JP6580310B2 - 高分解能走査顕微鏡 - Google Patents
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Description
この手法では、スポットを回折限界で検出平面上に撮像することによって、分解能の向上が達成される。回折限界の撮像は、点スポットをエアリー・ディスクとして撮像する。この回折ディスクは、その構造が分解可能となるように検出平面内で捕捉される。したがって、顕微鏡の撮像性能に関して、検出側でオーバーサンプリングが行われる。点スポットの撮像の際に、エアリー・ディスクの形状が分解される。前述の文献に記載の、これに関するその開示が本明細書に完全に含まれる、回折構造の適切な評価によって、回折限界の2倍の分解能向上が達成される。
なお、上述の特徴および以下にこれから説明される特徴は提示された組み合わせにおいてのみでなく、本発明の枠から逸脱することなく、他の組み合わせにおいて、もしくは単独でも使用可能である。
制御装置Cは、LSM1の全ての構成要素、特にスキャナ10および検出装置19を制御する。制御装置は様々な走査位置について、各個々の画像17のデータを記録し、その回折構造を分析して試料2の高分解能の全体画像を生成する。
今では検出装置19が、個々のファセット31を支持するファセット・ミラー30を備えている。ファセット31は、画像17の分解能の点で、光ファイバー束入口22における光ファイバー21の端部に対応している。個々のファセット31は、その放射線入射の光軸に対する傾きの点で互いに異なっている。レンズ32およびミニレンズ・アレイ33、ならびにビーム重畳にのみ使用される偏向ミラー34とともに、各ファセット31は単一画像17の面部分を検出器アレイ24のピクセル25上に撮像する。その際、ファセット31の配向に応じて、検出器アレイ24を好ましくは2Dアレイとしてもよいが、検出器行も可能である。
既に言及したように、検出器アレイ24は、その幾何学的形状に関して、さらなる制限なく選定することができる。その場合、当然ながら、検出装置19内の再分配素子を対応する検出器アレイに適合させなければならない。画像17を分解するのに用いられる個々のピクセルは、究極的にはそのサイズに関して、検出器アレイ24によって規定されるのではなく、検出平面18からの放射線の再分配を行う素子によって規定される。エアリー・ディスクの場合、回折限界の撮像ではディスクの直径が、公式によれば1.22λ/NAであり、ここで、λは撮像される放射線の平均の波長、NAは対物レンズ13の開口数である。その場合、半値幅は0.15λ/NAである。高分解能を達成するには、検出の際の空間分解能をこの半値幅の2倍の大きさにする、すなわち半値幅を2度サンプリングすることで足りる。したがって、ファセット素子31あるいは光ファイバー束入口22における光ファイバー21の端部は、回折限界の単一画像の半値幅の、最大で半分の大きさであってもよい。もちろんこれは、光学系が対物レンズ13に応じて作用する撮像倍率の考慮した場合に有効である。つまり、もっとも単純な場合には、半値幅当たり検出平面18内の4×4アレイのピクセルで十分過ぎる程であろう。
[1] ハインツマン アール(Heintzmann R.);クレマー シー(Cremer C.):Laterally Modulated Excitation Microscopy:Improvement of resolution by using a diffraction grating;In Proceedings of SPIE,Vol.3568(1998)
[2]シャオ エル(Shao L.);クナー ピー(Kner P.);ヘスパー イー(Hesper E.);グスタフソン・マッツ ジー エル(Gustafsson Mats G.L.):Super−resolution 3D−microscopy of live whole cells using structured illumination;In Nature Methods,Vol.8(2011)
[3]バーテロら(Bertero et al.),In Inverse Problems 3,195(1988)
[4]シェパードら(Sheppard et al.),In Optik 80,No.2,53(1982)
[5]グロホマリキら(Grochmalicki et al.),In J.Opt.Soc.Am.A 10,1074(1993)
