JP6528378B2 - 細胞展開方法およびそのためのキット - Google Patents
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Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
[1]
下記(a)〜(c)の条件を満たす、細胞懸濁液に含まれる細胞の固定化処理を行う工程(細胞固定化処理工程)、細胞懸濁液からタンパク質を除去する工程(タンパク質除去工程)、およびタンパク質除去工程を経た細胞懸濁液に含まれる細胞を細胞展開用基板上に展開して吸着させて回収する工程(細胞展開工程)を含む細胞展開方法:
(a)細胞固定化処理工程において、一分子中に二つ以上のアルデヒド基を含む化合物からなる固定化剤を使用する;
(b)少なくともタンパク質除去工程および/または細胞展開工程において、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタラート、ポリメタクリル酸メチルまたはシクロオレフィンポリマーから選ばれる材質のピペットチップおよび/またはマイクロチューブを用いる;
(c)細胞展開工程においてポリスチレン製の細胞展開用基板を用いる。
[2]
前記タンパク質除去工程を前記細胞固定化処理工程の後に行う項1に記載の細胞展開方法。
[3]
前記(a)の細胞固定化処理工程において、グリオキサール、マロンアルデヒド、スクシンアルデヒドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される少なくとも一種からなる固定化剤を用いる、項1または2に記載の細胞展開方法。
[4]
タンパク質除去工程によって、細胞懸濁液に含まれるタンパク質の濃度を0.001%未満とする、項1〜3の何れか一項に記載の細胞展開方法。
[5]
前記(b)の少なくともタンパク質除去工程/細胞展開工程において、ポリプロピレン製のピペットチップおよび/またはマイクロチューブを用いる、項1〜4の何れか一項に記載の細胞展開方法。
[6]
前記(c)の細胞展開工程において、チャンバーを有する細胞展開用デバイスを用いる、項1〜5の何れか一項に記載の細胞展開方法。
[7]
(i)一分子中に二つ以上のアルデヒド基を含む化合物からなる固定化剤、
(ii)ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタラート、ポリメタクリル酸メチルまたはシクロオレフィンポリマーから選ばれる材質のピペットチップおよび/またはマイクロチューブ、ならびに
(iii)ポリスチレン製の細胞展開用基板
を含む、細胞展開用キット。
[8]
前記(i)として、グリオキサール、マロンアルデヒド、スクシンアルデヒドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される少なくとも一種からなる固定化剤を含む、項7に記載の細胞展開用キット。
[9]
前記(ii)として、ポリプロピレン製のピペットチップおよび/またはマイクロチューブを含む、項7または8に記載の細胞展開用キット。
[10]
前記(iii)として、チャンバーを有する細胞展開用デバイスを含む、項7〜9の何れか一項に記載の細胞展開用キット。
本発明の細胞展開方法は、少なくとも、細胞固定化処理工程、タンパク質除去工程および細胞展開工程を含む。このような細胞展開方法の各工程は、たとえば、図1に示すフローチャートに沿った手順で実施することができる。以下、本発明の細胞展開方法に含まれる各工程について、より詳細に説明する。
本発明の細胞展開方法が対象とする細胞(集団)は特に限定されるものではないが、代表例としては、血液、尿、リンパ液、組織液、体腔液など、ヒトまたはその他の動物から採取された検体に含まれる細胞、あるいは培養された細胞(細胞株)が挙げられる。特に、血液等に含まれるCTC、CEC、CEP、その他の前駆細胞などの稀少細胞や、培養細胞中に含まれる幹細胞、特定の分化細胞、その他の特徴的な細胞を目的細胞とし、そのような目的細胞を含む細胞(集団)を細胞展開方法の対象とすることが好ましい。
