３４からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対を含む。
本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性分子を提供し、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号２４および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、配列番号１６および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列とを含む。
ある特定の実施形態では、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号２４／１６および４８／４０からなる群から選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を提供し、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号２０および４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、配列番号２２および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、配列番号１２および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、ならびに配列番号１４および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
本発明のある特定の非限定的で例示的な抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子は、それぞれ配列番号２０－２２－２４－１２－１４－１６および４４－４６－４８－３６－３８－４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、ＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインを含む。
本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性分子を提供し、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性分子を提供し、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１０および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性分子を提供し、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２／１０および２６／３４からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）のアミノ酸配列対を含む。
本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性分子を提供し、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号８および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、配列番号１６および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列とを含む。
特定の実施形態において、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号８／１６および３２／４０からなる群から選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
本発明はまた、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を提供し、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号４および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、配列番号６および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、配列番号１２および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列、ならびに配列番号１４および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
本発明のある特定の非限定的で例示的な抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子は、配列番号４－６－８－１２－１４－１６および２８－３０－３２－３６－３８－４０からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３を含む、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
関連する実施形態では、本発明は、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号２／１０および２６／３４からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列内に含有される重鎖および軽鎖ＣＤＲドメインを含む、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に開示される抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、またはＣＤＲ配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供し、本明細書の表２および／または表４に記載されるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、ならびに表２および／または表４に記載されるポリヌクレオチド配列のうちの２つ以上をその任意の機能的組み合わせまたは配置で含む核酸分子を含む。本発明の核酸を保有する組換え発現ベクター、およびそのようなベクターが導入された宿主細胞もまた、抗体の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって、および産生された抗体を回収することによって、抗体を産生する方法と同様に本発明に含まれる。
本発明は、ＣＤ２８に特異的に結合する前述の抗原結合ドメインのうちのいずれかが、ＭＵＣ１６に特異的に結合する前述の抗原結合ドメインのいずれかと組み合わされ、連結され、または他の方法で関連付けられて、ＣＤ２８およびＭＵＣ１６に結合する二重特異性抗原結合分子を形成する、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を含む。
本発明は、修飾グリコシル化パターンを有する抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を含む。いくつかの用途において、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾、または例えば抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）機能を増大させるためのオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠失している抗体が有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照）。他の用途では、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を修飾するために、ガラクトシル化の修飾を行うことができる。
別の態様では、本発明は、本明細書に開示される抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子と、第２の治療薬との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療薬は、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子と有利に組み合わされる任意の薬剤である。抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子と有利に組み合わせることができる例示的な薬剤は、本明細書の他所に詳細に論じられている。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を使用してＭＵＣ１６を発現する腫瘍細胞を標的化し／死滅させるための治療方法を提供し、本治療方法は、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を含む治療有効量の薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。
本発明はまた、ＭＵＣ１６発現に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患または障害の治療のための薬剤の製造における本発明の抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子の使用を含む。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を使用してＭＵＣ１６を発現する腫瘍細胞を標的化／殺滅するための治療方法を提供し、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３に結合する他の抗腫瘍二重特異性抗原結合分子と組み合わされる（例えば、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６は抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６抗体と組み合わされる）。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を使用してＭＵＣ１６を発現する腫瘍細胞を標的化／殺滅するための治療方法を提供し、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子は、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４を標的とするチェックポイント阻害剤と組み合わされる（例えば、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６は抗ＰＤ－１抗体と組み合わされる）。ある特定の実施形態では、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６抗体は、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、またはセミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））などのＰＤ－１を標的とする薬剤と組み合わせてもよいことが想定される。ある特定の実施形態では、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６抗体は、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、またはデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））などのＰＤ－Ｌ１を標的とする薬剤と組み合わせてもよいことが想定される。ある特定の実施形態では、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６抗体は、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））などのＣＴＬＡ－４を標的とする薬剤と組み合わせてもよいことが想定される。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を使用してＭＵＣ１６を発現する腫瘍細胞を標的化／殺滅するための治療方法を提供し、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３に結合する他の抗腫瘍二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６は抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体と組み合わされる）およびＰＤ－１、ＰＤＬ－１、またはＣＴＬＡ－４を標的とするチェックポイント阻害剤と組み合わされる（例えば、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６は抗ＰＤ－１抗体と組み合わされる）。
他の実施形態は、後述の詳細な説明の精査から明らかとなるであろう。
共刺激リガンド発現を導入した操作細胞株における腫瘍成長阻害を示すグラフである。３つの腫瘍細胞株、Ｂ１６Ｆ１０．９、ＥＬ４、およびＭＣ３８を、共刺激リガンド、またはＧＦＰ、または空ベクターを対照として発現するように操作した。操作された腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した。データは平均±ＳＥＭを表す。データは、群あたり５匹のマウスを用いた少なくとも１つの実験を表す。 グラフは、次のように計算した対照のパーセンテージとして腫瘍成長を示す。
Figure 2022515611000001
 図２Ａ～２Ｉは、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ２８が、抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ３および内在性ＭＵＣ１６を有する癌細胞株（ＰＥＯ１）によるＴＣＲ刺激の存在下でＴ細胞作用を増強することを示す、概略図およびグラフである。図２Ｂ～２Ｅは、ヒトＰＢＭＣのデータを示すグラフである。図２Ｆ～２Ｈは、カニクイザルＰＢＭＣのデータを示すグラフである。ヒトＴ細胞（図２Ｂ～２Ｅの場合）を、内在性ＭＵＣ１６発現を伴う癌標的細胞（卵巣癌株ＰＥＯ－１）および示された二重特異性抗体とともに９６時間培養した。図２Ａは、アッセイ設定の概略図である。 図２Ａ～２Ｉは、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ２８が、抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ３および内在性ＭＵＣ１６を有する癌細胞株（ＰＥＯ１）によるＴＣＲ刺激の存在下でＴ細胞作用を増強することを示す、概略図およびグラフである。図２Ｂ～２Ｅは、ヒトＰＢＭＣのデータを示すグラフである。図２Ｆ～２Ｈは、カニクイザルＰＢＭＣのデータを示すグラフである。ヒトＴ細胞（図２Ｂ～２Ｅの場合）を、内在性ＭＵＣ１６発現を伴う癌標的細胞（卵巣癌株ＰＥＯ－１）および示された二重特異性抗体とともに９６時間培養した。図２Ｂは、腫瘍細胞の殺滅を示すグラフである。Ｙ軸の値は、生存ＰＥＯ１細胞のパーセンテージを指す。 図２Ａ～２Ｉは、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ２８が、抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ３および内在性ＭＵＣ１６を有する癌細胞株（ＰＥＯ１）によるＴＣＲ刺激の存在下でＴ細胞作用を増強することを示す、概略図およびグラフである。図２Ｂ～２Ｅは、ヒトＰＢＭＣのデータを示すグラフである。図２Ｆ～２Ｈは、カニクイザルＰＢＭＣのデータを示すグラフである。ヒトＴ細胞（図２Ｂ～２Ｅの場合）を、内在性ＭＵＣ１６発現を伴う癌標的細胞（卵巣癌株ＰＥＯ－１）および示された二重特異性抗体とともに９６時間培養した。図２Ｃは、ＩＦＮγ放出を示すグラフである。 図２Ａ～２Ｉは、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ２８が、抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ３および内在性ＭＵＣ１６を有する癌細胞株（ＰＥＯ１）によるＴＣＲ刺激の存在下でＴ細胞作用を増強することを示す、概略図およびグラフである。図２Ｂ～２Ｅは、ヒトＰＢＭＣのデータを示すグラフである。図２Ｆ～２Ｈは、カニクイザルＰＢＭＣのデータを示すグラフである。ヒトＴ細胞（図２Ｂ～２Ｅの場合）を、内在性ＭＵＣ１６発現を伴う癌標的細胞（卵巣癌株ＰＥＯ－１）および示された二重特異性抗体とともに９６時間培養した。図２Ｄは、ＣＤ４ Ｔ細胞中のＣＤ２５＋のパーセンテージとして表した、ＣＤ４ Ｔ細胞の数およびＣＤ２５＋細胞の頻度を示すグラフである。 図２Ａ～２Ｉは、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ２８が、抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ３および内在性ＭＵＣ１６を有する癌細胞株（ＰＥＯ１）によるＴＣＲ刺激の存在下でＴ細胞作用を増強することを示す、概略図およびグラフである。図２Ｂ～２Ｅは、ヒトＰＢＭＣのデータを示すグラフである。図２Ｆ～２Ｈは、カニクイザルＰＢＭＣのデータを示すグラフである。ヒトＴ細胞（図２Ｂ～２Ｅの場合）を、内在性ＭＵＣ１６発現を伴う癌標的細胞（卵巣癌株ＰＥＯ－１）および示された二重特異性抗体とともに９６時間培養した。図２Ｅは、ＣＤ８ Ｔ細胞中のＣＤ２５＋のパーセンテージとして表した、ＣＤ８ Ｔ細胞の数およびＣＤ２５＋細胞の頻度を示すグラフである。 図２Ａ～２Ｉは、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ２８が、抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ３および内在性ＭＵＣ１６を有する癌細胞株（ＰＥＯ１）によるＴＣＲ刺激の存在下でＴ細胞作用を増強することを示す、概略図およびグラフである。図２Ｂ～２Ｅは、ヒトＰＢＭＣのデータを示すグラフである。図２Ｆ～２Ｈは、カニクイザルＰＢＭＣのデータを示すグラフである。ヒトＴ細胞（図２Ｂ～２Ｅの場合）を、内在性ＭＵＣ１６発現を伴う癌標的細胞（卵巣癌株ＰＥＯ－１）および示された二重特異性抗体とともに９６時間培養した。図２Ｆは、腫瘍細胞の殺滅を示すグラフである。Ｙ軸の値は、生存ＰＥＯ１細胞のパーセンテージを指す。 図２Ａ～２Ｉは、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ２８が、抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ３および内在性ＭＵＣ１６を有する癌細胞株（ＰＥＯ１）によるＴＣＲ刺激の存在下でＴ細胞作用を増強することを示す、概略図およびグラフである。図２Ｂ～２Ｅは、ヒトＰＢＭＣのデータを示すグラフである。図２Ｆ～２Ｈは、カニクイザルＰＢＭＣのデータを示すグラフである。ヒトＴ細胞（図２Ｂ～２Ｅの場合）を、内在性ＭＵＣ１６発現を伴う癌標的細胞（卵巣癌株ＰＥＯ－１）および示された二重特異性抗体とともに９６時間培養した。図２Ｇは、ＣＤ４ Ｔ細胞中のＣＤ２５＋のパーセンテージとして表した、ＣＤ４ Ｔ細胞の数およびＣＤ２５＋細胞の頻度を示すグラフである。 図２Ａ～２Ｉは、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ２８が、抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ３および内在性ＭＵＣ１６を有する癌細胞株（ＰＥＯ１）によるＴＣＲ刺激の存在下でＴ細胞作用を増強することを示す、概略図およびグラフである。図２Ｂ～２Ｅは、ヒトＰＢＭＣのデータを示すグラフである。図２Ｆ～２Ｈは、カニクイザルＰＢＭＣのデータを示すグラフである。ヒトＴ細胞（図２Ｂ～２Ｅの場合）を、内在性ＭＵＣ１６発現を伴う癌標的細胞（卵巣癌株ＰＥＯ－１）および示された二重特異性抗体とともに９６時間培養した。図２Ｈは、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞中のＣＤ２５＋のパーセンテージとして表した、ＣＤ４ Ｔ細胞の数およびＣＤ８ Ｔ細胞の数、ならびにＣＤ２５＋細胞の頻度を示すグラフである。 図２Ａ～２Ｉは、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ２８が、抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ３および内在性ＭＵＣ１６を有する癌細胞株（ＰＥＯ１）によるＴＣＲ刺激の存在下でＴ細胞作用を増強することを示す、概略図およびグラフである。図２Ｂ～２Ｅは、ヒトＰＢＭＣのデータを示すグラフである。図２Ｆ～２Ｈは、カニクイザルＰＢＭＣのデータを示すグラフである。ヒトＴ細胞（図２Ｂ～２Ｅの場合）を、内在性ＭＵＣ１６発現を伴う癌標的細胞（卵巣癌株ＰＥＯ－１）および示された二重特異性抗体とともに９６時間培養した。図２Ｉは、フローサイトメトリーによって測定した細胞標的への抗体結合を示すグラフを提供する。 図３Ａ～３Ｃは、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ２８二重特異性抗体が、抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ３誘発性Ｔ細胞活性化によって抗腫瘍免疫を強化することを示すグラフである。図３Ａは、平均放射輝度（平均放射輝度［ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ］）により測定した腫瘍組織量を経時的に示すグラフである。値は、群の中央値および範囲を表す。ｐ値は、各時点についてマンホイットニー検定を用いて計算した。ＭＵＣ１６×ＣＤ３とＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３との比較について、＊はｐ＜０．０５、または＊＊はｐ＜０．０１である。ＭＵＣ１６×ＣＤ３＋ＭＵＣ１６×ＣＤ２８とＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３との比較について、＃＃はｐ＜０．０１である。ヒトＰＢＭＣを生着させたＮＳＧマウスに、ＯＶＣＡＲ３－Ｌｕｃを腹腔内注射により移植した。５日目および８日目に、マウスにＩＶを投薬した（矢印）。マウスは、２．５μｇのＭＵＣ１６×ＣＤ３または２．５μｇのＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３のいずれかを受けた。一部のマウスには、１００μｇのＭＵＣ１６×ＣＤ２８も投与した。腫瘍組織量を、経時的に生物発光を監視することによって、腫瘍移植後４、８、１２、１５、２０、および２５日目に評価した。Ｎ＝５匹のマウス／群。 図３Ａ～３Ｃは、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ２８二重特異性抗体が、抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ３誘発性Ｔ細胞活性化によって抗腫瘍免疫を強化することを示すグラフである。図３Ｂは、図３Ａに示したものと同じ実験からの初回投薬の４時間後に取得した血液からの血清サイトカインレベルを示すグラフを提供する。ｐ値は一元配置分散分析で計算した。ＭＵＣ１６×ＣＤ３＋ＭＵＣ１６×ＣＤ２８とＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３との比較について、＃＃はｐ＜０．０１、または＃＃＃＃はｐ＜０．０００１である。ＭＵＣ１６×ＣＤ３＋ＭＵＣ１６×ＣＤ２８とＭＵＣ１６×ＣＤ３との比較について、＠＠＠はｐ＜０．００５である。ＭＵＣ１６×ＣＤ３＋ＭＵＣ１６×ＣＤ２８とＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３＋ＭＵＣ１６×ＣＤ２８との比較について、＾はｐ＜０．０１、＾＾はｐ＜０．００５、＾＾＾＾はＰ＜０．０００１である。 図３Ａ～３Ｃは、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ２８二重特異性抗体が、抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ３誘発性Ｔ細胞活性化によって抗腫瘍免疫を強化することを示すグラフである。図３Ｃは、２６日目の腫瘍組織量および血清中のＣＡ－１２５レベルとの相関関係を示すグラフを提供する。図３Ａに示されているものと同じ実験からの群あたりＮ＝５匹のマウス。 平均放射輝度（平均放射輝度［ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ］）により測定した腫瘍組織量を経時的に示すグラフである。値は、群の中央値および範囲を表す。ｐ値は、各時点についてマンホイットニー検定を用いて計算した。ＭＵＣ１６×ＣＤ３とＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３との比較について、＊＊はｐ＜０．０１である。ＭＵＣ１６×ＣＤ３＋ＭＵＣ１６×ＣＤ２８とＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３との比較について、＃＃はｐ＜０．０１である。ＭＵＣ１６×ＣＤ３＋ＭＵＣ１６×ＣＤ２８とＭＵＣ１６×ＣＤ３との比較について、＠はｐ＜０．０５である。ヒトＰＢＭＣを生着させたＮＳＧマウスに、ＯＶＣＡＲ３－Ｌｕｃを腹腔内注射により移植した。マウスを、０．５ｍｇ／ｋｇのＭＵＣ１６×ＣＤ３または０．５ｍｇ／ｋｇのＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３でＩＶ処理した。一部のマウスには、５日目および８日目（矢印）に０．２ｍｇ／ｋｇのＭＵＣ１６×ＣＤ２８も投与した。腫瘍組織量を、経時的に生物発光を監視することによって、４、８、１１、１４、２１、２８、および３４日目にＢＬによって評価した。Ｎ＝５または６匹のマウス／群。 図４Ａに示したものと同じ実験からの初回投薬の４時間後に取得した血液からの血清サイトカインレベルを示すグラフを提供する。ｐ値は一元配置分散分析で計算した。ＭＵＣ１６×ＣＤ３およびＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３との比較について、＊はｐ＜０．０５、ＭＵＣ１６×ＣＤ３＋ＭＵＣ１６×ＣＤ２８とＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３との比較について、＃＃はｐ＜０．０１、または＃＃＃はｐ＜０．００１、または＃＃＃＃はｐ＜０．０００１である。ＭＵＣ１６×ＣＤ３＋ＭＵＣ１６×ＣＤ２８とＭＵＣ１６×ＣＤ３との比較について、＠はｐ＜０．０５、または＠＠＠＠はｐ＜０．０００１である。ＭＵＣ１６×ＣＤ３＋ＭＵＣ１６×ＣＤ２８とＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３＋ＭＵＣ１６×ＣＤ２８との比較について、＾＾はｐ＜０．００１、または＾＾＾Ｐ＜０．００１、または＾＾＾はＰ＜０．０００１である。 経時的な生存率を示すグラフである。ＩＤ８－ＶＥＧＦ／ｈＭＵＣ１６細胞を、ｈＣＤ３／ｈＣＤ２８／ｈＭＵＣ１６についてヒト化したマウスの腹腔に移植した。矢印で示すように、ＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３またはＭＵＣ１６×ＣＤ３を、１ｍｇ／ｋｇで、または腫瘍移植後３、６、および１０日目に用いて、マウスを静脈内処理した。一部のマウスには、１ｍｇ／ｋｇのＭＵＣ１６×ＣＤ２８も投与した。ｐ値は、各時点についてマンテルコックス検定を用いて計算した。ＭＵＣ１６×ＣＤ３とＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３との比較について、＊＊はｐ＜０．０１である。ＭＵＣ１６×ＣＤ３＋ＭＵＣ１６×ＣＤ２８とＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３との比較について、＃＃はｐ＜０．０１である。ＭＵＣ１６×ＣＤ３＋ＭＵＣ１６×ＣＤ２８とＭＵＣ１６×ＣＤ３との比較について、＠はｐ＜０．０５である。 経時的な腫瘍体積を示すグラフである。ＭＣ３８／ｈＭＵＣ１６腫瘍細胞を、ｈＣＤ３／ｈＭＵＣ１６ヒト化マウスの皮下に移植した。マウスを、０．０１ｍｇ／ｋｇの抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３、０．５ｍｇ／ｋｇの本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ｍＣＤ２８二重特異性抗体で、０日目に開始して週に２回（矢印）示されるように処理した。腫瘍体積を、経時的にキャリパー測定によって監視した。示す値は平均±ＳＥＭである。データは３回の実験を表す。Ｎ＝７匹／群。ｐ値を、アイソタイプ対照と比較して二元配置分散分析を用いて計算した（ＭＵＣ１６×ＣＤ３＋ＭＵＣ１６×ｍＣＤ２８とアイソタイプ対照との比較について、＊＊はｐ＜０．０１、および＊＊＊＊はＰ＜０．０００１であり、ＭＵＣ１６×ＣＤ３とアイソタイプ対照との比較について、＃はｐ＜０．０５であり、ＭＵＣ１６×ｍＣＤ２８とアイソタイプ対照との比較について、＄はｐ＜０．０５である）。 図６Ａに示したものと同じ実験からの示す時点で取得した血液からの血清サイトカインレベルを示すグラフを提供する。 サイトカインレベルを示すグラフである。７日目の投与後４時間で、血清サイトカインのためにマウスから採血した。統計的有意性を、アイソタイプ＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１と比較して一元配置分散分析を用いて計算した。ｎ＝７匹のマウス／群。データは、代表的な３回の実験である。 サイトカインレベルを示すグラフである。７日目の投与後４時間で、血清サイトカインのためにマウスから採血した。統計的有意性を、アイソタイプ＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１と比較して一元配置分散分析を用いて計算した。ｎ＝７匹のマウス／群。データは、代表的な３回の実験である。 ドライコーティングまたはウェットコーティング法を使用してアッセイプレートにＭＵＣ１６×ＣＤ２８を固定しても、ＣＤ２８スーパーアゴニストとは対照的に、ＣＤ３刺激の非存在下ではＴ細胞の活性化が誘発されないことを示すグラフである。 単独または併用療法でのＭＵＣ１６ｘＣＤ２８が全身性Ｔ細胞活性化を誘発しないことを示すグラフである。カニクイザルに、１または１０ｍｇ／ｋｇのいずれか（括弧内に示す）で二重特異性抗体の単回用量を与えた。追加の群には、反復投与として示す合計４用量を与えた。示される投与後の時間（時間）に採血した。図８Ａが血清サイトカイン、図８Ｂが相対Ｔ細胞数、図８ＣがＫｉ６７＋およびＩＣＯＳ＋Ｔ細胞の頻度（ＣＤ３の％）を示す。データは、平均±ＳＥＭを表す。Ｎ＝３匹の動物／群。ｐ値は、アイソタイプ対照と比較して二元配置分散分析で計算された。（＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、および＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である）。 単独または併用療法でのＭＵＣ１６ｘＣＤ２８が全身性Ｔ細胞活性化を誘発しないことを示すグラフである。カニクイザルに、１または１０ｍｇ／ｋｇのいずれか（括弧内に示す）で二重特異性抗体の単回用量を与えた。追加の群には、反復投与として示す合計４用量を与えた。示される投与後の時間（時間）に採血した。図８Ａが血清サイトカイン、図８Ｂが相対Ｔ細胞数、図８ＣがＫｉ６７＋およびＩＣＯＳ＋Ｔ細胞の頻度（ＣＤ３の％）を示す。データは、平均±ＳＥＭを表す。Ｎ＝３匹の動物／群。ｐ値は、アイソタイプ対照と比較して二元配置分散分析で計算された。（＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、および＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である）。 単独または併用療法でのＭＵＣ１６ｘＣＤ２８が全身性Ｔ細胞活性化を誘発しないことを示すグラフである。カニクイザルに、１または１０ｍｇ／ｋｇのいずれか（括弧内に示す）で二重特異性抗体の単回用量を与えた。追加の群には、反復投与として示す合計４用量を与えた。示される投与後の時間（時間）に採血した。図８Ａが血清サイトカイン、図８Ｂが相対Ｔ細胞数、図８ＣがＫｉ６７＋およびＩＣＯＳ＋Ｔ細胞の頻度（ＣＤ３の％）を示す。データは、平均±ＳＥＭを表す。Ｎ＝３匹の動物／群。ｐ値は、アイソタイプ対照と比較して二元配置分散分析で計算された。（＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、および＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である）。 ＭＵＣ×ＣＤ２８およびＭＵＣ１６×ＣＤ３の二重特異性抗体が可溶性ＣＡ－１２５の存在下でＭＵＣ発現細胞に結合できることを示す。ＯＶＣＡＲ－３細胞を、フローサイトメトリー緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ）中４℃で３０分間、漸増濃度の可溶性ＣＡ－１２５（図９Ａ）またはＭＵＣ１６小塊（図９Ｂ）の存在下で、Ａｌｅｘａ６４７で標識した８ｎＭの示す抗体中でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。 ＭＵＣ×ＣＤ２８およびＭＵＣ１６×ＣＤ３の二重特異性抗体が可溶性ＣＡ－１２５の存在下でＭＵＣ発現細胞に結合できることを示す。ＯＶＣＡＲ－３細胞を、フローサイトメトリー緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ）中４℃で３０分間、漸増濃度の可溶性ＣＡ－１２５（図９Ａ）またはＭＵＣ１６小塊（図９Ｂ）の存在下で、Ａｌｅｘａ６４７で標識した８ｎＭの示す抗体中でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。 Ｔ細胞／抗原提示細胞ベースのレポーターバイオアッセイの概略図である。 ｂｓ２４９６３Ｄ（ＲＥＧＮ５６６８とも言及される）が、ＭＵＣ１６を発現する刺激性抗原提示細胞の存在下で、操作されたＴ細胞におけるＮＦ－ｋＢシグナル伝達を強化することを示す。端的に言えば、Ｊ．ＲＴ３．Ｔ３．５／ＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ／１Ｇ４ＡＢ／ｈＣＤ８αβ／ｈＣＤ２８レポーター細胞を、３．３３：１のレポーター細胞と刺激性３Ｔ３細胞との比での、３Ｔ３／ｈβ２Ｍ／ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹＥＳＯ１ｐ／ｈＭＵＣ１６（図１１Ａ）および３Ｔ３／ｈβ２Ｍ／ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹＥＳＯ１ｐ細胞（図１１Ｂ）の存在下で、抗体なしの対照を含むある範囲の濃度（３９ｐＭ～１０ｎＭ）のｂｓ２４９６３ＤまたはＣＤ２８非架橋対照二重特異性抗体（非ＴＡＡ×ＣＤ２８）とともにインキュベートした。ＮＦ－κＢシグナル伝達を、ルシフェラーゼ活性として検出し、発光シグナルの定量化によって測定し、これを相対光単位（ＲＬＵ）として報告する。重複ウェルで行ったアッセイからのデータを、平均±ＳＤとしてプロットする。 ｂｓ２４９６３Ｄ（ＲＥＧＮ５６６８とも言及される）が、ＭＵＣ１６を発現する刺激性抗原提示細胞の存在下で、操作されたＴ細胞におけるＮＦ－ｋＢシグナル伝達を強化することを示す。端的に言えば、Ｊ．ＲＴ３．Ｔ３．５／ＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ／１Ｇ４ＡＢ／ｈＣＤ８αβ／ｈＣＤ２８レポーター細胞を、３．３３：１のレポーター細胞と刺激性３Ｔ３細胞との比での、３Ｔ３／ｈβ２Ｍ／ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹＥＳＯ１ｐ／ｈＭＵＣ１６（図１１Ａ）および３Ｔ３／ｈβ２Ｍ／ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹＥＳＯ１ｐ細胞（図１１Ｂ）の存在下で、抗体なしの対照を含むある範囲の濃度（３９ｐＭ～１０ｎＭ）のｂｓ２４９６３ＤまたはＣＤ２８非架橋対照二重特異性抗体（非ＴＡＡ×ＣＤ２８）とともにインキュベートした。ＮＦ－κＢシグナル伝達を、ルシフェラーゼ活性として検出し、発光シグナルの定量化によって測定し、これを相対光単位（ＲＬＵ）として報告する。重複ウェルで行ったアッセイからのデータを、平均±ＳＤとしてプロットする。 ｂｓ２４９６３Ｄ（ＲＥＧＮ５６６８としても参照される）が、ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１標的細胞を用いたＲＥＧＮ４０１８（ＷＯ２０１７／０５３８５６Ａ１、ＲＥＧＮ４０１８であるＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１を参照）の存在下で、ヒト初代Ｔ細胞からの濃度依存的なＩＬ－２放出を媒介することを示す。端的に言えば、富化したヒト初代Ｔ細胞を、エフェクター対標的細胞比それぞれ１０：１または４：１での固定濃度（５ｎＭ）のＲＥＧＮ４０１８またはＣＤ３非架橋対照二重特異性抗体（非ＴＡＡ×ＣＤ３）のいずれかとヒト卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－３またはＰＥＯ１との存在下で、抗体なしの対照を含むある範囲（７．６ｐＭ～５００ｎＭ）のｂｓ２４９６３ＤまたはＣＤ２８非架橋対照二重特異性抗体（非ＴＡＡ×ＣＤ２８）とともにインキュベートした。データは、三重ウェルで行ったアッセイからのものであり、平均±ＳＤとしてプロットする。ＩＬ－２放出を、製造業者のプロトコルに従ってヒトＩＬ－２イムノアッセイを使用して測定した。 ｂｓ２４９６３Ｄ（ＲＥＧＮ５６６８としても参照される）が、ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１標的細胞を用いたＲＥＧＮ４０１８の存在下で、ヒト初代Ｔ細胞の増殖の濃度依存的な強化を媒介することを示す。端的に言えば、富化したヒト初代Ｔ細胞を、エフェクター対標的細胞比それぞれ１０：１または４：１での固定濃度（５ｎＭ）のＲＥＧＮ４０１８またはＣＤ３非架橋対照二重特異性抗体（非ＴＡＡ×ＣＤ３）のいずれかとヒト卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１との存在下で、抗体なしの対照を含むある範囲（７．６ｐＭ～５００ｎＭ）のｂｓ２４９６３ＤまたはＣＤ２８非架橋対照二重特異性抗体（非ＴＡＡ×ＣＤ２８）とともにインキュベートした。データは、三重ウェルで行ったアッセイからのものであり、平均±ＳＤとしてプロットする。Ｔ細胞の増殖を、トリチウム崩壊（***細胞に組み込まれたトリチウム化チミジンから）の検出を介して測定し、ＣＰＭとして報告した。 ｂｓ２４９６３Ｄ（ＲＥＧＮ５６６８としても言及される）が濃度依存的ＩＬ－２放出を媒介し、セミプリマブの添加がＳＷ１９９０およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１標的細胞を伴うヒト初代Ｔ細胞からのＩＬ－２放出を多少増加させることを示す。端的に言えば、富化したヒト初代Ｔ細胞を、エフェクター対標的細胞比２：１での固定濃度（２０ｎＭ）のセミプリマブまたはＩｇＧ４Ｐ対照とＳＷ１９９０およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１ヒト膵臓癌細胞株との存在下で、抗体なしの対照を含むある範囲（７．６ｐＭ～５００ｎＭ）のｂｓ２４９６３ＤまたはＣＤ２８非架橋対照二重特異性抗体（非ＴＡＡ×ＣＤ２８）とともにインキュベートした。データは、三重ウェルで行ったアッセイからのものであり、平均±ＳＤとしてプロットする。ＩＬ－２放出を、製造業者のプロトコルに従ってヒトＩＬ－２イムノアッセイを使用して測定した。統計的分析を、２元配置分散分析を使用して行った。ｐ＜０．０５の場合、差異を統計的に有意であると見なした。ｂｓ２４９６３Ｄ＋セミプリマブは、ＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１細胞におけるＲＥＧＮ５６６８＋ＩｇＧ４Ｐ対照と比較して、ＩＬ－２放出の統計的に有意な増加（ｐ＜０．０００１）を示した。 ｂｓ２４９６３Ｄ（ＲＥＧＮ５６６８としても言及される）が増殖の濃度依存的強化を媒介し、セミプリマブの添加がＳＷ１９９０およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１を伴うヒト初代Ｔ細胞の増殖を多少増加させることを示す。端的に言えば、富化したヒト初代Ｔ細胞を、エフェクター対標的細胞比２：１での固定濃度（２０ｎＭ）のセミプリマブまたはＩｇＧ４Ｐ対照とＳＷ１９９０およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１ヒト膵臓癌細胞株との存在下で、抗体なしの対照を含むある範囲（７．６ｐＭ～５００ｎＭ）のｂｓ２４９６３ＤまたはＣＤ２８非架橋対照二重特異性抗体（非ＴＡＡ×ＣＤ２８）とともにインキュベートした。データは、三重ウェルで行ったアッセイからのものであり、平均±ＳＤとしてプロットする。Ｔ細胞の増殖を、トリチウム崩壊（***細胞に組み込まれたトリチウム化チミジンから）の検出を介して測定し、ＣＰＭとして報告した。統計的分析を、２元配置分散分析を使用して行った。ｐ＜０．０５の場合、差異を統計的に有意であると見なした。ｂｓ２４９６３Ｄ＋セミプリマブは、ＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１細胞におけるｂｓ２４９６３Ｄ＋ＩｇＧ４Ｐ対照と比較して、増殖の統計的に有意な増加（ｐ＜０．０００１）を示した。
