JP6553075B2 - さらなるccr3−結合ケモカインを認識する抗エオタキシン−2抗体 - Google Patents
さらなるccr3−結合ケモカインを認識する抗エオタキシン−2抗体 Download PDFInfo
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Description
a)配列番号5で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR1又はその変型、
b)配列番号6で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR2又はその変型、及び
c)配列番号7で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR3又はその変型を含む重鎖可変領域、並びに
d)配列番号8で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR1又はその変型、
e)配列番号9で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR2又はその変型、及び
f)配列番号10で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR3又はその変型を含む軽鎖可変領域
を含む完全ヒト化抗体である。
a)配列番号5で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR1又はその変型、
b)配列番号6で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR2又はその変型、及び
c)配列番号7で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR3又はその変型を含む重鎖可変領域、並びに
d)配列番号8で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR1又はその変型、
e)配列番号9で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR2又はその変型、及び
f)配列番号10で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR3又はその変型を含む軽鎖可変領域
を含む。
a.CCR3結合ケモカインに対する抗体を得ることと、
b.CCR3結合ケモカインのN−ループ領域の、前記CCR3結合ケモカインのアミノ酸配列のアミノ酸位置14と24の間に位置する正電荷をもつアミノ酸残基の比較的高度な集中を特徴とする立体構造エピトープへの前記抗体の結合を評価すること、
c.前記立体構造エピトープに結合する抗体を選択することを含み、
そこにおいて、前記立体構造エピトープに特異的に結合する抗体は、CCR3、CCR1、CCR2、及びCCR5を発現する細胞の遊走性を効率的に弱めることができる。
a)配列番号5で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR1又はその変型、
b)配列番号6で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR2又はその変型、及び
c)配列番号7で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR3又はその変型を含む重鎖可変領域、並びに
d)配列番号8で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR1又はその変型、
e)配列番号9で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR2又はその変型、及び
f)配列番号10で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR3又はその変型を含む軽鎖可変領域
を含む。
a)配列番号5で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR1又はその変型、
b)配列番号6で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR2又はその変型、及び
c)配列番号7で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR3又はその変型を含む重鎖可変領域、並びに
d)配列番号8で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR1又はその変型、
e)配列番号9で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR2又はその変型、及び