細胞懸濁液は、例えば、稀少細胞またはその他の目的細胞を含んでいる可能性がある、血液、尿、リンパ液、組織液、体腔液等の検体、あるいはそれらの検体から得られた細胞画分や精製物などの前処理物を、PBS等の適切な溶媒で希釈することにより調製することができる。また、細胞懸濁液は、試験、研究等のために培養した、稀少細胞またはその他の目的細胞の細胞株、あるいは目的細胞を含む細胞集団を、PBS等に分散させて調製したものであってもよい。患者の血中細胞モデルとして、健常者から採取された血中細胞の懸濁液にCTC等の稀少細胞の細胞株を添加したものを、細胞懸濁液として用いてもよい。
本発明の細胞展開方法における細胞固定化処理工程、タンパク質除去工程、細胞展開工程などにおいては、ピペットチップ、マイクロチューブなどの実験用器具が用いられる。これらの実験用器具の材質としては様々なものが知られているが、本発明では、少なくともタンパク質除去工程および/または細胞展開工程においては、ポリプロピレン、ポリカーボナイト、ポリエチレンテレフタラート、ポリメタクリル酸メチルまたはシクロオレフィンポリマーから選ばれる材質のピペットチップおよび/またはマイクロチューブが用いられ、特にポリプロピレン製のものを用いることが好ましい。また、上記の材質の実験用器具の表面は、たとえば親水化処理など、さらに細胞が吸着しにくくなる処理が施されていてもよい。
細胞固定化処理工程は、細胞懸濁液に含まれる細胞の固定化処理を行う工程である。固定化処理は、細胞の自己分解や腐敗を遅延させ、その形態や抗原性を保持するために行われる処理であり、CTC等の目的細胞の検出性を高めることができる。
本発明では、細胞の固定化処理に用いられる固定化剤として、一分子中に二つ以上のアルデヒド基を含む化合物を用いる。一分子中に二つ以上のアルデヒド基を含む化合物は一般的に、式:H(O=)C−R−C(=O)H[式中、Rは単結合またはアルキレン基を表す。]で表される。たとえば、前記Rで表される炭素数が0(単結合)、1〜3の化合物に相当する、グリオキサール、マロンアルデヒド、グルタルアルデヒドなどは、本発明における固定化剤として好ましい。
細胞の固定化処理に先だって、血液またはそれから調製される画分に対しては、上述した固定化処理以外の処理を必要に応じて施すことができる。特に、細胞懸濁液をヒトまたはその他の動物から採取された検体を用いて調製する場合は、必要な前処理をあらかじめを行っておくことが適切である。以下、CTCを含有する代表的な検体である血液についての前処理方法について説明する。この場合、前述した固定化処理(細胞固定化処理工程)は一般的に、抗凝固処理および遠心分離処理を経た細胞懸濁液に対して施される。
採取されて体外に取り出された血液(全血)は、そのまま空気に触れさせると時間の経過と共に凝固し、そこに含まれる細胞を回収して観察することができなくなる。そのため、採取された血液は直ちに抗凝固処理することが好ましい。
全血から稀少細胞等の目的細胞を含む細胞画分を得て、さらに細胞展開工程に供するのに適した細胞懸濁液を調製するためには、通常、数回の遠心分離処理が行われる。遠心分離処理によって全血からCTC等の稀少細胞(白血球)を分離、精製し、そのような細胞を含む画分を調製するための手法は公知であり、適切な遠心分離機および遠心分離条件を用いて実施することができる。
タンパク質除去工程は、細胞懸濁液からタンパク質を除去する工程である。タンパク質除去工程は、固定化処理工程前であっても固定化処理工程後であってもよいが、固定化処理工程後のほうが好ましい。細胞展開工程において細胞に対してブロッキング効果を与えてしまうタンパク質を細胞懸濁液中から除去することで、細胞がマイクロチャンバーの内部に吸着する能力を失わないようにすることができる(ブロッキング効果ないしブロッキング処理については別途後述する)。