本発明を説明する前に、説明される特定の方法および実験条件が異なり得るため、本発明がかかる方法および条件に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語が、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
別段定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は全て、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本発明で使用する場合、「約１００」との表現は、９９および１０１、ならびにその間の全値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
本明細書に記載されるものと同様または同等のいずれの方法および材料も本発明の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書で言及される特許、出願、および非特許刊行物は全て、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
定義
本明細書で使用される「ＣＤ２８」という表現は、共刺激受容体としてＴ細胞上に発現される抗原を指す。ヒトＣＤ２８は、配列番号５０に記載されているアミノ酸配列を含み、かつ／またはＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００６１３０．１に記載されているアミノ酸配列を有する。マウスＦｃを有するヒトＣＤ２８外部ドメイン（Ｎ１９－Ｐ１５２）が配列番号５２に示される。ｍｙｃ－ｍｙｃ－ｈｉｓタグを有するヒトＣＤ２８外部ドメイン（Ｎ１９－Ｐ１５２）が配列番号５３に示される。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質フラグメントへの全ての言及は、非ヒト種由来であると明確に特定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質フラグメントのヒトバージョンを指すよう意図されている。したがって、「ＣＤ２８」という表現は、非ヒト種、例えば、「マウスＣＤ２８」、「サルＣＤ２８」などに由来すると特定されない限り、ヒトＣＤ２８を意味する。ｍｙｃ－ｍｙｃ－ｈｉｓタグを有するマウスＣＤ２８（受託番号ＮＰ＿０３１６６８．３）外部ドメインが配列番号５４に示される。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８に結合する抗体」または「抗ＣＤ２８抗体」は、単量体ＣＤ２８を特異的に認識する抗体およびその抗原結合フラグメント、ならびに二量体ＣＤ２８を特異的に認識する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、可溶性ＣＤ２８および／または細胞表面発現ＣＤ２８に結合することができる。可溶性ＣＤ２８には、天然ＣＤ２８タンパク質、ならびに膜貫通ドメインを欠くかまたはそうでなければ細胞膜と会合していない、例えば単量体および二量体ＣＤ２８構築物などの組換えＣＤ２８タンパク質変異体が含まれる。
本明細書で使用される場合、「細胞表面発現ＣＤ２８」という表現は、インビトロまたはインビボで細胞表面上に発現される１つ以上のＣＤ２８タンパク質（複数可）を意味し、ＣＤ２８タンパク質の少なくとも一部分は、細胞膜の細胞外の側に曝され、抗体の抗原結合部分に接近可能である。「細胞表面発現ＣＤ２８」としては、細胞膜内の機能的Ｔ細胞共刺激受容体の文脈に含まれるＣＤ２８タンパク質が挙げられる。「細胞表面発現ＣＤ２８」という表現は、細胞の表面上のホモ二量体の一部として発現されるＣＤ２８タンパク質を含む。「細胞表面発現ＣＤ２８」は、通常はＣＤ２８タンパク質を発現する細胞の表面上に発現されるＣＤ２８タンパク質を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、「細胞表面発現ＣＤ２８」は、通常はその表面上にヒトＣＤ２８を発現しないが、その表面上にＣＤ２８を発現するように人工的に操作されている細胞の表面上に発現されるＣＤ２８タンパク質を含み得るか、またはそれからなり得る。
本明細書で使用される場合、「抗ＣＤ２８抗体」という表現は、単一特異性を有する一価抗体、ならびにＣＤ２８に結合する第１のアームおよび第２の（標的）抗原に結合する第２のアームを含む二重特異性抗体の両方を含み、抗ＣＤ２８アームは、本明細書の表３に記載されているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のうちのいずれかを含む。抗ＣＤ２８二重特異性抗体の例は、本明細書の他の場所に記載されている。「抗原結合分子」という用語は、例えば、二重特異性抗体を含む、抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。
本発明で使用する場合、「ＭＵＣ１６」という用語は、非ヒト種由来であると特定されない限り、ヒトＭＵＣ１６タンパク質を指す（例えば、「マウスＭＵＣ１６」、「サルＭＵＣ１６」など）。ヒトＭＵＣ１６タンパク質は、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有し、かつ／またはＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０７８９６６に記載されるアミノ酸配列を有する。ｍｙｃ－ｍｙｃ－ｈｉｓタグを有するヒトＭＵＣ１６膜近位ドメイン（Ｐ１３８１０－Ｐ１４４５１）が配列番号５１として示される。
本明細書で使用される場合、「ＭＵＣ１６に結合する抗体」または「抗ＭＵＣ１６抗体」は、可溶性ＭＵＣ１６および／または細胞表面に発現されたＭＵＣ１６に結合し得る抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。可溶性ＭＵＣ１６には、天然ＭＵＣ１６タンパク質、ならびに膜貫通ドメインを欠くか、または細胞膜と会合していない組換えＭＵＣ１６タンパク質変異体、例えば、ＭＵＣ１６構築物などが含まれる。
本明細書で使用される場合、「抗ＭＵＣ１６抗体」という表現は、単一特異性を有する一価抗体、ならびにＭＵＣ１６に結合する第１のアームおよび第２の（標的）抗原に結合する第２のアームを含む二重特異性抗体の両方を含み、抗ＭＵＣ１６アームは、本明細書の表１に記載されているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のうちのいずれかを含む。抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体の例は、本明細書の他の場所に記載されている。「抗原結合分子」という用語は、例えば、二重特異性抗体を含む、抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。
「抗原結合分子」という用語は、例えば、二重特異性抗体を含む、抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。
本発明で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原（例えば、ＣＤ２８）に特異的に結合するかまたはそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分され得る。ＶＨおよびＶＬは各々、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順にアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本発明の異なる実施形態では、抗ＣＤ２８および／または抗ＭＵＣ１６抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、または天然に修飾されていても人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合フラグメントを含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」および同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然の、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗体結合フラグメントは、例えば、抗体可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関連するタンパク質消化技術または組換え遺伝子操作技術などの任意の適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から誘導され得る。かかるＤＮＡは既知であり、かつ／または例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、または合成され得る。ＤＮＡは、化学的に、または分子生物学技法を使用することによって配列決定および操作されて、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な立体配置に配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を作成し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などすることができる。
抗体結合フラグメントの非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール型免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用する「抗原結合フラグメント」という表現に包含される。
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであり得、一般に、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか、またはそれとインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＨドメインがＶＬドメインに結合した抗原結合フラグメントでは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに対して位置付けられてもよい。例えば、可変領域は二量体であり、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬ、またはＶＬ－ＶＬ二量体を含んでもよい。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを含んでもよい。
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含んでもよい。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見られ得る可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的な立体配置には、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが挙げられる。上に列記される例示的な立体配置のうちのいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインのいずれの立体配置でも、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されているか、または完全もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結されているかのいずれかであり得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の結合をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれより多数の）アミノ酸からなり得る。そのうえ、抗原結合フラグメントは、互いとのおよび／または１つ以上の単量体ＶＨドメインもしくはＶＬドメインとの（例えば、ジスルフィド結合（複数可）による）非共有結合において、先に列挙した可変ドメイン立体配置および定常ドメイン立体配置のうちのいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
完全抗体分子と同様に、抗体結合フラグメントは、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別個の抗原に、または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む任意の多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能な通例の技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合フラグメントとの関連で使用に適合し得る。
本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して機能してもよい。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下における本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、それによって標的細胞の溶解をもたらす、細胞媒介性反応を指す。ＣＤＣおよびＡＤＣＣは、当該技術分野において周知であり利用可能なアッセイを用いて測定することができる。（例えば、米国特許第５，５００，３６２号および第５，８２１，３３７号、ならびにＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６を参照）。抗体の定常領域は、補体を固定して細胞依存性細胞傷害性を媒介する抗体の能力において重要である。したがって、抗体のアイソタイプは、その抗体が細胞傷害性を媒介することが望ましいかに基づいて選択され得る。
本発明のある特定の実施形態では、本発明の抗ＣＤ２８および／またはＭＵＣ１６抗体（単一特異性または二重特異性）は、ヒト抗体である。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突然変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列へと移植された抗体を含むことを意図するものではない。
本発明の抗体は、いくつかの実施形態では、組換えヒト抗体であり得る。「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現される抗体など組換え手段によって調製、発現、作成、または単離される全てのヒト抗体（後述）、組換え型コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体（後述）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作成、または単離される抗体を含むことを意図する。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニック動物が使用される場合は、インビボ体細胞変異誘発）を受け、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し関連してはいるが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連する２つの形態で存在することができる。第１の形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されているおよそ１５０～１６０ｋＤａの安定した四本鎖構築体を含む。第２の形態では、二量体は鎖間ジスルフィド結合によって連結されておらず、共有結合した軽鎖および重鎖から成る約７５～８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製後でさえも分離することが極めて困難とされている。
様々な無傷のＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造上の相違によるが、それに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて典型的に観察されるレベルまで第２の形態の出現を有意に減少させることができる（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域に１つ以上の突然変異を有する抗体を包含し、例えば産生において、所望の抗体形態の収率を改善するのに望ましい場合がある。
本発明の抗体は、単離された抗体であってもよい。「単離された抗体」は、本明細書で使用される場合、その天然環境の少なくとも１つの成分から同定され、分離および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するかもしくは天然に産生される組織または細胞から分離または除去された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体は、組換え細胞内の原位置の抗体も含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離ステップを受けた抗体である。ある特定の実施形態によると、単離された抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
本発明はまた、ＣＤ２８および／またはＭＵＣ１６に結合するワンアーム抗体も含む。本明細書中で使用される場合、「ワンアーム抗体」は、単一の抗体重鎖および単一の抗体軽鎖を含む抗原結合分子を意味する。本発明のワンアーム抗体は、表１および表３に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含んでもよい。
本明細書の抗ＣＤ２８および／もしくはＭＵＣ１６抗体またはその抗原結合ドメインは、抗原結合タンパク質または抗原結合ドメインが由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含んでもよい。そのような突然変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗体、およびその抗原結合ドメインを含み、ここで、１つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）に、もしくは別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）に、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に突然変異する（そのような配列変化は、本明細書では集合的に「生殖系列突然変異」と称される）。当業者は、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列突然変異またはそれらの組み合わせを含む多くの抗体および抗体結合フラグメントを容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基は全て、抗体が由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと再び突然変異する。他の実施形態では、ある特定の残基のみが元の生殖系列配列に戻り突然変異し、例えば、突然変異した残基が、ＦＲ１の最初の８つのアミノ酸内またはＦＲ４の最後の８つのアミノ酸内にのみ見られるか、または突然変異した残基が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３内にのみ見られる。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）のうちの１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ突然変異する。さらに、本発明の抗体またはその抗原結合ドメインは、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列突然変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ突然変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ突然変異する。いったん得られれば、１つ以上の生殖系列突然変異を含有する抗原結合ドメインは、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または強化（場合によって）、免疫原性の低減などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な方法で得られた抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明の範囲内に包含される。
本発明はまた、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかの変異体を含む、抗ＣＤ２８および／またはＭＵＣ１６抗体ならびに抗原結合分子を含む。本発明のこの態様に含まれる例示的な変異体には、１つ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかの変異体が含まれる。例えば、本発明は、本明細書の表３に記載されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＣＤ２８抗体および抗原結合分子を含む。
「エピトープ」という用語は、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、１つ超のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は抗原上の異なる領域に結合してもよく、異なる生物学的効果を有してもよい。エピトープは、立体配座であっても直鎖状であってもよい。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基によって産生されたものである。ある特定の状況では、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含んでもよい。
「実質的な同一性」または「実質的に同一である」という用語は、核酸またはそのフラグメントを指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列した場合、以下に考察するように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなど、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定される場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、ある特定の場合では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
ポリペプチドへ適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列の保存的置換が互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．ＢｉｏＩ．２４：３０７－３３１を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的な置換とは、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。
ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、および他の修飾に割り当てられた類似性の測定値を使用して類似の配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間または野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメータとともに使用され得るＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムである既定パラメータまたは推奨パラメータを用いたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列との間の最良重複領域の整列および配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）（上記参照））。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する際の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．ＢｉｏＩ．２１５：４０３－４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照されたい。
二重特異性抗原結合分子
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であってもよい。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有してもよい。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａＩ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照されたい。本発明の抗ＣＤ２８および／またはＭＵＣ１６抗体は、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結するか、またはそれと同時発現させることができる。例えば、抗体またはそのフラグメントは、別の抗体または抗体フラグメントなどの１つ以上の他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合、もしくは他の方法により）機能的に連結されて、第２の結合特異性を有する二重特異性抗体または多重特異性抗体を産生することができる。
本明細書における「抗ＣＤ２８抗体」および／または「抗ＭＵＣ１６抗体」という表現の使用は、単一特異性抗ＣＤ２８抗体および／または抗ＭＵＣ１６抗体と、ＣＤ２８結合アームまたはＭＵＣ１６結合アームおよび標的抗原に結合する第２のアームを含む二重特異性抗体との両方を含むことを意図している。したがって、本発明は、免疫グロブリンの一方のアームがヒトＣＤ２８またはＭＵＣ１６に結合し、免疫グロブリンの他方のアームが標的抗原に特異的である、二重特異性抗体を含む。ＣＤ２８またはＭＵＣ１６二重特異性抗体のもう一方のアームが結合する標的抗原は、細胞、組織、器官、微生物、またはウイルス上またはその近傍で発現される、標的免疫応答が望まれる任意の抗原であり得る。ＣＤ２８結合アームは、本明細書の表３に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含み得る。ＭＵＣ１６結合アームは、本明細書の表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含み得る。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８結合アームは、ヒトＣＤ２８に結合し、ヒトＴ細胞増殖を誘発する。
抗体の一方のアームがＣＤ２８に結合し、もう一方のアームが標的抗原に結合する本発明の二重特異性抗体の文脈において、標的抗原は、ＭＵＣ１６などの腫瘍関連抗原であり得る。
ある特定の例示的な実施形態によると、本発明はＣＤ２８およびＭＵＣ１６に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。そのような分子は、本明細書では、例えば、「抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６」もしくは「抗ＣＤ２８×ＭＵＣ１６」もしくは「ＣＤ２８×ＭＵＣ１６」もしくは「抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ２８」もしくは「抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８」もしくは「ＭＵＣ１６×ＣＤ２８」二重特異性分子、または他の同様の用語として言及されてもよい。
図に示されるある特定の例示的な実施形態によると、二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）は、エフェクターアームおよび標的化アームを有してもよい。エフェクターアームは、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）上の抗原に結合する最初の抗原結合ドメイン（例えば、抗ＣＤ２８抗体）であってもよい。標的化アームは、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）上の抗原に結合する第２の抗原結合ドメイン（例えば、抗ＭＵＣ１６抗体）であってもよい。ある特定の例示的な実施形態によると、エフェクターアームは、ＣＤ２８に結合し、標的化アームは、ＭＵＣ１６に結合する。二重特異性抗ＣＤ２８／ＭＵＣ１６は、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に共刺激シグナルを提供することができる。エフェクターアームは、クラスター化せずにＴ細胞を刺激する効果はない。クラスター化すると、エフェクターアームだけでは、Ｔ細胞を刺激する効果がほとんどない。標的化アームと組み合わせて、エフェクターアームは、Ｔ細胞を刺激する。腫瘍標的化アームは、腫瘍特異性が不完全である可能性がある。標的化アームの標的である抗原（例えば、ＭＵＣ１６）は、腫瘍細胞の一部に発現されてもよい。腫瘍標的化アームの特異性は、抗ＣＤ３二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／ＭＵＣ１６二重特異性抗体）との組み合わせと重複することによって増加してもよい。
本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」という表現は、単独で、または特定の抗原に特異的に結合する、１つ以上のさらなるＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域（ＦＲ）と組み合わせて少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むまたはそれからなるタンパク質、ポリペプチド、または分子複合体を意味する。ある特定の実施形態では、抗原結合分子は、それらの用語が本明細書の他所で定義されているように、抗体または抗体のフラグメントである。
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗原結合分子」という表現は、少なくとも第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含むタンパク質、ポリペプチド、または分子複合体を意味する。二重特異性抗原結合分子内の各抗原結合ドメインは、単独で、または１つ以上の追加のＣＤＲおよび／またはＦＲと組み合わせて、特定の抗原に特異的に結合する少なくとも１つのＣＤＲを含む。本発明の文脈において、第１の抗原結合ドメインは第１の抗原（例えばＣＤ２８）に特異的に結合し、第２の抗原結合ドメインは第２の異なる抗原（例えばＭＵＣ１６）に特異的に結合する。
本発明のある特定の例示的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体の各抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＲ）を含む。第１および第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）の文脈において、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは、接頭辞「Ｄ１」を付けて指定され、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲは、接頭辞「Ｄ２」を付けて指定されてもよい。したがって、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書においてＤ１－ＨＣＤＲ１、Ｄ１－ＨＣＤＲ２、およびＤ１－ＨＣＤＲ３と称されてもよく、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書においてＤ２－ＨＣＤＲ１、Ｄ２－ＨＣＤＲ２、およびＤ２－ＨＣＤＲ３と称されてもよい。
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、互いに直接的または間接的に結合して、本発明の二重特異性抗原結合分子を形成してもよい。あるいは、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは各々、別々の多量体化ドメインに連結されていてもよい。１つの多量体化ドメインと別の多量体化ドメインとの会合は、２つの抗原結合ドメイン間の会合を促進し、それによって二重特異性抗原結合分子を形成する。本明細書で使用される場合、「多量体化ドメイン」は、同一または類似の構造または構成の第２の多量体化ドメインと会合する能力を有する任意の高分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体化成分の非限定的な例は、免疫グロブリンのＦｃ部分（ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む）、例えばアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択されるＩｇＧのＦｃドメイン、ならびに各アイソタイプ群内の任意のアロタイプである。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、典型的には２つの多量体化ドメイン、例えば、それぞれ別々の抗体重鎖の一部である２つのＦｃドメインを含む。第１および第２の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４などの同じＩｇＧアイソタイプであってもよい。あるいは、第１および第２の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４などの異なるＩｇＧアイソタイプであってもよい。
ある特定の実施形態では、多量体化ドメインは、Ｆｃフラグメントまたは少なくとも１つのシステイン残基を含有する長さが１～約２００アミノ酸のアミノ酸配列である。他の実施形態では、多量体化ドメインは、システイン残基、または短いシステイン含有ペプチドである。他の多量体化ドメインには、ロイシンジッパー、ヘリックスループモチーフ、またはコイルドコイルモチーフを含むか、またはそれからなるペプチドまたはポリペプチドが含まれる。
任意の二重特異性抗体フォーマットまたは技術を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製することができる。例えば、第１の抗原結合特異性を有する抗体またはそのフラグメントは、第２の抗原結合特異性を有する別の抗体または抗体フラグメントなどの１つ以上の他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合などにより）機能的に連結されて、二重特異性抗原結合分子を産生することができる。本発明の文脈において使用できる特定の例示的な二重特異性フォーマットには、例えば、ｓｃＦｖ系フォーマットまたはダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＯＶＯ）－Ｉｇ、Ｑｕａｄｒｏｍａ、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通の軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールを備えた共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＯ）体、ロイシンジッパー、Ｏｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用型Ｆａｂ（ＯＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマットが含まれるが、これらに限定されない（上述のフォーマットの総説については、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１－１１、およびそこに引用されている参考文献を参照）。
本発明の二重特異性抗原結合分子との関連で、多量体化ドメイン、例えば、Ｆｃドメインは、野生型の、天然に存在するＦｃドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸変化（例えば、挿入、欠失、または置換）を含んでもよい。例えば、本発明は、ＦｃとＦｃＲｎとの間の修飾された結合相互作用（例えば、強化または減少）を有する修飾Ｆｃドメインをもたらす、Ｆｃドメイン中の１つ以上の修飾を含む二重特異性抗原結合分子を含む。一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、ＣＨ２またはＣＨ３領域に修飾を含み、この修飾は酸性環境（例えば、ｐＨ範囲約５．５～約６．０のエンドソーム内）において、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を高める。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例には、例えば、２５０位（例えば、ＥもしくはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬもしくはＦ）、２５２位（例えば、ＬＮ／ＦＩＷもしくはＴ）、２５４位（例えば、ＳもしくはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／ＥＩＤもしくはＴ）での修飾、あるいは４２８位および／または４３３位（例えばＵＲ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）および／または４３４位（例えばＨ／ＦもしくはＶ）での修飾、あるいは２５０位および／または４２８位の修飾、あるいは３０７位または３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４位での修飾が含まれる。一実施形態において、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾；４２８Ｌ、２５９１（例えば、Ｖ２５９１）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾；２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、ならびに３０７および／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。
