JP6510162B2 - シート状細胞培養物の製造方法 - Google Patents
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Description
これらの原因と重症度に応じて弁形成術や置換術、冠動脈バイパス術、左室形成術、機械的補助循環などが適用される。
重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されてアポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞***をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。
このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。
このように、シート状細胞培養物を簡便に製造するための器具や方法が多く提供されている。
[1]シート状細胞培養物を製造する方法であって、細胞接着性成分を含む細胞非接着性ゲル表面に、シート形成細胞を播種し、インキュベートすることを含む、前記方法。
[2]細胞接着性成分を含む細胞非接着性ゲル表面が、細胞非接着性ゲル表面を細胞接着性成分で被覆することにより形成される、[1]の方法。
[3]細胞が、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で播種される、「1」または[2]の方法。
[4]細胞の密度が3.5×105個/cm2以上、3.4×106個/cm2未満である、[1]〜[3]の方法。
[5]細胞が、骨格筋芽細胞である、[1]〜[4]の方法。
[6]細胞接着成分が、全血清である、[1]〜[5]の方法。
[7]インキュベートの時間が、2〜5時間である、[1]〜[6]の方法。
本発明において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には1つの細胞層からなるものであるが、2以上の細胞層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接および/または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも機械的に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも機械的に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
本発明の一態様において、細胞非接着性ゲルの表面に細胞接着性成分を付与する工程を含んでよい。細胞接着性成分の付与は、細胞非接着性ゲルおよび細胞接着性成分の細胞接着性を変化させない限りどのような方法を用いてもよく、これに限定するものではないが、例えば細胞非接着性のゾル状物質に細胞接着性成分を混合した後ゲル化させてもよいし、細胞非接着性ゲルの表面を細胞接着性成分で被覆してもよい。
メビオールゲルを4℃下で基礎培地(DMEM/F12)に溶解し、ペトリディッシュ(φ35mm)の表面に塗布した後、4℃下で静置し、表面を平坦化させた。その後、37℃で保温してゲル化させた。ゲル化した後、終濃度が75%〜100%となるようにFBSを混合した基礎培地(DMEM/F12)を2mL添加し、37℃、5%CO2下で72時間インキュベートした。1.5×107個の細胞を2mLの20%FBS含有DMEM/F12に懸濁し、インキュベート後培地を廃棄した上記ペトリディッシュに播種し、37℃、5%CO2下で2時間半インキュベートした。
その結果、細胞がシート状に形成され、さらに、培養面であるゲル表面から、剥離操作を行うことなく自動的に剥離された(図1)。
軟寒天0.5gを37℃下で大塚蒸留水40mLに溶解した後、基礎培地(DMEM/F12)70mLと混合した。混合した軟寒天溶液2mLをペトリディッシュ(φ35mm)に添加した後、4℃で保温してゲル化させた。ゲル化した後、終濃度が75%〜100%となるようにFBSを混合した基礎培地(DMEM/F12)を2mL添加し、37℃、5%CO2下で72時間インキュベートした。1.5×107個の細胞を2mLの20%FBS含有DMEM/F12に懸濁し、インキュベート後培地を廃棄した上記ペトリディッシュに播種し、37℃、5%CO2下で2時間半インキュベートした。
その結果、上記実施例1と同様、細胞がシート状に形成され、さらに、培養面から自動的に剥離される事が分かった。
実施例1および2においてメビオールゲルおよび軟寒天をそれぞれペトリディッシュに被覆してゲル化した後、FBSを混合した基礎培地(DMEM/F12)に代えて、FBSを含まない基礎培地を2mL添加し、37℃、5%CO2下で72時間インキュベートした。1.5×107個の細胞を2mLの20%FBS含有DMEM/F12に懸濁して、インキュベート後培地を廃棄した上記ペトリディッシュに播種し、37℃、5%CO2下で2時間半インキュベートした。
その結果、培地中に細胞が浮遊しており、シート状細胞培養物の形成は認められなかった。
Claims (7)
- シート状細胞培養物を製造する方法であって、細胞非接着性ゲル分子および細胞接着性成分の分子が混在する状態の培養面に、シート形成細胞を播種し、インキュベートすることを含む、前記方法。
- 細胞非接着性ゲルが、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)(PIPAAm)をポリエチレングリコール(PEG)で架橋した温度応答性ゲルまたは軟寒天である、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で播種される、請求項1または2に記載の方法。
- 細胞の密度が3.5×105個/cm2以上、3.4×106個/cm2未満である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、骨格筋芽細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞接着成分が、全血清である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- インキュベートの時間が、2〜5時間である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
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