f)配列番号10で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR3又はその変型を含む軽鎖可変領域
を含む。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、トレオニン(T);及び
8)システイン(C)、メチオニン(M)
a.CCR3結合ケモカインに対する抗体を得ることと、
b.CCR3結合ケモカインのN−ループ領域の、前記CCR3結合ケモカインのアミノ酸配列のアミノ酸位置14と24の間に位置する正電荷をもつアミノ酸残基の比較的高度な集中を特徴とする立体構造エピトープへの前記抗体の結合を評価すること、
c.前記立体構造エピトープに結合する抗体を選択することを含み、
そこにおいて、前記立体構造エピトープに特異的に結合する抗体は、CCR3、CCR1、CCR2、及びCCR5を発現する細胞の遊走性を効率的に弱めることができる。
特異性ELISA
CM101の特異性はELISAで評価する。プレートを次の抗原でコーティングした:エオタキシン1、エオタキシン2、単球化学誘引物質タンパク質−3(CCL7)、及びRANTES(CCL5)。いずれも、1μg ml−1で4℃にて一晩コーティングした。洗浄(PBS+0.1% ツイーン20)した後、hCM101(5μg)をプレートに1時間加えた。再度洗浄した後、CM101を抗ヒト西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(PBSで1:5000希釈して1時間インキュベーション)を用いて検出し、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン基質(シグマケミカル社、ジリンガム、英国)を用いて定量した。10分後に反応を硫酸(50μl、2M)で止め、光学密度を450nMで測定した。
ヒトエオタキシン2/CCR3に対する免疫組織化学染色を、硬皮症患者の皮膚/肺生検の5μm厚凍結切片で行った。メタノール及びアセトンで固定した後、切片を非免疫ウサギ及びヤギ血清でブロックし、続いてCASブロッキング試薬とインキュベーションした。その後、一次抗体(抗エオタキシン−2抗体又は抗CCR3抗体のいずれか)を室温で1時間加えた。洗浄した後、ビオチン標識したアフィニティー精製ヤギ抗マウス/ウサギ抗体(ジャクソン社)を加えた。次に、スライドを0.3% H2O2とインキュベーションした後、さらに洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体(ジャクソン社)と室温で30分間インキュベーションした。スライドを3−アミノ−9−エチルカルバゾール基質(ダコ社)で15分間発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。皮膚及び肺切片の肺炎症及び線維症変化の分析にはH&E及びマッソントリクローム染色を用いた。
ダイナビーズプロトコール(ライフテクノロジー社)を用いるプルダウンを採用した。CM101の濃度を上げてさまざまな濃度で、磁気ビーズ(1mg)と室温で1.5時間インキュベーションした。次に、磁気分離を行った後、(全身性強皮症患者の)ヒト血清と一晩インキュベーションした。磁気分離及びビーズからのケモカインの溶出を行い、ニトロセルロース膜に移し、市販の抗Eox2抗体に曝した。また、エオタキシン1、RANTES、及びMCP−3に対するhCM101の結合能も、SDSゲル電気泳動を用いて評価した。
AML 14.3D10、CCR3を安定して発現する好酸性細胞系をPBSで洗浄し、アッセイバッファー(RPMI1640、1%エンドトキシンを含まないBSA、100U ml−1ペニシリン、及び100μg ml−1ストレプトマイシン)に107個の細胞 ml−1で再懸濁した。異なる濃度(10−7M〜10−9M)のhCM101を5nMヒトエオタキシン−1及びエオタキシン−2又はMCP−3及びRANTES(30分、37℃)の組み合わせとインキュベーションし、5μmの細孔をもつ24ウェルのトランスウェルプレート(コスター社)の下部チャンバーに入れ、100μlの細胞(1×106個の細胞)を各トランスウェルプレート上部チャンバーに入れて、アッセイを37℃で4時間インキュベーションした(5%C02)。下部チャンバーに遊走する生細胞をフローサイトメーター(FACSキャリバー)、BDバイオサイエンス社、カウリー、英国)を用いて数えた。結果は対照(つまり、ケモカインによって誘導された)遊走の%割合として表わされる。
細胞(2×106個の細胞/mL)をカルシウムセンサー(Flou4−AM、インビトロジェン)を4μΜの最終濃度で含むPBS+/+(カルシウム マグネシウム ++)中で370にて30分間インキュベーションした。次に細胞を洗い、370にて500ulのPBS+/+中でさらに30分間インキュベーションした。細胞をフローサイトメーターを用いて30秒間(488レーザー、フィルター520)解析し、次に(hCM101とのプレインキュベーションをした後又はプレインキュベーションをせずに)、100ng/mlのエオタキシン2で刺激し、直ちにフローサイトメトリーの読み取りに進んだ。