本発明は、第１のＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ ＣＨ３ドメインを含む二重特異性抗原結合分子も含み、第１および第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸が互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸の差により、そのアミノ酸の差を欠く二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの二重特異性抗体の結合が減少する。一実施形態では、第１のＩｇ ＣＨ３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによるもの、ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を減少または消失させる突然変異を含む。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによるもの、ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含んでもよい。第２のＣＨ３内に見出され得るさらなる修飾には、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによるもの；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによるもの；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が含まれる。
ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプに由来するＦｃ配列を組み合わせたキメラであってもよい。例えば、キメラＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ ＣＨ２領域に由来するＣＨ２配列の一部または全部、およびヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４に由来するＣＨ３配列の一部または全部を含み得る。キメラＦｃドメインは、キメラヒンジ領域も含み得る。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列と組み合わせた、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」配列を含むことができる。本明細書に記載される抗原結合分子のうちのいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの特定の例は、Ｎ末端からＣ末端に、［ＩｇＧ４ ＣＨ１］－［ＩｇＧ４上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ ＣＨ２］－［ＩｇＧ４ ＣＨ３］を含む。本明細書に記載される抗原結合分子のうちのいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの別の例は、Ｎ末端からＣ末端に、［ＩｇＧ１ ＣＨ１］－［ＩｇＧ１上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ ＣＨ２］－［ＩｇＧ１ ＣＨ３］を含む。本発明の抗原結合分子のうちのいずれかに含めることができるキメラＦｃドメインのこれらおよび他の例は、ＷＯ２０１４／０２２５４０Ａ１に記載されており、これらの一般的な構造配置を有するキメラＦｃドメイン、およびその変異体は、Ｆｃ受容体結合を変えてしまうことができ、そのことがＦｃエフェクター機能に影響を及ぼす。
配列変異体
本明細書の抗体および二重特異性抗原結合分子は、個々の抗原結合ドメインが由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含んでもよい。そのような突然変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明の抗原結合分子は、本明細書に開示される例示的なアミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗原結合フラグメントを含んでもよく、ここで、１つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）に、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）に、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に突然変異する（そのような配列変化は、本明細書では集合的に「生殖系列突然変異」と称される）。当業者は、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列突然変異またはそれらの組み合わせを含む多くの抗体および抗体結合フラグメントを容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基は全て、抗原結合ドメインが本来由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと再び突然変異する。他の実施形態では、ある特定の残基のみが、元の生殖系列配列へと再び突然変異し、例えば、突然変異した残基のみが、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められるか、または突然変異した残基のみが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に見出される。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）のうちの１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗原結合ドメインが本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ突然変異する。さらに、抗原結合ドメインは、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列突然変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ突然変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ突然変異する。いったん得られれば、１つ以上の生殖系列突然変異を含有する抗原結合ドメインは、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または強化（場合によって）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な方法で得られた１つ以上の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子は、本発明の範囲内に包含される。
本発明はまた、一方または両方の抗原結合ドメインが、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む、抗原結合分子を含む。例えば、本発明は、本明細書に開示するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換は、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。
本発明はまた、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかと実質的に同一であるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。アミノ酸配列意味する場合、「実質的な同一性」または「実質的に同一の」という用語は、２つのアミノ酸配列が、既定のギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％、または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。２つ以上のアミノ酸配列の保存的置換が互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．ＢｉｏＩ．２４：３０７－３３１を参照されたい。
ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には配列分析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、および他の修飾に割り当てられた類似性の測定値を使用して類似の配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間または野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメータとともに使用され得るＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムである既定パラメータまたは推奨パラメータを用いたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列との間の最良重複領域の整列および配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）（上記参照））。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する際の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．ＢｉｏＩ．２１５：４０３－４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照されたい。
ｐＨ依存的結合
本発明は、ｐＨ依存性結合特性を有する、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を含む。例えば、本発明の抗抗ＣＤ２８抗体は、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＣＤ２８への結合の低減を呈し得る。あるいは、本発明の抗ＭＵＣ１６抗体は、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＭＵＣ１６への強化された結合を示してもよい。「酸性ｐＨ」という表現は、約６．２未満、例えば、約６．０、５．９５、５．９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０、またはそれ以下のｐＨ値を含む。本明細書で使用される場合、「中性ｐＨ」との表現は、約７．０～約７．４のｐＨを意味する。「中性ｐＨ」という表現は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、および７．４のｐＨ値を含む。
場合によっては、「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨで．．．結合の低下」は、中性ｐＨでその抗原に結合する抗体のＫＤ値に対する酸性ｐＨでその抗原に結合する抗体のＫＤ値の比に関して、表される（またはその逆）。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントが、約３．０以上の酸性／中性ＫＤ比を呈する場合、本発明の目的のために、抗体またはその抗原結合フラグメントは、「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＣＤ２８への結合の低減」を呈すると見なされ得る。ある特定の例示的実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントの酸性／中性ＫＤ比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０以上であってもよい。
ｐＨ依存性結合特性を有する抗体は、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで特定の抗原への結合の低減（または強化）について抗体の集団をスクリーニングすることによって得ることができる。さらに、アミノ酸レベルでの抗原結合ドメインの修飾は、ｐＨ依存的特徴を有する抗体を産生し得る。例えば、抗原結合ドメイン（例えばＣＤＲ内）の１つ以上のアミノ酸をヒスチジン残基で置換することにより、中性ｐＨに対して酸性ｐＨで抗原結合が低減した抗体を得ることができる。
Ｆｃ変異体を含む抗体
本発明のある特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を強化または減少させる１つ以上の突然変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に突然変異を含む抗体および抗原結合分子を含み、この突然変異（複数可）は、酸性環境（例えば、ｐＨ範囲約５．５～約６．０のエンドソーム内）において、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を高める。そのような突然変異は、動物に投与されたときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例には、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）での、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）での、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾、あるいは４２８位および／または４３３位（例えばＨ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／または４３４位（例えばＨ／ＦまたはＹ）での修飾、あるいは２５０位および／または４２８位での修飾、あるいは３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位での修飾が含まれる。一実施形態において、修飾は４２８Ｌ（例えばＭ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えばＮ４３４Ｓ）の修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、３０７および／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。
例えば、本発明は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌのおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される、１つ以上の突然変異の対または群を含むＦｃドメインを含む、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を含む。前述のＦｃドメイン突然変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の突然変異の全ての可能な組み合わせが、本発明の範囲内で熟慮される。
抗体および抗原結合分子の生物学的特性
本発明は、ヒトＣＤ２８および／またはＭＵＣ１６に高い親和性で結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、治療状況および所望される特定の標的化特性に応じて、中程度または低度の親和性でヒトＣＤ２８および／またはＭＵＣ１６に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。例えば、一方のアームがＣＤ２８に結合し、別のアームが標的抗原（例えば、ＭＵＣ１６）に結合する二重特異性抗原結合分子の文脈では、標的抗原結合アームが標的抗原に高い親和性で結合することが望ましい場合があるが、抗ＣＤ２８アームは、中程度または低度の親和性でのみＣＤ２８に結合する。このようにして、標的抗原を発現する細胞への抗原結合分子の優先的標的化は、一般的／非標的化ＣＤ２８結合およびそれに付随する結果として生じる有害な副作用を回避しながら達成され得る。
ある特定の実施形態によると、本発明は、例えば、本明細書の実施例４に定義されるようなアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴により測定して、約１６５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＤ２８に（例えば、３７℃で）結合する抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。ある特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例４に定義されるようなアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により測定して、約１５０ｎＭ未満、約１３０ｎＭ未満、約１２０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、または約３０ｎＭ未満のＫＤでＣＤ２８に結合する。
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例４に定義されるようなアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、３７℃での表面プラズモン共鳴により測定して、約２．１分超の解離半減期（ｔ１／２）でＣＤ２８に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。ある特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例４に定義されるようなアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴により測定して、約５分超、約１０分超、約２０分超、約３０分超、約４０分超、約５０分超、約６０分超、約７０分超、約８０分超、約９０分超、約１００分超、約２００分超、約３００分超、約４００分超、約５００分超、約６００分超、約７００分超、約８００分超、約９００分超、約１０００分超、または約１２００分超のｔ１／２でＣＤ２８に結合する。
本発明は、ヒトＣＤ２８およびヒトＭＵＣ１６に同時に結合することができる二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）を含む。ある特定の実施形態によると、本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ２８および／またはＭＵＣ１６を発現する細胞と特異的に相互作用する。二重特異性抗原結合分子がＣＤ２８および／またはＭＵＣ１６を発現する細胞と結合する程度は、本明細書の実施例５に示すように、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によって評価することができる。例えば、本発明は、ＣＤ２８を発現するがＭＵＣ１６を発現しないヒトまたはカニクイザル細胞（例えば、Ｔ細胞）、およびＭＵＣ１６を発現するがＣＤ２８を発現しないヒト卵巣癌細胞株（例えば、ＯＶＣＡＲ－３またはＰＥＯ１）に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。本発明は、実施例４に記載されるようなＦＡＣＳアッセイまたは実質的に類似のアッセイを使用して決定して、約９．２×１０－６～約２．８×１０－１０、またはそれ以下のＥＣ５０値で、前述の細胞および細胞株のうちのいずれかに結合する二重特異性抗原結合分子を含む。
本発明はまた、腫瘍細胞のＴ細胞媒介性殺滅を誘発または増加させる抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を提供する。例えば、本発明は、本明細書の実施例７に定義されるようなアッセイフォーマット（例えば、抗ＣＤ２８×ＭＵＣ１６抗体の存在下でのヒトまたはカニクイザルＰＢＭＣによるＰＥＯ１腫瘍細胞殺滅の程度を評価する）または実質的に類似のアッセイを使用して、インビトロＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅アッセイにおいて測定して、約３９２ｐＭ未満のＥＣ５０で腫瘍細胞のＴ細胞媒介性殺滅を誘発するまたは増加させる抗ＣＤ２８×ＭＵＣ１６抗体を含む。ある特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書の実施例７に定義されるようなアッセイフォーマットまたは実質的に類似のアッセイを使用して、インビトロＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅アッセイにより測定して、約２００ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約７５ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約２５ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５．０ｐＭ未満、約４．０ｐＭ未満、約３．０ｐＭ未満、約２．５ｐＭ未満、約２．０ｐＭ未満、約１．５ｐＭ、または約１．４５ｐＭ未満のＥＣ５０値で、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅（例えば、ＰＥＯ１細胞のＰＢＭＣ媒介性殺滅）を誘発する。
本発明はまた、１．０ｐＭ～１０μＭの間のＥＣ５０値でＣＤ２８発現ヒトおよび／またはカニクイザルＴ細胞に結合する抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ２８／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子は、９．２μＭ～１２０ｎＭの間のＥＣ５０値でＣＤ２８発現ヒトおよび／またはカニクイザルＴ細胞に結合する。例えば、本発明は、約１ｐＭ、約１０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５００ｐＭ、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約２００ｎＭ、約３００ｎＭ、約５００ｎＭ、約８００ｎＭ、約１０００ｎＭ、約２μＭ、約４μＭ、約６μＭ、約８μＭ、約１０μＭ、またはそれ以上のＥＣ５０値でＣＤ２８発現ヒトＴ細胞に結合する、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を含む。
本発明はまた、（ａ）Ｔ細胞を活性化し、ＩＬ－２放出、ならびにヒトＰＢＭＣにおけるＣＤ２５＋およびＰＤ－１の上方調節を誘発する（例えば、本明細書の実施例６および７を参照）、（ｂ）ＭＵＣ１６発現細胞株に対するヒトまたはカニクイザルＴ細胞媒介性細胞傷害性を増加させる（例えば、本明細書の実施例７を参照）、（ｃ）ＭＵＣ１６発現細胞株に対してナイーブ霊長類Ｔ細胞媒介細胞傷害性を誘発する（例えば、本明細書の実施例７を参照）、（ｅ）マウスにおける腫瘍細胞を枯渇させる（例えば、本明細書の実施例８）、（ｆ）マウスにおける腫瘍クリアランスを強化する（例えば、本明細書の実施例８）、（ｇ）カニクイザルにおいて全身性Ｔ細胞活性化を誘発しない、からなる群から選択される１つ以上の特性を呈する、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を含む。
本発明は、対象の腫瘍細胞を枯渇させることができる抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を含む（例えば、実施例９を参照）。例えば、ある特定の実施形態によると、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子が提供され、対象への二重特異性抗原結合分子の二重投与（例えば、約５．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以下の用量）は、対象における腫瘍細胞の数の低減を引き起こす。ある特定の実施形態によると、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子が提供され、対象への二重特異性抗原結合分子の二重投与（例えば、約２５００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約５００ｍｇ、約２００ｍｇ、約１００ｍｇ、約５０ｍｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以下の用量）は、対象における腫瘍細胞の数の低減を引き起こす。
エピトープマッピングおよび関連技術
本発明の抗原結合分子が結合するＣＤ２８またはＭＵＣ１６上のエピトープは、ＣＤ２８タンパク質またはＭＵＣ１６タンパク質の３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）のアミノ酸の単一連続配列からなってもよい。あるいは、エピトープは、ＣＤ２８またはＭＵＣ１６の複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなっていてもよい。本発明の抗体は、ＣＤ２８単量体内に含まれるアミノ酸と相互作用してもよく、またはＣＤ２８二量体の２つ以上の異なるＣＤ２８鎖上のアミノ酸と相互作用してもよい。「エピトープ」という用語は、本発明で使用される場合、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は２つ以上のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は抗原上の異なる領域に結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座または直鎖状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基によって産生されたものである。ある特定の状況では、エピトープは、抗原上のサッカリド、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
当業者に既知の種々の技法を用いて、抗体の抗原結合ドメインがポリペプチドまたはタンパク質内にある「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを判定することができる。特定の抗体または抗原結合ドメインのエピトープまたは結合ドメインを決定するために使用できる例示的な技法には、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載されるものなどのルーチン交差遮断アッセイ、点突然変異誘発（例えば、アラニン走査突然変異誘発、アルギニン走査突然変異誘発など）、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－４６３）、プロテアーゼ保護、およびペプチド切断分析が含まれる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法を採用することができる（Ｔｏｍｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６）。抗体が相互作用するポリペプチドの内部にあるアミノ酸を同定するために用いることができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的にいえば、水素／重水素交換法は、関心対象のタンパク質を重水素標識した後、抗体を重水素標識タンパク質へ結合させることを包含する。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移して、抗体によって保護されている残基（重水素標識されたままである）を除く全ての残基で水素－重水素交換を生じさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析へ供し、それにより、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９、Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。Ｘ線結晶構造解析を使用して、抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定することもできる。
本発明はさらに、本明細書に記載される特定の例示的な抗体のうちのいずれかと同じエピトープに結合する、抗ＣＤ２８および抗ＭＵＣ１６抗体（本明細書の表１および３に記載されるようなアミノ酸配列のうちのいずれかを含む抗体）を含む。同様に、本発明はまた、ＣＤ２８および／またはＭＵＣ１６への結合について、本明細書に記載の特定の例示的な抗体のいずれかと競合する抗ＣＤ２８および／または抗ＭＵＣ１６抗体（例えば、本明細書の表１に記載のアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）も含む。
本発明はまた、ヒトＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＭＵＣ１６に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合分子を含み、第１の抗原結合ドメインは、本明細書に記載される特定の例示的なＣＤ２８特異的抗原結合ドメインのうちのいずれかと同じＣＤ２８上のエピトープに結合し、かつ／または第２の抗原結合ドメインは、本明細書に記載される特定の例示的なＭＵＣ１６特異的抗原結合ドメインのうちのいずれかと同じＭＵＣ１６上の同じエピトープに結合する。
同様に、本発明はまた、ヒトＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＭＵＣ１６に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合分子を含み、第１の抗原結合ドメインは、本明細書に記載される特定の例示的なＣＤ２８特異的抗原結合ドメインのうちのいずれかとＣＤ２８への結合について競合し、かつ／または第２の抗原結合ドメインは、本明細書に記載される特定の例示的なＭＵＣ１６特異的抗原結合ドメインのうちのいずれかとＭＵＣ１６への結合について競合する。
特定の抗原結合分子（例えば、抗体）またはその抗原結合ドメインが、本発明の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合するか、または結合について本発明の参照抗原結合分子と競合するかどうかは、当該技術分野で既知の常法を用いて容易に判定できる。例えば、試験抗体が本発明の参照二重特異性抗原結合分子と同じＣＤ２８（またはＭＵＣ１６）上のエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照二重特異性分子をまずＣＤ２８タンパク質（またはＭＵＣ１６タンパク質）に結合させる。次に、ＣＤ２８（またはＭＵＣ１６）分子へ結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が参照二重特異性抗原結合分子と飽和結合後にＣＤ２８（またはＭＵＣ１６）に結合することができる場合、試験抗体は参照二重特異性抗原とは異なるＣＤ２８（またはＭＵＣ１６）のエピトープに結合すると結論することができる。その一方で、試験抗体が、参照二重特異性抗原結合分子に飽和結合後にＣＤ２８（またはＭＵＣ１６）分子へ結合できない場合、試験抗体は、本発明の参照二重特異性抗原結合分子によって結合したエピトープと同じＣＤ２８（またはＭＵＣ１６）のエピトープへ結合してもよい。次に、試験抗体の結合の観察された欠失が、実際に、参照二重特異性抗原結合分子と同じエピトープへの結合によるものであるか、それとも立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠失の原因であるのかを確認するために、さらなる通例の実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的な抗体結合アッセイを用いて行うことができる。本発明のある特定の実施形態によると、例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰量の一方の抗原結合タンパク質が、競合結合アッセイにおいて測定して、もう一方の結合を少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％、またはさらに９９％阻害する場合、２つの抗原結合タンパク質は、同じ（または重複する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５－１５０２を参照）。あるいは、一方の抗原結合タンパク質の結合を低減または排除する抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、もう一方の結合を低減または排除する場合、２つの抗原結合タンパク質は同じエピトープと結合すると見なされる。一方の抗原結合タンパク質の結合を減少または排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の結合を減少または排除する場合、２つの抗原結合タンパク質は「重複エピトープ」を有するとみなされる。
抗体またはその抗原結合ドメインが、結合について、参照抗原結合分子と競合するかどうかを決定するために、上述の結合方法を２つの方向性で実施する。第１の方向性おいて、参照抗原結合分子を飽和条件下でＣＤ２８タンパク質（またはＭＵＣ１６タンパク質）へ結合させた後、ＣＤ２８（またはＭＵＣ１６）分子への試験抗体の結合を評価する。第２の方向性において、試験抗体を飽和条件下でＣＤ２８（またはＭＵＣ１６）分子に結合させた後、参照抗原結合分子のＣＤ２８（またはＭＵＣ１６）分子への結合を評価する。両方向において、第１の（飽和）抗原結合分子のみがＣＤ２８（またはＭＵＣ１６）分子に結合することができる場合、試験抗体および参照抗原結合分子は、ＣＤ２８（またはＭＵＣ１６）への結合について、競合すると結論される。当業者によって認識されるように、参照抗原結合分子との結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープへ結合するわけではないが、重複しているまたは隣接しているエピトープに結合することによって、参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
抗原結合ドメインの調製および二重特異性分子の調製
特定の抗原に特異的な抗原結合ドメインは、当該技術分野で既知の任意の抗体産生技術によって調製することができる。いったん得られれば、２つの異なる抗原（例えば、ＣＤ２８およびＭＵＣ１６）に特異的な２つの異なる抗原結合ドメインを互いに適切に配置して、常法を使用して本発明の二重特異性抗原結合分子を産生することができる。（本発明の二重特異性抗原結合分子を構築するために使用できる例示的な二重特異性抗体フォーマットの考察は、本明細書の他所に提供される）。ある特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子の１つ以上の個々の構成要素（例えば、重鎖および軽鎖）は、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体に由来する。そのような抗体を作製するための方法は当該技術分野において周知である。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子の１つ以上の重鎖および／または軽鎖は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を使用して調製することができる。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（または任意の他のヒト抗体産生技術）を使用して、特定の抗原（例えば、ＣＤ２８またはＭＵＣ１６）に対する高親和性キメラ抗体が、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有して最初に単離される。抗体を、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けし、選択する。マウス定常領域は、所望のヒト定常領域と置換されて、本発明の二重特異性抗原結合分子に組み込まれ得る完全ヒト型重鎖および／または軽鎖を生成する。
遺伝子操作された動物を、ヒト二重特異性抗原結合分子を作製するために使用してもよい。例えば、内在性マウス免疫グロブリン軽鎖可変配列を再編成および発現することができない、遺伝子改変マウスを使用することができ、マウスは、内在性マウスカッパ遺伝子座のマウスカッパ定常遺伝子に作動可能に連結されているヒト免疫グロブリン配列によってコードされる１つまたは２つのヒト軽鎖可変ドメインのみを発現する。そのような遺伝子改変マウスを使用して、２つの異なるヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントのうちの１つに由来する可変ドメインを含む同一の軽鎖と会合する２つの異なる重鎖を含む完全ヒト型二重特異性抗原結合分子を産生することができる。（そのような操作されたマウスおよび二重特異性抗原結合分子を産生するためのその使用の詳細な議論については、例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４を参照）。
生物学的等価物
本発明は、記載される抗体のものとは異なるが、ＣＤ２８および／またはＭＵＣ１６に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有する抗原結合分子を包含する。そのような変異体抗体は、親配列と比較して、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗原結合分子のものと本質的に同等である生物学的活性を呈する。同様に、本発明の抗体結合分子をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較して、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の記載された抗原結合分子と本質的に生物学的同等性である配列を包含する。そのような変異体アミノ酸およびＤＮＡ配列の例は、上で議論されている。
本発明は、本明細書に記載の例示的な抗原結合分子のいずれかと生物学的に等価な抗原結合分子を含む。２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、それらが類似の実験条件下で単回用量または複数回用量のいずれかで同じモル用量で投与された場合に、吸収速度および吸収の程度が有意差を示さない医薬的等価物または医薬的選択肢である場合、生物学的等価物とみなされる。いくつかの抗体は、これらの吸収の程度は等価であるが吸収速度は等価ではなく、吸収速度のこのような差が意図的であり、標識することに反映されているので生物学的に等価とみなされ得る場合、等価物または薬学的選択肢とみなされることになっており、例えば長期使用に及ぼす有効な身体薬剤濃度の達成に必須ではなく、研究した特定の薬剤製品にとって医学的に有意ではないとみなされる。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらの安全性、純度、または有効性において臨床的に有意性のある差がない場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減退を含む有害作用のリスクの期待される上昇なしで参照生成物と生物学的生成物の間での切り替えなしで持続される療法と比較して、患者が１回以上切り替えられることができる場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、条件または使用条件についての共通の機序または作用機序によって、このような機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