[6]シー ビー ミュラーら(C.B.Mueller et al.),In Phys.Rev.Lett.104,198101(2010)
[7]ヨーク エー ジー(York A.G.);パレク エス エイチ(Parekh S.H.);ノガレ ディー ディー(Nogare D.D.);フィッシャー アール エス(Fischer R.S.);テンプリン ケー(Temprine K.);ミオネ エム(Mione M.);シトニス エー ビー(Chitnis A.B.);コームズ シー エー(Combs C.A.);シュロフ エイチ(Shroff H.):Resolution doubling in live,multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy;In Nature Methods,Vol.9(2012)
[8]パヴァーニ エス アール ピー(Pavani S.R.P.)およびピーストゥン アール(Piestun R.):High−efficiency rotating point spread functions;In Optics Express 16(2008),p.3484
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レーザ走査顕微鏡(LSM)では、検出器の上流のいわゆるピンホールを回折限界(≦エアリー/4)よりも著しく小さいサイズに縮小することによって、分解能の向上が達成される。その場合、この顕微鏡は共焦点レーザ走査顕微鏡と呼ばれる。「エアリー」は、回折限界の照射スポットの第1の零点によって定義され、光学の文献では定着した概念である。
しかし、今では、同時により良好なSN比でレーザ走査顕微鏡の分解能を高めることも可能である。このためには、より多数の光子を検出可能であるより大きいピンホール直径(約1エアリー)と、サブ・エアリー空間分解検出とを用いて作業しなければならない。画像撮影後には、特別なアルゴリズムを用いてデータの再分類および相殺が行われる。その結果、試料画像において分解能が高められる。このコリン・シェパード(Colin Sheppard)の方法は、文献では「変位したサブ・エアリー検出値の蓄積(Akkumulation verschobener Sub−Airy−Detektorwerte)」とも呼ばれている[3〜7]。
図1〜図8には、ファイバー束およびPMTアレイに基づいた、高速高感度低ノイズ多素子検出装置が記載されており、LSMについて同時に良好なSN比で分解能を改善することが可能である。
9.解決法
サブ・エアリー空間分解検出装置を備えたLSMと同様に、原理上の制限により、軸外検出素子について照射点像関数(照射(強度)PSF)と検出点像関数(検出(強度)PSF)との間に相対的なずれが生じる。
全ての検出光53をPMTアレイ61上に再分配する、ファイバー束アレイ64から構成されたサブ・エアリー空間分解検出装置60の技術的に好ましい1実施形態が、特に有利であることが証明されている。
本発明は、独立請求項の特徴によって特徴付けられる。
a)横方向に速度が最適化された照射PSF
照射PSF形状を、瞳あるいは瞳付近において、もしくは対物レンズ瞳と光学的に共役な平面において、空間的位相変調によって変化させることにより(図9〜図15)、PSFの周波数成分によって、相殺後にも引き続き検出平面63内の約1エアリーのピンホール直径で少なくとも典型的な共焦点分解が達成可能になる。同時に、PSFは可能な限り広い面積を覆わなければならない。このようにして、本発明によれば、比較的広い試料領域からの試料光の平行化された検出によって、大幅により高い画像撮影速度を達成することができる。したがって、疑似の超高速ミニ・カメラである超高速高感度検出装置60の長所が有効に利用される。
3つ以上のスポット(≧3)を生成するために、照射放射線経路に適切な位相板を組み込むことも考えられる。
本発明によれば、位相マスクを介して検出PSF形状を構成することにより、検出PSFの周波数成分によって、相殺後にも引き続き少なくとも典型的な共焦点分解が達成可能となり、同時に、z情報を異なる平面にわたって横方向に符号化および最大化することにより、所与の横方向の分解能について可能な限り多くのZ平面が画像に寄与するようになる(図10)。検出PSFはz位置に応じた横方向の楕円形になるので、これは例えば、円柱レンズを用いることによって達成される。
