JP6574274B2 - シート状細胞培養物の製造方法 - Google Patents
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Description
これらの原因と重症度に応じて弁形成術や置換術、冠動脈バイパス術、左室形成術、機械的補助循環などが適用される。
重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されてアポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞***をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。
このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。
[1]遊離したシート状細胞培養物の製造方法であって、
(i)細胞を基材上に播種する工程、
(ii)細胞を基材に対して加圧する工程、
(iii)細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程、および
(iv)形成された培養物を基材から遊離させる工程
を含み、ここで工程(i)および(ii)からなる繰り返しセットが2回以上繰り返され、2回目以降の繰り返しセットにおける播種および/または加圧が、直前の加圧工程終了後における加圧の偏りによる細胞密度の疎密を是正するように行われることを特徴とする、前記方法。
[2]細胞の最終密度が、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度である、[1]に記載の方法。
[3]細胞の最終密度が3.5×105個/cm2以上、3.4×106個/cm2未満である、[1]または[2]の方法。
[4]細胞が、筋芽細胞を含む、[1]〜[3]の方法。
[5]基材が細胞非接着性の表面を有する、[1]〜[4]の方法。
[6]加圧が、遠心力によって行われる、[1]〜[5]の方法。
[7]加圧が、2〜2000Gの力で行われる、[1]〜[6]の方法。
(iv)工程(ii)における加圧の偏りを是正するように、細胞を基材に対して再加圧する工程、(v)細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程、および(vi)形成された培養物を基材から遊離させる工程、を含む、遊離したシート状細胞培養物の製造方法に関する。
本発明における細胞には、細胞培養物、特にシート状の細胞培養物を形成し得る任意の細胞が含まれる。かかる細胞の例としては、限定されずに、筋芽細胞(例えば、骨格筋芽細胞)、心筋細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、上皮細胞、内皮細胞などが含まれる。これらのうち、本発明においては、単層の細胞培養物を形成するもの、例えば、筋芽細胞が好ましい。細胞は、細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどが含まれる。また、本発明の方法に用いる細胞は1種類のみであってもよいが、2種類以上の細胞を用いることもできる。本発明の好ましい態様において、細胞培養物を形成する細胞が2種類以上ある場合、最も多い細胞の比率(純度)は、細胞培養物製造終了時において、65%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上である。
上記表面または界面は、種々の形状であってもよいが、平坦であることが好ましい。また、その面積は特に限定されないが、典型的には、1〜200cm2、好ましくは2〜100cm2、より好ましくは3〜80cm2である。
遠心力を負荷する場合、基材と細胞とを含む容器などを、遠心分離器を用いて遠心することができる。負荷する遠心力は、典型的には約2〜2000G、好ましくは約5〜1000G、より好ましくは約10〜800G、特に好ましくは50〜450Gである。細胞に損傷を与えない程度で、より強い遠心力を負荷することにより、細胞培養物の均一性をより高めること、すなわち、細胞培養物の空隙をより少なくすることができる。遠心時間は、典型的には2〜60分間、好ましくは3〜15分間、より好ましくは3〜5分間であり、遠心温度は、典型的には2〜37℃、より好ましくは4〜25℃である。
本明細書において「細胞密度」とは、培養面1cm2あたりの細胞の個数をいう。したがって「細胞播種密度」とは、培養面1cm2あたりに播種される細胞の密度を意味し、「最終細胞密度」または「細胞の最終密度」とは、加圧後の細胞密度を意味する。
本発明において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には1つの細胞層からなるものであるが、2以上の細胞層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接および/または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも機械的に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも機械的に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
細胞培養物の基材からの遊離は、細胞培養物が少なくとも部分的に、シート構造を保ったまま、足場となっている基材から遊離できれば特に限定されないが、典型的には、ピペッティングなどによって行う。また、細胞を、温度によって表面の親水性が変化する温度応答性基材上で培養し、形成された細胞培養物を温度変化により、非酵素的に遊離することもできる。
本発明の細胞培養物は、対象の疾病、傷病の治療に用いることができる。例えば、骨格筋芽細胞による細胞培養物は、心疾患、例えば、心筋梗塞、拡張型心筋症などに、移植片などの形態で用いることができる。したがって、本発明の別の態様は、上記細胞培養物を含む移植片に関する。
Claims (5)
- 遊離したシート状細胞培養物の製造方法であって、
(i)細胞を基材上に播種する工程、
(ii)細胞を所定の大きさの力で基材、または、基材に直接もしくは他の細胞を介して接触している他の細胞に接触させる加圧工程であって、当該加圧が10〜100mmHgの水圧の負荷である、前記加圧工程、
(iii)細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程、および
(iv)形成された培養物を基材から遊離させる工程
を含み、ここで工程(i)および(ii)からなる繰り返しセットが2回以上繰り返され、2回目以降の繰り返しセットにおける播種および/または加圧が、直前の加圧工程終了後における加圧の偏りによる細胞密度の疎密を是正するように行われることを特徴とする、前記方法。 - 細胞の最終密度が、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度である、請求項1に記載の方法。
- 細胞の最終密度が3.5×105個/cm2以上、3.4×106個/cm2未満である、請求項1または2に記載の方法。
- 細胞が、筋芽細胞を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 基材が細胞非接着性の表面を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
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