生物学的等価性は、インビボおよびインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性測定法には、例えば、（ａ）抗体またはその代謝産物の濃度が血液、血漿、血清、または他の生物学的流体中で時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボでの試験、（ｂ）ヒト生物学的利用能データと相関した、このデータを合理的に予測しているインビトロ試験、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定されるヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験、および（ｄ）抗体の安全性、効能、または生物学的利用能もしくは生物学的等価性を確立する、十分に管理された臨床試験が含まれる。
本明細書に示す例示的な二重特異性抗原結合分子の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基もしくは配列の種々の置換を生じること、または生物活性に必要とされない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失することによって構築され得る。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失または他のアミノ酸で置換することができる。他の文脈において、生物学的に等価な抗体は、抗体のグリコシル化特性を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除または除去する突然変異を含む、本明細書に記載される例示的な二重特異性抗原結合分子の変異体を含み得る。
種の選択性および種の交差反応性
本発明は、ある特定の実施形態によると、ヒトＣＤ２８に結合するが、他の種からのＣＤ２８には結合しない抗原結合分子を提供する。本発明はまた、ヒトＭＵＣ１６に結合するが、他の種からのＭＵＣ１６には結合しない抗原結合分子を提供する。本発明はまた、ヒトＣＤ２８および１つ以上の非ヒト種由来のＣＤ２８に結合する抗原結合分子、ならびに／またはヒトＭＵＣ１６および１つ以上の非ヒト種由来のＭＵＣ１６に結合する抗原結合分子を含む。
本発明のある特定の例示的な実施形態によると、ヒトＣＤ２８および／またはヒトＭＵＣ１６に結合し、場合によってはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、またはチンパンジーのＣＤ２８および／またはＭＵＣ１６のうちの１つ以上に結合するか、または結合しない抗原結合分子が提供される。例えば、本発明の特定の例示的な実施形態において、ヒトＣＤ２８およびカニクイザルＣＤ２８に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＭＵＣ１６に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
免疫複合体
本発明は、細胞毒素、化学療法薬、免疫抑制剤、または放射性同位元素などの治療部分（「免疫結合体」）に複合体化された抗原結合分子を包含する。細胞傷害性薬剤には、細胞に有害な任意の薬剤が含まれる。免疫複合体を形成するために好適な細胞傷害性薬剤および化学療法剤の例は、当該技術分野で知られている（例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照）。
治療用製剤および投与
本発明は、本発明の抗原結合分子を含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、好適な担体、賦形剤、および改善された移動、送達、耐性などを提供する他の薬剤とともに製剤化される。多くの適切な製剤は、薬剤師全員に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて認めることができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト、水中油エマルジョンおよび油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。
患者に投与される抗原結合分子の用量は、患者の年齢および大きさ、標的疾患、病態、投与経路などに応じて変動し得る。好ましい用量は、典型的には体重または体表面積に従って計算される。本発明の二重特異性抗原結合分子が成人患者の治療目的に使用される場合、本発明の二重特異性抗原結合分子を通常約０．０１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で、より好ましくは約０．０２～約７、約０．０３～約５、または約０．０５～約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で静脈内投与することが有利であり得る。容態の重症度に応じて、治療の頻度および期間を調整することができる。二重特異性抗原結合分子を投与するための有効投与量およびスケジュールは経験的に決定され、例えば、患者の経過を定期的な評価によって監視し、それに応じて用量を調整することができる。さらに、投与量の種間スケーリングは、当該技術分野において周知の方法を用いて実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
種々の送達系、例えば、リポソームにおける封入、微粒子、マイクロカプセル、突然変異体ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスが知られており、本発明の薬学的組成物を投与するために使用され得る（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照）。導入方法には、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入もしくはボーラス注射による、上皮または粘膜皮膚の内層（ｌｉｎｉｎｇ）（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収による任意の好都合な経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身または局所であり得る。
本発明の薬学的組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下にまたは静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の薬学的組成物を送達する際の適用を容易にする。このようなペン型送達デバイスは、再利用可能または使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン型送達デバイスは、概して、薬学的組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。一度、カートリッジ内の薬学的組成物が全て投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、薬学的組成物を含む新しいカートリッジと容易に交換することができる。次に、ペン型送達デバイスは再利用することができる。使い捨てのペン型送達デバイスにおいて、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、このデバイス内の貯蔵器の中に保持された薬学的組成物が事前に充填されている。貯蔵器から薬学的組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。
数多くの再利用可能なペン型送達デバイスおよび自動注射送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の皮下送達の用途を有する。例としては、ほんの数例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、ならびにＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物の皮下送達における用途を有する使い捨てペン送達デバイスの例としては、ほんの数例を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注射器（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）、およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ）が含まれるが、これらに限定されない。
ある特定の状況において、薬学的組成物は、徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ，上記、Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。さらに別の実施形態では、徐放系を組成物の標的の近傍に配置することができ、それによって全身用量の一部のみが必要となる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，上記，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８を参照）。他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７－１５３３による総説で考察されている。
注射可能な調製物には、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、および筋肉内注射、点滴注入などのための剤形が含まれてもよい。これらの注射可能な調製物は、公に知られている方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射用に従来通り使用される滅菌水性媒体または油性媒体中に上述の抗体またはその塩を溶解、懸濁または乳化させることによって調製されてもよい。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース含有等張液、および他の補助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。油性媒体として、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用され、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。このように調製された注射は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
有益なことに、上記に記載される経口または非経口での使用のための薬学的組成物は、有効成分の用量に適合するために好適な単位用量の投薬形態へと調製される。このような単位用量の剤形には、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射（アンプル）、坐薬などが含まれる。前述の含有される抗体の量は概して、単位用量の剤形あたり約５～約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、前述の抗体は、約５～約１００ｍｇで、他の剤形については約１０～約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
抗原結合分子の治療的使用
本発明は、抗ＣＤ２８抗体またはＣＤ２８および標的抗原（例えば、ＭＵＣ１６）に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む治療用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を含む。治療用組成物は、本明細書に開示される抗体または二重特異性抗原結合分子のいずれかと薬学的に許容される担体または希釈剤とを含み得る。本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という表現は、癌の１つ以上の症状または徴候を示すヒトまたは非ヒト動物（例えば、腫瘍を発現する対象または本明細書で後述される癌のいずれかを患う対象）、あるいは、そうでなければＭＵＣ１６活性の阻害もしくは減少またはＭＵＣ１６＋細胞の枯渇から利益を得る者を意味する。
本発明の抗体および二重特異性抗原結合分子（およびそれを含む治療用組成物）は、とりわけ、免疫応答の刺激、活性化、および／または標的化が有益である任意の疾患または障害の治療に有用である。特に、本発明の抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子は、ＭＵＣ１６発現もしくは活性、またはＭＵＣ１６＋細胞の増殖に関連するかまたはそれによって媒介される任意の疾患または障害の治療、予防、および／または改善に使用され得る。本発明の治療方法が達成される作用機序は、エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の存在下での、ＭＵＣ１６を発現する細胞の殺滅を含む。本発明の二重特異性抗原結合分子を使用して阻害または殺滅することができるＭＵＣ１６を発現する細胞には、例えば、腫瘍原性卵巣細胞が含まれる。
本発明の抗原結合分子は、例えば、結腸癌、肺癌、乳癌、腎癌、および膀胱癌のサブタイプで生じる原発性および／または転移性腫瘍を治療するために使用され得る。ある特定の例示的な実施形態によると、本発明の二重特異性抗原結合分子は、卵巣癌を治療するために使用される。
本発明はまた、対象における残存癌を治療するための方法も含む。本明細書で使用される場合、「残存癌」という用語は、抗癌療法による治療後の対象における１つ以上の癌性細胞の存在または持続を意味する。
ある特定の態様によると、本発明は、対象が他の種類の抗癌療法に対して非応答性であることが示された後、本明細書の他所に記載される二重特異性抗原結合分子のうちの１つ以上を対象に投与することを含む、ＭＵＣ１６発現に関連する疾患または障害（例えば、卵巣癌などのＭＵＣ１６発現癌）を治療するための方法を提供する。例えば、本発明は、対象が癌、例えば、卵巣癌に罹患している患者のための標準治療を受けてから１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、もしくは４週間、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、１年、またはそれ以上後に、抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を患者に投与することを含む、卵巣癌を治療するための方法を含む。他の態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子（抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子）は、最初に、１つ以上の時点で対象に投与され（例えば、卵巣癌細胞のロバストな初期枯渇を提供するため）、その後の時点で、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインなどの異なるＩｇＧドメインを含む等価の二重特異性抗原結合分子が投与される。本発明の抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６抗体は、抗ＰＳＭＡ／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体などの他の二重特異性抗原結合分子と併せて使用され得ることが想定される。本発明の二重特異性抗体は、チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４を標的とするもの、および他の標的と併せて使用されることも想定されている。同じ腫瘍抗原（例えば、ＭＵＣ１６）を標的とする２つの二重特異性抗体を組み合わせることが有利であり得るが、二重特異性抗体のうちの一方は、Ｔ細胞上のＣＤ３を標的とし、もう一方の二重特異性抗体は、ＣＤ２８のような共刺激分子を標的とする。この組み合わせは、腫瘍細胞殺滅を強化するために単独で使用することができるか、またはチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用することができる。
例示的なＭＵＣ１６発現癌には、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、肝内胆管細胞癌腫瘤形成型、子宮頸部の腺癌、および胃腸管の腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
併用療法および製剤
本発明は、本明細書に記載される例示的な抗体および二重特異性抗原結合分子のうちのいずれかを、１つ以上の追加の治療活性成分と組み合わせて含む組成物および治療用製剤、ならびにそのような組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法を含む。
本発明の抗原結合分子と組み合わせることができるか、またはそれと組み合わせて投与することができる例示的な追加の治療薬には、例えば、化学療法、放射線療法、ＰＤ－１を標的とするチェックポイント阻害剤（例えば、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、またはセミプリマブなどの抗ＰＤ－１抗体、ＵＳ９，９８７，５００を参照）、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３など、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、４－１ＢＢなどの分子を標的とする共刺激アゴニスト二価抗体、ＣＤ３×二重特異性抗体（例えば、ＷＯ２０１７／０５３８５６Ａ１、ＷＯ２０１４／０４７２３１Ａ１、ＷＯ２０１８／０６７３３１Ａ１、およびＷＯ２０１８／０５８００１Ａ１を参照）、ＭＵＣ１６×ＣＤ３を標的とする他の抗体（例えば、ＷＯ２０１７／０５３８５６Ａ１を参照）および他の共刺激ＣＤ２８×二重特異性抗体が含まれる。
本発明の抗体と組み合わせて有益に投与され得る他の薬剤には、例えば、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、ならびに小分子サイトカイン阻害剤およびＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８などのサイトカイン、またはそれらそれぞれの受容体に結合する抗体を含むサイトカイン阻害剤が含まれる。本発明の薬学的組成物（例えば、本明細書に開示される抗ＣＤ２８／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物）はまた、「ＩＣＥ」：イホスファミド（例えば、Ｉｆｅｘ（登録商標））、カルボプラチン（例えば、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、エトポシド（例えば、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ＶＰ－１６）、「ＤＨＡＰ」：デキサメタゾン（例えば、Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））、シタラビン（例えば、Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標）、シトシンアラビノシド、ａｒａ－Ｃ）、シスプラチン（例えば、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）－ＡＱ）、および「ＥＳＨＡＰ」：エトポシド（例えば、Ｅｔｏｐｏｆｏｓ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ＶＰ－１６）、メチルプレドニゾロン（例えば、Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標））、高用量シタラビン、シスプラチン（例えば、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）－ＡＱ）から選択される１つ以上の治療薬の組み合わせを含む治療レジメンの一部として投与され得る。
本発明はまた、本明細書で言及される抗原結合分子のうちのいずれか、およびＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ－ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ－ｏ、ＰＤＧＦＲ－Ｉ３、ＦＯＬＨ１、ＰＲＬＲ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＳＬＮ、ＣＡ９、ウロプラキンのうちの１つ以上の阻害剤、または前述のサイトカインのうちのいずれかを含む治療薬の組み合せを含み、その阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディ、または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆｄフラグメント；Ｆｖフラグメント；ｓｃＦｖ；ｄＡｂフラグメント；もしくはダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、および最小認識ユニットなどの他の操作された分子）である。本発明の抗原結合分子は、抗ウイルス薬、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイドおよび／またはＮＳＡＩＤと組み合わせて投与および／または同時製剤することもできる。本発明の抗原結合分子はまた、放射線治療および／もしくは従来の化学療法、またはチェックポイント阻害剤もしくは他の二重特異性抗体を含む生物学的薬剤による治療も含む、治療計画の一部として投与してもよい。
本発明は、１つ以上の化学療法剤と組み合わせて、本明細書に記載される抗原結合分子のうちのいずれかを含む組成物および治療用製剤を含む。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオラミド、およびトリメチルオロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストトラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２´，２´´－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えばパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）；Ａｖｅｎｔｉｓ Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；および上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。
追加の治療活性成分（複数可）は、本発明の抗原結合分子の投与の直前、同時に、または直後に投与してもよい。（本開示の目的のために、このような投与計画は、追加の治療活性成分と「組み合わせて」抗原結合分子を投与することとみなされる。
本発明は、本発明の抗原結合分子が、本明細書の他所に記載される追加の治療活性成分（複数可）のうちの１つ以上と同時製剤された薬学的組成物を含む。
投与レジメン
本発明のある特定の実施形態によると、複数回用量の抗原結合分子（例えば、ＭＵＣ１６およびＣＤ２８に特異的に結合する抗ＣＤ２８抗体または二重特異性抗原結合分子）を所定の期間にわたって対象に投与することができる。本発明のこの態様による方法は、本発明の抗原結合分子の複数回用量を対象へ連続的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続的に投与すること」は、抗原結合分子の各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日間、数週間または数か月間）によって分けられた異なる日に対象へ投与されることを意味する。本発明には、抗原結合分子の単回の初回用量と、それに続く抗原結合分子の１回以上の二次用量、次いで場合により抗原結合分子の１回以上の三次用量を患者へ連続的に投与することを含む方法が含まれる。
「一次用量」、「二次用量」、および「三次用量」という用語は、本発明の抗原結合分子の投与の時系列を指す。したがって、「一次用量」とは、治療様式の開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）であり、「二次用量」とは、一次用量後に投与される用量であり、「三次用量」とは、二次用量後に投与される用量である。一次用量、二次用量、および三次用量は全て、同じ量の抗原結合分子を含有し得るが、概して、投与頻度に関して互いに異なり得る。しかしながら、ある特定の実施形態では、一次用量、二次用量、および／または三次用量に含有される抗原結合分子の量は、治療経過の間、互いに異なる（例えば、適宜上下に調整される）。ある特定の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、または５回）の用量が治療レジメンの開始時において「負荷用量（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｏｓｅ）」として投与され、続いてより低い頻度に基づいて投与される後続用量（例えば、「維持用量」）が投与される。
本発明のある例示的な実施形態では、各二次用量および／または三次用量は、直前の用量の１～２６（例えば、１、１と１／２、２、２と１／２、３、３と１／２、４、４と１／２、５、５と１／２、６、６と１／２、７、７と１／２、８、８と１／２、９、９と１／２、１０、１０と１／２、１１、１１と１／２、１２、１２と１／２、１３、１３と１／２、１４、１４と１／２、１５、１５と１／２、１６、１６と１／２、１７、１７と１／２、１８、１８と１／２、１９、１９と１／２、２０、２０と１／２、２１、２１と１／２、２２、２２と１／２、２３、２３と１／２、２４、２４と１／２、２５、２５と１／２、２６、２６と１／２、またはそれ以上）週間後に投与される。「直前の用量」という句は、本明細書で使用される場合、一連の複数回投与において、抗原結合分子の用量を意味し、これは、介入用量のない直後の用量の投与の前に患者へ投与される。
本発明のこの態様による方法は、抗原結合分子（例えば、ＭＵＣ１６およびＣＤ２８に特異的に結合する抗ＣＤ２８抗体または二重特異性抗原結合分子）の二次用量および／または三次用量の任意の回数を患者に投与することを含んでもよい。例えば、ある特定の実施形態では、単回の二次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の二次用量が患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、単回の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の三次用量が患者に投与される。
複数回の二次用量を伴う実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の用量の１～２週間後に患者に投与されてもよい。同様に、複数の三次用量を含む実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各三次用量は、直前の用量の２～４週間後に患者に投与されてもよい。あるいは、二次用量および／または三次用量が患者へ投与される頻度は、治療計画の経過にわたって変動し得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療経過の間に調整され得る。
一実施形態では、抗原結合分子（例えば、ＭＵＣ１６およびＣＤ２８に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子）は、体重に基づく用量として対象に投与される。「体重に基づく用量」（例えば、ｍｇ／ｋｇ単位の用量）は、対象の体重に応じて変化することになる抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗原結合分子の用量である。
別の実施形態では、抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗原結合分子は、固定用量として対象に投与される。「固定用量」（例えば、ｍｇ単位の用量）は、抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗原結合分子の１用量が、体重などのいずれの特定の対象関連因子にも関係なく、全ての対象に使用されることを意味する。ある特定の実施形態では、本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗原結合分子の固定用量は、所定の重量または年齢に基づく。
概して、本発明の抗原結合分子の好適な用量は、レシピエントの体重１キログラムあたり約０．００１～約２００．０ミリグラムの範囲、概して体重１キログラムあたり約１～５０ｍｇの範囲であり得る。例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗原結合分子は、単回用量あたり約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇで投与され得る。列挙した値の中間の値および範囲も本発明の一部であることを意図している。
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合分子は、約２５ｍｇ～約２５００ｍｇの固定用量として投与される。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合分子は、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６７５ｍｇ、約７００ｍｇ、約７２５ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７７５ｍｇ、約８００ｍｇ、約８２５ｍｇ、約８５０ｍｇ、約８７５ｍｇ、約９００ｍｇ、約９２５ｍｇ、約９５０ｍｇ、約９７５ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約２０００ｍｇ、または約２５００ｍｇの固定用量として投与される。列挙した値の中間の値および範囲も本発明の一部であることを意図している。
抗体の診断的使用
本発明の二重特異性抗体はまた、例えば、診断目的のために、試料中のＣＤ２８もしくはＭＵＣ１６またはＣＤ２８発現細胞もしくはＭＵＣ１６発現細胞を検出および／または測定するために使用することができる。例えば、抗ＣＤ２８抗体×ＭＵＣ１６抗体、またはそのフラグメントを使用して、ＣＤ２８またはＭＵＣ１６の異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、発現の欠如など）を特徴とする病態または疾患を診断してもよい。ＣＤ２８またはＭＵＣ１６についての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を本発明の抗体と接触させることを含んでもよく、抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている。あるいは、標識されていない抗体は、それ自体が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて診断用途において使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアナートもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。試料中のＣＤ２８またはＭＵＣ１６を検出または測定するために使用することができる具体的な例示的アッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれる。本発明によるＣＤ２８またはＭＵＣ１６診断アッセイにおいて使用することができる試料には、正常条件または病理学的条件下で、検出可能な量のＣＤ２８もしくはＭＵＣ１６タンパク質またはそのフラグメントを含有する、患者から得ることのできる任意の組織または体液試料が含まれる。一般に、健常な患者（例えば、異常なＣＤ２８もしくはＭＵＣ１６のレベルもしくは活性と関連した疾患もしくは病態に罹患していない患者）から得られた特定の試料中のＣＤ２８またはＭＵＣ１６のレベルを測定して、ＣＤ２８またはＭＵＣ１６のベースラインレベルまたは標準レベルを最初に確立する。次いで、このＣＤ２８またはＭＵＣ１６のベースラインレベルを、ＣＤ２８またはＭＵＣ１６に関連する疾患または病態を有することが疑われる個体から得られた試料において測定されたＣＤ２８またはＭＵＣ１６のレベルと比較することができる。
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
背景
Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体がペプチド－ＭＨＣ複合体に結合すると開始される（「シグナル１」）。次に、活性化は、標的細胞上の同族のリガンド（複数可）に結合するＴ細胞上のＣＤ２８受容体などの第２の「共刺激」受容体の係合によって強化される（「シグナル２」）。最近記載されたＣＤ３ベースの「二重特異性」は、従来のシグナル１を置き換え、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を二重特異性の一方のアームに結合してＴ細胞を腫瘍細胞に結合し、もう一方のアームでＴＣＲ／ＣＤ３にブリッジすることによって作用する。これらのいわゆるＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のうちのいくつかは、癌患者において有望な抗腫瘍効果を示したが、それらの活性は、まだ最適化されていない。本明細書の他所に記載されるように、本発明において導入されるのは、第２のＴＳＡをＴ細胞上の共刺激ＣＤ２８受容体に架橋することによってシグナル２を模倣する新規クラスの二重特異性抗体である。これらの二重特異性抗体は、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体と呼称された。本明細書に記載されるように、本発明の１つの例示的な抗体は、卵巣癌抗原（例えば、ＭＵＣ１６）に特異的である。Ｔ細胞を広く活性化し、初期の臨床試験で重篤な毒性をもたらしたＣＤ２８スーパーアゴニストとは異なり、これらのＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体は、遺伝的にヒト化された免疫担当マウスモデルまたは霊長類において単独で使用した場合、限られた活性を示し、毒性はない。しかしながら、ＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせると、本発明の例示的な抗体は、Ｔ細胞とその標的細胞との間の人工シナプスを強化し、Ｔ細胞活性化を増強し、様々な異種および同系腫瘍モデルにおけるＣＤ３二重特異性抗体の抗腫瘍活性を著しく改善した。この新規クラスのＣＤ２８共刺激二重特異性抗体を、新たなクラスのＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせると、耐容性の高い「既製の」抗体療法が提供され、抗腫瘍効果が強化される可能性がある。
ウイルスに感染した細胞または腫瘍細胞などの細胞標的を認識して殺滅するＴ細胞の能力は、相互作用の調整されたセットに依存する。これらの中で最も重要なのは、ＴＣＲ複合体（関連するＣＤ３γ、δ、ε、ζ鎖を含む）による標的細胞の認識および結合である。この相互作用は、Ｔ細胞活性化の「シグナル１」と称されている。ＴＣＲは、標的細胞の表面上で発現されるＭＨＣタンパク質の溝に存在するウイルスまたは腫瘍ペプチドを認識することができる。この結合は通常、親和性が低くなり、したがって、シグナル１のトリガーを成功させるには、Ｔ細胞とその標的細胞との間のインターフェースに沿って多くのＴＣＲ複合体をクラスター化することが必要とされ、このインターフェースは、免疫シナプスと称されている（Ｊ．Ｂ．Ｈｕｐｐａ，Ｍ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ，Ｔ－ｃｅｌｌ－ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３，９７３－９８３（２００３））。次いで、Ｔ細胞の活性化および増殖は、ＣＤ２８（「シグナル２」）などの共刺激受容体との追加の相互作用によってさらに促進される（Ｊ．Ｈ．Ｅｓｅｎｓｔｅｎ，Ｙ．Ａ．Ｈｅｌｏｕ，Ｇ．Ｃｈｏｐｒａ，Ａ．Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．Ａ．Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，ＣＤ２８ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４，９７３－９８８（２０１６））。Ｔ細胞がＴＣＲ複合体を介して標的細胞を認識し、プロフェッショナル抗原提示細胞または標的細胞上のその同族リガンド（複数可）（ＣＤ８０／Ｂ７．１および／もしくはＣＤ８６／Ｂ７．２）に結合するＣＤ２８を介してシグナル２と係合する場合、Ｔ細胞の活性化が強化される。シグナル１と同様に、ＣＤ２８を介したシグナル２は、免疫シナプスでの共クラスター化を介して発生すると考えられている。
腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を標的とする従来のモノクローナル抗体は、過去２０年間にわたって抗腫瘍治療薬として使用されてきた（Ｇ．Ｓａｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ２０ Ｙｅａｒｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．Ａｄｖ Ｔｈｅｒ ３４，２２３２－２２７３（２０１７）、Ｍ．Ｖ．Ｍａｔｅｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｐｌｕｓ Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ，Ｍｅｌｐｈａｌａｎ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ ｆｏｒ Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７８，５１８－５２８（２０１８）：Ｗ．Ｅｉｅｒｍａｎｎ，Ｇ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｓｔｕｄｙ，Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＨＥＲ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｐｉｖｏｔａｌ ｔｒｉａｌ ｄａｔａ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １２ Ｓｕｐｐｌ １，Ｓ５７－６２（２００１）、Ｊ．Ｍ．Ｃｏｎｎｏｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ Ｖｅｄｏｔｉｎ ｗｉｔｈ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｓｔａｇｅ ＩＩＩ ｏｒ ＩＶ Ｈｏｄｇｋｉｎ´ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７８，３３１－３４４（２０１８）、Ｖ．Ｄｉｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ ｖｅｒｓｕｓ ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ ｐｌｕｓ ｌａｐａｔｉｎｉｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ＨＥＲ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｄｖａｎｃｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ（ＥＭＩＬＩＡ）：ａ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｉｎａｌ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ ３ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １８，７３２－７４２（２０１７））。しかしながら、このクラスの抗体は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を誘発する能力が限られており、代わりに抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／もしくは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を促進するか、または腫瘍細胞に毒素を送達することによって作用した。最近、Ｔ細胞を腫瘍細胞に結合し、代理機序を介して（通常はＣＤ３のｅ鎖を介して）ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を活性化し、したがってシグナル１を模倣することによって、腫瘍細胞のＴ細胞を介した殺滅を効率的に誘発できる新しいクラスの二重特異性抗体（ＴＳＡ×ＣＤ３）が出現した。そのような二重特異性抗体の初期バージョン（一方のアームは白血病細胞上のＣＤ１９に結合し、もう一方のアームはＣＤ３に結合する）は最近、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病に対して規制当局の承認を受けた（Ｒ．Ｂａｒｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１，９７４－９７７（２００８）、Ｈ．Ｋａｎｔａｒｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７６，８３６－８４７（２０１７））。最近、より高度なバージョンの二重特異性抗体が、非ホジキンリンパ腫に対して良好な活性を有し、これらのリンパ腫上のＣＤ２０を標的とすることを示した（Ｅ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ，ｎａｔｉｖｅ－ｆｏｒｍａｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｏｂｕｓｔｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５，１７９４３（２０１５）、Ｌ．Ｌ．Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ－ＣＤ２０／ＣＤ３ Ｔ ｃｅｌｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ７，２８７ｒａ２７０（２０１５）、Ｍ．Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，ＣＤ２０－ＴＣＢ ｗｉｔｈ Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｓ Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２４，４７８５－４７９７（２０１８）、Ｒ．Ｂａｎｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＲＥＧＮ１９７９，ａｎ Ａｎｔｉ－ＣＤ２０ｘＡｎｔｉ－ＣＤ３ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｌａｐｓｅｄ／Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ Ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＦＬ），Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＤＬＢＣＬ），ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ（Ｂ－ＮＨＬ）Ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，（２０１８）、Ｌ．Ｂｕｄｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｓｕｎｅｔｕｚｕｍａｂ，ａ Ｆｕｌｌ－Ｌｅｎｇｔｈ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ２０／ＣＤ３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｄｉｓｐｌａｙｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｒｅｌａｐｓｅｄ／Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＮＨＬ）：Ｉｎｔｅｒｉｍ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ Ｐｈａｓｅ １ Ｓｔｕｄｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，（２０１８））。しかしながら、ＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、血液悪性腫瘍における重要な新しいクラスの免疫療法として浮上しているが、横断研究の比較（Ｅ．Ａ．Ｚｈｕｋｏｖｓｋｙ，Ｒ．Ｊ．Ｍｏｒｓｅ，Ｍ．Ｖ．Ｍａｕｓ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ＣＡＲｓ：ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０，２４－３５（２０１６））は、場合によっては、個別化されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法で見られるレベルの有効性を達成できない可能性があることを示唆している。
ＣＡＲ－Ｔ療法の強力な有効性の理由のうちの１つは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、腫瘍細胞上のその標的に結合する際に、シグナル１（ＣＤ３ｚ細胞ドメインの一部分を介して）およびシグナル２（例えば、ＣＤ２８細胞ドメインの一部分を介して）の両方を提供するように操作されていることである。２つのＣＡＲ－Ｔ細胞療法は最近、Ｂ細胞悪性腫瘍についてＦＤＡの承認を受け、どちらも抗原ＣＤ１９に結合して標的化することによって作用する（Ｓ．Ｓ．Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ Ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ ＣＡＲ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｌａｒｇｅ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７，２５３１－２５４４（２０１７）、Ｓ．Ｊ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７，２５４５－２５５４（２０１７））。ＣＡＲ－Ｔ細胞アプローチは、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）および神経毒性などの重篤な有害作用（Ｓ．Ｓ．Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ－ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １５，４７－６２（２０１８）、Ｊ．Ｇｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｆｔｅｒ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ７，１４０４－１４１９（２０１７）、Ａ．Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ－Ｖｏｒｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ６，５６（２０１８））、ならびに高度に個別化された製造プロセスおよび化学療法レジメンを事前調整するための要件に起因して関連付けることができ（Ｓ．Ｓ．Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ Ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ ＣＡＲ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｌａｒｇｅ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７，２５３１－２５４４（２０１７）、Ｓ．Ｊ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７，２５４５－２５５４（２０１７）、Ｐ．Ｓａｌｍｉｋａｎｇａｓ，Ｎ．Ｋｉｎｓｅｌｌａ，Ｐ．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌｓ（ＣＡＲＴ－Ｃｅｌｌｓ）ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｏｖｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ？Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ３５，１５２（２０１８））、多くの患者は適切な候補とは見なされない。
ＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の、より広い患者集団に対する比較的耐容性が高く「既製の」治療ソリューションとしての利点は、抗腫瘍活性をさらに最適化できれば、特に耐容性を犠牲にすることなく実行できれば、さらに向上するか、または恐らく正常細胞とは対照的に、腫瘍細胞に対する特異性がさらに高まる。この目的に向けて、ＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体を、シグナル２を独立して活性化する新規クラスの二重特異性抗体と対合すると、可能性のある有効性の向上と特異性の強化の機会がもたらされる可能性があるとの仮説が立てられた。したがって、第２のクラスの二重特異性抗体が設計された。これらの二重特異性抗体は、Ｔ細胞上で発現される共刺激受容体ＣＤ２８（ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体）とともに、同じ腫瘍特異的抗原上の第２のエピトープまたは第２の別個の腫瘍抗原のいずれかに係合する可能性がある。ＴＳＡ１×ＣＤ３とＴＳＡ２×ＣＤ２８とを組み合わせると、シグナル１およびシグナル２の両方をトリガーすることによって、Ｔ細胞の誘導され強化された代理活性化が可能になり、特異性は両方のエピトープまたは両方の抗原を発現する腫瘍細胞のみを標的とし、特異性を高める機会とともに、より大きな抗腫瘍活性を可能にするはずであると考えられた。
卵巣癌を標的とするＴＳＡ×ＣＤ２８共刺激二重特異性抗体（ケラチン癌において高レベルで発現される大型の膜内糖タンパク質であるＭＵＣ１６に結合し（Ｈ．Ｓｕｈ，Ｋ．Ｐｉｌｌａｉ，Ｄ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍｕｃｉｎｓ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｌｅ，ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｍ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７，１３７２－１３８３（２０１７））、切断されて卵巣腫瘍バイオマーカーＣＡ－１２５を放出する（Ｉ．Ｍｙｌｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｕｒ ｍａｒｋｅｒ ＣＡ－１２５ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ，ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２３，１０７５－１０８０（２００３））ＭＵＣ１６×ＣＤ２８）の生成および試験が本明細書に記載される。遺伝的にヒト化された免疫担当マウスおよびカニクイザルにおける毒性学研究は、これらの二重特異性抗体が限られた活性を呈し、単剤として毒性を呈しないことを実証する。しかしながら、これらの新規共刺激二重特異性抗体は、ＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の新しいクラスと効果的に組み合わせて、異種腫瘍モデルと同系腫瘍モデルとの両方における抗腫瘍反応を増強することができる。まとめると、これらのデータは、この新規クラスのＣＤ２８ベースの二重特異性抗体（ＴＳＡ×ＣＤ２８）をＣＤ３ベースの二重特異性抗体（ＴＳＡ×ＣＤ３）と組み合わせると、著しく強化された相乗的な抗腫瘍活性を備えた、耐容性の高い「既製の」生物製剤ソリューションを提供できることを示唆している。
実施例１．抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８抗体の構築
抗ＣＤ２８抗体の生成
抗ＣＤ２８抗体は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（すなわち、ヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む操作されたマウス）を、マウスＩｇＧ２ａのＦｃ部分に融合されたヒトＣＤ２８で免疫するか、またはＣＤ２８を発現する細胞またはＣＤ２８をコードするＤＮＡで免疫することによって得た。抗体免疫応答を、ＣＤ２８特異的イムノアッセイによって監視した。所望の免疫応答が達成されたとき、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、ＣＤ２８特異的抗体を産生する細胞株を同定した。この技法を使用して、いくつかの抗ＣＤ２８キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する抗体）を得た。さらに、ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載されるように、いくつかの完全ヒト抗ＣＤ２８抗体を、骨髄腫細胞に融合させることなく抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。
本実施例の方法に従って生成された例示的な抗ＣＤ２８抗体のある特定の生物学的特性を、以下に記載される実施例において詳細に説明する。
抗ＭＵＣ１６抗体の生成
抗ＭＵＣ１６抗体は、遺伝子改変マウスをヒトＭＵＣ１６抗原で免疫することによって、またはヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む操作されたマウスをヒトＭＵＣ１６抗原で免疫することによって得た。
遺伝子改変マウスをｈＭＵＣ１６．ｎｕｂ（ムチン１６（配列番号４９）の最後の５つのＳＥＡドメイン包含する切断型形態）で免疫するか、またはＯＶＣＡＲ－３細胞などのｈＭＵＣ１６発現細胞株で免疫した。免疫後、各マウスから脾細胞を採取して、（１）マウス骨髄腫細胞と融合してそれらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞を形成してＭＵＣ１６特異性についてスクリーニングし、または（２）反応性抗体（抗原陽性Ｂ細胞）に結合して同定する選別試薬としてヒトＭＵＣ１６フラグメントを用いて、Ｂ細胞を選別した（ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載のとおり）。
ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するＭＵＣ１６２に対するキメラ抗体を最初に単離した。抗体を、親和性、選択性などを含む望ましい特徴について特徴付けし選択する。必要ならば、マウス定常領域を所望のヒト定常領域、例えば野生型または改変ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域と置き換えて、完全ヒト型抗ＭＵＣ１６抗体を産生した。選択される定常領域は特異的用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特徴および標的特異性特徴は、可変領域に存在する。
本実施例の方法に従って産生された例示的な抗ＭＵＣ１６抗体の特定の生物学的特性を、以下に示す実施例において詳細に説明する。
ＣＤ２８およびＭＵＣ１６に結合する二重特異性抗体の生成
抗ＭＵＣ１６特異的結合ドメインおよび抗ＣＤ２８特異的結合ドメインを含む二重特異性抗体を、標準的な方法を用いて構築し、ここで、抗ＭＵＣ１６抗原結合ドメインおよび抗ＣＤ２８抗原結合ドメインはそれぞれ、共通のＬＣＶＲと対をなす異なる別個のＨＣＶＲを含む。場合によっては、二重特異性抗体は、抗ＣＤ２８抗体からの重鎖、抗ＭＵＣ１６抗体からの重鎖、および共通の軽鎖を利用して構築した（表５を参照）。
本実施例に従って作成された二重特異性抗体は、２つの別個の抗原結合ドメイン（すなわち、結合アーム）を含む。第１の抗原結合ドメインは、抗ＣＤ２８抗体（「ＣＤ２８－ＶＨ」）に由来する重鎖可変領域を含み、第２の抗原結合ドメインは、抗ＭＵＣ１６抗体（「ＭＵＣ１６－ＶＨ」）に由来する重鎖可変領域を含む。抗ＭＵＣ１６および抗ＣＤ２８の両方が、共通の軽鎖を共有する。ＣＤ２８－ＶＨ／ＭＵＣ１６－ＶＨ対合は、Ｔ細胞上のＣＤ２８および腫瘍細胞上のＭＵＣ１６を特異的に認識する抗原結合ドメインを作成する。
実施例２．重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
表１は、選択された本発明の抗ＭＵＣ１６抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。対応する核酸配列識別子を表２に記載する。
Figure 2022515611000002
Figure 2022515611000003
表３は、本発明の選択された抗ＣＤ２８抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域（ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ）ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。対応する核酸配列識別子を表４に示す。
Figure 2022515611000004
Figure 2022515611000005
構築した様々な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体の構成部分の要約を表５に示す。表６および７に、二重特異性抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＣＤＲ、ならびに重鎖および軽鎖の配列識別子を列挙する。
Figure 2022515611000006
表６は、本明細書に例示される二重特異性抗ＭＵＣ１６×抗ＣＤ２８抗体のアミノ酸配列識別子を示す。対応する核酸配列識別子を表７に記載する。
Figure 2022515611000007
Figure 2022515611000008
実施例３．ＣＤ２８は強力な共刺激受容体である
Ｔ細胞の活性化に重要な共刺激シグナルを提供するのにどの共刺激受容体が効果的であるかを決定するために、同系腫瘍のパネル上で共刺激リガンドの強制発現によって実施される共刺激経路のブラインドスクリーン（表８および図１）が、４－１ＢＢとともに最も強力な共刺激受容体の１つとしてＣＤ２８を再度確立した。表８は、ブラインドスクリーンでの無腫瘍マウスの数を要約したものである。アッセイは、７つの異なる共刺激リガンドを発現するように操作された３つの異なる腫瘍細胞株で実施した。各升目の数は、合計５匹のマウスのうち無腫瘍マウスの数を表す。
Figure 2022515611000009
実施例４．抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体の表面プラズモン共鳴由来の結合親和力および速度定数
本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６ｘＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体の結合速度論を決定するために、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体のＭＵＣ１６および／またはＣＤ２８に対する表面プラズモン共鳴により導出した結合親和性および速度定数を決定した。
精製した本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体対するｈＭＵＣ１６．ｍｍｈ（配列番号５１）、ｈＣＤ２８．ｍｍｈ（配列番号５３）、およびｍＣＤ２８．ｍｍｈ（マウスＣＤ２８．ｍｍｈ、配列番号５４）の結合についての平衡解離定数（ＫＤ値）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ－２００機器を使用したリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して決定した。ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面は、精製された本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体を捕捉するように、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体とのアミンカップリングによって誘導体化した。２つの例示的な二重特異性抗体ｂｓ２４９６３ＤおよびＲＥＧＮ４６１５を試験した。ＲＥＧＮ４６１５は、ヒトＭＵＣ１６およびマウスＣＤ２８を認識する抗体／ｓｃＦｖであり、抗ＭＵＣ１６×ｍｓＣＤ２８抗体と称されることがある。ＲＥＧＮ４６１５のＭＵＣ１６アームは、ｍＡｂ８７９４Ｐ２について上記の表１に示すように、ＶＨおよびＶＫ－ＵＬＣ１～３９配列を利用する。ｍＣＤ２８（ＰＶ－１）は、配列番号１１の軽鎖（ＵＳ２００４／０１１６６７５の図１５Ａも参照）および配列番号１３の重鎖（図１５を参照）とともに、ＵＳ２００４／０１１６６７５に記載されているものであり、これを、本明細書に記載の実験のためにｓｃＦｖとして再フォーマットした。
このＳＰＲ結合研究は、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０で構成されるｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳ－ＥＴ泳動緩衝液）中で行った。異なる濃度のＣ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－６×Ｈｉｓタグを伴うｈＭＵＣ１６（ｈＭＵＣ１６．ｍｍｈ）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－６×Ｈｉｓタグを伴うｈＣＤ２８（ｈＣＤ２８．ｍｍｈ）、およびｍＣＤ２８ Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－６×Ｈｉｓタグ（ｍＣＤ２８．ｍｍｈ）を、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体および抗ＭＵＣ１６×ｍＣＤ２８二重特異性抗体に対する親和性決定のために、３倍段階希釈として、３．３３ｎＭ～９０ｎＭ（ｈＭｕｃ１６について）または２２．２ｎＭ～６００ｎＭ（ｈＣＤ２８またはｍＣＤ２８について）の範囲のＨＢＳ－ＥＴ泳動緩衝液中で調製した。
ＭＡＳＳ－２大容量アミンセンサー表面は、約５００～９００ＲＵの抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８または抗ＭＵＣ１６×ｍＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体を捕捉するために、まずモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体とのアミンカップリングによって誘導体化した。製造元によって定義されたように、１ＲＵ（応答ユニット）は、１ｍｍ２あたり１ｐｇのタンパク質を表す。異なる濃度のＣ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－６×Ｈｉｓタグを伴うｈＭＵＣ１６（ｈＭＵＣ１６．ｍｍｈ）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－６×Ｈｉｓタグを伴うｈＣＤ２８（ｈＣＤ２８．ｍｍｈ）、およびｍＣＤ２８ Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－６×Ｈｉｓタグ（ｍＣＤ２８．ｍｍｈ）を、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体および抗ＭＵＣ１６×ｍＣＤ２８二重特異性抗体に対する親和性決定のために、３倍段階希釈として、３．３３ｎＭ～９０ｎＭ（ｈＭｕｃ１６について）または２２．２ｎＭ～６００ｎＭ（ｈＣＤ２８またはｍＣＤ２８について）の範囲のＨＢＳ－ＥＴ泳動緩衝液中で調製し、抗ヒトＦｃで捕捉した抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８または抗ＭＵＣ１６×ｍＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体表面上に、５０μＬ／分の流量で５分間かけて注射した。結合したｈＭＵＣ１６、ｈＣＤ２８、およびｍＣＤ２８試薬の解離を、ＨＢＳ－ＥＴ泳動緩衝液中で１０分間監視した。会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度の定数は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ評価ソフトウェアバージョン２．０ｃを使用して、リアルタイム結合センサーグラムを、物質移動限界（ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を有する１：１結合モデルにあてはめることにより決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、動的速度定数から以下のように計算した。
Figure 2022515611000010
３７℃での精製したｈＭＵＣ１６、ｈＣＤ２８、ｍＣＤ２８組換えタンパク質に結合する例示的な二重特異性抗体の結合速度論的パラメータを以下の表９～１２に示す。
Figure 2022515611000011
Figure 2022515611000012
Figure 2022515611000013
Figure 2022515611000014
実施例５．抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体のＴ細胞および標的細胞への結合
ヒトおよびカニクイザルＴ細胞および標的細胞に対する本発明の例示的な二重特異性抗体の結合を決定するために、フローサイトメトリー分析を利用して、ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体のＯＶＡＣＲ－３、ＰＥＯ１、陰性対照Ｒａｊｉ細胞、ヒトおよびカニクイザルＴ細胞への結合を決定した後、フィコエリトリン（ＰＥ）標識またはＡｌｅｘａ－６４７標識した抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。簡単に説明すると、１×１０５細胞／ウェルを、例示的なＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体、またはヒトもしくはカニクイザルＣＤ２８との交差反応性なしにヒト抗原に結合するＩｇＧ４アイソタイプ対照の段階希釈物とともに４℃で３０分間インキュベートし、この希釈物は、ヒトおよびカニクイザルＴ細胞については１３３ｎＭ～３２．６ｐＭの範囲、およびＭｕｃ１６発現細胞および陰性対照Ｒａｊｉ細胞については１３３ｎＭ～８．１４ｐＭの範囲であった。インキュベーション後、細胞を、１％濾過ＦＢＳを含有する冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥ複合体化またはＡｌｅｘａ６４７複合体化抗ヒト二次抗体をそれぞれＭＵＣ１６発現細胞またはヒト／カニクイザルＴ細胞に添加し、さらに３０分間インキュベートした。Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素を、ヒトおよびカニクイザルＴ細胞のインキュベーションに添加した。抗体なしまたは二次抗体のみを含有するウェルを対照として使用した。
ＭＵＣ１６発現細胞とのインキュベーション後、細胞を洗浄し、１％の濾過したＦＢＳを含有する２００μＬの冷ＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ上でフローサイトメトリーにより分析した。
ヒトまたはカニクイザルＴ細胞とのインキュベーション後、細胞を洗浄し、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ中の抗ＣＤ２、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ４、および抗ＣＤ８抗体のカクテルを用いてさらなる２０分間のインキュベーションの間４℃で染色した。洗浄後、細胞を、１％の濾過したＦＢＳを含有する２００μＬの冷ＰＢＳ中に再懸濁し、Ｌｉｖｅ／ＣＤ２＋／ＣＤ４＋／ＣＤ１６またはＬｉｖｅ／ＣＤ２＋／ＣＤ８＋／ＣＤ１６ゲートにゲートし、ＢＤ ＦＡＣＳ ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ－Ｘ２０上でフローサイトメトリーにより分析した。
例示的なＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体の、ヒトＴ細胞の表面への結合をフローサイトメトリーによって試験した。ｂｓ２４９６３Ｄは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に２．６１×１０－７ＭのＥＣ５０値で結合した。これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞に２．５３×１０－７ＭのＥＣ５０値で結合した。ｂｓ３２８９７Ｄは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に９．１６×１０－６ＭのＥＣ５０値で弱く結合した。これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞にも７．５８×１０－６ＭのＥＣ５０値で弱く結合した。結果を表１３に要約した。
Figure 2022515611000015
例示的なＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体のカニクイザルＴ細胞の表面への結合をフローサイトメトリーによって試験した。例示的なｂｓ２４９６３Ｄは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に２．０３×１０－７ＭのＥＣ５０値で結合した。これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞に１．２２×１０－７ＭのＥＣ５０値で結合した。例示的なｂｓ３２８９７Ｄは、ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１細胞に、それぞれ、２．８７×－１０Ｍおよび５．９６×１０－１０ＭのＥＣ５０値で結合した。例示的なｂｓ２４９６３Ｄは、ＭＵＣ１６陰性対照ＲＡＪＩ細胞へのいずれの結合も呈しなかった。結果を表１４に要約した。
Figure 2022515611000016
ＭＵＣ１６を発現する細胞株の表面への例示的なＭＵＣ１６ｘＣＤ２８二重特異性抗体の結合を、フローサイトメトリーによって試験した。ｂｓ２４９６３Ｄは、ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１細胞に、それぞれ、６．０９×１０－１０Ｍおよび４．６７×１０－１０ＭのＥＣ５０で結合した。ｂｓ３２８９７Ｄは、ＭＵＣ１６陰性対照ＲＡＪＩ細胞へのいずれの結合も呈しなかった。ｂｓ２４９６３Ｄは、ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１細胞に、それぞれ、２．８７×１０－１０Ｍおよび５．９６×１０－１０ＭのＥＣ５０値で結合した。ｂｓ２４９６３Ｄは、ＭＵＣ１６陰性対照ＲＡＪＩ細胞へのいずれの結合も呈しなかった。アイソタイプ対照抗体は、ヒトまたはカニクイザルのＴ細胞へのいずれの結合も呈せず、ＭＵＣ１６を発現する細胞株にも結合しなかった。結果を表１５に要約した。
Figure 2022515611000017
実施例６．ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体の一次バイオアッセイ
Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の主要組織適合性複合体クラスＩまたはＩＩ（ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ）タンパク質によって提示される特定のペプチドを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を刺激することによって達成される（Ｇｏｌｄｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｄｉｖｅｒｓｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ ４０２，２５５－２６２（１９９９））。活性化されたＴＣＲは、順にシグナル伝達事象のカスケードを開始し、これはアクチベータータンパク質１（ＡＰ－１）、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）、または活性化Ｂ細胞の核因子κ軽鎖エンハンサー（ＮＦκＢ）などの様々な転写因子によって駆動される、レポーター遺伝子によって監視することができる。Ｔ細胞応答は次いで、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）、ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）、ＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子３）、または他の分子などのＴ細胞上に構成的または誘発的のいずれかで発現した共受容体の関与を介してさらに精製される（Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｂ７－ＣＤ２８ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２（２）：１１６－２６（２００２））。共刺激分子であるＣＤ２８は、ＡＰＣ上で発現する内在性リガンドＣＤ８０またはＣＤ８６によって活性化される。ＣＤ２８は、ＴＣＲ活性化後、ＮＦκＢ転写因子によって制御される経路などの細胞シグナルを増強する。ＣＤ２８共シグナルは、Ｔ細胞の分化、増殖、サイトカイン放出、および細胞死などの効果的なＴ細胞活性化に重要である（Ｓｍｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，ＮＦκＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ＣＤ２８ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ－Θ，ＰＮＡＳ，９７（７）：３３９４－３３９９（２０１２）。
一次刺激およびＭＵＣ１６標的発現の両方の存在下でＴ細胞活性を強化する抗体を同定するために、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体を、ヒト初代Ｔ細胞を使用した細胞ベースのアッセイにおいて特徴付けた。これらのアッセイは、一次刺激の存在下および非存在下、ならびに標的発現の存在下および非存在下での抗ＭＵＣ１６／ＣＤ２８二重特異性抗体の挙動を評価するものである。
初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を使用したＩＬ－２機能アッセイ：
初代ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＡＰＣ機能アッセイは、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体との係合によるＩＬ－２産生に対するＣＤ２８活性化の影響を評価するために開発された。
ａ）ヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離：
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なドナー白血球パックから単離した。ＰＢＭＣの単離は、製造元の推奨プロトコルに従って、５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブを使用した密度勾配遠心分離によって達成した。簡単に説明すると、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ ＰＬＵＳを５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅチューブに重層し、続いてＤ－ＰＢＳで１：２に希釈した３０ｍＬの白血球を添加した。その後のステップは、ＳｅｐＭａｔｅ製造元のプロトコルに従った。続いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造元のプロトコルに従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製のヒトＣＤ４マイクロビーズキットを使用して、ＰＢＭＣから単離した。単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を、１バイアルあたり５×１０６細胞の濃度で１０％のＤＭＳＯを含むＦＢＳ中で凍結させた。
ｂ）ＣＤ２８抗体で処理された初代ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ－２放出：
このアッセイでは、ヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を、細胞表面にＭｕｃ１６を発現するヒト標的細胞ＯＶＣＡＲ３またはＰＥＯ－１とともにインキュベートしたαＭｕｃ１６×αＣＤ３二重特異性抗体（ＲＥＧＮ４０１８）を使用して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と複合体形成したＣＤ３分子の架橋を介して活性化する。Ｍｕｃ１６を発現する標的細胞へのＲＥＧＮ４０１８のＭｕｃ１６アームの結合により、ＣＤ３分子のクラスター化が促進され、同種応答の非存在下のまたはその追加に対するＴ細胞刺激に必要な最初のシグナルが提供される。しかしながら、このアッセイでは、Ｔ細胞活性化を完了し、ＩＬ－２放出のレベルを増加させるために、ＣＤ２８分子の架橋によって提供される共刺激が必要とされる。ここで、二重特異性抗ＣＤ２８抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２８およびＯＶＣＡＲ３またはＰＥＯ－１細胞上のＭｕｃ１６と相互作用し、共刺激分子であるＣＤ２８のクラスター化－活性化を促進する。組み合わされたＴＣＲとＣＤ２８との係合により、ＩＬ－２産生が強化され、これが細胞培養培地中に放出される。ＩＬ－２は、均質な洗浄なしのＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製ＡｌｐｈａＬｉｓａキットを使用して細胞上澄から検出および定量する。