さらに、本発明によれば、位相マスクを介して検出PSF形状を変更することにより、PSFの周波数成分によって、相殺後にも引き続き少なくとも典型的な共焦点分解が維持可能となり、ただし、z情報が異なる平面にわたって横方向に符号化および最大化されることにより、所与の横方向の分解能について、可能な限り少ないZ平面が画像に寄与し、z方向のzPSFの導出が可能な限り量的に大きくなる。これに関する解決法の例は、螺旋形状である[8]。
位相マスクを構成することによって、照射波長に応じて位相関数が異なることにより、照射光学系の焦点において、同時に異なる波長で適用された照射光分布が、試料平面において、および最後には空間分解検出器(ファイバー束)上においても、その空間的な重複が可能な限り少なくなる。その際、本発明によれば、位相関数を生成する光学素子用の最適化可能な適合装置が、色素粒子に応じて適切に調節可能な照射波長の組み合わせのために形成されていることが有利である。
e)空間分解検出装置(ファイバー束/アレイ検出器)上での多色画像化
ファイバー束内のファイバーと蛍光色スペクトルの波長との間の特定の割り当てを可能にする、色的に作用する光学位相素子を検出放射線経路に挿入することも考えられる(スペクトル検出器の概念)。その際、位相マスクを使用した検出点像関数の帯域幅はやはり回折限界の検出点像関数と本質的には異ならないので、典型的な共焦点分解を達成することができる。
本発明は基本的に、対物レンズ瞳平面もしくはその付近に配置された、その横方向の断面に沿った位相において波面に様々な影響を与える素子に基づいており、これにより、物体平面(試料)には変化させることが可能な空間的構造が生じる。このような素子は、大抵の場合、「位相板」もしくは「位相マスク」と呼ばれ、伝達格子の場合のようにエッチングされた凹部を備えた石英ガラスのコーティングおよびエッチングのうちの少なくとも一方によって、または伝達素子の異なる厚さによる位相ずれによって、位相の様々な影響を生じさせることができる(例えば、段付きのガラス板)。この種の位相マスクは、振幅マスクと組み合わせることができる。
図9 照射の2D強度分布による、瞳およびそれに属する断面における位相関数/振幅関数の例の図。
図10b) 焦点における2D強度分布の図。
図11a) 照射および検出に対して異なる作用を有する位相マスクの図であって、1つの経路および2つの経路のうちの少なくとも一方における補償されていない位相関数の図。
図11c) 照射および検出に対して異なる作用を有する位相マスクの図であって、位相マスクを通って両方向に伝播する光についての補償された位相関数の図。
図13 超高速高感度空間分解検出装置60と対物レンズ瞳内の振幅マスク/位相マスク48.1とを備えたレーザ走査顕微鏡の図。
図15 超高速高感度空間分解検出装置60と、フィルタ/ビーム・スプリッタ・ホイール49内の1つまたは複数の振幅マスク/位相マスク49.1とを備えたレーザ走査顕微鏡の図。
左側には様々な位相マスクが、右側には照射時に対物レンズ瞳においてマスクを使用した際の光軸に対する横方向の位置に応じた物体平面内に生じる強度分布が図示されている。
右側には、位相マスクを使用しない場合のエアリー輪郭を有する中央に位置するスポットSの代わりに、空間的に分離した互いに近接して位置する2つのスポットS1およびS2が図示されている。
図9d)には、図9a)と同様に、例えば振幅マスクAおよび位相マスクPの組み合わせによる、追加の伝達変化のある半空間マスクの重畳が図示されている。
図示の照射光分布が、前述の検出装置60(検出カメラとして機能する)を使用した画像撮影において平行化を可能にすることが明らかである。というのも、マスクを使用すれば複数の照射スポットが生じるが、これらが互いに非常に近接して位置するので、厚い試料の場合にクロストークの問題が起こり得る。上述の平行化によって、画像撮影速度が高められる。なお、試料内への侵入深さの増加に伴って生じ得る収差が発生した場合、照射の変調が変化する。場合によっては、ここでは専門家らしく適合光学系によって撮像誤差を補正することができる。
それぞれの半瞳における両方の位相ランプは、上から下へ互いに逆向きに位相変化が推移している。
ここでも、2つの互いに近接して位置する照射スポットが生じている。しかし、焦点の外側の照射の対称性が、図10b)および図10c)の撮影と比較すれば、変化している(図10c)では焦点から200nm外側)。このことは、少ない断面画像で3D構造を撮影することが重要である場合に有利である。これが可能であるのは、異なるz平面からの光が空間的にやや違ったふうにカメラ(図1〜図8によるファイバー束の入口面)上で分布されるからである。