線維芽細胞をCM101(10又は5μg/ml)及びヒト血清と24時間インキュベーションした。次に、細胞をトリプシン処理し、70% エタノールで固定し、細胞付き抗αSMA抗体(anti α SMA Ab with the cells)(バイオレジェンド社)と室温にて0.5時間インキュベーションした。次に細胞を洗浄し、二次抗体Cye3ロバαウサギIgG(PBS中1:300)に室温にて0.5時間供した。フローサイトメーターによって細胞を解析した。
ブレオマイシン(シグマ社)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に100μg/mlで溶かした。
50μgのブレオマイシンを6週齢の雌C3Hマウスに21日間、毎日皮下注射して全身性硬化症を誘導した。ブレオマイシン注射の開始と同時に、CM−101(5μg、10μg、20μg、又は50μgの投与量)、免疫グロブリンG1(IgG1)、又はPBSを1日おきに注射した(1日目から開始)。
6週齢の雌C3Hマウスをブレオマイシン(1日当たり50μg)の皮下注射で20日間治療した。ブレオマイシンの連日投与の開始後8日から始めて、マウスを100μlの腹腔内注射中50μg/日のCM−101又はPBSで毎日治療し、21日目に犠牲にした。重大なことには、CM−101での治療の開始が疾患症状の発症後であった。
予防モデル−
7週齢の雄C57BLマウスをイソフルレン麻酔下で気管内注射によってBLMの単回投与(60μg/マウス)で治療した。BLMはPBSに溶かした。注射後、マウスを立向き姿勢(vertical position)にして1分間回転した。ブレオマイシン注射の開始と同時に、CM−101(10μg、50μg、又は100μgの投与量)、免疫グロブリンG1(IgG1)、又はPBSを1日おきに注射した(1日目にから開始)。
7週齢の雄C57BLマウスをイソフルレン麻酔下で気管内注射によってBLMの単回投与(60μg/マウス)で治療することになる。BLMはPBSに溶かした。注射後、マウスを立向き姿勢にして1分間回転した。ブレオマイシン投与後9日、マウスを100μl腹腔内注射中10又は50μg/日のCM−101、IgG、又はPBSで毎日治療し、21日目に犠牲にした。重大なことには、CM−101での治療の開始が疾患症状の発症後であった。ブレオマイシン注射の9日後、ベースライン線維症及び炎症を評価するためにPBS群及びブレオマイシン群を犠牲にした。21日目に残りの群も犠牲にした。
可溶性コラーゲンはSircol可溶性コラーゲンアッセイ(Biocolor社、ベルファスト、英国)を用いて定量した。皮膚試料をCM101(5、20、又は100μg/ml)、IgG、又はPBSのいずれかで治療した強皮症マウスから得た。試料は酸・ペプシン溶液に抽出した。その試料を製造業者のプロトコールに従ってコラーゲン含有量について分析した。手短に言うと、100μlの試料を1mlの比色試薬(ピクリン酸中の色素SR)に加え、30分間撹拌した後、10,000gで10分間遠心分離した。アルカリ試薬(1N NaOH)を用いてSR色素をペレットから放出させ、マイクロプレートリーダー上で555nmにて分光光度の読み取りを行った。
BALアッセイを以前の記述(Komaiら、2010年)の通り行った。気管にカニューレを挿入し、肺を0.1% BSA及び0.05mM EDTA−2Naを含有する0.5mlのカルシウムもマグネシウムも含まないPBSで4時間洗浄した。この手順を3回繰り返した(合計体積:1.3ml、回収率>85%)。各動物からのBALをプラスチックチューブに集め、氷上で冷やし、4℃で10分間遠心分離した(150×g)。細胞ペレットを同じバッファー(0.5ml)に懸濁した。分画細胞カウントをフローサイトメトリーで行った。
エオタキシン−1、エオタキシン−2、及びRANTESレベルを、次の酵素結合免疫吸着法キットを製造業者のプロトコールに従って用いて硬皮症患者及び健康なドナーの血清中で決定した:QuantikineヒトCCL11/エオタキシン、CCL24/エオタキシン−2、及びCCL5/RANTES(R&D社)。
CHIP KMCを、pH7.0のTBSバッファー中の0.05% ツイーン−20、0.05% トリトンX−100で4℃にて一晩ブロックした。0.05% ツイーン−20及び0.05% トリトンX−100を含む1mLのpH7.0の1xTBSでCHIPを洗浄し、635nm及びPMT700にてスキャンした。次に、CM101のエピトープ結合を検出するために、CHIPを1mlの結合バッファーで4℃にて20分間で洗浄し、結合バッファー(pH7.4)中1μg/mlのhCM101と4℃で2時間インキュベーションした。インキュベーションに続いて、CHIPを洗浄し、結合バッファー(pH7.4)中の10ng/ml 抗ヒトIgG Alexa647複合体と4℃で1時間インキュベーションした。再度CHIPを洗い、635nm及びPMT700にてスキャンした。