以前に単離し、凍結したドナー１０４由来のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼヌクレアーゼを含む刺激培地（１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、および０．０１ｍＭ ＢＭＥを補充したＸ－ＶＩＶＯ １５細胞培養培地）中でアッセイの日に解凍した。細胞を、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、刺激培地中に再懸濁し、１×１０５細胞／ウェルの濃度で９６ウェル丸底プレート中にプレートした。ＯＶＣＡＲ３およびＰＥＯ－１細胞は、ＯＶＣＡＲ３には２５μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ、ＰＥＯ－１細胞には１０μｇ／ｍＬを使用して、一次刺激培地中でマイトマイシンＣにより処理した。３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした後、標的細胞を、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で３回洗浄し、ウェルあたり１×１０４のＯＶＣＡＲ３または２．５×１０４のＰＥＯ－１細胞の最終濃度で、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含有するウェルに添加した。続いて、３ｐＭ～２００ｎＭの範囲の１：４で段階希釈したＣＤ２８二重特異性抗体または対照抗体を、一定５ｎＭのＲＥＧＮ４０１８（αＭｕｃ１６×αＣＤ３）または陰性対照抗体（ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照＝Ｈ４ｓＨ）の存在下でウェルに添加した。１０点希釈の最終点には、バックグラウンドシグナルであるＣＤ２８抗体は含まれなかった。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした後、それらを遠心分離して細胞をペレット化し、２０μＬの培地上清を収集した。このことから、製造元のプロトコルに従い、ヒトＩＬ－２ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにおいて、５μＬを試験した。測定値をマルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎで取得し、原ＲＬＵ（相対光単位）値をプロットした。全ての段階希釈物を二重に試験した。
抗体のＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して、１０点用量応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式にデータを適合させることによって決定した。最大倍率誘発を、次の方程式を使用して計算した。
Figure 2022515611000018
ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化（ＩＬ－２放出により測定）は、一次刺激（抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３）および標的細胞上で発現されたＭＵＣ１６の存在下でｈＭＵＣ１６×ｈＣＤ２８によって強化された。
ｃ）初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を使用したＩＬ－２機能アッセイの結果：
抗Ｍｕｃ１６×抗ＣＤ２８二重特異性抗体がＴＣＲ刺激二重特異性抗体（ＲＥＧＮ４０１８＝抗Ｍｕｃ１６×抗ＣＤ３）の非存在下または存在下で単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２８をとおした共刺激を提供する能力を、細胞表面に内因的にＭｕｃ１６を発現する標的細胞（ＯＶＡＲ３およびＰＥＯ－１細胞）とともにインキュベートした単離されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した機能的ＩＬ－２放出アッセイにおいて評価した。
一定５ｎＭのｈＩｇＧ４Ｈ４ｓＨアイソタイプ対照またはＲＥＧＮ４０１８抗Ｍｕｃ１６×抗ＣＤ３のいずれかに加えてＯＶＣＡＲ３またはＰＥＯ－１細胞とともに共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞の倍率誘発値を、表１６および１７に要約する。
単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、一定量のＨ４ｓＨアイソタイプ対照を使用したＲＥＧＮ４０１８を介した有向ＴＣＲ刺激の非存在下でＯＶＣＡＲ３またはＰＥＯ－１標的細胞とともにインキュベートすると、検出されたＩＬ－２量は、ＣＤ２８親抗体、二重特異性抗Ｍｕｃ１６×抗ＣＤ２８抗体（ｂｓ３２８９７Ｄおよびｂｓ２４９６３Ｄ）、および陰性Ｈ４ｓＨアイソタイプ対照抗体の間で類似する。（表１６）
対照的に、ＩＬ－２レベルの上昇が、抗Ｍｕｃ１６×抗ＣＤ３（ＲＥＧＮ４０１８）で処理した試料中で検出される。これらの条件下で、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞をＯＶＣＡＲ３またはＰＥＯ－１細胞とともに共培養した場合、両方のＣＤ２８二重特異性抗体は、それぞれの親ＣＤ２８抗体よりもＩＬ－２レベルを増加させる。予想どおり、アイソタイプ対照では最小限のＩＬ－２放出は観察されない。（表１７）
ＯＶＣＡＲ３を標的細胞として使用すると、両方のＣＤ２８二重特異性抗体（ｂｓ３２８９７Ｄ：５．６３×およびＥＣ５０＝６０６ｐＭ）ならびにｂｓ２４９６３Ｄ：５．３２×およびＥＣ５０＝４０１ｐＭ）について、類似の用量依存性ＩＬ－２放出が測定される。一方、ＰＥＯ－１細胞では、ＩＬ－２レベルの倍率誘発の差異が両方の二重特異性分子間で観察された。ここで、ｂｓ２４９６３Ｄ（１０．９４×およびＥＣ５０＝９９６ｐＭ）は、ｂｓ３２８９７Ｄよりも高いＩＬ－２値をもたらす（用量応答曲線が飽和に達しなかったため、５．２２×およびＥＣ５０を決定することはできなかった）。
同種応答をとおしたまたは抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３によって促進されるＴＣＲ刺激の非存在下において、ＯＶＣＡＲ３またはＰＥＯ－１細胞の存在下で一定量のアイソタイプ対照を含むウェルのＣＤ２８抗体では、測定可能なＩＬ－２放出は観察されない（表１６）。表１６は、ＯＶＣＡＲ３またはＰＥＯ－１および一定５ｎＭのアイソタイプ対照とともに共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ－２放出のＥＣ５０値および倍率誘発を要約する。
Figure 2022515611000019
対照的に、測定可能なＩＬ－２レベル（ＲＬＵ）が、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３で処理した試料中で検出された。これらの条件下で、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞をＯＶＣＡＲ３またはＰＥＯ－１細胞とともに共培養した場合、両方のＣＤ２８二重特異性抗体は、その親ＣＤ２８抗体よりもＩＬ－２レベルを増加させる。予想どおり、アイソタイプ対照ではＩＬ－２放出は観察されない（表１７）。表１７は、ＯＶＣＡＲ３またはＰＥＯ－１および一定５ｎＭの５ｎＭ抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３とともに共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ－２放出のＥＣ５０値および倍率誘発を要約する。
Figure 2022515611000020
実施例７．抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体は、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３によるＴＣＲ刺激の存在下で、卵巣腫瘍細胞に対するＴ細胞の活性化および細胞傷害性を増強すると結論した。
本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体が卵巣腫瘍細胞に対する抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化および細胞傷害性を強化できたかどうかを調査するために、ＦＡＣＳを使用して、漸増用量の単独のまたはＭＵＣ１６×ＣＤ２８と組み合わせたＭＵＣ１６×ＣＤ３とともにインビトロで共培養した後の腫瘍細胞および表現型Ｔ細胞の生存を調査した（図２Ａ）。Ｔ細胞を含むヒト末梢血単核（ＰＢＭＣ）細胞を、内在レベルのＭＵＣ１６を発現するＰＥＯ－１卵巣癌細胞とともに培養した（Ｃｏｓｃｉａ，Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１６），Ａｕｇｕｓｔ ２６；７：１２６４５）。
２つのＦＡＣＳベースの細胞傷害性研究を実施した。第１の研究では、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８刺激の存在下または非存在下、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３の存在下で、ＭＵＣ１６＋細胞に対してＦＡＣＳベースの細胞傷害性を実施した（ＭＵＣ１６細胞＋ヒトＰＢＭＣ＋／－ＭＵＣ１６×ＣＤ２８刺激に対するＦＡＣＳベースの細胞傷害性（ＭＵＣ１６×ＣＤ２８とＭｕｃ１６×ＣＤ３とのマトリックス設定））。第２の研究は、ヒトＰＢＭＣの代わりにカニクイザルＰＢＭＣを使用することを除いて、第１の研究と同じである（ＭＵＣ１６細胞＋カニクイザルＰＢＭＣ＋／－ＭＵＣ１６×ＣＤ２８刺激に対するＦＡＣＳベースの細胞傷害性（ＭＵＣ１６×ＣＤ２８とＭＵＣ１６×ＣＤ３とのマトリックス設定））。
実験手順
本発明の抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３抗体および例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８抗体の組み合わせの存在下でのＭＵＣ１６＋細胞の死滅を監視するために、ＭＵＣ１６を内在的に発現する細胞株（ＰＥＯ１、ＭＵＣ１６＋）を１μＭのＶｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒで標識し、３７℃で一晩プレーティングした。別に、ヒトＰＢＭＣ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ）またはカニクイザルＰＢＭＣ（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｃｒａｎｆｏｒｄ ＮＪ）を、１×１０６細胞／ｍＬで補充ＲＰＭＩ培地に播種し、付着マクロファージ、樹状細胞、およびいくつかの単球を枯渇させることによってリンパ球を濃縮するために３７℃で一晩インキュベートした。翌日、標的細胞を、接着細胞が枯渇したナイーブヒトＰＢＭＣ（エフェクター／標的細胞４：１比）、および単独の、または固定濃度（２．５μｇ／ｍｌ）の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体と組み合わせた抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３または非標的ＣＤ３ベース二重特異性抗体（ｂｓ１７６６４Ｄ）のいずれかの段階希釈物とともに、９６時間、３７℃で共インキュベートした。インキュベーション後、トリプシン－ＥＤＴＡ解離緩衝液を使用して、細胞を細胞培養プレートから取り出し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により分析した。
ＦＡＣＳ分析の場合、細胞を生存率の遠赤細胞トラッカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、抗体をＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２５（ＢＤ）に直接複合体化した。試料は、細胞カウント用のキャリブレーションビーズとともに泳動させた。殺滅の特異性を評価するために、標的細胞を、バイオレット細胞トラッカー陽性集団としてゲートした。生きた標的細胞のパーセントは、次のように計算した：生細胞のパーセンテージ＝（Ｒ１／Ｒ２）＊１００（ここで、Ｒ１＝抗体の存在下での生きた標的細胞のパーセンテージ、およびＲ２＝試験抗体の非存在下での生きた標的細胞のパーセンテージ）。Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ２＋／ＣＤ４＋またはＣＤ２＋／ＣＤ８＋）Ｔ細胞のうちの活性化（ＣＤ２５＋）Ｔ細胞のパーセントによって測定した。ＰＤ－１マーカーの上方調節は、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＰＤ－１に対して直接複合体化した抗体とともに細胞をインキュベートし、全Ｔ細胞（ＣＤ２＋）のうちのＰＤ－１＋Ｔ細胞のパーセントを報告することによって評価した。Ｔ細胞数は、キャリブレーションビーズあたりの生きたＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の数を計算することによって測定した。培地に蓄積されたサイトカインのレベルは、ＢＤサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキットを使用して、製造元のプロトコルに従って分析した。
結果、要約、および結論：
抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体を、単剤としてまたは共刺激抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８抗体の存在下で、ナイーブヒトＴ細胞を誘発して、ヒトＭＵＣ１６を発現するＰＥＯ１標的細胞を殺滅する能力について試験した。ヒトＴ細胞を活性化し、ＰＥＯ１細胞を枯渇させるように、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体を誘導した。さらに、ＭＵＣ１６×ＣＤ３単独では、ＰＥＯ－１癌細胞の中程度のＴ細胞死滅が誘導され、それにより、それらの生存率が約６０％まで用量依存的に低下した（図２Ｂおよび表１８）。抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体の存在下で標的細胞の殺滅が観察され、ＰＥＯ１細胞は、ピコモル（ｐＭ）レベルのＥＣ５０で用量依存的に殺滅された（表２Ｂ）。抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３が存在しない場合、標的細胞の殺滅は観察されなかった（図２Ｂ）。観察された標的細胞溶解は、再びピコモル（ｐＭ）レベルのＥＣ５０でのＣＤ２＋Ｔ細胞上のＣＤ２５＋およびＰＤ－１＋細胞の上方調節と関連付けられた（表１８）。
抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３は、ヒトサイトカインの放出を誘発した。単剤としての抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体で観察された細胞傷害活性は、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８共刺激分子ｂｓ２４９６３Ｄおよびｂｓ３２８９７Ｄの存在下で強化された。
本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８の添加により、ＭＵＣ１６×ＣＤ３によって誘発される細胞傷害性の効力および深さが増加し、その結果、ＰＥＯ－１癌細胞の生存が２０％未満（Ｔ細胞殺滅の３倍超の増加）にさらに低下することが見出された（図２Ｂ）。さらに、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８により、ＭＵＣ１６×ＣＤ３によって誘発されるＩＦＮγ放出のレベルが１０倍以上増加した（図２Ｃ）。ＭＵＣ１６×ＣＤ２８とＭＵＣ１６×ＣＤ３との組み合わせにより、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞が増殖し、活性化マーカーＣＤ２５の発現レベルが増加した（図２Ｄ～Ｅ）。注目すべきことに、非標的化ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＭＵＣ１６×ＣＤ２８は、Ｔ細胞の細胞傷害性も活性化も誘発しなかった（図２Ｂ）。
要約すると、共刺激は、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３を単剤として用いて観察されたものと比較した場合、Ｔ細胞活性化、ＰＤ－１上方調節、およびサイトカイン放出を増加させた。表１８および１９ならびに図２Ａ～２Ｅ）は、ヒトＰＢＭＣを使用した実験結果を要約する。
Figure 2022515611000021
抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体は、単剤としてまたは共刺激性抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体の存在下で、ナイーブカニクイザルＴ細胞を誘発して、ヒトＭＵＣ１６を発現する標的細胞を殺滅する能力についても試験した。カニクイザルのＰＢＭＣを使用して同じアッセイを実施すると、類似の結果が得られた（図２Ｆ～Ｈ）。図２Ｉは、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体が、フローサイトメトリーによって測定して、細胞標的に結合することを示している。これらの結果は、本発明の抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体が、増殖およびサイトカイン放出だけでなく細胞傷害性によっても、ＭＵＣ１６×ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化を強力に強化できることを実証した。選択した抗体滴定で、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＴ細胞を活性化したが、Ｔ細胞にＰＥＯ１細胞を枯渇させるようには誘導しなかった（表１９）。本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８抗体との共刺激により、Ｔ細胞の活性化が増加し、細胞傷害活性が強化され、Ｔ細胞上のＰＤ－１マーカーが上方調節された（表１９）。
Figure 2022515611000022
実施例８．抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８抗体のインビボ研究
腫瘍抗原を標的とする抗ＣＤ３×ＭＵＣ１６と抗ＣＤ２８×ＭＵＣ１６二重特異性抗体とを組み合わせることにより、マウスモデルにおける腫瘍クリアランスが強化された。以下に詳細に示すように、ＯＶＣＡＲ－３腫瘍成長は、抗ＣＤ３×ＭＵＣ１６のみ、または対照アイソタイプを投与したマウスと比較して、本発明の例示的な抗ＣＤ３×ＭＵＣ１６および例示的な抗ＣＤ２８×ＭＵＣ１６を投与したマウスで有意に阻害された。
ＭＵＣ１６×ＣＤ２８がインビボでＭＵＣ１６×ＣＤ３の抗腫瘍効果を強化できるかどうかを調査するために、以下に詳述するように、２つの異なる腫瘍モデル、腫瘍異種腹水モデル、および腫瘍同系マウスモデルを使用した。
腫瘍異種腹水モデル
腫瘍異種腹水モデルにおいて、内在性の高レベルのＭＵＣ１６を発現するヒト起源の高悪性度漿液性癌腫ＯＶＣＡＲ－３卵巣癌細胞を、ヒトＰＢＭＣを事前に生着させたＮＳＧマウスに腹腔内移植する（Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ａ，Ｈａｂｅｒ Ｌ，Ｋｅｌｌｙ ＭＰ，Ｖａｚｚａｎａ Ｋ，Ｃａｎｏｖａ Ｌ，Ｒａｍ Ｐ，Ｐａｗａｓｈｅ Ａ，Ｆｉｎｎｅｙ Ｊ，Ｊａｌａｌ Ｓ，Ｃｈｉｕ Ｄ，Ｃｏｌｌｅｔｏｎ ＣＡ，Ｇａｒｎｏｖａ Ｅ，Ｍａｋｏｎｎｅｎ Ｓ，Ｈｉｃｋｅｙ Ｃ，Ｋｒｕｅｇｅｒ Ｐ，Ｄｅｌｆｉｎｏ Ｆ，Ｐｏｔｏｃｋｙ Ｔ，Ｋｕｈｎｅｒｔ Ｊ，Ｇｏｄｉｎ Ｓ，Ｒｅｔｔｅｒ ＭＷ，Ｄｕｒａｍａｄ Ｐ，ＭａｃＤｏｎａｌｄ Ｄ，Ｏｌｓｏｎ ＷＣ，Ｆａｉｒｈｕｒｓｔ Ｊ，Ｈｕａｎｇ Ｔ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ，Ｌｉｎ ＪＣ，Ｓｍｉｔｈ Ｅ，Ｔｈｕｒｓｔｏｎ Ｇ，Ｋｉｒｓｈｎｅｒ ＪＲ．Ａ Ｍｕｃｉｎ １６ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ－ｅｎｇａｇｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９ Ｊｕｎ ２０１９：Ｖｏｌ１１，Ｉｓｓｕｅ４９７，ｅａａｕ７５３４）。ＯＶＣＡＲ－３細胞を、ルシフェラーゼレポーターを用いて操作し、インビボ生物発光（ＢＬＩ）を使用して腫瘍の成長を経時的に追跡した。
実験手順
実験は、（Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ａ，Ｈａｂｅｒ Ｌ，Ｋｅｌｌｙ ＭＰ，Ｖａｚｚａｎａ Ｋ，Ｃａｎｏｖａ Ｌ，Ｒａｍ Ｐ，Ｐａｗａｓｈｅ Ａ，Ｆｉｎｎｅｙ Ｊ，Ｊａｌａｌ Ｓ，Ｃｈｉｕ Ｄ，Ｃｏｌｌｅｔｏｎ ＣＡ，Ｇａｒｎｏｖａ Ｅ，Ｍａｋｏｎｎｅｎ Ｓ，Ｈｉｃｋｅｙ Ｃ，Ｋｒｕｅｇｅｒ Ｐ，Ｄｅｌｆｉｎｏ Ｆ，Ｐｏｔｏｃｋｙ Ｔ，Ｋｕｈｎｅｒｔ Ｊ，Ｇｏｄｉｎ Ｓ，Ｒｅｔｔｅｒ ＭＷ，Ｄｕｒａｍａｄ Ｐ，ＭａｃＤｏｎａｌｄ Ｄ，Ｏｌｓｏｎ ＷＣ，Ｆａｉｒｈｕｒｓｔ Ｊ，Ｈｕａｎｇ Ｔ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ，Ｌｉｎ ＪＣ，Ｓｍｉｔｈ Ｅ，Ｔｈｕｒｓｔｏｎ Ｇ，Ｋｉｒｓｈｎｅｒ ＪＲ．Ａ Ｍｕｃｉｎ １６ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ－ｅｎｇａｇｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９ Ｊｕｎ ２０１９：Ｖｏｌ１１，Ｉｓｓｕｅ４９７，ｅａａｕ７５３４）に記載されているとおりに行った。端的に言えば、マウスに、ＰＢＳ中に懸濁したルシフェラーゼ基質のＤ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）１５０ｍｇ／ｋｇをＩＰ注射した。１０分後、マウスのＢＬＩイメージングを、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてイソフルラン麻酔下で行った。Ｄでの視野、１．５ｃｍの被写体の高さ、および０．５分間の露光時間の中程度のビニングレベルで、画像取得を行った。ＢＬＩシグナルはＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ；Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を用いて抽出した。目的の領域を各腫瘍量の周囲に描き、光子強度をｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ（ステラジアンあたり平方センチメートルあたり秒あたりの光子）として記録した。ＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ細胞を与えなかったマウスは、ＢＬＩ活性のベースライン読取り値として機能した。腫瘍のないこれらのベースラインマウス（Ｎ＝３）を各日撮像し、検出下限（ＬＯＤ）を、撮像した全ての無腫瘍マウスにわたる平均ＢＬＩ読取り値として計算した。
８～１０週齢のＮＳＧ（ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ鎖ノックアウト）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＭＤ）に５×１０６のヒトＰＢＭＣ（ＲｅａｃｈＢｉｏ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を注射した。１０～１４日後、マウスの尾静脈から採血して、ヒトＴ細胞の生着を測定した。ＰＢＭＣ移行の２週間以内に、予めインビボで継代培養したＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ細胞株からの２×１０６腹水細胞を、２週以内（０日目）に腹腔内（ＩＰ）投与した。マウスをフローサイトメトリーによってＴ細胞の生着についてチェックした後、類似の腫瘍組織量を確保するためにＢＬＩを使用して群に割り当てた。腫瘍移植の４日後、マウスを、２つの研究のために、１．４９×１０５または３．０３×１０５Ｐ／Ｓ／ｃｍ２／ｓｒの中央値ＢＬＩで、各５匹の群に分けた。５日目および８日目に、示す二重特異性抗体または対照抗体でマウスを治療した。マウスに、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３またはＣＤ３結合対照を、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８（ｂｓ２４９６３Ｄ）を伴ってまたは伴わずに、静脈内（ＩＶ）注射により２回投与した。腫瘍の成長を追跡するために、研究全体を通して複数回の撮像を行った。
血液からの血清サイトカインレベルも、示す時点で取得した。示す時点で、顎下腺穿刺によってマイクロテイナー血清チューブ（ＢＤ３６５９６７）に血液を収集した。サイトカインレベルは、Ｖ－ｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ ＰｒｏＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ－１０ Ｐｌｅｘキットを使用して、製造元の指示（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＡ）に従って分析した。
全ての手順は、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）の実験動物の管理と使用に関する指針に従って実施した。プロトコルは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの動物実験委員会によって承認された。群あたり５匹のマウスを用いた合計２つの研究を完了した。
結果、要約、および結論
異種腫瘍研究では、２つのモデルを使用した。第１の異種モデルについては、ＮＳＧマウスに、ヒトＰＢＭＣ生着の１３日後に予めインビボで継代培養した（０日目）ＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ細胞を腹腔内（ＩＰ）注射した。５日目および８日目にマウスをＩＶ治療した。マウスに、１２．５μｇの抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３または１２．５μｇのＣＤ３結合対照（ｈＩｇＧ４Ｐ－ＰＶＡアイソタイプ）のいずれかを与えた。一部のマウスには、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８（ｂｓ２４９６３Ｄ）も１００μｇで投与した。腫瘍組織量を、腫瘍移植後４、８、１２、１５、２０、および２５日目にＢＬＩによって評価した。例示的なｂｓ２４９６３Ｄを抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３なしで投与すると、ＢＬＩで明らかな腫瘍の減少は観察されなかった。対照的に、１２．５μｇの抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３を用いた処理により、ＢＬＩで明らかな腫瘍が有意に減少した一方、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８により、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３単独よりも有意に有効性が強化された（表２０～２２）。
表２０は、第１のＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ異種モデルにおける腫瘍移植後４日目の生物発光レベルを要約する。
Figure 2022515611000023
表２１は、第１のＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ異種モデルにおける腫瘍移植後２５日目の生物発光レベルを要約する。
Figure 2022515611000024
表２２は、第１のＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ異種モデルにおける腫瘍移植後４日目から２５日目の間のＢＬＩの倍率変化を要約する。
Figure 2022515611000025
第２の異種モデルについては、ＮＳＧマウスに、ヒトＰＢＭＣを移植した１０日後に予めインビボで継代培養した（０日目）ＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ細胞を注射した。マウスを、５日目および８日目に、０．５ｍｇ／ｋｇの抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３でＩＶ処理するか、または０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ３結合対照を投与した。４、８、１１、１４、２１、２８、および３４日目に、ＢＬＩによって腫瘍組織量を評価した。一部のマウスには、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８（ｂｓ２４９６３Ｄ）も、０．２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇで投与した。例示的なｂｓ２４９６３Ｄは、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３なしで投与した場合、腫瘍組織量を減少させなかった。対照的に、０．５ｍｇ／ｋｇの抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３を用いた処理により、ＢＬＩで明らかな腫瘍が有意に減少した一方、例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８により、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３単独よりも有効性が強化された（表２３～２５および図４Ａ）。
表２３は、第２のＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ異種モデルにおける腫瘍移植後４日目の生物発光レベルを要約する。
Figure 2022515611000026
表２４は、第２のＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ異種モデルにおける腫瘍移植後２５日目の生物発光レベルを要約する。
Figure 2022515611000027
表２５は、第２のＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ異種モデルにおける腫瘍移植後４日目から３４日目の間のＢＬＩの倍率変化を要約する。
Figure 2022515611000028
異なる投薬量を使用した第２の異種モデルの他の結果を図３Ａに示す。腫瘍移植後５日目および８日目に２．５μｇのＭＵＣ１６×ＣＤ３で処理したマウスは、ＣＤ３結合対照抗体（ＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３）で処置したマウスと比較して腫瘍組織量を有意に減少させたが、ＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ腫瘍細胞を完全には除去しなかった（図３Ａ）。１００μｇのＭＵＣ１６×ＣＤ２８と組み合わせた２．５μｇのＭＵＣ１６×ＣＤ３により、腫瘍成長がさらに阻害され、腫瘍細胞が経時的により持続して拒絶された（図３Ａ）。同じ実験で、血清サイトカインレベルも得た。図３Ｂは、異なる抗体および／または抗体の組み合わせで処理したマウスのサイトカインレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す。図３Ｃは、２６日目の腫瘍組織量および血清中のＣＡ－１２５レベルとの相関関係を示す。
インビボで腫瘍殺滅を助長するＣＤ２８およびＣＤ３二重特異性抗体の能力を試験するために、十分に確立された異種腹腔内卵巣ＯＶＣＡＲ－３腫瘍モデルを使用した。このモデルでは、腫瘍細胞を、ヒトＰＢＭＣで再構成した免疫不全マウスに導入する。他の卵巣癌細胞株と同様に、ＯＶＣＡＲ－３細胞はＭＵＣ１６を発現する。移植前に、ＯＶＣＡＲ－３細胞をルシフェラーゼレポーターで操作して、生物発光（ＢＬＩ）を使用した経時的な腫瘍成長のインビボ追跡を可能にした。移植したＯＶＣＡＲ－３腫瘍は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体、これらの細胞に結合しなかった対照ＣＤ３二重特異性抗体で処理したマウス、およびＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体のみで処理したマウスにおいて、衰えることなく成長した（図３Ａ）。ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体単独は、有意な抗腫瘍活性を示したが、ＯＶＣＡＲ－３腫瘍を完全に除去することはなく（図３Ａ）、一方で、ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性をＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体に追加すると、ＭＵＣ１６×ＣＤ３単独よりもインビボの抗腫瘍効果が強化された（図３Ａ）。増強された抗腫瘍活性と一致して、両方の二重特異性抗体の組み合わせにより、循環サイトカインの分泌も増加した（図３Ｂ）。
ＭＵＣ１６二重特異性抗体は、タンパク質分解的切断により予後卵巣癌バイオマーカーＣＡ－１２５が放出された後、卵巣癌細胞表面上のＭＵＣ１６の残りの「小塊」（ＣＡ－１２５の切断および放出後の細胞表面の残骸）に結合するが（Ｉ．Ｍｙｌｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｕｒ ｍａｒｋｅｒ ＣＡ－１２５ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ，ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２３，１０７５－１０８０（２００３））、可溶性ＣＡ－１２５には結合しない（図９Ａおよび９Ｂ）。ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体がＣＡ－１２５を卵巣腫瘍組織量のバイオマーカーとして使用する能力を障害したかどうかを決定するために、マウスのＣＡ－１２５レベルを測定した。ＣＡ－１２５レベルは、処理に関係なく腫瘍組織量と相関した。最も低いＣＡ－１２５レベルは、ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体について以前に示されたように、二重特異性抗体の組み合わせで処理したマウスにおいて見られた（図３Ｃ）。
同系腫瘍モデル
実験手順
以前に説明されているように、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）技術を使用してＭＣ３８研究のためにＣＤ３およびヒトＭＵＣ１６の一部を発現するように遺伝子修飾したマウスにおいて、同系研究を実行した（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊｕｎｅ；２１（６）：６５２－９）、（Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ａ，Ｈａｂｅｒ Ｌ，Ｋｅｌｌｙ ＭＰ，Ｖａｚｚａｎａ Ｋ，Ｃａｎｏｖａ Ｌ，Ｒａｍ Ｐ，Ｐａｗａｓｈｅ Ａ，Ｆｉｎｎｅｙ Ｊ，Ｊａｌａｌ Ｓ，Ｃｈｉｕ Ｄ，Ｃｏｌｌｅｔｏｎ ＣＡ，Ｇａｒｎｏｖａ Ｅ，Ｍａｋｏｎｎｅｎ Ｓ，Ｈｉｃｋｅｙ Ｃ，Ｋｒｕｅｇｅｒ Ｐ，Ｄｅｌｆｉｎｏ Ｆ，Ｐｏｔｏｃｋｙ Ｔ，Ｋｕｈｎｅｒｔ Ｊ，Ｇｏｄｉｎ Ｓ，Ｒｅｔｔｅｒ ＭＷ，Ｄｕｒａｍａｄ Ｐ，ＭａｃＤｏｎａｌｄ Ｄ，Ｏｌｓｏｎ ＷＣ，Ｆａｉｒｈｕｒｓｔ Ｊ，Ｈｕａｎｇ Ｔ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ，Ｌｉｎ ＪＣ，Ｓｍｉｔｈ Ｅ，Ｔｈｕｒｓｔｏｎ Ｇ，Ｋｉｒｓｈｎｅｒ ＪＲ．Ａ Ｍｕｃｉｎ １６ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ－ｅｎｇａｇｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９ Ｊｕｎ ２０１９：Ｖｏｌ１１，Ｉｓｓｕｅ４９７，ｅａａｕ７５３４）。ヒトＣＤ３、ヒトＣＤ２８、およびヒトＭＵＣ１６の一部を発現するマウスを、ＩＤ８－ＶＥＧＦ研究に使用した。ＣＤ３のヒト化のために、マウスＣＤ３遺伝子の細胞外部分（γδε）を遺伝子の対応するヒト領域で置き換える標的化ベクターの操作を行った。ＣＤ２８のヒト化には、マウスＣＤ２８遺伝子の細胞外部分を遺伝子の対応するヒト領域で置き換える標的化ベクターの操作を行った。ＭＵＣ１６については、マウスのＳＥＡ反復１３～１７を、ヒトＳＥＡ反復１２～１６で置き換えた。各ヒト化マウスについて、Ｆ１Ｈ４（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９ハイブリッド）胚性幹（ＥＳ）細胞クローンにおける正しい遺伝子標的化は、以前に記載されているように対立遺伝子喪失アッセイによって同定された（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ（２００７），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊａｎｕａｒｙ；２５（１）：９１－９）。標的ＥＳ細胞を、８細胞期のスイスウェブスター胚に注入して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ，ＮＹ）とホモ接合性で繁殖させるための完全にＦ０世代のヘテロ接合マウスを産生した。次に、ＣＤ３のヒト細胞外部分（γδε）、ＣＤ２８のヒト細胞外部分、およびヒトＭＵＣ１６の一部を発現するマウスを、ホモ接合性に繁殖させた（ｈＣＤ３／ｈＭｕｃ１６またはｈＣＤ３／ｈＣＤ２８／ｈＭＵＣ１６ヒト化マウスと称する）。
免疫担当モデルでの有効性を調査するために、ノックインマウスを作成した。このマウスのＴ細胞はヒトＣＤ３を発現し、マウスＭＵＣ１６の代わりに、本発明の例示的な二重特異性抗体が結合するヒトＭＵＣ１６の一部を含むキメラ分子が発現される。したがって、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３分子をこの研究で使用することができる。標的化ＣＤ２８二重特異性分子の添加によりこれらのマウスにおける有効性を強化することができるかどうかを調査するために、代理二重特異性抗体も生成した。代理抗体は、ＣＤ２８共刺激の効果を検査するために、ヒトＭＵＣ１６を認識するが、マウスＣＤ２８は認識しなかったものであり、抗ＭＵＣ１６×ｍＣＤ２８と称されることがある。同系腫瘍モデルでは、ヒトＭＵＣ１６の一部を発現するように操作されたＭＣ３８細胞株を使用した。マウスにＭＣ３８／ｈｕＭＵＣ１６細胞を皮下（ＳＣ）移植し、移植日に０．０１ｍｇ／ｋｇの抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３で週２回２１日目まで処理した。０．０１ｍｇ／ｋｇの抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３を用いた処理により、有意な抗腫瘍効果が生じ、ＭＵＣ１６×ｍＣＤ２８を添加することで、この効果は強化された。（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、および６Ｄを参照）。同系腫瘍の移植および測定