これはしかし、検出される画像を歪めないためには望ましくない。
図13に示された技術的に好ましい実施形態とは異なり、図14では、振幅マスク/位相マスク56.1が検出放射線経路のみに位置している。本発明によれば、3Dスタックの撮影速度の向上もしくは軸方向の分解/コントラストの改善のために、この実施形態を用いることができる。その際、マスク56.1は、光ファイバー入口面64の分布上の平行な検出スポットを生成することによって、図10による構造を有していてもよい。
同様に、照射放射線経路および検出放射線経路のうちの少なくとも一方内に挿入される位相マスクは、矢印で概略的に図示されているように、放射線経路から押出可能に形成されていてもよく、それにより、調節可能な照射モードおよび検出モードのうちの少なくとも一方に関する最大の柔軟性が確保される。
図18に提示されている実施形態では、振幅マスク/位相マスク48.1が、瞳あるいは瞳付近において対物レンズの直近に位置している。しかし、サンプリング方向が走査光学系の瞳(焦点)内をちょうど通っていなければ、光分布あるいは48.1の振幅マスク領域/位相マスク領域に関して全く非対称性が生じ得ないことが、本実施形態の小さいサンプリング角度についての利点である。しかし、サンプリング角度を変更した際に、振幅マスク/位相マスク48.1の作用が変化しないことを確認しなければならない。この配置の欠点は、検出光53が同様にマスク48.1を通過することによって変更されてしまう点である。これを防ぐには、特に48.1が位相マスクである場合は、検出光53にのみ作用する位相マスク49.1として、逆の位相マスク構造をカラー・スプリッタ・ホイール49に挿入すればよい。
Claims (37)
- 試料(2)の高分解能走査顕微鏡検査のための顕微鏡であって、
− 該試料(2)を照射するための照射装置(3)と、
− 該試料(2)上に少なくとも1つの点スポットもしくは線スポット(14)を走査させるための、および、該点スポットもしくは線スポット(14)を、撮像倍率のもとで検出平面(18)内に静止単一画像(17)に撮像するための撮像装置(4)と、
− 該撮像倍率を考慮して該単一画像(17)の半値幅の少なくとも2倍の大きさである空間分解能で、様々な走査位置について該検出平面(18)内の該単一画像(17)を捕捉するための検出装置(19)と、
− 該検出装置(19)のデータから、該走査位置の該単一画像の回折構造を評価するための、および、回折限界を超えて高められた分解能を有する該試料(2)の画像を生成するための評価装置(C)とを備えた顕微鏡において、
− 該検出装置(19)が、
− ピクセル(25)を備えており該単一画像(17)より大きい検出器アレイ(24)と、
− 該検出器アレイ(24)の上流に配置され、該検出平面(18)からの放射線を非撮像的に該検出器アレイ(24)の該ピクセル(25)上に分配する非撮像の再分配素子(20〜21;30〜34;30〜35)とを備え、
対物レンズ瞳内もしくはその付近に、または該対物レンズ瞳と共役な平面もしくはその付近に少なくとも1つの位相マスクが設けられており、光軸に直交して、および/もしくは該光軸の方向に照射光および検出光のうちの少なくとも一方の空間的分布を生じさせるために、前記少なくとも1つの位相マスクは、位相影響が横断方向に可変に推移し、
前記位相マスクは、前記照明光のみに作用して照射PSFを、前記対物レンズ瞳もしくはその付近において、もしくは前記対物レンズ瞳と光学的に共役な平面もしくはその付近において、空間的位相変調によって変化させるか、または
前記位相マスクは、共通の照明放射線経路および検出放射線経路に配置され、かつ検出の方向における位相の影響を取り消すように構成されていることを特徴とする顕微鏡。 - 前記再分配素子が、光ファイバー(21)からなる束(20)を含んでおり、該束が、前記検出平面(18)に配置された入口(22)と、該光ファイバー(21)が該入口(22)の幾何学的配置とは異なる幾何学的配置で前記検出器アレイ(24)の前記ピクセル(25)にて終端する出口(23)とを備えていることを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡。
- 前記光ファイバー(21)が、隣接して位置する前記ピクセル(25)の放射強度に応じたクロストークを最小化するために、前記出口(23)に隣接する前記光ファイバー(21)が前記入口(22)にも隣接するように、前記入口(22)から前記出口(23)まで延びていることを特徴とする、請求項2に記載の顕微鏡。