細胞展開工程は、タンパク質除去工程を経た細胞懸濁液に含まれる細胞を細胞展開用基板上に展開して吸着させて回収する工程である。
細胞展開用基板は、典型的には、後述する細胞展開用ないし細胞観察用のシステムに用いられるデバイスの流路基板に相当する。流路形成部材と組み合わせて流路を形成し、その流路に細胞懸濁液を導入することにより、細胞展開用基板(流路基板)の表面に細胞懸濁液中の細胞を展開するようにして用いられる。しかしながら、本発明の細胞展開方法を実施することのできる細胞展開用基板はそのような実施形態に限定されるものではなく、表面に細胞懸濁液を展開してその中に含まれる細胞を吸着させることができるものであればよい。たとえば、細胞展開用基板はスライドグラスや細胞培養用のシャーレの底面であってもよい。
稀少細胞等の目的細胞の検出効率を高めるためには、細胞を固相化する、つまり細胞展開用基板上の細胞の位置が動かないようにする必要がある。細胞を固相化することにより、観察の対象とする細胞の位置を特定しやすくなり、必要に応じて検出された目的細胞を回収することも可能となる。
表面にマイクロチャンバーを備えるポリスチレン製の細胞展開用基板を用いる場合、マイクロチャンバーの開口以外の領域は、ブロッキング処理しておくことが好ましい。そのような領域をブロッキング処理しておき細胞が吸着してしまうことを防ぐことで、稀少細胞等をマイクロチャンバー内に効率的に回収して吸着させることができる。
細胞展開用デバイスは、流路基板および流路形成部材よって構築されており、これらによって閉鎖されている空間が、細胞懸濁液等の液体を送液して満たすことのできる流路となっている。流路の上流側および下流側の末端付近には、上記の各種の液体を流入および排出させるための流入口および排出口が形成される。流路基板と流路形成部材とは、観察やメンテナンスのしやすさの観点から、係合、ねじ固定、粘着等の手段で取り付け・取り外しが可能なようになっていてもよい。
本発明の細胞展開方法の用途は特に限定されるものではなく、目的に応じた様々な実施形態において本発明の細胞展開方法を利用することができる。典型的には、本発明の細胞展開方法は、稀少細胞等の目的細胞を検出するために利用され、細胞展開用基板上に細胞を展開した後、細胞の(蛍光)染色および観察などが行われる。このような実施形態が前述したような細胞展開用デバイスを用いて行われる場合、細胞を展開するための細胞懸濁液の送液の後に、(蛍光)染色剤の送液や洗浄剤の送液などが引き続き行われる。
本発明の細胞展開方法を実施するための手段は特に限定されるものではなく、細胞固定化処理工程、タンパク質除去工程および細胞展開工程を公知の手段を用いて順次行っていけばよい。
送液系機構は、好ましくは制御手段の制御により、試薬収容器の細胞懸濁液、(蛍光)染色液、洗浄液、その他の試薬類それぞれの収納部と細胞回収デバイスの流入口との間を移動し、それらの液の吸引および吐出を行う機構である。具体的には、送液系機構によって、試薬収容器に収容されている細胞懸濁液等の液体を所定の量吸引し、細胞回収デバイスの流入口で所定の流量で吐出して、流路に導入する。また、送液により所定の処理が終わった後は、流路を満たしていた液体を流入口から吸引して排出し、試薬収容器の廃液収納部で吐出する。送液系機構は、例えば、シリンジポンプ、交換可能なチップ、X軸方向(図の左右方向)およびZ軸方向(図の上下方向)に移動可能なアクチュエーターなどを用いて構築することができる。シリンジポンプは、細胞展開工程およびその他の工程において、細胞懸濁液、洗浄液等を所望の流量で吸引および吐出ができる能力を有する。