hCM101又はマウスCM101の親和定数をビアコアT100を用いて評価した。この方法は表面プラズモン共鳴(SPR)電気光学現象を使用して、結合相手間の結合定数及びオン/オフレート(on/off rate)を測定する。エオタキシン2をCM−5チップの表面に共有結合的に固定し、CM101の溶液をその表面上に通した。SPR角の変化を測定し、KDを決定可能になった。
20名の健康なドナーのPBMCを解凍してカウントし、生存能力を評価した。各ドナーについて、1mlの増殖細胞ストックを24ウェルプレートの適切なウェルに加えたバルク培養を確立した。0.5mlの培養培地及び0.5mlの希釈したCM101の各々をPBMCに加えて、試料当たり50ug/mlの最終濃度を得た。各ドナーについて、再現性対照(100ug/ml KLH)及び培養培地のみのウェルも含んだ。培養を合計8日間、37℃にて5%CO2インキュベーションした。5、6、7、及び8日目に、各ウェルの細胞を100ulのAIM−V培養培地中の0.75uCi[3H]−チミジン(パーキンエルマー社、英国)でパルスし、TomTec Mach IIIを用いて収穫する前に18時間インキュベーションした。カウント毎分(cpm)をシンチレーション測定Meltilex(パーキンエルマー社、英国)で決定した。
強皮症におけるCCR3結合ケモカインの関与の可能性を調べるために、硬皮症患者の血清中でエオタキシン1、2、及びRANTESのレベルを健康な対象と比較して評価した。それぞれ図1A及び1Bに示されるように、結果は、エオタキシン2及びRANTESレベルの著しい増加(pv<0.05)を示した。くわえて、エオタキシン2及びその受容体であるCCR3の両方の著しく上昇した発現が硬皮症患者から取った皮膚生検で検出された(データ示さず)。よって、エオタキシン−2/CCR3経路の活性化が硬皮症において働いている可能性がある。
特発性肺線維症(IPF)におけるエオタキシン2の関与の可能性を調べるために、エオタキシン−2のレベルをIPF患者の肺生検で評価した。IPF患者から取った皮膚生検においてエオタキシン−2の発現の著しい上昇が見られた(図7に示す)。これらのデータは、エオタキシン−2経路がIPFで活性化されうるという考えを支持する。
マウス抗体CM101の可変(V)領域遺伝子をアンチトープ(Antitope)ベクターにクローニングして、ヒトIgG1重鎖定常領域及びκ軽鎖定常領域と併せてマウスV領域を含むキメラ抗体を作り出した。アンチトープのIgG1 VH及びVκ鎖発現ベクターにクローニングするための隣接制限酵素部位を導入したプライマーを用いて、マウスCM101抗体のVH及びVκ配列をPCR増幅した。VH領域はMluI及びHindIII部位を用いてクローニングし、Vκ領域はBssHII及びBamHI制限酵素認識部位を用いてクローニングした。両方のコンストラクトをDNAシークエンシングで確認した。くわえて、一連の4つのヒト化IgG1用VH領域及び4つのヒト化VK領域を設計し、Composite Human Antibody(商標)技術(アンチトープ社)を用いて構築した。
VH CDR1はアミノ酸配列NSGMN(配列番号5)をもつ。
VH CDR2はアミノ酸配列WINTYNGEPTYTDDFKG(配列番号6)をもつ。
VH CDR3はアミノ酸配列HSYGSSYAMDN(配列番号7)をもつ。
VK CDR1はアミノ酸配列KASQSVDYDGDSYMN(配列番号8)をもつ。
VK CDR2はアミノ酸配列VASNLKS(配列番号9)をもつ。
VK CDR3はアミノ酸配列QQSNEEPWT(配列番号10)をもつ。
hCM101のエオタキシン−2に対する結合親和力及び他の関連ケモカインに対する結合親和力を調べるために、幾つかの異なる方法:酵素結合免疫吸着法、ビアコア、及びCHIPによるエピトープマッピングを用いた。ビアコアによって、抗体のエオタキシン2に対する相当な結合が示され(図16)、酵素結合免疫吸着法によって、親和定数が3×10−9Mであることが明らかとなった。
エオタキシン1及びエオタキシン2は、CCR3と結合して活性化することを通して組織に好酸球を動員することに関与するケモカインである。
免疫原性の相対的なリスクを決定するために、リード完全ヒト化抗エオタキシン−2抗体(hCM101)を、エピスクリーン(商標)経時変化T細胞アッセイを用いて20名の健康なドナーのコホートに対して試験した。試料は最終濃度50μg/mlのhCM101で試験した。これはこの飽和濃度が検出可能な抗体特異的T細胞応答を刺激するのに充分であることを示した以前の研究に基づいた。各試料の潜在的な免疫原性を評価するために、エピスクリーン(商標)経時変化T細胞アッセイを増殖の分析とともに使用してT細胞活性化を測定した。
1. Goodnow CC et al, Cellular and genetic mechanisms of self tolerance and autoimmunity. Nature 2005; 2; 435(7042):590−7.