- 前記再分配素子が、様々に傾けられたミラー素子(31)を備えたミラー(30)を含んでおり、該ミラーが、前記検出平面(18)からの放射線を前記検出器アレイ(24)の前記ピクセル(25)上に偏向させ、前記検出器アレイ(24)の前記ピクセル(25)が、該ミラー素子(31)の幾何学的配置とは異なる幾何学的配置を有していることを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡。
- 前記撮像装置(4)が、前記単一画像(17)のサイズを前記検出装置(19)のサイズに適合させるための、撮像方向において前記検出平面(18)の上流に配置されたズーム光学系(27)を備えていることを特徴とする、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記照射装置(3)と前記撮像装置(4)とが走査装置(10)を共有しており、前記照射装置(3)が、前記撮像装置によって撮像された前記スポット(14)と一致するスポットもしくは線スポットで前記試料を照射し、前記ズーム光学系(27)もまた前記照射装置(3)の構成要素となるように前記ズーム光学系(27)が配置されていることを特徴とする、請求項5に記載の顕微鏡。
- 前記検出器アレイ(24)が、検出器行であることを特徴とする、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 試料(2)の高分解能走査顕微鏡検査のための方法であって、
− 該試料(2)を照射し、
− 該試料(2)上を走査するように導かれる少なくとも1つの点スポットもしくは線スポット(14)を単一画像(17)に撮像し、その際、該スポット(14)を撮像倍率のもとで、該単一画像(17)に撮像し、該単一画像(17)が検出平面(18)内に静止しており、
− 様々な走査位置について、該撮像倍率を考慮して該単一画像(17)の半値幅の少なくとも2倍の大きさの空間分解能で該単一画像(17)を捕捉することにより、該単一画像(17)の回折構造を捕捉し、
− 各該走査位置について該単一画像(17)の該回折構造を評価し、回折限界を超えて高められた分解能を有する該試料(2)の画像を生成する方法において、
− ピクセル(25)を備えており該単一画像(17)よりも大きい検出器アレイ(24)を設け、
− 前記検出平面(18)からの該単一画像の放射線を、非撮像的に該検出器アレイ(24)の該ピクセル(25)上に再分配し、
− 光軸に直交して、および/もしくは該光軸の方向に照射光および検出光のうちの少なくとも一方の空間的分布を生じさせるために、位相影響が横断方向に可変に推移する少なくとも1つの位相マスクを、対物レンズ瞳内もしくはその付近に、または該対物レンズ瞳と共役な平面もしくはその付近に設け、
前記位相マスクは、前記照明光のみに作用して照射PSFを、前記対物レンズ瞳もしくはその付近において、もしくは前記対物レンズ瞳と光学的に共役な平面もしくはその付近において、空間的位相変調によって変化させるか、または
前記位相マスクは、共通の照明放射線経路および検出放射線経路に配置され、かつ検出の方向における位相の影響を取り消すように構成されていることを特徴とする方法。 - 前記単一画像(17)の放射線を、光ファイバー(21)からなる束(20)を用いて再分配し、該束が、前記検出平面(18)に配置された入口(22)と、該光ファイバー(21)が該入口(22)の幾何学的配置とは異なる幾何学的配置で前記検出器アレイ(24)の前記ピクセル(25)にて終端する出口(23)を備えていることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記光ファイバー(21)を、隣接して位置する前記ピクセル(25)の放射強度に応じたクロストークを最小化するために、前記出口(23)に隣接する前記光ファイバー(21)が前記入口(22)にも隣接するように、前記入口(22)から前記出口(23)まで導くことを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 