試薬収容器には、細胞懸濁液、染色液(核染色剤溶液、免疫蛍光染色溶液等)、洗浄液など、細胞展開工程およびその他の細胞観察のための工程を行う上で流路に送液する必要のある各種の液体が収容されている。例えば、洗浄液など比較的保存性の高い液体は、密封された状態であらかじめ試薬収容器の所定の部位に収容しておくことが可能であり、細胞懸濁液、染色液など細胞観察の直前に調製する必要のある液体は、調製後に試薬収容器の所定の部位に添加して収容させることができるようにする。本発明では、細胞懸濁液として、固定化処理工程およびタンパク質除去工程を経たものが用いられる。染色液、洗浄液など、細胞観察の際に複数回使用される溶液は、各工程に対応した容量の溶液を別個の部位に収容しておいてもよいし、各工程で同一の組成の溶液を繰り返し使用する場合はそれらの合計の用量の液体を1つの部位に収容しておいてもよい。また、試薬収容器には必要に応じて、送液後に吸引して流路から排出させた廃液を貯留する部位を設けておくようにする。
本発明の細胞展開方法を実施するために利用することのできる細胞展開用キットは、例えば、上述したような一分子中に二つ以上のアルデヒド基を含む化合物からなる固定化剤;ポリプロピレン、ポリカーボナイト、ポリエチレンテレフタラート、ポリメタクリル酸メチルまたはシクロオレフィンポリマーから選ばれる材質のピペットチップおよび/またはマイクロチューブ;ならびにポリスチレン製の細胞展開用基板を含む。このような細胞展開用キットは、必要に応じて、その他の試薬、試薬を調製するための器具、使用説明書などを含んでいてもよい。その他の試薬としては、例えば、前述したような核染色液、洗浄液、あるいはこれらを調製するための核染色剤、洗浄剤、とそれらの希釈液(PBS等の溶媒)などが挙げられる。
MDA−MB231細胞(ヒト乳癌由来細胞)を回収し、200G,4分遠心処理を行い、PBSで2回の洗浄を行った。この細胞をPBSで懸濁し、3.0×105/mlの濃度の細胞懸濁液200μlを調製した。この細胞懸濁液に最終濃度が4w/v%となるようグルタルアルデヒドを添加して、プロテオセーブSS1.5mlマイクロチューブ(品番MS−4215M、登録商標、住友ベークライト、超親水化処理済みのポリプロピレン製)内で、室温で細胞の固定化処理を行った。得られた細胞懸濁液を実施例1のサンプルとした。
最初に実施例1と同様にして調製された細胞懸濁液を用い、最終濃度が4w/v%となるようグルタルアルデヒドを添加したことに代えて、最終濃度が0.5w/v%となるようグリオキサールを添加して細胞の固定化処理を行ったこと以外は実施例1と同様にして、実施例2のサンプルを得た。
最初に実施例1と同様にして調製された細胞懸濁液を用い、最終濃度が4w/v%となるようグルタルアルデヒドを添加したことに代えて、最終濃度が4w/v%となるようホルマリンを添加して細胞の固定化処理を行ったこと以外は実施例1と同様にして、比較例1のサンプルを得た。
PBSに代えてBSAを1w/v%の濃度で含むPBSを用いて調製された細胞懸濁液を用いたこと、また最終濃度が4w/v%となるようグルタルアルデヒドを添加したことに代えて、最終濃度が4w/v%となるようホルマリンを添加して細胞の固定化処理を行ったこと以外は実施例1と同様にして、比較例2のサンプルを得た。
最初に実施例1と同様にして調製された細胞懸濁液を用い、最終濃度が4w/v%となるようグルタルアルデヒドを添加したことに代えて、−30℃にてメタノールを添加して細胞の固定化処理を行ったこと以外は実施例1と同様にして、比較例3のサンプルを得た。
最初に実施例1と同様にして調製された細胞懸濁液を用い、最終濃度が4w/v%となるようグルタルアルデヒドを添加したことに代えて、−30℃にてアセトンを添加して細胞の固定化処理を行ったこと以外は実施例1と同様にして、比較例4のサンプルを得た。
実施例1〜2および比較例1〜4の各サンプルについて、下記の手順で評価試験1を行った。
(2)固定化処理直後、サンプルの全量を、ARTチップ(登録商標、molecular Bio Products)を用いて20回ピペッティングした後、(1)と同様にサンプル20μlをマイクロピペットにて秤量し、血球計数板を用いて16視野全数測定にて細胞数を計測し、サンプル中の細胞濃度を算出した。