2. Jose PJ, Griffiths−Johnson DA, Collins PD et al., Eotaxin: a potent eosinophil chemoattractant cytokine detected in a guinea pig model of allergic airways inflammation, J Exp Med 1994; 179: 881−887.
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Claims (17)
- 線維性疾患、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、又はアレルギー・アトピー性疾患の治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物が(i)少なくとも2つのCCR3結合ケモカインに結合する単離多重特異性抗体、又はその任意の抗原結合断片、及び(ii)薬理学的に許容される担体を含み、前記単離多重特異性抗体が、
a)配列番号5で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR1、
b)配列番号6で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR2、及び
c)配列番号7で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR3を含む重鎖可変領域、並びに
d)配列番号8で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR1、
e)配列番号9で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR2、及び
f)配列番号10で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR3を含む軽鎖可変領域
を含む完全ヒト化抗体であることを特徴とする医薬組成物。 - 請求項1に記載の医薬組成物において、前記その抗原結合断片が、Fv、一本鎖Fv(scFv)、抗原に結合可能な重鎖可変領域、抗原に結合可能な軽鎖可変領域、Fab、F(ab)2’、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする医薬組成物。
- 請求項1または2に記載の医薬組成物において、前記線維性疾患が、硬皮症、特発性肺線維症(IPF)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、糸球体硬化症、肝硬変、及びメタボリックシンドロームからなる群より選択されることを特徴とする医薬組成物。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の医薬組成物において、前記自己免疫性炎症性疾患が、全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ、乾癬、大腸炎、ブドウ膜炎、多発性硬化症、及びタイプI糖尿病からなる群より選択されることを特徴とする医薬組成物。
- 請求項1または2に記載の医薬組成物において、前記単球関連疾患がアテローム性動脈硬化症であることを特徴とする医薬組成物。
- 請求項1または2に記載の医薬組成物において、前記アレルギー・アトピー性疾患が、喘息、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、及び過敏症反応からなる群より選択されることを特徴とする医薬組成物。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の医薬組成物において、前記少なくとも2つのCCR3結合ケモカインが、エオタキシン1、エオタキシン−2、RANTES、及びMCP−3からなる群より選択されることを特徴とする医薬組成物。
- 請求項7に記載の医薬組成物において、前記抗体が、エオタキシン1、エオタキシン−2、RANTES、及びMCP−3に結合することを特徴とする医薬組成物。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の医薬組成物において、前記抗体が、CCR3、CCR1、CCR2、及びCCR5を発現する細胞の遊走性を弱めることを特徴とする医薬組成物。
- 請求項1に記載の医薬組成物において、前記抗体が配列番号3で表わされる重鎖可変領域及び配列番号4で表わされる軽鎖可変領域を含む完全ヒト化抗体であることを特徴とする医薬組成物。
- 少なくとも2つのCCR3結合ケモカインに結合する単離多重特異性抗体又はその任意の抗原結合断片であって、前記抗体が、完全ヒト化抗体であり、
a)配列番号5で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR1、
b)配列番号6で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR2、及び
c)配列番号7で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VH CDR3を含む重鎖可変領域、並びに
d)配列番号8で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR1、
e)配列番号9で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR2、及び
f)配列番号10で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域VK CDR3を含む軽鎖可変領域
を含む単離多重特異性抗体又はその任意の抗原結合断片。 - 請求項11に記載の前記抗体をコードする核酸分子。
- 少なくとも2つのCCR3結合ケモカインに結合するヒト化抗体をコードする核酸分子であって、配列番号1及び配列番号2で表わされる配列を含む核酸分子。
- 請求項12又は13のいずれか一項に記載の前記核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項14に記載の前記発現ベクターを含む宿主細胞。
- 線維性疾患、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、又はアレルギー・アトピー性疾患の治療のための医薬の製造における、請求項11に記載の前記抗体の使用。
- 線維性疾患、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、又はアレルギー・アトピー性疾患における、CCR3、CCR1、CCR2、及びCCR5を発現する細胞の遊走性を弱めるための医薬の製造における、請求項11に記載の前記抗体の使用。
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