各前記光ファイバー(21)に個別に放射線を当てることによって前記光ファイバー(21)からなる前記束(20)および前記検出器アレイ(24)の較正を行い、隣接する前記光ファイバー(21)の前記出口(23)に割り当てられた前記ピクセル(25)における干渉信号を捕捉し、前記試料(2)の顕微鏡検査の際に隣接して位置する前記ピクセル(25)の放射強度に依存したクロストークを補正するために用いる較正マトリクスを作成することを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記単一画像(17)の放射線を、様々に傾けられたミラー素子(31)を備えたミラー(30)を用いて再分配し、その際、該ミラー(30)によって前記検出平面(18)からの放射線が前記検出器アレイ(24)の前記ピクセル(25)上に導かれ、前記検出器アレイ(24)の前記ピクセル(25)が、該ミラー素子(31)の幾何学的配置とは異なる幾何学的配置を有していることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記検出器アレイ(24)として、検出器行を使用することを特徴とする、請求項8乃至12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出器アレイ(24)の個々の前記ピクセル(25)の信号を、相互相関関数を用いて評価することによって、前記点スポットもしくは線スポット(14)の走査の移動方向を特定することを特徴とする、請求項8乃至13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料(2)において前記点スポットもしくは線スポット(14)が静止している際に前記単一画像(17)の時間的変化を特定および評価することによって、前記試料(2)における変化を捕捉することを特徴とする、請求項8乃至14のいずれか1項に記載の方法。
- 1つの支持体上に、もしくは前後に配置された2つの支持体上に、振幅マスクおよび位相マスクの組み合わせを備えた、請求項1に記載の顕微鏡。
- 両側にそれぞれ可変な位相推移を有する半瞳位相マスクを備えた、請求項1または16に記載の顕微鏡。
- 前記両側での推移が互いに逆である、請求項17に記載の顕微鏡。
- 前記位相マスク上に位相跳躍を有する、請求項1及び16乃至18のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記位相マスクがスパイラル位相マスクである、請求項1及び16乃至19のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 位相に影響を与えるために断面に沿って厚さが異なるガラス板を備えた、請求項1及び16乃至20のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 異なる厚さの領域を分離するためのエッジを有する位相マスクを備えた、請求項1及び19乃至21のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記照射および検出放射線経路を分離するための、および位相に影響を与えるための共通の素子が設けられている、請求項1及び16乃至22のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記位相マスクが、照射方向において対物レンズ瞳内に前記対物レンズの直近の上流に配置されている、請求項1及び16乃至22のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記位相影響が逆方向に推移する、同じ構造の追加の位相マスク、もしくは逆の構造の追加の位相マスクが設けられている、請求項1に記載の顕微鏡。
- 前記検出において少なくとも2つの検出放射線経路を有する、分配のための二色性のビーム・スプリッタが設けられている、請求項1及び16乃至25のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 検出放射線経路にバリオ光学系が配置されている、請求項1及び16乃至26のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 位相および振幅のうちの少なくとも一方に影響を与えるための空間光変調器(SLM)が設けられている、請求項1及び16乃至27のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 試料(2)の高分解能走査顕微鏡検査のための顕微鏡であって、
− 該試料(2)を照射するための照射装置(3)と、