対応するマウス遺伝子座においてヒトＣＤ３およびＭＵＣ１６のヒト－マウスキメラを発現するマウスに１×１０６個のＭＣ３８／ｈｕＭＵＣ１６細胞を皮下（ＳＣ）移植した。マウスに、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３またはアイソタイプ対照を、ヒトＭＵＣ１６およびマウスＣＤ２８を認識する代理二重特異性抗体を伴ってまたは伴わずに、２１日目まで研究をとおして週２回、腹腔内（ＩＰ）投与し。処理は移植日に開始した。腫瘍増殖を、キャリパーを用いて週２回測定した。腫瘍移植後５０日目にマウスを殺処分した。
同系腫瘍の成長および阻害の計算
外部キャリパーで腫瘍体積を決定するために、最大長径（長さ）および最大横径（幅）を決定した。キャリパー測定値に基づいて、腫瘍体積を式：体積＝（長さ×幅２）／２により計算した。ＸおよびＹ直径のキャリパー測定を使用して、腫瘍の成長を経時的に監視した。腫瘍サイズが２０００ｍｍ３を超えたとき、マウスを安楽死させた。統計的有意性は、対応のないノンパラメトリックなマンホイットニーｔ検定を用いて決定した。
結果
異なる処理下でのＭＣ３８／ｈｕＭＵＣ１６モデルの腫瘍サイズを表２６に要約した。
Figure 2022515611000029
本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体が、完全に無傷の免疫系を有するマウスの同系マウスモデルにおいてＭＵＣ１６×ＣＤ３の抗腫瘍効果を強化したかどうかを試験した。マウスを、Ｖｅｌｏｃｉｇｅｎｅ技術を使用してマウス遺伝子の代わりにヒトＣＤ３およびヒトＭＵＣ１６を発現するように遺伝子操作した（Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ａ，Ｈａｂｅｒ Ｌ，Ｋｅｌｌｙ ＭＰ，Ｖａｚｚａｎａ Ｋ，Ｃａｎｏｖａ Ｌ，Ｒａｍ Ｐ，Ｐａｗａｓｈｅ Ａ，Ｆｉｎｎｅｙ Ｊ，Ｊａｌａｌ Ｓ，Ｃｈｉｕ Ｄ，Ｃｏｌｌｅｔｏｎ ＣＡ，Ｇａｒｎｏｖａ Ｅ，Ｍａｋｏｎｎｅｎ Ｓ，Ｈｉｃｋｅｙ Ｃ，Ｋｒｕｅｇｅｒ Ｐ，Ｄｅｌｆｉｎｏ Ｆ，Ｐｏｔｏｃｋｙ Ｔ，Ｋｕｈｎｅｒｔ Ｊ，Ｇｏｄｉｎ Ｓ，Ｒｅｔｔｅｒ ＭＷ，Ｄｕｒａｍａｄ Ｐ，ＭａｃＤｏｎａｌｄ Ｄ，Ｏｌｓｏｎ ＷＣ，Ｆａｉｒｈｕｒｓｔ Ｊ，Ｈｕａｎｇ Ｔ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ，Ｌｉｎ ＪＣ，Ｓｍｉｔｈ Ｅ，Ｔｈｕｒｓｔｏｎ Ｇ，Ｋｉｒｓｈｎｅｒ ＪＲ．Ａ Ｍｕｃｉｎ １６ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ－ｅｎｇａｇｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９ Ｊｕｎ ２０１９：Ｖｏｌ１１，Ｉｓｓｕｅ４９７，ｅａａｕ７５３４）。ＭＣ３８結腸癌細胞株を、ヒトＭＵＣ１６（ｐＬＶＸ．ＥＦ１ａ．ＭＵＣ１６、ＭＣ３８／ｈＭＵＣ１６）を発現するように操作し、皮下移植した。マウスに、移植日（０日目）から開始して週２回の腹腔内注射により、アイソタイプ対照（Ｉｓｏ Ｃｔｌ）、０．０１ｍｇ／ｋｇのＭＵＣ１６×ＣＤ３、０．５ｍｇ／ｋｇのＭＵＣ１６×ｍＣＤ２８、またはそれらの組み合わせを投薬した。腫瘍成長を経時的に監視した（図６Ａ）。ＭＵＣ１６×ＣＤ３またはＭＵＣ１６×ＣＤ２８の単剤療法により、腫瘍成長が顕著に阻害された。腫瘍成長は、ＭＵＣ１６×ＣＤ３とＭＵＣ１６×ＣＤ２８との併用治療によってさらに顕著に阻害された（表２６）。同じ実験で、血清サイトカインレベルも得た。図６Ｂは、異なる抗体および／または抗体の組み合わせで処理したマウスのサイトカインレベルを示す。
適切なヒト化マウスＭＣ３８／ｈＭＵＣ１６に、移植された腫瘍細胞を与え、対照、個々のＣＤ３もしくはＣＤ２８二重特異性抗体、またはそれらの組み合わせで処理した（図６Ａ、６Ｃ、および６Ｄ）。ＭＵＣ１６腫瘍モデルにおいて、ＣＤ３およびＣＤ２８二重特異性抗体の組み合わせにより、サイトカイン産生のアッセイ（図６Ｃおよび６Ｄ）でも指摘されたように、最良の抗腫瘍応答がもたらされた（図６Ａ）。
ＭＵＣ１６×ＣＤ２８リードの標的化の追加により同系モデルにおける有効性が強化され得るかどうかを調査するために、マウスＭＵＣ１６の代わりにヒトＣＤ３、マウスＣＤ２８の代わりにヒトＣＤ２８、および本発明の例示的な二重特異性抗体が結合するヒトＭＵＣ１６の一部を含むキメラ分子を発現するマウスを使用した。ＩＤ８－ＶＥＧＦ細胞株を、ヒトＭＵＣ１６（ＩＤ８－ＶＥＧＦ／ｈＭＵＣ１６）を発現するように操作し、腹腔内移植した。マウスに、腫瘍移植後３、６、および１０日目に、１ｍｇ／ｋｇのＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３またはＭＵＣ１６×ＣＤ３を単独でまたはＭＵＣ１６×ＣＤ２８と組み合わせて投薬した。体重増加を使用して腫瘍成長を監視した（図５）。腫瘍成長はＭＵＣ１６×ＣＤ３によって阻害され、ＭＵＣ１６×ＣＤ２８との併用により、腫瘍成長はさらに遅延した。
注目すべきことに、ＣＤ２８二重特異性抗体が非常に限られた単剤活性を有していた以前のインビトロおよびインビボ分析（上記参照）とは異なり、この同系ＭＣ３８／ＭＵＣ１６モデルのＣＤ２８二重特異性抗体は、単剤としてより顕著な活性を有した。これは、これらのＭＣ３８モデルでは「シグナル１」が既にある程度活性化されていることを示唆した。これと一致して、ＭＣ３８腫瘍細胞は、ｐ１５Ｅなどの再活性化された内在性レトロウイルスタンパク質を高レベルで発現し、Ｃ５７ＢＬ６マウスは、このネオエピトープを認識して応答する内在性Ｔ細胞を生成できることが以前に示されている（Ｊ．Ｃ．Ｙａｎｇ，Ｄ．Ｐｅｒｒｙ－Ｌａｌｌｅｙ，Ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２３，１７７－１８３（２０００）、Ｈ．Ｊ．Ｚｅｈ，３ｒｄ，Ｄ．Ｐｅｒｒｙ－Ｌａｌｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．Ｄｕｄｌｅｙ，Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｃ．Ｙａｎｇ，Ｈｉｇｈ ａｖｉｄｉｔｙ ＣＴＬｓ ｆｏｒ ｔｗｏ ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２，９８９－９９４（１９９９））。実際、本発明のＭＣ３８モデルでは、このｐ１５Ｅネオ抗原に応答する腫瘍内Ｔ細胞を容易に検出できることが確認された（データ割愛）。したがって、このＭＵＣ１６同系腫瘍モデルのＣＤ２８二重特異性抗体は、内在性ＴＣＲ／ＣＤ３依存性Ｔ細胞応答を促進することができ、ＣＤ３二重特異性抗体を介して追加の「シグナル１」活性化を提供することでさらに強化することができる。
ＴＣＲ複合体を介したＴ細胞の活性化（「シグナル１」）は、Ｔ細胞上のＣＤ２８受容体が、標的細胞上のそのリガンド（ＣＤ８０／Ｂ７．１およびＣＤ８６／Ｂ７．２）に係合するときに媒介されるような共刺激シグナル（「シグナル２」）によって著しく強化され得ることが長い間認識されてきた（Ｊ．Ｈ．Ｅｓｅｎｓｔｅｎ，Ｙ．Ａ．Ｈｅｌｏｕ，Ｇ．Ｃｈｏｐｒａ，Ａ．Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．Ａ．Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，ＣＤ２８ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４，９７３－９８８（２０１６））。発明者らのデータと一致して、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を強化するＣＤ２８共刺激の可能性は、Ｂ７リガンドが腫瘍細胞上で過剰発現された研究によって最初に実証され（Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ２８，ＣＴＬＡ－４，ａｎｄ Ｂ７／ＢＢ１ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ ７１，１０６５－１０６８（１９９２）、Ｌ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｔｈｅ Ｂ７ ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ＣＤ２８ ａｎｄ ＣＴＬＡ－４．Ｃｅｌｌ ７１，１０９３－１１０２（１９９２））、そのようなＢ７発現腫瘍のＴ細胞拒絶反応の改善を示した。この可能性が、ヒト治験においてＣＤ２８活性化抗体を評価する取り組みの動機付けとなった。残念なことに、そのような抗体（ＴＧＮ１４１２）の２００６年の試験は、大量サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）に起因する多臓器不全により、６人のヒトボランティア全員に生命を脅かす合併症をもたらした（Ｇ．Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔｏｒｍ ｉｎ ａ ｐｈａｓｅ １ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＣＤ２８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴＧＮ１４１２．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５５，１０１８－１０２８（２００６））。この大惨事は、ヒトにおけるＣＤ２８活性化抗体のさらなる試験の中止につながった。
腫瘍細胞表面上にクラスター化されない限り、ＣＤ２８を直接活性化しないＣＤ２８二重特異性抗体により、従来のＣＤ２８活性化抗体の全身毒性を伴わずに、腫瘍部位でのみ共刺激を助長する可能性がもたらされた。このようなＣＤ２８二重特異性抗体の初期バージョンは、１９９０年代に提案され、評価された（Ｃ．Ｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｅ ｏｆ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４，８３３－８３５（１９９４）、Ｇ．Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｇｌｉｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ２ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｒｅｓｔｉｎｇ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｉｎ ｓｉｔｕ ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９１，２２５－２３０（２００１）、Ｍ．Ｂｒａｎｄｌ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｅ－Ｈｏｖｅｓｔ，Ｅ．Ｈｏｌｌｅｒ，Ｈ．Ｊ．Ｋｏｌｂ，Ｇ．Ｊｕｎｇ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＤ２０ Ｘ ＣＤ２８ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｌｌｏｗ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２７，１２６４－１２７０（１９９９））。しかしながら、当時利用可能であった初期の技術では、提案されたバイオ医薬品を創出するために化学的架橋またはハイブリッド／ハイブリドーマ融合が必要とされ、腫瘍細胞上のクラスター化とは無関係に独自に大規模な活性を有する、最適とは言えない試薬がもたらされた（恐らくこれらの二重特異性抗体の非特異的凝集に起因して、従来のＣＤ２８抗体に似ているもの）。さらに、これらの初期のアプローチでは、いずれの抗腫瘍活性であってもそれをインビボで観察するためには、Ｔ細胞をインビトロで事前に活性化する必要もあった。これらを併せて、ＴＧＮ１４１２ ＣＤ２８活性化抗体による壊滅的な臨床結果、およびこれらの初期のＣＤ２８二重特異性抗体アプローチの限界により、これらのアプローチのさらなる探索が断念された。
共刺激「シグナル２」を提供することによって抗腫瘍活性を顕著かつ安全に助長することができる新規クラスのＣＤ２８共刺激二重特異性抗体が、本明細書に記載される。これらのＣＤ２８二重特異性抗体は、それら自体では（「シグナル１」がない場合）限られた活性しかないが、これらのＣＤ２８二重特異性抗体を新たなクラスのＣＤ３二重特異性抗体と対合することによって提供され得る場合（またはこれらのＣＤ２８二重特異性が、腫瘍特異的Ｔ細胞の内在性集団がすでに存在する状況で使用される場合）、「シグナル１」の状況において抗腫瘍活性を顕著に強化し得る。この新たなＣＤ２８二重特異性抗体アプローチの作成、試験、および成功は、（１）ＣＤ３二重特異性抗体を産生するために最初に開発され、これらのＣＤ３二重特異性抗体について、技術（Ｅ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ，ｎａｔｉｖｅ－ｆｏｒｍａｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｏｂｕｓｔｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５，１７９４３（２０１５））および臨床（Ａ．Ｃｒａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＲＥＧＮ４０１８，ａ ｎｏｖｅｌ ＭＵＣ１６ｘＣＤ３ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ２０１８，（２０１８））両方の面で最近検証され（Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ：ＮＣＴ０２２９０９５１、Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ：ＮＣＴ０３５６４３４０）、その後、特異的「シグナル１」の非存在下で最低限の活性を示すＣＤ２８二重特異性抗体を効率的に産生するように適合された、新規の二重特異性プラットフォームの利用、（２）これらのＣＤ２８二重特異性を単独でおよびＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて評価するための、複数の異種および同系の遺伝的にヒト化された（Ｄ．Ｍ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１，６５２－６５９（２００３）、Ｗ．Ｔ．Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｇｅｎｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５，９１－９９（２００７））動物腫瘍モデルの開発、（３）サイトカイン放出症候群およびその臨床的発達に関するはるかに深い知識（Ａ．Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ－Ｖｏｒｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ６，５６（２０１８）、Ｄ．Ｗ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｌｏｏｄ １２４，１８８－１９５（２０１４）、Ｃ．Ｌ．Ｂｏｎｉｆａｎｔ，Ｈ．Ｊ．Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｋ．Ｊ．Ｃｕｒｒａｎ，Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ＣＡＲ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ ３，１６０１１（２０１６））と併せて、これらのＣＤ２８二重特異性抗体のいずれの可能性のある毒性も従来のＣＤ２８活性化抗体の毒性と比較することができるサルモデルの検証、によって決まった。
卵巣癌のＴＳＡを標的とするＴＳＡ×ＣＤ２８共刺激二重特異性抗体（ＭＵＣ１６×ＣＤ２８）の生成および試験が本明細書に記載される。「シグナル１」の非存在下で、これらのＣＤ２８二重特異性抗体は、インビトロまたはインビボで最小限の活性を有することが示された。しかしながら、これらのＣＤ２８二重特異性は、ＣＤ３二重特異性抗体と対合して、腫瘍抗原ならびにＴＣＲおよびＣＤ２８の複合体を含む人工的な「免疫シナプス」を形成することができる。さらに、インビトロで適切なＣＤ３二重特異性抗体と対合すると、これらのＣＤ２８二重特異性抗体は、Ｔ細胞の活性化および腫瘍細胞の殺滅を、抗原依存的に効率的かつ特異的に助長することができる。さらに、これらのＣＤ２８二重特異性抗体はまた、異種および同系腫瘍モデルにおいて、ＣＤ３二重特異性抗体の抗腫瘍活性を、腫瘍抗原特異的な方法で、インビボで効率的に強化する。そのようなモデルでは、腫瘍特異的Ｔ細胞がすでに存在しない限り、ＣＤ２８二重特異性抗体は、最小限の単剤活性を有し、そのような設定では、腫瘍抗原依存的にこの特異的活性を強化すると思われる。さらに、ＴＳＡ×ＣＤ２８とＴＳＡ×ＣＤ３との併用療法により、腫瘍内活性化／メモリーＴ細胞表現型の拡張がインビボで大幅に促進される。最後に、遺伝的にヒト化された免疫担当マウスおよびカニクイザルにおける毒性学研究は、これらの二重特異性抗体が、従来のＣＤ２８活性化抗体と直接比較して、単剤として限られた活性を呈し、毒性を呈しないことを実証する。
多くの場合、免疫腫瘍学の分野におけるヒト特異的臨床候補の特徴付けは、生着したヒト免疫細胞を用いた異種腫瘍モデルでの試験に限定されている。これらの異種モデル（利用されたＯＶＣＡＲ３モデルなど）は非常に便利であるが、制限がある。そのような異種モデルで使用されるマウスは、それらの正常組織においてヒト腫瘍標的を発現せず、それにより、標的の正常組織発現の状況における試験薬剤の評価を妨げる。実際、標的が通常正常組織でも高レベルで発現される場合、これは試験薬を腫瘍からそらすことによって抗腫瘍効果を制限する可能性があり、かつこれらの正常組織に毒性をもたらす可能性があるため、これらのいずれも異種モデルにおいて評価することができなかった。追加の制限は、免疫不全マウスに移された生着したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の活性を伴う可能性があり、これは免疫担当系に見られる正常な宿主Ｔ細胞の活性とは異なる可能性がある。これらの制限を克服し、ヒト固有の臨床候補を試験するためのより良いモデルを提供するために、ダブルおよびトリプルの遺伝的にヒト化されたマウスを作成した。これらのモデルでは、腫瘍抗原を、適切な宿主組織での正常な発現を可能にするために遺伝的にヒト化し（ＭＵＣ１６について）、ＣＤ３および／またはＣＤ２８成分を、免疫担当宿主細胞がヒト特異的臨床候補に応答できるように、遺伝的にヒト化した。これらの遺伝的にヒト化した免疫担当同系動物モデルにおいて、異種動物モデルのように、ＭＵＣ１６腫瘍標的のＣＤ２８二重特異性抗体より、それらの適切なＣＤ３二重特異性抗体の抗腫瘍活性が強化されることが見出された。複数の前臨床モデルにわたる異なるＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体（例えば、ＭＵＣ１６およびＰＳＭＡ（データ割愛））による抗腫瘍効果の同様の強化は、この治療法がロバストであり、特定の腫瘍モデルに限定されず、免疫療法の新規組み合わせ標的クラスとしてより広い有用性を有し得ることを示唆する。全体として、調査結果は、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が、ＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性と相乗作用し得、十分に研究されたＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の有効性を、合理的に安全で耐容性の高い方法で顕著に強化し、ヒト治験での試験を正当化できる生物製剤ソリューションを提供する可能性があることを強調している。
ＴＳＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、有望な新しいクラスの免疫療法を表すが、多くの場合、抗腫瘍活性のさらなる最適化が確実に必要となる。ＣＡＲ－Ｔアプローチが、「シグナル１」および「シグナル２」の両方を人工的に活性化して抗腫瘍活性を改善するキメラ受容体を採用したように（Ｅ．Ａ．Ｚｈｕｋｏｖｓｋｙ，Ｒ．Ｊ．Ｍｏｒｓｅ，Ｍ．Ｖ．Ｍａｕｓ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ＣＡＲｓ：ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０，２４－３５（２０１６）、Ｓ．Ｌ．Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ ｉｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ Ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７８，４３９－４４８（２０１８））、ＣＤ３特異性抗体（「シグナル１」を提供する）とＣＤ２８二重特異性抗体（「シグナル２」を提供する）とを組み合わせて抗腫瘍活性を強化することの可能性のある利点をここに示す。そのようなアプローチが、ＣＡＲ－Ｔ療法に勝る実際的な利点に加えて、各患者に個別にカスタマイズする必要のある面倒な細胞療法の準備を必要とせず、患者が毒性化学療法を介して先制的に「リンパ球枯渇」する必要なく、それにより、しばしば副作用を伴うこの細胞療法を受け入れることができる（Ａ．Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ－Ｖｏｒｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ６，５６（２０１８）、Ｃ．Ｈ．Ｊｕｎｅ，Ｒ．Ｓ．Ｏ´Ｃｏｎｎｏｒ，Ｏ．Ｕ．Ｋａｗａｌｅｋａｒ，Ｓ．Ｇｈａｓｓｅｍｉ，Ｍ．Ｃ．Ｍｉｌｏｎｅ，ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９，１３６１－１３６５（２０１８））－本発明による二重特異性アプローチは、有効性の向上ならびに作用の安全性および特異性の向上の可能性を提供する。すなわち、１つの抗原のＣＤ３二重特異性抗体を第２の抗原に特異的なＣＤ２８二重特異性抗体と対合することによって、「コンビナトリアル標的化」を利用することが可能であり、有効性の向上は、両方の抗原を発現する腫瘍細胞でのみ発生しであり、したがって両方の抗原を発現する腫瘍細胞のみに対するＴ細胞殺滅に焦点を当てる一方で、抗原のうちの１つのみを発現する正常組織における「オフターゲット毒性」を制限する。まとめると、本明細書に提示されるデータは、ＣＤ２８ベースの二重特異性抗体をＣＤ３ベースの二重特異性抗体と組み合わせると、顕著に強化され相乗的な抗腫瘍活性を有する耐容性の高い「既製の」生物製剤ソリューションを提供し得ることを示す。ヒト治験におけるこの可能性に関する最初の試験は、今年行われる。
実施例９．単独または併用療法でのＴＳＡ×ＣＤ２８は、カニクイザルのＣＤ２８スーパーアゴニストと比較して全身性Ｔ細胞活性化を誘発しない
本発明の例示的なＭＵＣ１６×ＣＤ２８抗体は、カニクイザルからのＴ細胞のＭＵＣ１６×ＣＤ３活性化を増強する（図２Ｆ～２Ｈ）。単独のまたは抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３との組み合わせた本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体の安全性および耐容性を決定するために、カニクイザルにおいて単回投与毒性学研究を行った。表２７に示されるように、雌または雄のカニクイザルを治療群に割り当てた。
カニクイザルの研究は、ＩＡＣＵＣガイドラインに従って実施した。雄のカニクイザル（３匹／群）は、およそ３０分間の静脈内注入を介して各試験品の単回投与を受けた（併用処置は、合計１時間の個別注入として投与した）。毒性の評価は、臨床観察、定性的な食物消費、体重、神経学的検査、バイタルサイン（体温、心拍数、パルスオキシメトリ、および呼吸数）、ならびに臨床的および解剖学的病理学に基づいた。サイトカイン分析、免疫表現型分析、組織病理学、および毒物動態評価のために、血液および組織試料を収集した。ＣＲＰレベルは、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｐ８００システムで分析した。サイトカインは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によって測定した。末梢血フローサイトメトリーでは、血液をカリウムＥＤＴＡチューブに収集し、溶解し、抗ＣＤ３、抗Ｋｉ６７、および抗ＩＣＯＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで分析した。
動物に、およそ３０分間の静脈内注入を介して各試験品の単回投与を与えた（併用処置は、合計１時間の個別注入として投与した）。毒性の評価は、臨床観察、定性的な食物消費、体重、神経学的検査、バイタルサイン（体温、心拍数、パルスオキシメトリ、および呼吸数）、ならびに臨床的および解剖学的病理学に基づいた。サイトカイン分析、ＦＡＣＳ免疫表現型分析、および毒物動態評価のために、血液試料を収集した。本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８を１または１０ｍｇ／ｋｇで、ＭＵＣ１６×ＣＤ３を１または１０ｍｇ／ｋｇで、または併用治療を、単回で投与した後、有意なサイトカイン放出も、Ｔ細胞辺縁趨向も、Ｔ細胞活性化マーカーの上方制御も観察されなかった。表２７は、絶対Ｔ細胞数、Ｔ細胞活性化マーカー（ｋｉ６７）、ＣＲＰ、および個々の動物から示す時点で得られた血液からの血清サイトカインレベルを含む様々な読取り値を要約する。さらに、これらの発見は、ドライコーティングおよびウェットコーティングしたヒトＴ細胞増殖アッセイを使用して検証され、これにより、ドライコーティングまたはウェットコーティング法を使用してアッセイプレートにＭＵＣ１６×ＣＤ２８を固定しても、ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗体とは対照的に、ＣＤ３刺激の非存在下ではＴ細胞の活性化が誘導されないことが実証された（図７）。実際、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体ならびに親二価ＣＤ２８抗体が、ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗体と比較して、ヒトＴ細胞増殖の誘発に失敗したことが見出された。全体として、サルにおける探索的単回投与毒性学研究およびインビトロヒトＴ細胞ベースのアッセイは、本発明の例示的な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ２８二重特異性抗体が安全であり、忍容性が良好であることを示唆している。
Figure 2022515611000030
サイトカインおよびフローサイトメトリー免疫表現型分析のために血液試料を収集した。サルに投与したＣＤ２８－ＳＡは、有意なサイトカイン放出、リンパ球辺縁趨向、およびＴ細胞活性化を誘発したが、ＭＵＣ１６×ＣＤ２８の投与後には、サイトカイン放出も、Ｔ細胞辺縁趨向も、Ｔ細胞活性化も観察されなかったことは注目に値する（図８Ａ～８Ｃおよび表２７）。全体として、これらの予備観察により、ＴＳＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体が霊長類における忍容性が良好であり、ＣＤ２８－ＳＡで見られるようにサイトカイン放出およびＴ細胞活性化を誘発しないことが示唆される（データ割愛）。サルにおけるＣＤ２８－ＳＡを用いた以前の研究では、ヒトに見られる大規模なサイトカイン放出およびＴ細胞活性化を予測できなかったことに留意すべきであり（Ｔｅｇｅｎａｒｏ ＡＧ，ｗｗｗ．ｃｉｒｃａｒｅ．ｏｒｇ／ｆｏｉａ５／ｔｇｎ１４１２ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｂｒｏｃｈｕｒｅ．ｐｄｆ）、これは、サルにおけるより低いＣＤ２８発現に起因していた（Ｄ．Ｅａｓｔｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴＧＮ１４１２ ｔｒｉａｌ ｆａｉｌｕｒｅ ｅｘｐｌａｉｎｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ＣＤ２８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ＣＤ４＋ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌｓ．Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １６１，５１２－５２６（２０１０））。カニクイザルの忍容性研究はヒトのＣＲＳを予測するものではないとしても、サルのＣＤ２８－ＳＡで示された強いシグナルは、Ｔｅｇｅｎａｒｏらが、単にこれらの応答をロバストに観察できる適切な早期の時点を調査しなかったために、これを見落としたことを示唆する。
実施例１０：ｂｓ２４９６３Ｄ（ＲＥＧＮ５６６８とも言及されるＭＵＣ１６×ＣＤ２８ Ａｂ）およびＲＥＧＮ４０１８（ＭＵＣ１６×ＣＤ３）の、ヒトまたはカニクイザルＭＵＣ１６を発現する細胞株、ヒトまたはカニクイザルＰＢＭＣからの初代細胞、およびＴ細胞株への結合
材料および方法－実験手順の要約
フローサイトメトリー分析を利用して、ヒトＭＵＣ１６を内因的に発現するヒト卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１）へのｂｓ２４９６３Ｄの結合と、ヒトまたはカニクイザルＭＵＣ１６を発現するように操作されたマウスＩＤ８細胞への、ヒトおよびカニクイザルＴ細胞への、ならびに操作されたレポーターＴ細胞株へのｂｓ２４９６３ＤおよびＲＥＧＮ４０１８の結合とを決定した。
端的に言えば、１×１０５細胞／ウェルを、ｂｓ２４９６３Ｄ、ＲＥＧＮ４０１８、および対照抗体（ＩｇＧ４Ｐ－ＰＶＡ非結合対照ｍＡｂ、ＣＤ２８非架橋対照二重特異性抗体、または親ＣＤ２８もしくはＣＤ３対照）を含む抗体の段階希釈物とともに４℃で３０分間インキュベートした。
抗体の希釈は、ヒトおよびカニクイザルの初代Ｔ細胞ならびに操作されたレポーターＴ細胞には１２．２ｐＭ～２００ｎＭの範囲であり、一方でＭＵＣ１６＋標的細胞には８．１ｐＭ～１３３ｎＭを選択した。
インキュベーション後、細胞を１％濾過ＦＢＳ含有する冷ＰＢＳで２回洗浄し、続いてフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ヒトＩｇＧ（ＭＵＣ１６＋細胞）またはＡｌｅｘａ６４７標識抗ヒトＩｇＧ（ＣＤ２８＋細胞）を用いて検出した。
近赤外線（ＩＲ）反応性ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ色素を、ヒトおよびカニクイザルＴ細胞に添加した。抗体または２次抗体を含有しないウェルのみを対照として使用した。
ＭＵＣ１６＋細胞またはＪ．ＲＴ３．Ｔ３．５／ＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ／１Ｇ４ＡＢ／ｈＣＤ８αβ／ｈＣＤ２８細胞株を用いたインキュベーション後、細胞を洗浄し、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（１％濾過ＦＢＳおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含有する冷ＰＢＳ）に再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩでフローサイトメトリーによって分析した。
ヒトまたはカニクイザルＴ細胞とのインキュベーション後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中の抗ＣＤ２、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ４、および抗ＣＤ８抗体のカクテルを用いて、２０分間４℃で染色した。洗浄後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、Ｌｉｖｅ／ＣＤ２＋／ＣＤ４＋／ＣＤ１６－またはＬｉｖｅ／ＣＤ２＋／ＣＤ８＋／ＣＤ１６－にゲートし、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０上でフローサイトメトリーにより分析した。
ＥＣ５０決定のため、測定したＭＦＩを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用する９点応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式を使用して分析した。最大ＭＦＩの倍率増加を、検出された最高のＭＦＩと二次抗体のみを含むウェルのＭＦＩとの比率をとることによって決定した。
フローサイトメトリーを使用して、ｂｓ２４９６３Ｄおよび市販の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の、ＭＵＣ１６＋ヒト膵臓癌細胞、ＳＷ１９９０およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１細胞への結合を決定した。端的に言えば、２×１０５個の細胞を、５μＬ（６６．７ｎＭ）のｂｓ２４９６３Ｄ、抗ＰＤ－Ｌ１（２．５μＬ）、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（ｂｓ２４９６３Ｄ）もしくはＡＰＣ（抗ＰＤ－Ｌ１）と複合体化した非結合対照抗体とともにインキュベートし、 ３０分間氷上でインキュベートした。細胞を、染色緩衝液で１回洗浄し、遠心分離し、Ｄ－ＰＢＳで洗浄した。細胞を、１００μＬの１：１０００希釈のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ生死判定色素で染色し、室温で１５分間インキュベートした。細胞を、染色緩衝液中で３回洗浄し、１００μＬの１：１の染色緩衝液およびｃｙｔｏｆｉｘ溶液中に再懸濁し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘサイトメーターを使用するフローサイトメトリーにより分析した。生存に対する倍率結合を、目的の抗体のＭＦＩを生存のみのＭＦＩで割ることによって計算した。
材料および方法
ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーターバイオアッセイ
図１０に示すように、ＴＣＲを介したシグナル伝達を強化するｂｓ２４９６３Ｄの能力を、操作されたＴ細胞／抗原提示細胞ベースのレポーターアッセイにおいて評価した。ＴＣＲは特定のＭＨＣ／ペプチド複合体を認識し、活性化タンパク質１（ＡＰ－１）、活性化されたＴ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）、または活性化されたＢ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦ－κＢ）などの多数の転写因子を介してＴ細胞を活性化する（Ｇｏｌｄｒａｔｈ，１９９９；Ｎａｔｕｒｅ ４０２：２５５－６２）（Ｓｈａｐｉｒｏ，１９９８；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１６１（１２）：６４５５－８）。Ｔ細胞応答は、ＣＤ２８などの共刺激受容体の関与を介してさらに精緻化され、これが今後は内在性リガンドであるＣＤ８０またはＣＤ８６によって活性化され、続いて、ＴＣＲ活性化後にＮＦ－κＢ転写因子によって制御される経路などの細胞シグナルを増強する。
このアッセイでは、操作されたＴ細胞は、ヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ－Ａ２および操作された抗原提示３Ｔ３細胞上に示されるｈβ２Ｍと複合体を形成したＮＹ－ＥＳＯ－１ １５７－１６５ペプチド（ＮＹＥＳＯ１ｐ）を認識する、１Ｇ４ ＴＣＲ（ＩＧ４ＡＢ）を介して直接活性化される（Ｒｏｂｂｉｎｓ，２００８；Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１８０（９）：６１１６－３１）。ＴＣＲ活性化により、ルシフェラーゼが産生され、これは、操作されたレポーターＴ細胞のＮＦ－κＢ転写因子によって促進される。ＣＤ８は、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）をＴＣＲ／ＣＤ３複合体に動員することにより、ＴＣＲ／ＭＨＣ相互作用を容易にし、Ｔ細胞活性化を助長することで、細胞内免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化をとおしてＴＣＲシグナル伝達を強化する（Ｃｏｌｅ，２０１２；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１３７（２）：１３９－４８）（Ｇｕｉｒａｄｏ，２００２；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２９１（３）：５７４－８１）。
非架橋対照であるｂｓ２４９６３Ｄ（非ＴＡＡ×ＣＤ２８二重特異性抗体）または非結合対照の２倍段階希釈物（３９ｐＭ～１０ｎＭ）を、ＭＵＣ１６－（３Ｔ３／ｈβ２Ｍ／ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹＥＳＯ１ｐ）またはＭＵＣ１６＋（３Ｔ３／ｈβ２Ｍ／ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹＥＳＯ１ｐ／ｈＭＵＣ１６）のいずれかであった１．５×１０４個の抗原提示細胞の存在下で、ウェルあたり５×１０４個の操作されたレポーターＴ細胞（Ｊ．ＲＴ３．Ｔ３．５／ＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ／１Ｇ４ＡＢ／ｈＣＤ８αβ／ｈＣＤ２８）に繰り返して添加した。抗体希釈およびバイオアッセイは、完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ、ならびにペニシリン、ストレプトマイシン、およびＬ－グルタミンのカクテル）中で行った。いずれの抗体も含まないウェルを、追加の対照として含め、活性およびＥＣ５０値の倍率増加を計算するために使用した。プレートを３７℃および５％ＣＯ２で５時間インキュベートした後、ＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（１００μＬ）を各ウェルに添加した。ルシフェラーゼ活性を、ＥＮＶＩＳＩＯＮプレートリーダーを使用して発光シグナルとして記録し、相対光単位（ＲＬＵ）として表した。検出されたＲＬＵを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して１０点応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式によって分析した。
最大活性化シグナルを、試験した抗体濃度範囲内で検出された平均最大ＲＬＵ応答として決定した。活性の倍率増加を、抗体の非存在下で記録された平均ＲＬＵ値に対する、試験した抗体濃度範囲内で記録された最高の平均ＲＬＵ値の比率として計算した。
Ｔ細胞増殖およびＩＬ－２放出についてのＴ細胞活性化アッセイ