(3)固定化処理開始から30分後、上記(2)と同様にピペッティングしたサンプルの細胞濃度を算出した。
(4)さらに30分後(固定化処理開始から60分後)、上記(2)と同様にピペッティングしたサンプルの細胞濃度を算出した。
実施例1〜2および比較例1〜4の各サンプルについて、下記の手順で評価試験2を行った。
PP表面に対する細胞吸着抑制性能は上記評価試験1における(1)の細胞濃度に対する、工程(4)において測定された細胞濃度割合を、○:67%〜100%、△:33%〜67%、×:0%〜33%と評価し、
PS表面に対する細胞吸着性能は、洗浄液送液前に対する洗浄液送液後の細胞数の割合は○:67%〜100%、△:33%〜67%、×:0%〜33%、と評価した。
2 流入口
3 流出口
4 リザーバー
5 マイクロチャンバー
10 細胞回収デバイス
11 流路基板
12 流路形成部材
12a 枠部材
12b 天板部材
20 試薬収容器
CL 細胞懸濁液
100 細胞検出装置
110 送液系機構
111 チップ
120 光学系機構
160 細胞回収デバイスホルダー
170 試薬収容器ホルダー
190 制御手段
200 細胞観察システム
Claims (7)
- 下記(a)〜(c)の条件を満たす、細胞懸濁液に含まれる細胞の固定化処理を行う工程(細胞固定化処理工程)、細胞懸濁液からタンパク質を除去することで細胞懸濁液に含まれるタンパク質の濃度を0.001w/v%未満とする工程(タンパク質除去工程)、およびタンパク質除去工程を経た細胞懸濁液に含まれる細胞を細胞展開用基板上に展開して吸着させて回収する工程(細胞展開工程)を含む細胞展開方法:
(a)細胞固定化処理工程において、グリオキサール、マロンアルデヒド、スクシンアルデヒドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される固定化剤を使用する;
(b)少なくともタンパク質除去工程および/または細胞展開工程において、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタラート、ポリメタクリル酸メチルまたはシクロオレフィンポリマーから選ばれる材質のピペットチップおよび/またはマイクロチューブを用いる;
(c)細胞展開工程においてポリスチレン製の細胞展開用基板を用いる。 - 前記タンパク質除去工程を前記細胞固定化処理工程の後に行う請求項1に記載の細胞展開方法。
- 前記(b)の少なくともタンパク質除去工程および/または細胞展開工程において、ポリプロピレン製のピペットチップおよび/またはマイクロチューブを用いる、請求項1または2に記載の細胞展開方法。
- 前記(c)の細胞展開工程において、チャンバーを有する細胞展開用デバイスを用いる、請求項1〜3の何れか一項に記載の細胞展開方法。
- (i)グリオキサール、マロンアルデヒド、スクシンアルデヒドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される少なくとも一種からなる、細胞の固定化処理に用いられる固定化剤、
(ii)ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタラート、ポリメタクリル酸メチルまたはシクロオレフィンポリマーから選ばれる材質のピペットチップおよび/またはマイクロチューブ、ならびに
(iii)ポリスチレン製であり、前記固定化剤により前記固定化処理が施された細胞を展開するための細胞展開用基板
を含む、請求項1〜4の何れか一項に記載の細胞展開方法を行うための細胞展開用キット。 - 前記(ii)として、ポリプロピレン製のピペットチップおよび/またはマイクロチューブを含む、請求項5に記載の細胞展開用キット。
- 前記(iii)として、チャンバーを有する細胞展開用デバイスを含む、請求項5または6に記載の細胞展開用キット。
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