− 該試料(2)上に少なくとも1つの点スポットもしくは線スポット(14)を走査させるための、および、該点スポットもしくは線スポット(14)を、撮像倍率のもとで検出平面(18)内に静止単一画像(17)に撮像するための撮像装置(4)と、
− 該撮像倍率を考慮して該単一画像(17)の半値幅の少なくとも2倍の大きさである空間分解能で、様々な走査位置について該検出平面(18)内の該単一画像(17)を捕捉するための検出装置(19)と、
− 該検出装置(19)のデータから、該走査位置の該単一画像の回折構造を評価するための、および、回折限界を超えて高められた分解能を有する該試料(2)の画像を生成するための評価装置(C)とを備えた顕微鏡において、
− 該検出装置(19)が、
− ピクセル(25)を備えており該単一画像(17)より大きい検出器アレイ(24)と、
− 該検出器アレイ(24)の上流に配置され、該検出平面(18)からの放射線を非撮像的に該検出器アレイ(24)の該ピクセル(25)上に分配する非撮像の再分配素子(20〜21;30〜34;30〜35)とを備え、
対物レンズ瞳内もしくはその付近に、または該対物レンズ瞳と共役な平面もしくはその付近に少なくとも1つの位相マスクが設けられ、光軸に直交して、および/もしくは該光軸の方向に照射光および検出光のうちの少なくとも一方の空間的分布を生じさせるために、前記少なくとも1つの位相マスクは、位相影響が横断方向に可変に推移し、
位相マスクとして、空間的に少なくとも部分的に別々に異なる波長で作用を及ぼすための、色的に作用する位相マスクが設けられており、
照射光学系の焦点において、異なる波長で照射された照射光分布が、試料平面および空間分解検出器の前記検出平面のうちの少なくとも一方において少なくとも部分的に空間的に重複しないように、位相関数が照射波長に応じて異なるように、前記色的に作用する位相マスクが設計されている、顕微鏡。 - 検出放射線経路に、色的に作用する光学位相素子が挿入されており、該素子が、1つもしくは複数のファイバー入口面と1つもしくは複数の波長との間の特定の割り当てを行う、請求項29に記載の顕微鏡。
- 試料(2)の高分解能走査顕微鏡検査のための方法であって、
− 該試料(2)を照射し、
− 該試料(2)上を走査するように導かれる少なくとも1つの点スポットもしくは線スポット(14)を単一画像(17)に撮像し、その際、該スポット(14)を撮像倍率のもとで、該単一画像(17)に撮像し、該単一画像(17)が検出平面(18)内に静止しており、
− 様々な走査位置について、該撮像倍率を考慮して該単一画像(17)の半値幅の少なくとも2倍の大きさの空間分解能で該単一画像(17)を捕捉することにより、該単一画像(17)の回折構造を捕捉し、
− 各該走査位置について該単一画像(17)の該回折構造を評価し、回折限界を超えて高められた分解能を有する該試料(2)の画像を生成する方法において、
− ピクセル(25)を備えており該単一画像(17)よりも大きい検出器アレイ(24)を設け、
− 前記検出平面(18)からの該単一画像の放射線を、非撮像的に該検出器アレイ(24)の該ピクセル(25)上に再分配し、
− 光軸に直交して、および/もしくは該光軸の方向に照射光および検出光のうちの少なくとも一方の空間的分布を生じさせるために、位相影響が横断方向に可変に推移する少なくとも1つの位相マスクを、対物レンズ瞳内もしくはその付近に、または該対物レンズ瞳と共役な平面もしくはその付近に設け、
位相マスクとして、空間的に少なくとも部分的に別々に異なる波長で作用を及ぼすための、色的に作用する位相マスクを設け、
照射光学系の焦点において、異なる波長で照射された照射光分布が、試料平面および空間分解検出器の前記検出平面のうちの少なくとも一方において少なくとも部分的に空間的に重複しないように、位相関数が照射波長に応じて異なるように、前記色的に作用する位相マスクが設計されていることを特徴とする方法。 - 前記光ファイバー(21)は、多モード光ファイバーである、請求項2に記載の顕微鏡。
- 前記ミラー(30)は、ファセット・ミラー、DMD、または適応ミラーである、請求項4に記載の顕微鏡。
- 検出器行は、APD行またはPMT行である、請求項7に記載の顕微鏡。
- 前記光ファイバー(21)は、多モード光ファイバーである、請求項9に記載の方法。
- 前記ミラー(30)は、ファセット・ミラー、DMD、または適応ミラーである、請求項12に記載の方法。
- 検出器行は、APD行またはPMT行である、請求項13に記載の方法。
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