一定濃度のＲＥＧＮ４０１８（ヒト卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１で評価）の存在下または一定濃度のセミプリマブ（ヒト膵臓癌細胞株［ＳＷ１９９０およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１］で評価）の存在下でＩＬ－２放出およびＴ細胞増殖を媒介するｂｓ２４９６３Ｄの資質を、それぞれ３人または２人のドナーからの富化したヒト初代Ｔ細胞を用いたＴ細胞活性化アッセイを使用して決定した。
ヒト初代Ｔ細胞の分離
ヒトＰＢＭＣを、４人の健康なドナーの白血球パックから単離した。ドナー５５５０１４および５５５１０９については、ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離を使用して末梢血から単離した。端的に言えば、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓを５０ｍＬコニカルチューブに加え、続いて２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで１：１に希釈した３０ｍＬの血液を上に重ねた。ブレーキをオフにして４００×ｇで３０分間遠心分離した後、単核細胞層を新しいチューブに移し、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで５倍に希釈し、３００×ｇで８分間遠心分離した。ドナー５５５１３１および５５５１２９については、ＰＢＭＣを、Ｓｔｅｍ ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＥａｓｙＳｅｐ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用し、製造業者のプロトコルに従って、健康なドナーの末梢血から単離した。単離したＰＢＭＣを１０％ＤＭＳＯを含有するＦＢＳ中で凍結させた。ＣＤ３＋Ｔ細胞を単離するため、凍結させたＰＢＭＣのバイアルを、３７℃の水槽中で解凍し、５０Ｕ／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｓｅを含有する刺激培地（１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、および０．０１ｍＭのβ－メルカプトエタノール［ＢＭＥ］で補充したＸ－ＶＩＶＯ １５細胞培養培地）中で希釈した。細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＥａｓｙＳｅｐ緩衝液に再懸濁し、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＥａｓｙＳｅｐ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔを製造業者のプロトコルに従って使用して単離した。
ヒトＯＶＣＡＲ－３、ＰＥＯ１、ＳＷ１９９０、ＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１細胞、およびヒト初代Ｔ細胞を用いたＴ細胞活性化アッセイ
刺激培地（１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、および０．０１ｍＭのＢＭＥで補充したＸ－ＶＩＶＯ ５細胞培養培地）に再懸濁したＣＤ３＋Ｔ細胞を、１×１０５細胞／ウェルの濃度で９６ウェル丸底プレートにプレーティングした。ＯＶＣＡＲ－３、ＰＥＯ１、ＳＷ１９９０、またはＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、２５μｇ／ｍＬ（ＯＶＣＡＲ－３）、１０μｇ／ｍＬ（ＰＥＯ１）、または３０μｇ／ｍＬ（ＳＷ１９９０およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１）のマイトマイシンＣで処理して、増殖を阻止した。３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした後、マイトマイシンＣで処理した細胞を２％ＦＢＳを含有するＤ－ＰＢＳで３回洗浄し、続いて刺激培地での最後の再懸濁を行った。ＯＶＣＡＲ－３、ＰＥＯ１、ＳＷ１９９０、およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、ＯＶＣＡＲ－３、ＰＥＯ１、および両ＳＷ１９９０細胞について、それぞれ、１×１０４、２．５×１０４細胞、または５×１０４細胞の最終濃度で、ＣＤ３＋Ｔ細胞を含むウェルに添加した。一定濃度のＲＥＧＮ４０１８またはＣＤ３非架橋対照二重特異性抗体（５ｎＭ）、またはセミプリマブもしくは非結合ＩｇＧ４Ｐ対照（２０ｎＭ）を、ＯＶＣＡＲ－３、ＰＥＯ１、ＳＷ１９９０、またはＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を含むウェルに添加した。続いて、ｂｓ２４９６３Ｄ、非ＴＡＡ×ＣＤ２８対照、または非結合対照の抗体を、１：４希釈系列で７．６ｐＭから５００ｎＭまで滴定し、ウェルに添加した。１０点濃度曲線の最終点には抗体が含まれず、これを活性の倍率増加を計算するために使用した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で７２（ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１）または９６（ＳＷ１９９０およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１）時間インキュベートした後、５０μＬの培地上清を収集して、増殖を定量化するため［メチル－３Ｈ］－チミジンでの処置の前にＩＬ－２放出を測定した。
ＩＬ－２放出について、５μＬ（ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１細胞を使用するアッセイの場合）または２０μＬ（ＳＷ１９９０およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を使用するアッセイの場合）の上清を、製造業者のプロトコルに従ってヒトＩＬ－２ ＡｌｐｈａＬＩＳＡキットを使用して試験した。ＩＬ－２測定値を、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのマルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎで取得し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）として報告した。
増殖アッセイについて、刺激培地中で２ｍＣｉ／ｍＬに希釈した５０μＬの［メチル－３Ｈ］－チミジンをウェルに添加し、プレートを、６時間（ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１細胞を使用するアッセイの場合）または１６時間（ＳＷ１９９０およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を使用するアッセイの場合）のいずれかの間インキュベートした。［メチル－３Ｈ］－チミジンは、より高量で***細胞に組み込まれることになる。インキュベーション後、細胞をフィルタープレートに採取し、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ＆Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ計器での測定のために準備した。
全ての段階希釈を、ＩＬ－２の放出および増殖について三重で試験した。抗体のＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して、１０点用量応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式から決定した。ＩＬ－２放出および増殖の最大レベルを、試験した用量範囲内で検出された平均最大応答として付与する。ｂｓ２４９６３Ｄによって媒介される最大ＩＬ－２放出またはＴ細胞増殖の倍率増加は、いずれの抗体によっても媒介されない最大ＩＬ－２放出または増殖に対して計算した。
Ｔ細胞を活性化するｂｓ２４９６３Ｄの能力を、刺激性抗原提示細胞がシグナル１を提供するアッセイにおいて評価した。このアッセイでは、ヒトＣＤ８、ヒトＣＤ２８、ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成したＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド（ＮＹＥＳＯ１ｐ）を認識する文献に記載されているＴＣＲ（１Ｇ４）、およびＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するように操作されたＪ．ＲＴ３．Ｔ３．５レポーターＴ細胞を使用した。シグナル１を提供する刺激性抗原提示細胞は、ＨＬＡ－Ａ２、ｈβ２Ｍ、およびＮＹＥＳＯ１ｐを、ヒトＭＵＣ１６（ｈＭＵＣ１６）の有無にかかわらず発現するように操作された３Ｔ３細胞であった。ＣＤ２８非架橋対照二重特異性抗体（非ＴＡＡ×ＣＤ２８）および非結合対照ｍＡｂ（ＩｇＧ４Ｐ－ＰＶＡ）をｂｓ２４９６３Ｄと並行して試験した。ＮＦ－κＢシグナル伝達を、ルシフェラーゼレポーター活性を検出するために発光試薬を使用して測定した。結果を表２８に要約する。
抗原この試験システムでは、ｂｓ２４９６３Ｄにより、ＭＵＣ１６＋抗原提示細胞の存在下でのレポーターＴ細胞におけるＮＦ－κＢシグナル伝達の濃度依存的な増加が媒介され、ＭＵＣ１６発現を欠く細胞を使用した場合、活性は見られなかった（図１１Ａおよび１１Ｂ）。ＣＤ２８非架橋対照二重特異性抗体では、ＮＦ－κＢシグナル伝達の増加は観察されなかった。
Figure 2022515611000031
実施例１１．ＲＥＧＮ４０１８（抗ＭＵＣ１６×抗ＣＤ３）またはセミプリマブ（ＰＤ－１アンタゴニスト抗体）の存在下または非存在下でのｂｓ２４９６３Ｄ（抗ＭＵＣ１６×抗ＣＤ２８）を介したＩＬ－２放出およびヒト初代Ｔ細胞の増殖の評価
ＩＬ－２放出およびＴ細胞増殖によって決定した、ヒト初代Ｔ細胞を活性化するｂｓ２４９６３Ｄの能力を、２つの異なるＭＵＣ１６＋ヒト卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１）の存在下で評価した。これらの細胞は同種応答からの十分なシグナル１を提供しないため、シグナル１を提供するために固定濃度のＲＥＧＮ４０１８（ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体）を含めた。ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１細胞の結果を、ＩＬ－２の放出については表２９に、増殖については表３０に要約する。
ＩＬ－２放出およびＴ細胞増殖によって決定した、ヒト初代Ｔ細胞を活性化するｂｓ２４９６３Ｄの能力を、ＭＵＣ１６＋ヒト膵臓癌細胞株（ＳＷ１９９０）およびヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するように操作したＳＷ１９９０（ＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１）の存在下で評価した。両方の細胞株が、シグナル１として機能するのに十分な同種応答を提供する。加えて、固定濃度のセミプリマブ（２０ｎＭ）がｂｓ２４９６３Ｄの効果を増補する能力も評価した。ＳＷ１９９０およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１細胞の結果を、ＩＬ－２放出については表３１に、増殖については表３２に要約する。
ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１標的細胞によるＲＥＧＮ４０１８の存在下または非存在下でのヒト初代Ｔ細胞からのＩＬ－２放出およびそれらの増殖を強化するｂｓ２４９６３Ｄ（ＲＥＧＮ５６６８）の能力
ＯＶＣＡＲ－３およびＰＥＯ１癌細胞とともにインキュベートした場合、ｂｓ２４９６３Ｄは、ＲＥＧＮ４０１８の存在下でのみ、ヒトＴ細胞からのＩＬ－２放出（図１２）およびそれらの増殖（図１３）の濃度依存的な強化を媒介した。ＣＤ３およびＣＤ２８非架橋対照二重特異性抗体は、ＲＥＧＮ４０１８の存在下でも非存在下でも、ＩＬ－２放出を増強しなかった。
このアッセイ中、５ｎＭのＲＥＧＮ４０１８単独では、非結合対照と比べて、ＩＬ－２放出は増加しなかったが、Ｔ細胞増殖の中程度の強化が示された。
Figure 2022515611000032
Figure 2022515611000033
ＳＷ１９９０およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１標的細胞によるセミプリマブの存在下または非存在下でのヒト初代Ｔ細胞からのＩＬ－２放出およびそれらの増殖を強化するｂｓ２４９６３Ｄ（ＲＥＧＮ５６６８）の能力
ＳＷ１９９０およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１ ＭＵＣ１６＋ヒト膵臓癌細胞とともにインキュベートした場合、ｂｓ２４９６３Ｄは、セミプリマブの存在下および非存在下で、ヒトＴ細胞からのＩＬ－２放出（図１４）およびそれらの増殖（図１５）の濃度依存的な増強を媒介した。ＳＷ１９９０細胞におけるヒトＰＤ－Ｌ１の過剰発現は、ｂｓ２４９６３Ｄの存在下でＩＬ－２およびＴ細胞の増殖を抑制し、これらはセミプリマブの添加によって多少増加した。高濃度では、ＣＤ２８非架橋対照二重特異性抗体は、ＳＷ１９９０およびＳＷ１９９０／ｈＰＤ－Ｌ１細胞の存在下でいくらかのＩＬ－２放出を媒介した。ｂｓ２４９６３Ｄの非存在下では、セミプリマブはＣＤ２８非架橋対照二重特異性抗体と比べてＩＬ－２放出もＴ細胞増殖も増加させなかった。
Figure 2022515611000034
Figure 2022515611000035
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な修正は、前述の記載および添付の図から当業者には明らかであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims (54)

  1. 単離された二重特異性抗原結合分子であって、
    ａ）３７℃で表面プラズモン共鳴により測定して、約２×１０－７Ｍ未満のＫＤでヒトＣＤ２８に結合する第１の抗原結合ドメイン（Ｄ１）と、
    ｂ）３７℃で表面プラズモン共鳴により測定して、約１０－９Ｍ未満のＫＤで、標的腫瘍細胞上のヒトムチン１６膜抗原（ＭＵＣ１６）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン（Ｄ２）と、を含む、単離された二重特異性抗原結合分子。
  2. 前記二重特異性抗原結合分子が、インビトロＦＡＣＳ結合アッセイにより測定して、約１０－５Ｍ未満のＥＣ５０でヒトＴ細胞の表面に結合する、請求項１に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  3. 前記二重特異性抗原結合分子が、インビトロＦＡＣＳ結合アッセイにより測定して、約６×１０－６Ｍ未満のＥＣ５０でカニクイザルＴ細胞の表面に結合する、請求項１に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  4. 前記二重特異性抗原結合分子が、インビトロＦＡＣＳ結合アッセイにより測定して、約１０－９Ｍ未満のＥＣ５０でＭＵＣ１６を発現する細胞株の表面に結合する、請求項１に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  5. 前記二重特異性抗原結合分子が、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用され、ＭＵＣ１６を発現する標的細胞で試験された場合、共刺激効果を示す、請求項１に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  6. 前記共刺激効果が、以下：（ａ）ＭＵＣ１６を発現する標的細胞を殺滅するようにヒトＴ細胞を活性化および誘導する能力、（ｂ）Ｔ細胞上のＰＤ－１を上方調節する能力、（ｃ）ＰＢＭＣからのサイトカインＩＦＮγの放出を増加させる能力、（ｄ）腫瘍細胞を枯渇させる能力、（ｆ）腫瘍クリアランスを強化する能力、ならびに／または全身性Ｔ細胞活性化の誘発の欠如のうちの１つ以上によって示される、請求項５に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  7. 前記共刺激効果が、（ｇ）一次ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＡＰＣ機能アッセイを使用したＩＬ－２サイトカイン産生の測定によってさらに示される、請求項６に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  8. 前記標的腫瘍細胞が、卵巣癌細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  9. 前記第１の抗原結合ドメイン（Ｄ１）が、
    ａ）配列番号１８および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、
    ｂ）配列番号１０および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含まれる３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  10. ａ）配列番号２０および４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、配列番号２２および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、配列番号２４および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含む、請求項９に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  11. ａ）配列番号１２および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、配列番号１４および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、配列番号１６および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む、請求項１０に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  12. 前記第１の抗原結合ドメインが、
    ａ）ＨＣＶＲ ＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）であって、配列番号２０、２２、２４、および４４、４６、４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むセットと、ＬＣＶＲ ＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）であって、配列番号１２、１４、１６、および３６、３８、４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むセットと、を含む、請求項９に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  13. 前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１８／１０および４２／３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む、請求項９に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  14. 前記第２の抗原結合ドメインが、
    ａ）配列番号２および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ内に含まれる３つのＨＣＤＲと、
    ｂ）配列番号１０および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ内に含まれる３つのＬＣＤＲと、を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  15. 前記第２の抗原結合ドメインが、
    ａ）配列番号４および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、
    ｂ）配列番号６および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
    ｃ）配列番号８および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含む、請求項１４に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  16. 前記第２の抗原結合ドメインが、
    ａ）配列番号１２および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、配列番号１４および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、配列番号１６および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む、請求項１５に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  17. 前記第２の抗原結合ドメインが、
    ａ）ＨＣＶＲ ＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）であって、配列番号４、６、８、および２８、３０、３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むセットと、ＬＣＶＲ ＣＤＲのセット（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）であって、配列番号１２、１４、１６、および３６、３８、４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むセットと、を含む、請求項１６に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  18. ａ）配列番号２０、２２、２４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ ＣＤＲ、および配列番号１２、１４、１６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ ＣＤＲを含む第１の抗原結合ドメインと、
    ｂ）配列番号４、６、８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ ＣＤＲ、および配列番号１２、１４、１６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ ＣＤＲを含む第２の抗原結合ドメインと、を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  19. ａ）配列番号４４、４６、４８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ、および配列番号３６、３８、４０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲを含む第１の抗原結合ドメインと、
    ｂ）配列番号２８、３０、３２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ、および配列番号３６、３８、４０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲを含む第２の抗原結合ドメインと、を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  20. ａ）配列番号１８／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む第１の抗原結合ドメインと、
    ｂ）配列番号２／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む第２の抗原結合ドメインと、を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  21. ａ）前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号４２／３４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含み、
    ｂ）前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号２６／３４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  22. ＭＵＣ１６への結合について競合する、または参照抗体と同じＭＵＣ１６上のエピトープに結合する、単離された二重特異性抗原結合分子であって、前記参照抗体が、配列番号１８／１０または４２／３４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する第１の抗原結合ドメイン、および配列番号２／１０または２６／３４のいずれかのアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する第２の抗原結合ドメインを含む、単離された二重特異性抗原結合分子。
  23. ヒトＣＤ２８への結合について競合する、または参照抗体と同じヒトＣＤ２８上のエピトープに結合する、単離された二重特異性抗原結合分子であって、前記参照抗体が、配列番号１８／１０または４２／３４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する第１の抗原結合ドメイン、および配列番号２／１０または２６／３４のいずれかのアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する第２の抗原結合ドメインを含む、単離された二重特異性抗原結合分子。
  24. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
  25. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
  26. 請求項２５に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  27. 請求項２６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  28. 対象における卵巣細胞腫瘍の成長を阻害する方法であって、請求項１～２３のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体または請求項２６に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  29. 第２の治療薬を投与することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記第２の治療薬が、抗腫瘍剤、放射線療法、抗体薬物複合体、抗腫瘍剤に複合化された二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 卵巣癌または別のＭＵＣ１６発現細胞悪性腫瘍に罹患している患者を治療する方法であって、請求項１～２３のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体または請求項２４に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  32. 第２の治療薬を投与することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記第２の治療薬が、抗腫瘍剤、放射線療法、抗体薬物複合体、抗腫瘍剤と複合化された二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記第２の治療薬が、同じ腫瘍標的抗原に結合する第１の抗原結合ドメインおよびＴ細胞上のＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、異なる二重特異性抗体である、請求項２９または３２のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記抗原結合分子が、ヒト卵巣細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害を誘発する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗原結合分子。
  36. ヒトＣＤ２８に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＭＵＣ１６に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子。
  37. 前記抗原結合分子が、１×１０－１２Ｍ～１０×１０－６ＭのＥＣ５０値で、ＣＤ２８を発現するヒトＴ細胞に結合する、請求項３６に記載の二重特異性抗原結合分子。
  38. 前記抗原結合分子が、１×１０－９Ｍ～１０×１０－６ＭのＥＣ５０値で、ＣＤ２８を発現するヒトＴ細胞に結合する、請求項３７に記載の二重特異性抗原結合分子。
  39. 前記抗原結合分子が、ヒトＣＤ２８を発現するヒト細胞およびカニクイザルＣＤ２８を発現するカニクイザル細胞に結合する、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  40. 前記抗原結合分子が、ヒト全血におけるサイトカイン放出およびＣＤ２５上方調節を誘発する、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  41. 前記抗原結合分子が、ヒト卵巣細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害を誘発する、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  42. ヒトＣＤ２８に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１８および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）由来の前記重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）由来の前記軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  43. ヒトＭＵＣ１６に特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号２および２６を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）由来の前記重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）由来の前記軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  44. ヒトＣＤ２８に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含み、ＨＣＤＲ１が、配列番号２０および４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号２２および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号２４および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１２および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号１４および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号１６および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  45. ヒトＭＵＣ１６に特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含み、ＨＣＤＲ１が、配列番号４および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号６および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号８および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１２および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号１４および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号１６および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  46. ヒトＣＤ２８に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含み、ヒトＭＵＣ１６に特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含み、
    前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号２０および４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号２２および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号２４および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１２および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号１４および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号１６および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号４および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号６および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号８および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１２および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号１４および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号１６および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  47. 前記第１の抗原結合ドメインが、ヒトＣＤ２８への結合について、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む参照抗原結合タンパク質と競合し、ＨＣＤＲ１が、配列番号２０および４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号２２および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号２４および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１２および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号１４および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号１６および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  48. 前記第１の抗原結合ドメインが、ヒトＣＤ２８への結合について、配列番号１８および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、配列番号１０および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、を含む参照抗原結合タンパク質と競合する、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  49. 前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＭＵＣ１６への結合について、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む参照抗原結合タンパク質と競合し、ＨＣＤＲ１が、配列番号４および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号６および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号８および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１２および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号１４および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号１６および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  50. 前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＭＵＣ１６への結合について、配列番号２および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、配列番号１０および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、を含む参照抗原結合タンパク質と競合する、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  51. 前記第１の抗原結合ドメインが、ヒトＣＤ２８への結合について、配列番号１８および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、配列番号１０および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、を含む参照抗原結合タンパク質と競合し、前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＭＵＣ１６への結合について、配列番号２および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、配列番号１０および３４からなる群から選択されるアミノ酸を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、を含む参照抗原結合タンパク質と競合する、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  52. 請求項３６～５１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む、薬学的組成物。
  53. 対象において卵巣癌を治療する方法であって、前記対象に請求項５２に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
  54. 前記二重特異性抗原結合分子が、固定用量で投与される、請求項２８～３４および５３のいずれか一項に記載の方法。
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